JP5919117B2 - 核酸クロマトグラフィー検査具およびその製造方法 - Google Patents
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Description
図1Aは、本願の第1発明の核酸クロマトグラフィー検査具の一実施形態を示す正面図である。図1Bは、図1Aに示されている白抜き矢印VLの方向(側方)から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具1aの側面図である。本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具1aは、細長形状の多孔性シート10と、バッキング部材20とを備えている。さらに、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具1aでは、吸収パッド40を備えている。
図4Aは、本願の第2発明の核酸クロマトグラフィー検査具の一実施形態を示す正面図である。図4Bは、図4Aに示されている白抜き矢印VLの方向(側方)から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具101aの側面図である。本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具101aは、細長形状の多孔性シート110と、バッキング部材120とを備えている。さらに、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具101aでは、吸収パッド140を備えている。
まず、第1の発明に関する実施例1,2および比較例1について説明する。
メルクミリポア製Hi−Flow Plus メンブレンシート(以下、「多孔性シート」と称する)(45mm×300mm)をメルクミリポア製ラミネート加工メンブレンカード(以下、「バッキング部材」と称する)(60mm×300mm)に貼り付けて、複合シートを作製した。続いて、下記の手順1〜7に従い、複合シートの多孔性シートの表面に、表1に示す塩基配列からなるキャプチャーDNAプローブ溶液を、日本ガイシ株式会社製GENESHOT(登録商標)スポッターを用いてスポットし、キャプチャーDNAプローブを多孔性シートの表面に固定化し、次いで、複合シートを細長形状に切断する加工を行うことにより、核酸クロマトグラフィー検査具のストリップを得た。なお、GENESHOT(登録商標)スポッターは、特開2003−75305号公報に記載されている吐出ユニット(インクジェット法)を用いた装置である。
9種類のキャプチャーDNAプローブを表1の塩基配列に従って合成し、これらのキャプチャーDNAプローブをTris−EDTA bufferで溶解した水溶液を、SSC緩衝液およびブロモフェノールブルーと混合して、ブロモフェノールブルー0.05wt%、キャプチャーDNAプローブ濃度2〜60μMの溶液を調製した。
複合シートの多孔性シートの表面にキャプチャーDNA溶液をスポットするのに先立ち、検査用のシート上に検査スポットを行うことにより、スポット条件の検討を行った。具体的には、GENESHOT(登録商標)スポッターの吐出ユニット内に配置した液体注入部に、キャプチャーDNAプローブ溶液を注入し、吐出ユニットから検査用シートに向けてキャプチャーDNAプローブ溶液を吐出して検査用のシート上に検査スポットを行った。品質の検査は、検査用シートに対して、(i)スポットが形成されないことはないか、(ii)スポットがいびつな形状ではないか、(iii)スポット径が設計値から10%以上ずれていないか、(iv)不要なスポット(一般に「サテライト」と称されているスポット)が発生していないか、(v)スポット位置がスポット径の3分の1以上ずれていないか、という5項目について実施した。キャプチャーDNAプローブ溶液はブロモフェノールブルーによって青色に着色されているので、上記(i)〜(v)の項目については検査用のシート上のスポットを目視で観察することにより検査可能であった。
上述の手順2の条件検討後、下記のスポット方法1〜3のいずれかの方法にてスポットを行うことにより、スポット形状が楕円形状であり、その長手方向が多孔性シートの長手方向に平行である表示部(実施例1)、スポット形状が楕円形状であり、その長手方向が多孔性シートの短手方向に平行である表示部(実施例2)、スポット形状が真円形状である表示部(比較例1)をそれぞれ有する核酸クロマトグラフィー検査具を作製した。
不良スポットが検出されなくなったことを確認した後、以下の方法でキャプチャーDNAプローブを、複合シートの多孔性シートの表面にスポットした。本スポット方法1では、吐出ユニットを、多孔性シートの長手方向[完成品の「長手方向Y」に対応]に対して、30°垂線側に傾けた角度(垂線に対する傾斜角度:60°)から多孔性シート上に液滴を吐出するように配置して、全てのスポットを行った。
吐出ユニットを、多孔性シートの短手方向[完成品の「幅方向X」に対応]に対して30°垂線側に傾けた角度(垂線に対する傾斜角度:60°)から多孔性シート上に液滴を吐出するように配置して、全てのスポットを行ったこと以外は、上述のスポット方法1と同様の方法によりラインを形成した。なお、スポットのピッチは、横方向[完成品の「幅方向X」に対応]に0.08mm、縦方向[完成品の「長手方向Y」に対応]に0.04mmとし、着弾した後のスポット形状は、長径(幅方向X)が0.14mm、短径(長手方向Y)が0.06mmの楕円形状であった。また、横方向[完成品の「幅方向X」に対応]に0.08mmのピッチでスポットを形成するために、まず、横方向[完成品の「幅方向X」に対応]に0.16mmのピッチで前半のスポットを行い、続いて前半のスポットで形成されたスポットとスポットとの隙間にキャプチャーDNAプローブのスポットを着弾させる態様で、0.16mmのピッチにて後半のスポットを行った。
