TWI481398B - 茶多酚用於治療及／或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之用途 - Google Patents

Description

茶多酚用於治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之用途

本發明係關於一種治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之方法，其包含投予有效量之茶多酚至一個體。特定言之，本發明利用兒茶素以治療/或預防尼古丁或尼古丁衍生物或雌激素誘發之乳癌。

在美國，乳癌在女性癌症相關死亡之第二大主因，在美國及日本執行之大族群研究顯示，患有乳癌之風險與主動及被動吸煙相關。香菸的煙霧為超過4000種化學成份之複雜組合物，其包含之尼古丁(Nic)為主要之致癌成份。使用¹⁴ C-Nic進行研究顯示，在吸煙時，80至90%所吸入之Nic係全身性地吸收(Armitage,A. K.,Dollery,C. T.,George ,C. F.,Houseman,T. H. et al.,Br. Med. J. 1975,4,313-316 )。吸煙後，Nic之濃度迅速在血漿中平均達15 ng/mL，且在唾液及胃液中特別高(分別>1300及800 ng/mL)。反覆暴露於菸草特異之致癌物質4-(甲基硝基胺}-1-(3-砒啶)-1-丁酮(NNK)之非癌性人類乳腺上皮細胞(MCF-10A)，在小鼠模型中會出現異體移植之腫瘤生成，且在軟瓊脂上有非附著性群落之形成。體內試驗則顯現Nic可促使固體腫瘤之生長，這表示Nic可能有助於腫瘤中，細胞之增生、侵襲及血管新生之發展(Heeschen,C.,Jang,J. J., Weis,M.,Pathak,A. et al.,Nat. Med. 2001,7,833-839 )。這些結果意味著Nic可改變正常乳腺上皮細胞，且可能助乳癌發生。

雌激素可刺激乳腺及子宮內膜組織增生、增強骨密度及降低血漿膽固醇。選擇性雌激素受體調節劑(SERMs)是雌激素受體之小配位體，其可誘發受體各種不同的形態轉變，從而引起各種不同之生物態勢。許多SERMs係雙功能的，因其可於刺激某些功能時亦拮抗某些功能。舉例而言，他莫昔芬(tamoxifen)，其係為雌激素受體之部分激動劑/拮抗劑，其抑制雌激素誘發之乳癌細胞增生，但刺激子宮內膜生長並防止骨質流失。

人類神經組織已被報導，在慢性暴露於Nic中，具有高度之尼古丁乙醯膽鹼受體(nAChR)次單元之表現。天然的nAChRs之配位體為乙醯膽鹼；然而，在菸草的成份中，如Nic或NNK，皆已知為nAChRs的高親和性激動劑。先前的研究中，吸菸是肺癌、大腸癌、膀胱炎及乳癌的主要危險因子，而動物實驗中，在α9-nAChR過度表現之受MCF-10A-Nic(DOX)-異體移植腫瘤組織之BALB/c-nu/nu小鼠，伴隨著細胞週期蛋白cyclin D3之過度表現(Chen,C. S.,Lee,C. H.,Hsieh,C. D.,Ho,C. T. et al.,Breast Cancer Res. Treat. 2010 )。進一步的研究顯示由天然可食用之植物中分離出的物質可透過針對人體nAChRs而抑制人類乳癌細胞增生(Shih,Y. L., Liu,H. C.,Chen, C. S.,Hsu,C. H. et al.,J. Agric. Food Chem. 2010,58,235-241;Lin,Y. S.,Tsai,Y. J.,Tsay,J. S.,Lin,J. K.,J. Agric. Food Chem. 2003,51,1864-1873 )。這些結果意味著在人類乳癌細胞中所偵測到的nAChRs可做為臨床應用上之治療分子標靶。

茶多酚具有多種功效，如具抗氧化功用(美國專利第4673530號及日本專利公開號第H1-268683號)、抗菌及制菌功效(日本專利公開號第H2-276562號及歐盟專利第0443090 B1號)、膽固醇增加之抑制活性(日本專利公開號第S60-156614號)、血壓升高之抑制活性(美國專利第4840966 B1號)及血糖升高之抑制活性(歐盟專利第0573682 A1號)係為已知。此外，綠茶萃取之(-)-表沒食子兒茶酚沒食子酸(epigallocatechin gallate，“EGCG”)已研究其抗氧化及清除自由基活性(Lin,Y. S.,Tsai,Y. J.,Tsay,J. S.,Lin,J. K.,J. Agric. Food Chem. 2003,51,1864-1873;Lin,J. K.,Chen,P. C.,Ho,C. T.,Lin-Shiau,S. Y.,J. Agric. Food Chem. 2000,48,2736-2743 )。EGCG在誘發乳癌細胞凋亡及細胞週期阻滯亦有效用(Pan,M. H.,Lin,C. C.,Lin,J. K.,Chen,W. J.,J. Agric. Food Chem. 2007,55,5030-5037;Stuart,E. C.,Rosengren,R. J.,Life Sci. 2008,82,943-948 )。其他研究亦顯示許多綠茶之癌症化學預防功效係透過EGCG所介導，其可透過改變細胞週及調控蛋白之表現、活化殺手卡斯帕斯酶(killer caspase)及抑制核因子xB之活化，而誘發細胞凋亡並促使細胞生長停止(Butt,M. S.,Sultan,M. T.,Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2009,49,463-473 )。

然而，並未有任何的先前技術揭示或建議茶多酚與尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之關連。

本發明提供一種治療及或/預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌，其包含投予有效量之茶多酚或其鹽類至一個體，從而治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌。本發明亦提供一種茶多酚或其醫藥上可接受之鹽類之新用途，其係用於製備治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之藥劑。

本發明驚人地發現尼古丁受體α9-nAChR在乳癌中顯著地受Nic及雌二醇(E2)誘發，且茶多酚可阻礙E2-及Nic-或Nic-衍生化合物誘發α9-nAChR蛋白質的表現。本發明出人意料的發現茶多酚透過向下調節α9-nAChR的表現，而可作為阻礙吸菸(尼古丁，Nic)或荷爾蒙(雌二醇，E2)誘發之乳癌細胞增生之藥劑。因此，本發明提供了一種茶多酚之化學預防功能，其係透過抑制吸煙介導之乳癌形成，即E2-或Nic-或Nic-衍生化合物誘發α9-nAChR蛋白質的表現。

術語「一種(a)」及「一種(an)」代表於本文中之語法對象有一個或多於一個(即至少一個)。

術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」或「治療(treating)」意指降低病人經歷乳癌症狀之頻率、程度、嚴重性及/或持續時間。

