JP6296533B2 - システイン及びシスチンの定量方法 - Google Patents

Description

本発明はシステイン及びシスチンの定量方法及び定量試薬キットに関する。

生体中の蛋白質を構成する硫黄含有アミノ酸として、メチオニン、システイン、シスチンが知られている。これらは、生体内において、一連の代謝サイクルの中で恒常性を維持している。例えば、メチオニンは、通常、生体内でシステインに代謝されており、この代謝過程で中間体として生成するホモシステインは、セリンとの縮合によるシスタチオニンの形成後、システインに導かれる。

この中でもシステインは、含硫アミノ酸の代謝障害や、酸化還元関連疾患の原因を把握する指標候補として注目されており、生体内例えば血中内の濃度測定は重要である。

しかしながら、システインは、チオール基を有するため、システインが存在する系の酸化還元反応によってこのチオール基が酸化してシスチンが生成する。そのため、システイン及びシスチンの各々の生体内含有量を正確に定量することは困難であった。

上記課題に対して、システイン及びシスチンの各々の含有量を正確に定量できる定量方法を提供することを目的とする。

システイン及びシスチンを含む試料にメチルチオ化剤を添加する、第１工程と、
前記第１工程によってメチルチオ化したシステインと、前記シスチンとを、誘導体化剤により誘導体化する、第２工程と、
前記第２工程後のシステイン誘導体及びシスチン誘導体を、光学異性体を区別して分析して、前記システイン及び前記シスチンの各々を、光学異性体を区別して定量する、第３工程と、
を有するシステイン及びシスチンの定量方法が提供される。

本発明の一実施形態によれば、システイン及びシスチンの各々の含有量を正確に定量できる定量方法を提供できる。

本実施形態に係る定量方法の一例のフロー図である。 システインとシスチンとの間の平衡状態を説明するための概略図である。 システインのメチルチオ化を説明するための概略図である。 逆相分離におけるＨＰＬＣ／ＦＬ分析の結果の一例である。 光学分割におけるＨＰＬＣ／ＦＬ分析の結果の一例である。 光学分割におけるＨＰＬＣ／ＭＳ分析の結果の一例である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明者らは、例えばカラムクロマトグラフィ法を用いた、より好ましくは高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法を利用したシステイン及びシスチンの分析において、メチルチオ化剤を用いてシステインをメチルチオ化し、得られたＳ−（メチルチオ）システイン及びシスチンを、誘導体化剤を用いて誘導体化して分析に供することで、システイン及びシスチンの各々を定量分析できることを見出した。また、この分析においては、システイン及びシスチンの光学分割も可能であり、本実施形態に係る定量方法は、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、Ｌ−シスチン及びＤ−シスチンの各々の定量分析が可能であることを見出した。

（定量方法）
次に、本実施形態に係るシステイン及びシスチンの定量方法について、詳細に説明する。図１に、本実施形態に係る定量方法の一例のフロー図を示す。

本実施形態に係る定量方法は、
システイン及びシスチンを含む試料にメチルチオ化剤を添加する、第１工程（Ｓ１００）と、
前記第１工程によってメチルチオ化した前記システインと、前記シスチンとを、誘導体化剤により誘導体化する、第２工程（Ｓ１１０）と、
前記第２工程後のシステイン誘導体及びシスチン誘導体を分析する、第３工程（Ｓ１２０）と、
を有する。

各々の工程について、下記に詳細に説明する。

図２に、システインとシスチンとの間の平衡状態を説明するための概略図を示す。２分子のシステインは酸化されることによってチオール基同士が結合してシスチンが生成する。また、シスチンは、還元されることによってシステインへと変化する。即ち、システイン及びシスチンは、酸化還元状態によって、系内の各々の含有量に変化が生じる。生体内と比較して、生体外では酸素ポテンシャルが高い状態にあるため、生体内でのシステイン及びシスチンの含有量を正確に知ることは困難であった。

しかしながら、本実施形態の定量方法は、システイン及びシスチンを含む試料にメチルチオ化剤を添加するＳ１００の第１工程を有する。この際、メチルチオ化剤としては、例えばメタンチオスルホン酸Ｓ−メチル（以下、ＭＭＴＳ）を使用することができる。

図３に、システインのメチルチオ化を説明するための概略図を示す。

図３に示すように、第１工程により、システインは、即座に、具体的には数秒程度でアルキル化され、Ｓ−（メチルチオ）システインが生成する。また、この反応により、分子内のチオール基がブロックされるため、酸化還元電位の変化によるシスチンの生成が停止する。

次に、Ｓ１１０の第２工程では、Ｓ−（メチルチオ）システイン及びシスチンを、誘導体化剤により誘導体化する。本実施形態においては、誘導体化剤として、４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジ アゾール（以下、ＮＢＤ−Ｆ）を使用した。

ＮＢＤ−Ｆは、一般的に、第１、第２アミン及びアミノ酸等の蛍光誘導体化に使用される、ＨＰＬＣ用誘導体化試薬として知られている。アミノ酸を温和な条件で誘導体化することができ、また、誘導体化後の試薬は、安定性が高く、経時変化による試料の感度が低下しないため、好ましく使用される。

そして、次の第３工程では、ＮＢＤ−Ｆによって誘導体化されたアミノ酸誘導体を、ＨＰＬＣ分析に供することによって、元の試料中のシステイン及びシスチンの各々の含有量を定量することができる。

本実施形態においては、逆相カラム及び光学分割カラムを連結した２次元液体クロマトグラフィ装置を使用して分離し、蛍光検出器又は質量分析計で検出することで、分析を行った。