吐出ユニットを、多孔性シートの垂線方向から液滴を多孔性シート上に吐出するように配置して、全てのスポットを行ったこと以外は、上述のスポット方法1と同様の方法によりラインを形成した。なお、スポットのピッチは、横方向[完成品の「幅方向X」に対応]、縦方向[完成品の「長手方向Y」に対応]ともに0.05mmとし、着弾した後のスポット形状は、直径が0.07〜0.1mmの真円であった。また、横方向[完成品の「幅方向X」に対応]に0.05mmのピッチでスポットを形成するために、まず、横方向[完成品の「幅方向X」に対応]に0.1mmのピッチで前半のスポットを行い、続いて前半のスポットで形成されたスポットとスポットとの隙間にキャプチャーDNAプローブのスポットを着弾させる態様で、0.1mmのピッチにて後半のスポットを行った。
上述のスポット方法1〜3において形成する表示部の位置の判定を容易にするために、顔料系マゼンタインクを含んだ液体をスポットすることにより、位置マーカーのラインを形成した。なお、位置マーカーのラインは、上述のスポット方法1〜3のキャプチャーDNAプローブ溶液のスポットと、それぞれ同様の方法でスポットを行うことにより形成した。その結果、図8(a)に示すように、9本のキャプチャーDNAプローブのライン[ブロモフェノールブルー(BPB)で着色]と、3本の位置マーカーのライン(顔料系マゼンタインクで着色)とがストライプ状に配置された複合シートを得た。
手順4を経てキャプチャーDNAプローブのライン、位置マーカーのラインの形成が完了したのち、複合シートを50℃で30分間加熱することにより、キャプチャーDNAプローブを多孔性シートの表面に固定し、位置マーカーの顔料系マゼンタインクを多孔性シートの表面に固着した。
上述の手順2で行った検査と同様の項目[(i)〜(v)]に関して、複合シートの多孔性シートに対して検査を行った。
メルクミリポア製吸収パッド(20mm×300mm)を、多孔性シートに5mm程度被るように装着した。吸収パッドを固定するために、粘着テープ(25mm×300mm)を吸収パッドの上面部に貼った。続いて、この複合シートについて裁断機もしくはギロチン式のカッターを用いて切断を行い、幅3.5mm、長さ60mmのストリップ(核酸クロマトグラフィー検査具)を85個得た。
実施例1,2、参考例1〜7、比較例1,2の核酸クロマトグラフィー検査具のストリップについて、下記の手順8〜10に従った、クロマトグラフィー法により評価を行った。
プローブ番号1の塩基配列に相補的な塩基配列を有するサンプルDNA(なお、アミノ基で修飾)を、カルボキシル化ラテックス粒子(色:青色、平均粒子径:400nm)に固定した。このサンプルDNAを固定したラテックス粒子を滅菌水で分散し、移動相とした。
0.2mlマイクロチューブに、移動相50μlを分注し、核酸クロマトグラフィー検査具のストリップの先端を移動相に浸積した。浸漬直後から、移動相が毛細管現象により、多孔性シート内を上方(吸収パッドが設けられているもう一方の先端の方向)に向かって移動した[図8(a)〜8(d)を参照]。ブロモフェノールブルー(BPB)は、多孔性シートに固定されていないため、移動相により洗い流された。こうして洗い流されることで、ブロモフェノールブルーによるラインは消失した[図8(a)〜8(d)中、焼失したラインの位置を星印(*)で示す]。こうして移動相が上方に移動していくにつれて、ブロモフェノールブルーによる9本のラインが順次消失していくので、移動相が多孔性シート内のどこの位置まで到達しているのかを容易に確認することが可能であった。なお、位置マーカーの顔料系マゼンタインクは、メンブレンシート(多孔性シート)に固着しており、移動相に不溶であるため、移動相によって洗い流されなかった。
移動相中のサンプルDNAは、プローブ番号1のキャプチャーDNAプローブと相補的な塩基配列を有しているため、ハイブリダイゼーション反応によって、プローブ番号1のキャプチャーDNAプローブに特異的に結合する。これにより、サンプルDNAを固定したラテックス粒子が、プローブ番号1のキャプチャーDNAプローブに捕捉される。プローブ番号1のキャプチャーDNAプローブが固定されている表示部では、サンプルDNAとプローブ番号1のキャプチャーDNAプローブとのハイブリダイゼーション反応の進行に伴い、ラテックス粒子が蓄積、凝集し、発色した[図8(d)を参照]。移動相への浸漬から約20分で、移動相がすべて吸収パッドに移動して反応が終了した。以上の手順9、手順10で述べたように、ブルーのラインの色が移動相の展開(上昇)とともに一旦消失した後[図8(c)を参照]、プローブ番号1の表示部がラテックス粒子の蓄積、凝集により発色した[図8(d)を参照]。
次に、第2の発明に関する参考例1〜7、および比較例2〜5について説明する。
表2に示されているように、参考例1〜4、比較例3のように、ストリップ幅が2mm以上の場合には、検出ラインを容易に確認することができた[評価結果:良、表2中では丸印(○)で表示]。一方、比較例2のように、ストリップ幅が2mm未満の場合には、ストリップ幅と厚さの差が小さくなってしまうため、検出ラインを確認するのが困難となる場合があった[評価結果:不可、表2中ではクロス印(×)で表示]。
表2に示されているように、参考例1〜4、比較例2のように、ストリップ幅が5mm以下の場合には、移動相が均等に展開し、まだら模様となっていない明瞭な検出ラインが確認できた[評価結果:良、表2中では丸印(○)で表示]。一方、比較例3のように、ストリップ幅が5mm超の場合には、移動相が均等に展開せず、まだら模様の検出ラインとなった。即ち、検出ラインの内部で発色の濃淡が認められた[評価結果:不可、表2中ではクロス印(×)で表示]。