術語「防止(prevent)」、「預防(prevention)」或「防止(preventing)」意指抑制或避免乳癌相關之症狀。

術語「緩和(alleviate)」、「減輕(alleviation)」或「改善(alleviating)」意指減少一或多個疾病、失調或病狀之症狀。

術語「茶多酚」(以下簡稱TP)意指茶葉中主要之水溶性物質，佔10%至25%之茶葉乾重。TP主要包含四種成分：兒茶素、黃酮類、花青素酚酸及還原性酚酸，其中兒茶素最為豐富，總量約有60%至80%。

術語「兒茶素」是一個統稱，其包含了表沒食子兒茶酚沒食子酸(epigallocatechin gallate，以下簡稱“EGCG”)、表沒食子兒茶酚(epigallocatechin，以下簡稱“EGC”)、表兒茶酚沒食子酸(epicatechin gallate，以下簡稱“ECG”)、表兒茶酚(epicatechin，以下簡稱“EC”)、沒食子兒茶酚沒食子酸(gallocatechin gallate，以下簡稱“GCG”)、沒食子兒茶酚(gallocatechin，以下簡稱“GC”)、兒茶酚沒食子酸(catechin gallate，以下簡稱“CG”)及兒茶酚(catechin，以下簡稱“C”)。在此所述之兒茶素皆可為(+)-形式或(-)-形式，其中較佳係(-)-EGCG、(-)-EGC、(-)-ECG、(-)-EC、(-)-GCG、(-)-GC、(-)-CG及(+)-C。

術語「醫藥上可接受之鹽」係指那些保有生物有效性及游離鹼特性之鹽類，其係與如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對-甲苯磺酸、水楊酸、蘋果酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸等等之無機酸或有機酸反應而得。

術語「有效量」係指茶多酚可有效地治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌的量，舉例而言，該茶多酚有效量可減少腫瘤細胞數量；降低腫瘤大小；抑制(即減緩至一定程度，較佳為停止)腫瘤細胞浸潤至周圍器官；抑制(即減緩至一定程度，較佳為停止)腫瘤轉移；抑制一定程度之腫瘤生長；促進細胞凋亡；及/或減輕在一定程度上疾病之一個或多個相關症狀。

本發明提供一種治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌，其包含投予有效量之茶多酚或及其醫藥上可接受之鹽至一個體，從而治療及/或預防尼古丁或雌激素誘發之乳癌。

技術領域中已知尼古丁並不是一個完全的致癌物質，尼古丁之亞硝化作用切割了N─CH₃ 鍵結並失去甲醛後得到NNN(N'-亞硝基尼古丁)，或分別經由無論是切斷2’-N或5’-N鍵結而得到NNK(4-(甲基硝基胺}-t-(3-砒啶)-1-丁酮，NNK一詞的由來係「尼古丁衍生之亞硝基胺酮」)或NNA(4-甲基硝基胺)-4-{3-砒啶)-丁醇)(Cancer Research 45,935-944,March 1985 ，其全部內容納入作為參考)。這些尼古丁衍生化合物為致癌物質。

根據本發明，各種茶多酚(TP)可做為本發明之方法之活性成分。在一個實施例中，TP係兒茶素。較佳地，該兒茶素包含但不限於表沒食子兒茶酚沒食子酸(epigallocatechin gallate，“EGCG”)、表沒食子兒茶酚(epigallocatechin，“EGC”)、表兒茶酚沒食子酸(epicatechin gallate，“ECG”)、表兒茶酚(epicatechin，“EC”)、沒食子兒茶酚沒食子酸(gallocatechin gallate，“GCG”)、沒食子兒茶酚(gallocatechin，“GC”)、兒茶酚沒食子酸(catechin gallate，以下簡稱“CG”)及兒茶酚(catechin，“C”)。上述化合物皆可為(+)-形式或(-)-形式，其中較佳之兒茶素係EGCG，更佳之兒茶素係(-)-EGCG。

根據本發明，合適之TP醫藥上可接受之鹽類包含但不限於醫藥上可接受之無機酸之鹽，如鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、磺胺酸及氫溴酸，或醫藥上可接受之有機酸之鹽，如醋酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來酸、羥基馬來酸、富馬酸、順丁烯二酸、檸檬酸、乳酸、黏液酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、氨基苯磺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、伸乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸酸、單寧酸、抗壞血酸及戊酸。

根據本發明，TP或其醫藥上可接受之鹽係有效地治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之病狀。特別是，尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌係由因E2-或Nic-誘導α9-nAChR蛋白質表現(特別是過度表現)所引起。根據本發明，TP或其醫藥上可接受之鹽賦予吸煙介導的乳癌之化學預防能力。TP或其醫藥上可接受之鹽可選擇性地與手術、放射療法、化療、細胞毒性藥物、細胞生長劑或荷爾蒙療法併用，包含任何揭示於此或本文之參考資料所提之療法或治療。較佳地，TP係與化療併用。

TP或其醫藥上可接受之鹽用於治療應用(如尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌)之有效量，在一定程度上取決於如正在接受治療者之病症狀態、是否TP或其鹽係用於預防(較低劑量)、惡性腫瘤之嚴重程度、給藥方式及藥物配方等因素，這些因素將取決於臨床醫師對於常規劑量之逐步研究，通常的情況下，投予個體的劑量約以體重計由500至2500毫克/公斤體重，較佳之TP劑量係約500至2000、700至2000、1000至2000、1000至1800或1200至1600毫克/公斤體重，更佳之TP劑量係以體重計1500毫克/公斤體重。這些因素將取決於臨床醫生使用常規劑量的升級研究。通常情況下，劑量各題目是從約500-2,500毫克/公斤體重。最好是，TP的劑量為500-2,000，700-2,000，1000-2000，1000-1800或1200-1600。更優選，TP的劑量是1500毫克/公斤體重。

本發明另提供一種茶多酚或其醫藥上可接受之鹽類之新用途，其係用於製備協助戒菸及/或治療及/或預防吸煙成癮之藥劑。世界衛生組織(WHO)分類吸煙及尼古丁成癮為世界上最盛行的成癮性人類行為。雖然大眾已增加體認，其仍為盛行的疾病及死亡的原因。技藝人士認同吸煙行為牽涉兩種生理反應，即，腦中的尼古丁誘導的生化訊號，及感覺中樞及生理訊號(如，吸煙的嗅覺、味覺、適應化)。隨時間經過，尼古丁的增強行為變成與吸煙相關的感覺及生理反應密切相關。結果，協助吸煙者停止吸煙的設計較佳是尼古丁增強與吸煙的感覺及生理反應分離。因此，本發明亦關於茶多酚或其醫藥上可接受之鹽類治療及/或預防吸煙成癮的用途。

