JP6298761B2 - クロマトグラフィー装置及びその利用 - Google Patents
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Description
本明細書に開示される、クロマトグラフィー装置は、1又は2以上の標的物質を分離することができる。本クロマトグラフィー装置は、特に限定しないが、薄層クロマトグラフィーなどの分配クロマトグラフィーあるいはアフィニティークロマトグラフィーを実施する装置であることが好ましい。なかでも、アフィニティークロマトグラフィーを実施する装置であることが好ましい。アフィニティークロマトグラフィーは、食品衛生検査、臨床検査、遺伝子検査等の分野において汎用され有用であるからである。
図1に示すように、本クロマトグラフィー装置は固相を備えている。本クロマトグラフィー装置における固相は、移動相を毛細管現象により移動させることできる担体である。こうした担体としては、典型的には液体の浸透性を有する多孔質担体が挙げられる。すなわち、連続孔を形成している多孔質担体が挙げられる。多孔質担体の材料は、分離しようとする標的物質の種類や移動相の種類によって適宜選択される。多孔質担体としては、典型的には、ニトロセルロース、セルロースなどの高分子繊維状体の交絡体、ガラス繊維などの無機繊維状体の交絡体、ポリスチレンやポリビニルなどの多孔質樹脂成形体等が挙げられる。この種の多孔質担体は、アフィニティークロマトグラフィーに好ましく用いられる。
本クロマトグラフィー装置は、図1に示すように、固相に第1の着色領域を備えている。第1の着色領域は、第1の色剤を保持する領域である。第1の着色領域には、その領域全体にわたり、第1の色剤がほぼ均質に、同じ着色程度で保持されていることが好ましい。第1の色剤は、固相表面よりも固相に適用される液体の移動相に分配される色剤である。第1の色剤は、換言すれば、固相に対して付着等により保持されているが、移動相が展開されると固相から分離して移動相とともに展開する色剤である。さらに具体的には、移動相の展開により、固相におけるその着色が低減又は消失可能な色剤である。
本クロマトグラフィー装置は、さらに、1又は2以上のプローブ領域を備えることができる。プローブ領域は、1又は2以上の標識物質とそれぞれ特異的に結合する物質である捕捉用プローブを固相に保持している。本クロマトグラフィー装置がアフィニティークロマトグラフィーを実施するものであるとき、利用しようとするアフィニティーによって標識物質と結合する物質を保持するプローブ領域が備えられる。
本クロマトグラフィー装置は、さらに、第2の着色領域を、備えることもできる。第2の着色領域は、第2の色剤を保持している。第2の着色領域には、その領域全体にわたり、第2の色剤がほぼ均質に、同じ着色程度で保持されていることが好ましい。第2の色剤は、固相に適用される液体の移動相よりも固相の表面に分配される色剤である。第2の色剤は、換言すれば、固相に対して付着等により保持されており、移動相が展開されても固相から分離しないで固相に保持される色剤である。第2の着色領域は、プローブ領域での標的物質と捕捉用プローブとの結合を検出するのを容易にするために、固相に備えるマーカー領域である。
本クロマトグラフィー装置の製造方法は、固相に第1の色剤を供給して第1の着色領域を形成する工程を備える。第1の色剤を固相に供給するには、第1の色剤を含む液体(典型的には第1の色剤溶液)の液滴(典型的には、50〜300plであり、液滴が固相に着弾したときのスポット直径は、0.05〜0.25mmである。)を、公知の方法で所定の平面形態を形成するように固相に供給する。供給方法は、特に限定しないで、公知の印刷技術などを用いることができるが、例えば、ピエゾ方式、サーマル方式等による微小な液滴を吐出する方法が挙げられる。
本明細書の標的物質の検出方法は、本クロマトグラフィー装置を用いる。本検出方法は、1又は2以上の標的物質を含む可能性のある移動相を本クロマトグラフィー装置の固相に供給して移動相を下流方向に展開する工程を備えることができる。本検出方法によれば、容易に移動相の展開位置を確認できるため、より適切により再現性よくクロマトグラフィーを実施できる。また、第1の着色領域を移動相の展開途中に設けることで、展開途中の移動相の展開状況を確認でき、より適切なクロマトグラフィーを実施できる。
メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート(60mm x 600mm)に以下の表に示す塩基配列からなるキャプチャーDNAプローブ溶液を、特開2003−75305号公報に記載されている吐出ユニット(インクジェット法)を用いた日本ガイシ株式会社GENESHOT(登録商標)スポッターを用いて、スポットし、以下の手順で固定化した。
キャプチャーDNAプローブ9種類を以下の表の塩基配列に従って合成し、Tris-EDTA bufferで溶解した水溶液を、SSC緩衝液、ブロモフェノールブルーと混合して、ブロモフェノールブルー0.05wt%、キャプチャーDNAプローブ濃度2μM〜60μMの溶液を調製した。