次に、具体的な実施形態を説明することにより、本発明をより詳細に説明する。

（第１の実施形態）
本実施形態の定量方法により、システイン及びシスチンの各々の含有量を正確に定量できることを確認した実施形態について、説明する。

システイン及びシスチンを含む１００ｍＭの塩酸溶液１０μＬに、４００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）を１５μＬ添加し、更に、１．５ｍＭの濃度のＭＭＴＳ溶液（溶媒：アセトニトリル）を５μＬ添加した。得られた溶液を２５℃で１０分間静置することで、システインをメチルチオ化した。

次に、この溶液に、４０ｍＭの濃度のＮＢＤ−Ｆ溶液（溶媒：アセトニトリル）を５μＬ添加し、６０℃で２分間加熱することで、Ｓ−（メチルチオ）システイン及びシスチンを蛍光誘導体化した。

２％トリフルオロ酢酸水溶液を５０μＬ添加して反応を停止させた後、純水を４１５μＬ添加し、反応溶液５μＬを直接ＨＰＬＣ装置に注入した。なお、分離した試料は、蛍光検出器により検出した。蛍光検出器の測定波長は、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍとした。

また、比較の実施形態として、ＭＭＴＳを添加しない以外は同様の方法で試料を調製し、ＨＰＬＣ分析に供した。

ＨＰＬＣ分析の分析条件としては、
逆相分離：
カラム：ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ＯＤＳ ｃｏｌｕｍｎ（０．５３ｍｍ ｉ.ｄ.×１０００ｍｍ）、
流速：２５μＬ／ｍｉｎ、
温度：４５℃、
移動相：アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸を含む水溶液、
とし、
光学分割：
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−２５００Ｓ（１．５ｍｍ ｉ.ｄ.×２５０ｍｍ）、
流速：２００μＬ／ｍｉｎ、
温度：２５℃、
移動相：ギ酸を含むメタノール及びアセトニトリルの混合溶液、
とした。

図４に、逆相分離におけるＨＰＬＣ／ＦＬ分析の結果の一例を示す。図４における横軸は溶出時間であり、縦軸は蛍光強度である。また、図４（ａ）は、本実施形態に係るＭＭＴＳを添加した場合の結果の一例であり、図４（ｂ）は、ＭＭＴＳを添加していない場合の結果の一例である。

システイン及びシスチンの平衡状態に関して、一般的な生体外の酸化還元電位においては、シスチンが生成する方向に平衡が傾き、図４（ｂ）に示されるシステインとシスチンのピーク強度が変化する。

しかしながら、本実施形態の定量方法では、ＭＭＴＳを添加しているため、システインが予めＳ−（メチルチオ）システインに変化している。そのため、Ｓ−（メチルチオ）システイン及びシスチン由来の蛍光ピークが試料採取後の影響を受けず生体中の状況を反映した形で測定できる。

図５に、光学分割におけるＨＰＬＣ／ＦＬ分析の結果の一例を示す。図５（ａ）は、Ｓ−（メチルチオ）システインに関する結果であり、図５（ｂ）はシスチンに関する結果である。図５における横軸は溶出時間であり、縦軸は蛍光強度である。

図５（ａ）及び図５（ｂ）に示すように、本実施形態に係る定量方法は、Ｓ−（メチルチオ）システイン及びシスチン由来のピークに関して、Ｄ体及びＬ体を光学的に区別して定量することができる。即ち、本実施形態に係る定量方法は、システイン及びシスチンの各々の含有量を、Ｄ体及びＬ体を区別して正確に定量できる方法であることがわかった。

（第２の実施形態）
次に、本実施形態に係る定量方法が、蛍光検出以外の検出方法でも実施可能であることを確認した実施形態について、説明する。

ＨＰＬＣ装置によって分離した試料を、タンデム型質量分析計により検出した以外は、第１の実施形態と同様の方法により定量を行った。質量分析については質量電荷比（Ｍ／Ｚ） ３３１のプリカーサイオンから生成するＭ／Ｚ ２８３のプロダクトイオンを質量分析した。

図６に、光学分割におけるＨＰＬＣ／ＭＳ分析の結果の一例を示す。図６は、Ｓ−（メチルチオ）システインに関する結果であり、横軸は溶出時間であり、縦軸はイオン強度である。

図６に示すように、本実施形態に係る定量方法は、質量分析計による検出方法でも、システイン及びシスチンの各々の含有量を、Ｄ体及びＬ体を区別して正確に定量できる方法であることがわかった。

Claims (5)

1. システイン及びシスチンを含む試料にメチルチオ化剤を添加する、第１工程と、
   前記第１工程によってメチルチオ化したシステインと、前記シスチンとを、誘導体化剤により誘導体化する、第２工程と、
   前記第２工程後のシステイン誘導体及びシスチン誘導体を、光学異性体を区別して分析して、前記システイン及び前記シスチンの各々を、光学異性体を区別して定量する、第３工程と、
   を有するシステイン及びシスチンの定量方法。
2. 前記メチルチオ化剤は、メタンチオスルホン酸Ｓ−メチルを含む、
   請求項１に記載の定量方法。
3. 前記誘導体化剤は、４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジ アゾールを含む、
   請求項１又は２に記載の定量方法。
4. 前記第３工程は、蛍光検出液体クロマトグラフ装置を使用して、各々の前記誘導体を検出する工程を含む、
   請求項１乃至３のいずれか一項に記載の定量方法。
5. 前記第３工程は、液体クロマトグラフ／質量分析装置を使用して、各々の前記誘導体を検出する工程を含む、
   請求項１乃至３のいずれか一項に記載の定量方法。

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