任何適合的投藥路線可用於提供患者有效劑量的TP或其醫藥上可接受的鹽。例如，口服、肛內、非經腸、穿皮、穿黏膜、皮下、肌內、腦脊髓膜內、肺泡內、鼻腔內或陰道內及類似路線。劑型包括錠劑、糖衣錠、膠囊、口含錠、分散劑、懸浮劑、溶液、貼片、片劑、口膠、栓劑、乳劑、凝膠、陰道栓劑、膜、粉末及其類似物。

含有TP或其鹽之藥物劑型典型地包含一或多種載劑或賦形劑，且可選擇地含其他治療成分。該載劑通常係”可接受的”，係在某種意義上與劑型中之其他成分可兼容，且對其服用者之生理無害。該等載劑或賦型劑已為已知，如填充劑、潤滑劑、黏合劑、及用於液體劑型之各種液體賦形劑。適當的載劑包含揭示於本文提及之參考資料中。

合適之劑型包含水性或油性之TP或其鹽。活性成分適於經注射投藥之配方包含水性及非水性之組合物，其中該活性成分係溶解或懸浮於液體。適合經注射投藥之劑型包含水性或非水性之無菌溶液，其可包含抗氧化劑、緩衝液、抗菌劑或可使劑型與服藥者血液呈等張之溶質。其他的經注射劑型可包含水性或非水性之無菌懸浮液，其可包含懸浮劑或增稠劑。

適用於本發明經口投藥之劑型可製備為離散之單元，如膠囊、藥包或錠劑，皆含有預設量之TP或其鹽；如粉末或顆粒；如溶液或在水性或非水性液體之懸浮液；或水包油液體乳化液或油包水液體乳化液。

經直腸投藥之劑型可與合適之鹼作為塞劑。

適合經肺內或鼻腔給藥之劑型具有粒子大小，如0.01至200微米之範圍(包括粒子大小範圍介於0.01及500微米之間，以0.1微米增加，如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、5、30、35微米等)，其可經由鼻腔或經口吸入因而到達許多支氣管及肺泡囊。合適的氣霧或乾粉投藥劑型以依照傳統方式製備，亦可與其他治療藥劑合併投藥。

適合陰道投藥之劑型可以含有活性成分及技術領域中已知之合適載劑，以子宮帽、棉條、乳霜、凝膠、膏狀、泡沫或噴霧之製劑呈現。

含有TP及其鹽之劑型可呈現於單劑量或多劑量之包裝，如密封之安瓶或藥瓶，可儲存於冷凍乾燥(凍乾)之狀態，且可在加入無菌之液體載劑(如注射用水)後即可使用。由先前描述之無菌粉末、顆粒及錠劑可製備即可使用之注射液或懸浮液，較佳的單位劑量劑型為那些含如本文所述之每日劑量或每日單位分劑量，或其合適份量之活性成分。

應理解的是，上述特別提及之本發明之劑型中，除了TP及其鹽類外，可根據所欲之劑型之常規技術而包含其他製劑，如合適於口服劑型者包含香料或著色劑。

TP及其鹽可用於作為控釋藥物劑型，其含有TP及其鹽類，其中TP及其鹽類之釋放係受控制及調節，而使給藥頻率降低或增進TP或其鹽之藥物動力或毒性。

劑型包含那些適用於上述任一之給藥途徑。該等劑型可以傳統之單一劑量型態呈現，且可由任何藥物學中眾所周知之方式製備。這些方法包含將活性成分與由一或多種輔助之成份或賦形劑所組成之載劑混合。在一般的情況下，這些劑型係將活性成分與液體載劑或精細切割之固體載劑或兩者，均勻且詳盡的混合後，如有必要，將產品塑型。

錠劑係由壓製或鑄模所製備，且可選擇地添加一或多種輔助成分。壓製之錠劑係將自由流動形式(如粉末或顆粒)之TP或其鹽，可選擇性地與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或崩散劑混合後，透過適合之機器而製得。鑄模而得之錠劑則係由將粉末狀之活性成分以惰性液態稀釋劑混合後，以適合的機器模製而成。該等錠劑可選擇性地受包覆或痕刻及可選擇性地經調配而由此達到活性成分的緩慢或控制釋放。

吸煙及荷爾蒙是與乳癌形成相關之兩個重要致病因素。本發明揭示了EGCG可抑制尼古丁(Nic)(特別是高濃度之尼古丁(10 μM))與其受體之結合。此結果具重要之臨床意義，因為先前報導指出，吸煙者之在穩態之血清中尼古丁濃度為200 nM，並在吸煙後血清濃度大幅升高至10至100 μM，甚至在唾液中達1 mM(West,K. A.,Brognard,J.,Clark,A. S.,Linnoila,I. R.et al .,J .Clin .Invest . 2003,111 ,81-90)。儘管許多體外及動物試驗提出綠茶具保護作用而可對抗乳癌，但從流行病學研究所得到之結果並不一致(Iwasaki,M.,Inoue,M.,Sasazuki,S.,Miura,T.et al .,Breast Cancer Res .Treat . 2010;Nakachi,K.,Suemasu,K.,Suga,K.,Takeo,T.et al .,Jpn .J .Cancer Res . 1998,89 ,254-261)。例如，最近已有研究EGCG在人類乳癌形成中扮演之可能之保護角色(Iwasaki,M.,Inoue,M.,Sasazuki,S.,Miura,T.et al. ,Breast Cancer Res. Treat. 2010)。一個大族群(年紀在40至69歲之24226個女性)進行長期研究(10.6年)探討乳癌風險與血漿中茶多酚濃度之關係，包含(-)-表沒食子兒茶酚(EGC)、(-)-表兒茶酚(EC)、EGCG及(-)-表兒茶酚沒食子酸(ECG)。該結果並不支持茶多酚具有保護功效之假設。在本發明指出，在野生型MCF-7細胞中以ECGC預處理可顯著地抑制[³ H]-Nic之結合活性，且進一步顯示，以siRNA剔除之α9-nAChR顯著的抑制[³ H]-Nic結合活性。Si細胞以ECGC預處理，相較於Sc或野生型細胞，可顯著地抑制[³ H]-Nic之結合活性，此外，在EGCG-預處理的細胞中，E2-或Nic-誘發之α9-nAChR蛋白質表現可幾乎完全地被抑制。