吐出ユニット内に配置した液体注入部に、キャプチャーDNAプローブ溶液を注入し、メンブレンシートにスポットする前に、検査用のシート上に検査スポットを行った。品質の検査は、検査スポットに対し、スポットが形成されないことはないか、スポットがいびつな形状ではないか、スポット径が設計値から10% 以上ずれていないか、サテライトと呼ばれる本スポット以外の不要なスポットが発生していないか、スポット位置がスポット径の3分の1以上ずれていないかという項目を実施した。キャプチャーDNAプローブ溶液はブロモフェノールブルーによって青色に着色されており、スポットを目視で検査することができる。また、この溶液は、プローブ領域を兼ねる第1の着色領域を形成することができる。
検査スポットで不良が検出されたときは、吐出ユニット内に配置された圧電/電歪素子の駆動信号を調整して検査スポットを再度行う。駆動信号の調整は電圧値、所定電圧までの上昇時間、所定電圧値のキープ時間、電圧立ち下げ時間の変更で行った。それでも不良が検出されるときは、真空吸引することで吐出ユニットからキャプチャーDNAプローブ溶液を抜き取り、液体注入部にキャプチャーDNAプローブ溶液を再度注入して、検査スポットを行う。不良スポットが検出されなくなるまで、この操作を繰り返した。
不良スポットが検出されなくなったことを確認したのち、以下の方法でキャプチャーDNAプローブをメンブレンシートにスポットした。すなわち、1種類のキャプチャーDNAプローブ溶液につき、スポットのピッチを横方向(X方向)、縦方向(Y方向)ともに0.05mmで、横方向、縦方向ともにスポットを行い、横方向300mm、縦方向0.5mmのラインを形成した。メンブレンシート上を吐出ユニットがメンブレンシートの長手方向(X方向)に移動しながら、メンブレンシートがメンブレンシートの短手方向(Y方向)に移動して、非接触でスポットを行った。キャプチャーDNAプローブのスポットが着弾し、スポットが乾燥する前に、隣接するスポットが着弾し、先に着弾したスポットと接触すると、滲みや色むらが発生する恐れがある。そこで、横方向(X方向)に0.1mmのピッチでスポットを行い、続いて先のスポットとスポットの間に0.1mmのピッチでスポットを行い、0.05mmのピッチのラインを形成することで、滲みや色むらを防ぐことができた。
検出するラインの位置の判定を容易にするために、キャプチャーDNAプローブ溶液4ラインごとに、顔料系マゼンダインクを含んだ液体でマーカーのスポットを行い、ライン状の第2の着色領域を形成した。結果的に、シート内に、1.2mmのピッチで9本のプローブ領域を兼ねる第1の着色領域である青色のライン(キャプチャーDNAプローブ)と3本の第2の着色領域であるマゼンダのライン(マーカー)を形成した。
キャプチャーDNAプローブ溶液、マーカーのスポットが完了したのち、50℃で30分間加熱することで、キャプチャーDNAプローブの固定、マーカーの固着を行った。
(手順1)で行う検査と同様の項目で検査を行った。
不良が検出されなかったメンブレンシートについて、吸収パッドを装着して、テープで吸収パッドを固定した後、3.5mm×60mmのストリップに切断し、1シートから85個のストリップを得た。
プローブ番号1の相補配列を有し、アミノ基で修飾したサンプルDNAを、カルボキシル化ラテックス粒子に固定した。ラテックス粒子を滅菌水で分散し移動相とした。
0.2mlマイクロチューブに、移動相50μlを分注し、手順7で作製したストリップの先端を移動相に浸積した(図4(a)参照)。浸漬直後から、移動相が毛細管現象により、ストリップの下流方向に向かって移動した。ブロモフェノールブルーは、メンブレンに固定されていないため、ブルーのプローブ領域を兼ねる第1の着色領域のラインに到達した移動相により洗い流された。洗い流されることで第1の着色領域のラインの色が消失した(図4(b)参照)。移動相が、プローブ領域を兼ねる第1の着色領域のラインの色を消失しながら上昇し、第2の着色領域を除いたラインの色が全て消失した(図4(c)〜図4(e))。第2の着色領域で使用している顔料系マゼンダインクは、メンブレンシートに固着しており、移動相に不溶であるため、移動相で洗い流されなかった(図4(e))。プローブ領域を兼ねる第1の着色領域のブルーのラインの色は、移動相が流れる上流方向から、順番に消失するため、移動相がストリップ内のどこを流れているか容易に確認することができた。
移動相中のサンプルDNAは、メンブレンシートに固定されたキャプチャーDNAプローブと、相補の配列を有しているため、ハイブリダイゼーション反応によって結合する。これにより、サンプルDNAに固定したラテックス粒子が、キャプチャーDNAプローブに捕捉される。
Claims (19)
- 1又は2以上の標的物質を分離するためのクロマトグラフィー装置であって、
固相と、
前記固相表面よりも前記固相に適用される液体の移動相に分配される第1の色剤を前記固相に保持する2以上の第1の着色領域と、
前記固相に適用される前記移動相よりも前記固相表面に分配される第2の色剤を前記固相に保持する1又は2以上の第2の着色領域と、