表3に示されているように、参考例5〜7のように、L2/L1が0.2〜2の範囲にある場合には、プローブ番号1のラインとプローブ番号2のラインが発色していることが容易に確認でき[評価結果:良、表3中では丸印(○)で表示]、同時検出時の視認性に優れたストリップであることが確認できた。比較例4のように、L2/L1が0.2未満である場合、プローブ番号1のラインとプローブ番号2のラインが1本のラインであるように見えるため、2本のラインが発色したことを確認することが困難であった。また、比較例5のように、L2/L1が2超である場合には、プローブ番号1のラインとプローブ番号2のラインとの間に発色していない1本のラインが存在するのか否か、即ち、2本のラインが連続して発色しているのか否かの判定が困難であった[評価結果:不可、表3中ではクロス印(×)で表示]。
Claims (14)
- 標的核酸を含む試料液体を展開し、前記標的核酸を検出して表示するための細長形状の多孔性シートと、
前記多孔性シートが貼り付けられたバッキング部材と、を備え、
前記多孔性シートは、表面に、前記多孔性シートの長手方向と交わる角度に延びる帯状の表示部を有し、
前記表示部は、前記標的核酸を捕獲するための核酸プローブが固定された複数の楕円形状のスポットの集合体により形成されるものであり、前記集合体は前記スポットの複数の列によって形成され、複数の前記スポットの前記楕円形状の長軸方向が互いに平行であり、前記表示部の輪郭部分が微細な凹凸形状を有する、核酸クロマトグラフィー検査具。 - 複数の前記スポットは、前記多孔性シートの長手方向および短手方向のそれぞれにおいて、前記スポットの重心が整列しているとともに、前記スポット同士が、少なくとも一部において重なっている請求項1に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
- 前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの長手方向と平行である請求項1または2に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
- 前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの短手方向と平行である請求項1または2に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
- 前記多孔性シートが繊維状の材料からなり、
前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの繊維の目の方向と平行である請求項1または2に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。 - 前記楕円形状の短径に対する長径の比が、1.1〜3.5である請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法であって、
前記核酸プローブを含有する複数の液滴を、前記多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させて吐出することにより、前記液滴が前記多孔性シート上に着滴して形成される複数の楕円形状のスポットであり、隣り合う前記スポット同士が少なくとも一部において重なっているスポットの集合体を形成する吐出工程と、
前記楕円形状のスポットを乾燥して、前記核酸プローブを前記多孔性シートの表面に固定させる乾燥工程と、を含む核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。 - 前記吐出工程において、前記液滴を吐出するための吐出ユニットを、前記多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させた状態で、前記液滴を吐出する請求項7に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
- 前記吐出ユニットを、前記多孔性シートの長手方向に傾斜させる請求項7または8に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
- 前記吐出ユニットを、前記多孔性シートの短手方向に傾斜させる請求項7または8に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
- 前記吐出工程において、前記吐出ユニットを、前記表示部の長手方向に移動させながら、前記液滴を吐出する請求項7〜10のいずれか1項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
- 前記吐出工程において、1つのスポットが乾燥した後に、当該スポットに隣接するスポットを形成するための液滴を吐出する請求項7〜11のいずれか1項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
- 前記スポット1つ分以上の間隔を隔てて1列のスポットを形成した後、当該列に形成された2つの隣接するスポットの間に、更に液滴を吐出してスポットを形成する請求項12に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
- 第1の列を形成した後、1列以上の間隔を隔てて第2の列を形成し、その後、前記第1の列と、前記第2の列との間に、更に第3の列を形成する請求項12または13に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
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