本發明建議，以飲食為基礎之保護以抗乳癌可能部份源於飲食中植物化學物質之間，針對特異分子標靶乳癌細胞之協同作用。本發明另提供支持以飲食為基礎以預防及治療乳癌之可行性。重要的是，本發明提供了E2在乳癌細胞中，可特異性地增加α9-nAChR蛋白質之表現量。

以下實施例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

藥理試驗 化學藥品

薑黃素購自E.默克公司(Darmstadt，德國)，厚朴酚(Magnolol)、二苯甲醯基甲烷、EGCG、1-(2-羥苯基)-3-苯基-1,3-丙二酮及1-(2-羥基-5-甲基苯基)-3-苯基-1,3-丙二酮購自Sigma-Aldrich化學公司(Milwaukee,WI,USA)。10 mM之Nic及NNK(Chemsyn,Lenexa,KS,USA)之貯存液係以二次蒸餾水配製。其他用於研究之化學品係依照Pan,M. H.,Huang,M. C.,Wang,Y. J.,Lin,J. K.,Lin,C. H.,J. Agric. Food Chem. 2003,51,3977-3984及Chen,L. C.,Liu,Y. C.,Liang,Y. C.,Ho,Y. S.,Lee,W. S.,J. Agric. Food Chem. 2009之描述,溶於DMSO中。

細胞培養

人類乳腺表皮腺癌細胞(MCF-7、MDA-MB-231、AU-565、MDA-MB-453及BT-483)及正常人類乳腺表皮纖維囊細胞株(MCF-10A及HBL-100)皆購自ATCC(美國菌種保存中心，Manassas，VA，USA)，MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-453皆培養於DMEM中，而BT-483則培養於RPMI-1640中。細胞生長、增生及存活皆以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法測定，於吸光度450 nm下測定甲臢產物。

RNA分離及RT-PCR分析

根據製造商的說明書，利用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)由人類細胞株中抽取全部RNA。α9-nAChR次單位之特異性引子由MB Mission BioTech公司(台北，台灣)合成，其係詳述於先前報導(Chen,C .S .,Lee,C .H .,Hsieh,C .D .,Ho ,C .T .et al .,Breast Cancer Res .Treat .2010;Shih,Y .L .,Liu,H .C .,Chen,C .S .,Hsu,C .H .et al .,J .Agric .Food Chem .2010,58,235-241 )。PCR之擴增產物使用1.2%之瓊脂膠(Amresco,Solon,OH,USA)以溴化乙菲錠染色分析，並測定α9-nAChR之mRNA強度且以β-葡萄糖醛酸苷酶之表現標準化。利用INFINITY-α數位影像系統(Vilber Lourmat,France)拍攝其條帶並利用PhotoCapt Version 11.01軟體分析條帶強度。

蛋白質提取、西方墨點法及抗體

製備蛋白質樣品，細胞先以冰冷之PBS清洗，並在冰上以含有蛋白酶抑制劑之細胞溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl,pH 8.0，120 mM NaCl₂ ，0.5%之乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，100 mM氟化鈉及200 μM之釩酸鈉)溶解細胞，詳述於(Shih,Y .L .,Liu,H .C .,Chen,C .S .,Hsu,C .H .et al .,J .Agric .Food Chem .2010,58,235-241 )。各種樣品之蛋白質(50 μg)溶解於12%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠中,進行西方墨點法之電泳、轉印及分析。抗體皆購自下列廠商：抗-總AKT及蛋白質A/G瓊脂珠購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)；抗-GAPDH及抗α9-nAChR抗體係購自Abcam(Cambridge,UK)；抗-磷酸化AKT(Ser⁴⁷³ )、抗-c-Jun及抗-c-Fos購自(Cell Signaling Technology(Beverly,MA,USA)；鹼性磷酸酶耦合之抗-小鼠及抗-兔IgG之二級抗體購自Santa Cruz Biotechnology；特異之蛋白質複合物係以硝基四氮唑藍基質顯色測定，而5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-磷酸鹽則購自KPL(Gaithersburg,MD,USA)。在各個實驗中，蛋白質係以抗-GAPDH抗體作為探針以作為蛋白質輸入量(loading)之控制組。

軟瓊脂群落試驗

基礎層之培養基係含有0.9%之低凝點SeaPlaque瓊脂膠(Sigma,St. Louis,MO,USA)，詳述於(Shih,Y. L.,Liu,H. C.,Chen,C. S.,Hsu,C. H. et al.,J. Agric. Food Chem. 2010,58,235-241 )。軟瓊脂之培養基含有0.4%之SeaPlaque瓊脂膠，與1 x 10⁴ MCF-7細胞混合後倒入含基礎層之直徑60 mm之培養皿。軟瓊脂培養於37℃並以Leica DMI 4000B顯微鏡成像系統(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)計數出現之群落。

RNA干擾

在乳癌細胞中α9-nAChR之表現至少須以兩個獨立的小干擾RNAs(siRNAs)干擾(Chen,C. S.,Lee,C. H.,Hsieh,C. D.,Ho,C. T. et al.,Breast Cancer Res. Treat. 2010 )。選擇α9-nAChR mRNA之標的序列以抑制α9-nAChR基因表達。各個siRNAs之凌亂(scrambled)序列作為對照組(Chen,C. S.,Lee,C. H.,Hsieh,C. D.,Ho,C. T. et al.,Breast Cancer Res. Treat. 2010 )。經由BLAST分析後，確認與其他人類基因沒有顯著之同源性後，篩選出序列插入以BglII/HindIII消化之pSUPER載體以產生pSUPER-Si α9-nAChR及pSUPER-凌亂載體。所有的構築體皆以DNA序列分析確認，轉染之方法先前已有描述(Chen,C. S.,Lee,C. H.,Hsieh,C. D.,Ho,C. T.et al.,Breast Cancer Res. Treat. 2010;Shih,Y. L.,Liu,H. C.,Chen,C. S.,Hsu,C. H. et al.,J. Agric. Food Chem. 2010,58,235-241 )。簡言之，1.5 x 10⁵ 細胞以PBS清洗兩次後，與0.5 μg質體混合，之後使用吸管型之MP-100微孔電穿儀(microporator，Digital Bio,Seoul,Korea)以固定之電壓1.6 kV給予一個20 ms之脈衝。