前記1又は2以上の標的物質とそれぞれ特異的に結合する捕捉用プローブを前記固相に保持する1又は2以上のプローブ領域と、
を備え、
前記2以上の第1の着色領域を前記移動相の移動方向に添って備えており、これらの第1の着色領域は、前記移動相の前記固相に対する展開に伴いその着色程度が低減又は消失するように構成され、
前記1又は2以上の第2の着色領域を、前記移動相の移動方向に沿って、前記2以上の第1の着色領域とは異なる展開位置に、前記1又は2以上のプローブ領域に隣接して備えている、クロマトグラフィー装置。 - 前記第1の色剤は染料である、請求項1に記載のクロマトグラフィー装置。
- 前記第1の色剤は水溶性染料である、請求項1又は2に記載のクロマトグラフィー装置。
- 前記第1の色剤は、ブロモフェノールブルー、アシッドレッド及びキシレンシアノールから選択される1種又は2種以上である、請求項1〜3のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置。
- 前記2以上の第1の着色領域の少なくとも一つを、前記1又は2以上のプローブ領域の少なくとも一つのプローブ領域の範囲内に備える、請求項1〜4のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置。
- 前記2以上の第1の着色領域の少なくとも一つを、前記1又は2以上のプローブ領域の少なくとも一つのプローブ領域の範囲に一致して備える、請求項1〜5のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置。
- 前記2以上の第1の着色領域の全てを、前記1又は2以上のプローブ領域の全てのプローブ領域に一致して備える、請求項1〜6のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置。
- 前記第2の色剤は顔料である、請求項1〜7のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置。
- シート状体である、請求項1〜8のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置を用いる1又は2以上の標的物質の検出方法であって、
前記1又は2以上の標的物質を含む可能性のある前記移動相を前記固相に供給して前記固相を下流方向に展開する工程を備える、検出方法。 - 請求項1〜9のいずれかに記載のクロマトグラフィー装置の製造方法であって、
前記第1の色剤を前記固相に供給して前記第1の着色領域を形成する工程、を備える、製造方法。 - 前記第1の色剤溶液は、前記捕捉用プローブを含む、請求項11に記載の製造方法。
- 前記第1の着色領域の形成工程は、0.01質量%超0.1質量%未満の濃度で含有する第1の色剤溶液を前記固相に供給することにより前記1又は2以上の第1の着色領域を形成する工程である、請求項11又は12に記載の製造方法。
- 前記第1の着色領域の形成工程は、前記移動相の展開幅方向に沿って一定のピッチで前記第1の色剤のスポットを有するスポット列からなるストリーム状の第1の着色サブ領域を、前記移動相の展開方向に沿って一定のピッチで複数個備える前記第1の着色領域を形成することを含み、
前記第1の着色領域の展開方向に沿う少なくとも上下端にそれぞれ対応する前記第1の着色サブ領域を、直前に形成した他の前記第1の着色サブ領域に隣接しない順序でそれぞれ形成する、請求項11〜13のいずれかに記載の製造方法。 - 前記第1の着色領域の形成工程は、2つ目以降の少なくとも一つの第1の着色サブ領域を、直前に形成した他の前記第1の着色サブ領域に隣接しない順序で形成する、請求項14に記載の製造方法。
- 前記第1の着色領域の形成工程は、前記第1の色剤の液滴を直前に形成した他のスポットに隣接しない順序で吐出してスポットを形成して第1の着色サブ領域を形成することを含む、請求項14又は15に記載の製造方法。
- さらに、前記第2の着色領域の形成工程は、前記移動相の展開幅方向に沿って一定のピッチで前記第2の色剤のスポットを有するスポット列からなるストリーム状の第2の着色サブ領域を、前記移動相の展開方向に沿って一定のピッチで複数個備える前記第2の着色領域を形成することを含み、
前記第2の着色領域の展開方向に沿う少なくとも上下端にそれぞれ対応する前記第2の着色サブ領域を、直前に形成した他の前記第2の着色サブ領域に隣接しない順序でそれぞれ形成する、請求項11〜16のいずれかに記載の製造方法。 - 前記第2の着色領域の形成工程は、2つ目以降の少なくとも一つの第2の着色サブ領域を、直前に形成した他の前記第2の着色サブ領域に隣接しない順序で形成する、請求項17に記載の製造方法。
- 前記第2の着色領域の形成工程は、前記第2の色剤の液滴を直前に形成した他のスポットに隣接しない順序で吐出してスポットを形成して第2の着色サブ領域を形成することを含む、請求項17又は18に記載の製造方法。
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