製備穩定α9-nAChR剔除細胞株

至少製備三株可穩定表現siRNA之MCF-7細胞株。所有實驗之每個細胞株均使用多個亞群落以得到一致的結果。

製備穩定α9-nAChR剔除細胞株

至少製備三株可穩定表現siRNA之MCF-7細胞株。所有實驗之每個細胞株均使用多個亞群落以得到一致的結果。將pSUPER-Si α9-nAChR及pSUPER-凌亂載體轉染至細胞中，穩定轉染者則以建那酶素(Geneticin,4 mg/mL)處理後72小時候被篩選出來。經過30天培養於選擇性培養基中，分離出兩株建那酶素(G418)-抗性細胞株，稱為pSUPER-Si α9-nAChR。這些細胞株相較於對照組細胞株(pSUPER-scramble)顯示降低480%之mRNA及蛋白質表現水平。

質體構築

所有α9-nAChR啟動子-螢光素酶基因融合皆係於pGL3-Basic載體中(Promega,Madison,WI,USA)透過引入適當之啟動子片斷至螢光素酶基因之多位點接頭上游。這些片段係經由限制酶切割產生並直接選殖至pGL3-Basic，或經次選殖，即先至選殖至pBluescript後轉移至pGL3-Basic。最靠啟動子近端區域之缺失分析係透過適當之限制酶酵素片段或PCR片段兩者之一與合適之正義股(sense)寡核苷酸及可與pGL3-Basic載體下游之轉錄起始點黏合之反義股引子(5'-TATAGAGGCTCAGGAAAAAG-3'(SEQ ID NO:1))來分析。

螢光素酶活性測試

MCF-7細胞接種於6孔盤中。第二天，根據廠商的說明書，利用MP-100微孔電穿儀(Digital Bio)，將含有全長α9-nAChR啟動子之pGL3-Basic質體1.5 μg與RLTK質體(Promega) 0.1 μg過渡性共轉染至細胞中。經過24小時培育後，培養基換為含有10% FBS或含有尼古丁或不含尼古丁之0.1% FBS，24小時後，細胞以一倍之報導溶解緩衝液(Reporter Lysis Buffer(Promega))溶解，並冷凍於-20℃過夜。螢光酶素活性測定係使用HIDEX濾片式多功能微盤分析儀測試50 μL之細胞溶解物及50 μL之螢光酶速檢定試劑(Promega)。同一細胞溶解物相對之螢光素酶單位係利用水母冷光酶標準化，每個螢光素酶檢定試驗皆進行三次。

染色質免疫沉澱試驗

培養細胞之染色質免疫沉澱(ChIP)試驗已詳述於先前之研究中(Chen,C. S.,Lee,C. H.,Hsieh,C. D.,Ho,C. T. et al.,Breast Cancer Res. Treat. 2010;Shih,Y. L.,Liu,H. C.,Chen,C. S.,Hsu,C. H. et al.,J. Agric. Food Chem. 2010,58,235-241)。簡言之，在經過不同方案之Nic處理後，以最終濃度為1%之福馬林在25℃下直接加入細胞培養液中固定細胞15分鐘，以0.125 M甘胺酸終止交連反應5分鐘，將細胞收集至一個新的離心管中。細胞溶解物以超音波震盪10秒三次，使產生許多的約1000 bp大小之DNA片段，並於免疫沉澱反應中使用c-Jun(AP-1)抗體(Santa Cruz Biotechnology)。使用可偵測α9-nAChR啟動子之引子對(前置引子：5'-ATGCAATG CAAGCCTGAGCT-3'(SEQ ID NO:2)及反置引子：5'-TATA-GAGGCTCAGGAAAAAG-3'(SEQ ID NO:3))，以32個循環數擴增-960至-1區域，接著使用瓊脂膠體電泳將PCR產物分離並分析。

[ ³ H]-Nic平衡結合

L-(-)-[N-甲基-³ H]-Nic([³ H]-Nic)(71-75 Ci/mmol)購自Dupont/NEN Research Products(Boston,MA,USA)，游離鹼Nic(純度99%)購自The Eastman Kodak(Rochester,NY,USA)。為了研究單層MCF-7細胞(2 x 10⁶ cells/well)之[³ H]-Nic吸收，細胞先以含有140 mM NaCl、5.4 mM KCl,1.8 mM CaCl₂ 、0.8 mM MgSO₄ 、5 mM葡萄糖及25 mM Hepes/Tris(pH 7.4)之緩衝液濕潤。飽和結合試驗則在6孔盤中，利用介於1至15 nM範圍中至少八種不同濃度之[³ H]-Nic，於37℃下處理2 h。非特異性結合則以添加10nM之Nic測定之。每種濃度之總結合以測定五次評估，空白對照組則測定三次。[³ H]-Nic的吸收藉由抽走該吸收培養液及以冰冷緩衝液清洗每個孔洞3次而中斷。細胞以1 mL之0.5% Triton X-100溶解，而等分之細胞溶解物則轉移至塑膠閃爍計數瓶中，藉由閃爍計數以決定所結合之放射活性。抑制研究則是以加入不同濃度之未標記化合物至吸收培養基中來測試。

統計

所有的數據皆以平均值±SE表示，比較法則利用單因子變異分析(ANOVA)後接著以費雪式(Fisher’s)最小顯著差異法試驗，設定p<0.05為有差異。

實施例1、人類乳癌細胞株中Nic-及E2-誘發之α9-nAChR表現

吸煙及荷爾蒙是與乳癌形成相關之兩個重要致病因素(Daniell,H. W.,breast cancer,and smoking. N. Engl. J. Med. 1980,302,1478)。最近的一篇研究顯示，在MCF-7細胞中α9-nAChR次單元的表現與所觀察到之Nic-誘發增生有極大相關(Chen,C. S.,Lee,C. H.,Hsieh,C. D.,Ho,C. T. et al.,Breast Cancer Res. Treat. 2010 )。為了測試是否尼古丁-誘發細胞增生之訊號係透過誘發α9-nAChR而與荷爾蒙(如E2)交互影響，將MCF-7細胞以不同劑量之Nic、其代謝活性致癌劑化合物NNK及E2處理(圖1A)。結果顯示無論是香煙成分(NNK或Nic)或荷爾蒙(E2)皆可於MCF-7細胞中顯著地誘導α9-nAChR蛋白質的量(圖1A)。為了測試MCF-7細胞中α9-nAChR蛋白質受E2誘發是否為ER狀態特異性，具有ER表現(MCF-7及BT483)或不具ER表現(MDA-MB-231及MDA-MB-453)之人類乳癌細胞以E2(10 nM)處理24小時(圖1B)。相較於ER-(MDA-MB-231及MDA-MB-453)細胞，ER+(MCF-7及BT483)細胞可明顯地偵測到E2-誘發之α9-nAChR蛋白質表現(圖1B)。時程試驗則顯示經6小時Nic處理的MCF-7細胞中，α9-nAChR mRNA及蛋白質顯著的提升(圖1C)。

實施例2、MCF-7細胞中茶多酚(EGCG)阻礙Nic-及E2-誘發之α9-nAChR表現

許多來自於可食用植物之天然酚類化合物已受測試，這些化合物在許多文章中被報導在人類癌症細胞中具有抗增生或誘發細胞凋亡之活性(Pan,M. H.,Huang,M. C.,Wang,Y. J.,Lin,J. K.,Lin,C. H.,J. Agric. Food Chem. 2003,51,3977-3984;Aggarwal,B. B.,Sethi,G.,Ahn,K. S.,Sandur,S. K. et al.,Ann. NYAcad. Sci. 2006,1091,151-169 )。本發明發現Nic-處理之細胞其α9-nAChR mRNA及蛋白質的表現量受到EGCG(1 μM)的向下調控(圖2A及圖2B)，接著再行測試是否EGCG亦可阻礙E2-誘發之α9-nAChR過度表現。MCF-7細胞在存有或不存有EGCG的狀態下受E2處理(圖2B)。為了評估EGCG-誘發向下調節α9-nAChR基因之定量效果，另以即時PCR試驗偵測受EGCG-及Nic-處理之人類乳癌細胞中α9-nAChR mRNA之表現量。該結果顯示受到Nic(10 μM)或E2(10 nM)處理24小時候，α9-nAChR mRNA之表現量顯著的提升(圖2C，左邊及右邊之圖式，柱狀1比2，*p<0.05)。然而，這些效應在EGCG(10 μM)-處理之細胞中完全地減緩(圖2C，左邊及右邊之圖式，柱狀1比2，*p<0.05)，該等結果顯示EGCG減緩Nic-誘發之α9-nAChR細胞生長增殖訊號係因向下調節α9-nAChR mRNA之表現。

實施例3、以EGCG預處理的MCF-7細胞透過抑制AKT信號而減緩Nic-及E2-誘發之α9-nAChR蛋白質表現

先前已有研究顯示，AKT係透過與乳癌細胞增生相關之不同的上游刺激因子磷酸化絲胺酸(Ser⁴⁷³ )或蘇胺酸(Thr³⁰⁸ )而被活化(Liu,Z.,Yu,X.,Shaikh,Z. A.,Toxicol. Appl. Pharmacol. 2008,228,286-294 )。為了測試是否PI3激酶(PI3K)介導的訊號也參與Nic-及E2-誘發之α9-nAChR活化，MCF-7細胞先以PI3K/AKT抑制劑(LY294002,25 μM)或EGCG(10 μM)預處理24小時後，接著再以Nic(10 μM)或E2(10 nM)額外處理24小時。進行免疫墨點法分析，結果顯示經Nic及E2處理可顯著增加p-AKT(Ser⁴⁷³ )的量(圖4A及B，條帶2)，然而，研究顯示Nic-及E2-誘發之α9-nAChR向上調節並不會透過pAKT去活化而顯著地受LY294002抑制(圖3A，條帶4及圖3B，條帶3)。相反地，無論是受到E2或Nic所誘發之α9-nAChR或pAKT蛋白之表現，皆顯著地受到EGCG之抑制(圖3A，條帶6及圖3B，條帶4)，該結果顯示有其他信號蛋白參與了α9-nAChR蛋白質表現之轉錄活化。

實施例4、辨別MCF-7細胞中對於EGCG減緩Nic-及E2-誘發之α9-nAChR蛋白質表現有反應之轉錄因子

為了探討此一假設，將帶有全長人類的α9-nAChR啟動子之1-kb基因片段插入螢光素酶報導基因的上游(圖4A)。具有全長α9-nAChR啟動子之螢光素酶活性與單純載體相比並定義為100%(基準位點)。實驗利用全長構築體顯示MCF-7細胞中，經Nic(10 μM)或E2(10 nM)處理24小時之α9-nAChR啟動子活性顯著被誘發(分別為41.8及2.3倍)(圖4B，*p<0.05)。MCF-7細胞也以EGCG(10 μM)預處理24小時後接著以Nic(或E2)處理額外24小時，結果顯示以EGCG預處理可顯著降低Nic-或E2-誘發之α9-nAChR啟動子螢光素酶活性(圖4B，*p<0.05)。

為了更精確地定義α9-nAChR啟動子受Nic-誘發之轉錄活化之調控元件，進行了一系列5’啟動子缺失構築體次選殖至pGL載體之試驗，將該得到之質體轉染至MCF-7細胞中，α9-nAChR啟動子中之特異反應元件在較小的構築體中淘汰，以pGL3(-44-0)、pGL3(-125-0)及pGL3(-1000-700)構築之啟動子片段保留了Nic-誘發之反應(圖4C)。這些結果顯示Nic-誘發之轉錄因子反應元件係位於AP-2及p53位點(圖4A)。

為確定AP-1或p53轉錄因子是否因Nic處理後直接結合至相關的α9-nAChR啟動子結合位點，在MCF-7細胞中進行ChIP試驗。結果顯示MCF-7細胞在24小時經Nic(10 μM)處理後，偵測到增加的AP-1結合至α9-nAChR啟動子上(圖4D，條帶4)。以EGCG(10 μM，24h)預處理則減緩Nic-誘發之AP-1結合至α9-nAChR啟動子(圖4D，條帶5比4)。有趣地發現到，p53轉錄因子結合至α9-nAChR啟動子(-125至0)不會受到EGCG的影響(圖4D，條帶5比4)。

實施例5、EGCG透過抑制α9-nAChR介導之信號影響Nic-誘發之乳癌細胞增生

為了試驗至α9-nAChR是否可作為人類乳癌細胞中之治療分子標靶，在有或沒有EGCG預處理下，人類乳癌(MCF-7)及正常(MCF-10A)細胞以Nic(10 μM)處理，並計數細胞數目。結果顯示Nic可顯著地刺激乳癌細胞生長，而其增生則受EGCG劑量依賴性的抑制(圖5A，柱狀3比5及柱狀5比9，*p<0.05)。相反地，可觀察到正常乳腺表皮(MCF-10A)細胞無論經Nic或EGCG處理皆不影響細胞數目的改變(圖5A)。為了探究在人類乳腺細胞增生中Nic-誘發α9-nAChR之次單元表現所扮演的角色，建構一其α9-nAChR之表現受RNA干擾所剔除之穩定MCF-7細胞株(Lee,C. H.,Huang,C. S.,Chen,C. S.,Tu,S. H. et al.,J. Natl. Cancer Inst. 2010,in press )(圖5B，柱狀4及5)。野生型MCF-7細胞(C)及含有凌亂載體之控制組細胞(Sc)，在經Nic(10 μM)處理後，細胞增生率顯著地增加(圖5B，柱狀1比2及柱狀1比6)，而EGCG(10 μM，24h)預處理者則反轉了Nic-誘發之細胞增生效應(圖5B，柱狀3比2及柱狀7比6，*p<0.05)。然而，該受Nic-誘發之細胞之生長效應幾乎在受siRNA剔除α9-nAChR之細胞(Sc)中完全減緩(圖5B，柱狀4比2)，有趣的是，與Sc細胞相比，合併處理EGCG可顯著的抑制Nic-處理之α9-nAChR細胞(Si)細胞之增生(圖5B，柱狀5比7，*p<0.05)。

這些結果顯示，受Nic誘發之乳癌細胞增生可透過內源性之α9-nAChR之介導，因此，可阻礙Nic及之α9-nAChR結合之藥劑應可用於阻礙Nic-介導之細胞增生效應。為了證實此假設，MCF-7細胞以[³ H]-Nic處理以測試其配位體-受體結合能力。先前的結果顯示[³ H]-Nic結合之解離常數(Kd)為3 nM，而其於MCF-7細胞中在60分鐘達到最高之結合能力(Lee,C. H.,Huang,C. S.,Chen,C. S.,Tu,S. H. et al.,J. Natl. Cancer Inst. 2010,in press )。偵測不同處理療程之細胞之相對的[³ H]-Nic結合能力：24小時[³ H]-Nic處理(控制組)、[³ H]-Nic+EGCG共處理24小時(共處理組)、EGCG預處理24小時後接著以[³ H]-Nic共處理額外24小時(預處理組)或EGCG預處理24小時後，先清洗再以[³ H]-Nic處理額外24小時(預處理後清洗組)。結果顯示相對的[³ H]-Nic結合能力在EGCG預處理組中顯著受阻礙(圖5C，柱狀1比4，*p<0.05)；相反的，[³ H]-Nic結合能力在EGCG共處理以及預處理後清洗組並未顯著受抑制(圖5C，柱狀3比1或3比5，"p<0.05)。有趣的是，相對於Sc或野生型細胞，以EGCG預處理之Nic-處理之α9-nAChR細胞(Si)細胞可顯著地抑制[³ H]-Nic結合能力(圖5D，柱狀4比2或4比6，"p<0.05)。

實施例6、EGCG對於Nic-誘發之乳癌細胞於軟瓊之上群落形成之效用

先前研究顯示利用軟瓊脂轉化法及異體移植裸鼠動物模型展現了利用無論是香菸煙霧冷凝物或煙草特異性致癌物NNK使非癌性人類乳現表皮(MCF-7)細胞轉化(Mei,J .,Hu,H .,McEntee,M .,Plummer,H .,3rd et al .,Breast Cancer Res .Treat .2003,79,95-105;Siriwardhana,N .,Choudhary,S .,Wang,H .C .,Breast Cancer Res .Treat .2008,109,427-441 )。為了測試Nic-誘發細胞群落形成是否透過其同源受體(α9-nAChR)活性，以軟瓊脂法試驗人類乳癌細胞(MCF-7)。細胞α9-nAChR(Si)以及(Sc)在存在或不存在EGCG的狀態下，以Nic(10 μM)處理(圖6A及B)。比較與Nic處理之細胞該結果顯示EGCG(10 μM)可顯著地抑制轉化細胞群落之形成(圖6B，柱狀2比3，"p<0.05)。有趣的是，與Sc細胞相比，以EGCG預處理可顯著地抑制α9-nAChR(Si)細胞群落形成(圖5D，柱狀4比2或4比6，#p<0.05)。

<110>　台北醫學大學

<120>　茶多酚用於治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之用途

<130>　US1866

<160>　3

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

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<212>　DNA

<213>　人工序列

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圖1顯示人類乳癌細胞中Nic-及E2-誘發之尼古丁受體向上調節。(A) MCF-7細胞以Nic(0.1-10 μM)、NNK(0.1-10 μM)或E2(1-200 nM)處理24小時，α9-nAChR蛋白質表現量以免疫墨點法分析。(B)具有ER表現(MCF-7及BT483)或不具ER表現(MDA-MB-231及MDA-MB-453)之人類乳癌細胞以E2(10 nM)處理24小時，α9-nAChR蛋白質表現量以免疫墨點法分析。(C) MCF-7細胞以Nic(1 μM)處理多次，α9-nAChR mRNA(上方)及蛋白質表現量(下方)分別以以RT-PCR及免疫墨點法測定。使用Roche LightCycler軟體版本4分析α9-nAChR mRNA表現量並以β-葡萄醣醛酸酶的表現量標準化，已詳述於先前研究中(Chen,C .S .,Lee,C .H ., Hsieh,C. D.,Ho,C. T. et al.,Breast Cancer Res. Treat. 2010 )。mRNA及蛋白質表現量改變以光密度測定儀(Bio-1D chemiluminescent imaging system)分析，結果之差距以統計方法計算。顯示的結果為至少三次的獨立試驗。

圖2表示乳癌細胞株中，EGCG可抑制Nic-及E2-誘發之α9-nAChR表現。(A) MCF-7細胞在存有或不存有天然多酚化合物(每個化合物1 μM)的狀態下受Nic(10 μM)處理24小時。α9-nAChR mRNA表現量以RT-PCR分析。(B) MCF-7細胞在存有或不存有EGCG(1-10 μM)的狀態下以Nic(10 μM)或E2(10 nM)處理24小時。α9-nAChR蛋白質表現量以免疫墨點法測定。顯示的結果為至少三次的獨立試驗。(C) MCF-7細胞在存有或不存有EGCG(1-10 μM)的狀態下以Nic(10 μM)處理24小時。α9-nAChR mRNA表現量以RT-PCR分析，結果以三次獨立試驗之mean±SE顯示。p <0.05代表有意義。

圖3顯示EGCG在MCF-7細胞中對於Nic-及E2-誘發之PI3K活性之功效。(A及B)MCF-7細胞以PI3K/AKT抑制劑(LY294002,25 μM)或EGCG(10 μM)預處理24小時，並接著以(A)E2(10 nM)或(B)Nic(10 μM)處理額外24小時，α9-nAChR、磷酸化AKT(p-AKT)及總AKT蛋白以免疫沉澱法分析。

圖4顯示MCF-7細胞中，AP-1介導Nic及E2對α9-nAChR之轉錄調控。(A) α9-nAChR啟動子區域示意圖，圖示了假設之AP1及p53轉錄因子結合位點。(B) MCF-7細胞以帶有全長(-1000至-1)的pGL3(α9-nAChR)及pRL-TK質體過渡轉染24小時，這些細胞以EGCG(10 μM)預處理24小時接著以Nic(10 μM)或E2(10 nM)處理額外24小時。收集細胞溶解物並測定相對螢火蟲螢光素酶活性，相同的細胞溶解物以水母冷光酶標準化。以空白對照(E2之對照為0.1%DMSO，Nic的對照為ddH₂ O)處理之控制組所測得之細胞螢光素酶活性定義為一倍的改變，數據採用配對t -檢定，所有p 值皆為雙邊。以下列方式做比較：將Nic-(或E2-)處理之群組與空白對照、EGCG+E2或EGCG+Nic處理之群組作比較(*p <0.05)。(C) MCF-7細胞以具有不同長度pGL3(α9-nAChR)啟動子及pRL-TK過渡轉染24小時，該轉染細胞以EGCG(10 μM)預處理理24小時接著以Nic(10 μM)處理額外24小時，數據採用配對t -檢定，所有p 值皆為雙邊。以下列方式做比較：將Nic處理之群組與空白對照及EGCG+Nic合併處理之群組作比較(*p <0.05)。(D) MCF-7細胞以Nic(10 μM)處理24小時或同上述方式以EGCG(10 μM)預處理，處理後，收集細胞溶解物，並利用特異抗體將受到AP-1或p53結合之DNA沉澱以進行ChIP。為避免偽陰性的產生，利用對p53特異之抗體進行免疫沉澱試驗。p53蛋白質可被p53特異抗體偵測(右圖)。所得之數據代表具相似結果之三個獨立試驗，由MCF-7中分離出之DNA作為陽性輸入對照組以確保PCR之狀態。

圖5顯示EGCG透過阻礙Nic-結合至α9-nAChR而抑制Nic-誘發之乳癌細胞增生之功效。(A)經EGCG(10 μM，24小時)預處理或未預處理之狀態下，MCF-7及MCF-10細胞以Nic(10 μM，24小時)或單獨空白對照處理，24小時之藥物處理後，以MTT試驗測試細胞生長。(B) MCF-7、α9-nAChR(Si)及(Sc)細胞暴露於EGCG(10 μM)24小時後，接著以Nic(10 μM)處理額外24小時。利用MTT法在指定的時間檢測細胞增生。(C) MCF-7細胞以EGCG(10 μM)預處理24小時，以額外之24小時使用[³ H]-Nic處理暴露於EGCG之細胞(EGCG預處理組)，此外，EGCG處理的細胞以PBS清洗三次，於額外之24小時加入[³ H]-Nic(預處理後清洗組)。細胞以EGCG及[³ H]-Nic兩者處理者則定義為EGCG共處理組。該特異結合活性呈現如下：全結合-非特異結合。(C) α9-nAChR(Si)、(Sc)及野生型MCF-7(C)細胞以EGCG(10 μM)預處理24小時，經EGCG預處理後，細胞接著以[³ H]-Nic處理額外24小時並評估[³ H]-Nic結合活性。數據係以三次獨立試驗之平均值±SE表示。*p <0.05代表有意義。

圖6顯示EGCG抑制Nic-誘發乳癌(MCF-7)細胞於軟瓊脂中群落形成之功效。(A)在存在或不存在EGCG(10 μM)之狀態下，MCF-7細胞以Nic(10 μM)或單獨空白對照處理。培養盤上顯示MCF-7細胞群落之總體形態。這些群落於其形態上展現了微妙的變化，包括與未處理細胞相比，有輕微的解聚集。比例尺為200 μM。(B)軟瓊脂平盤上群落之計數：MCF-7(C)、α9-nAChR(Si)及(Sc)接種於軟瓊脂上並於存在或不存在EGCG之狀態下，以Nic處理。每個平盤上佔1 x 3 cm面積之群落才會被計數。數據係以三次獨立試驗之平均值±SE表示。p <0.05代表有意義。*合併EGCG+Nic處理之群組與Nic-處理之群組有顯著的不同。#在野生型(C)及(Sc)MCF細胞中，合併EGCG+Nic處理之siRNA細胞之群組與EGCG+Nic處理之群組有顯著的不同。

圖7顯示於MCF-7細胞中α9-nAChR啟動子受PI3-K介導之AP-1轉錄活化，及投予Nic至人類MCF-7細胞誘發PI3K活化之示意圖。隨後活化的激酶(如pAKT)誘發AP-1活化，AP-1接著以協同方式移位至細胞核中，並導致其結合到α9-nAChR啟動子之AP-1位點。α9-nAChR蛋白質之表現從而被誘發，導致Nic-誘發致癌訊號擴增因而導致MCF-7之細胞增生。

(無元件符號說明)

Claims (11)

1. 一種萃取自茶之茶多酚之用途，其係用於製備治療及/或預防尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌之製劑；其中該尼古丁或尼古丁衍生化合物或雌激素誘發之乳癌係由因雌激素或尼古丁或尼古丁衍生化合物誘導α9-nAChR蛋白質表現所引起；其中該α9-nAChR之表現係過度表現。
2. 如請求項1之用途，其係用於治療及/或預防吸煙所介導的乳癌形成。
3. 如請求項1之用途，其係用於預防尼古丁或雌激素所誘發之乳癌。
4. 如請求項1之用途，其係提供化學預防能力。
5. 如請求項1之用途，其中該茶多酚可與選自由手術、放射治療、化學治療、細胞毒性藥物及荷爾蒙治療所組成之群之療法合併使用。
6. 如請求項1之用途，其中該藥劑係經注射、經口腔、經直腸、經肺內、經鼻腔或經陰道投予。
7. 如請求項1之用途，其中該藥劑投予至一個體之量係約由500至2500毫克/公斤體重。
8. 如請求項1之用途，其中該治療及/或預防係用於尼古丁誘發之乳癌。
9. 如請求項1之用途，其中該治療及/或預防係用於雌激素誘發之乳癌。
10. 如請求項1之用途，其中該茶多酚可與化學治療、手 術、放射治療及荷爾蒙治療合併使用。
11. 如請求項1之用途，其中該尼古丁衍生化合物係NNN(N'-亞硝基尼古丁)、NNK(4-(甲基硝基胺}-t-(3-砒啶)-1-丁酮)或NNA(4-甲基硝基胺)-4-{3-砒啶)-丁醇)。