WO2021060517A1 - 有機物質の誘導体の製造方法、及び有機物質を含む試料の分析方法 - Google Patents

有機物質の誘導体の製造方法、及び有機物質を含む試料の分析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021060517A1
WO2021060517A1 PCT/JP2020/036408 JP2020036408W WO2021060517A1 WO 2021060517 A1 WO2021060517 A1 WO 2021060517A1 JP 2020036408 W JP2020036408 W JP 2020036408W WO 2021060517 A1 WO2021060517 A1 WO 2021060517A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
organic substance
group
derivative
solution
sample
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/036408
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真志 原田
Original Assignee
味の素株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 味の素株式会社 filed Critical 味の素株式会社
Priority to KR1020227009967A priority Critical patent/KR20220069949A/ko
Priority to JP2021548452A priority patent/JPWO2021060517A1/ja
Publication of WO2021060517A1 publication Critical patent/WO2021060517A1/ja
Priority to US17/700,721 priority patent/US20220267264A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/14—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides
    • C07C319/18—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides by addition of thiols to unsaturated compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/416—2,5-Pyrrolidine-diones with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to other ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C315/00—Preparation of sulfones; Preparation of sulfoxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/14—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides
    • C07C319/20—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides by reactions not involving the formation of sulfide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/57—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C323/58—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups with amino groups bound to the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/40—Esters thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8818—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a derivative of an organic substance and a method for analyzing a sample containing an organic substance.
  • Thiols play an important role in the body. For example, it plays a role of maintaining a redox state in a living body, controlling protein functions, and detoxifying foreign substances such as heavy metals. Therefore, attempts to analyze thiols in samples such as biological samples have been made conventionally. For example, there is a technique for analyzing a thiol by an electrochemical detector using an oxidation-reduction reaction on the electrode surface (Non-Patent Documents 1 and 2). Attempts have also been made to convert thiols into derivatives and analyze them (Non-Patent Documents 3 to 8). As a reaction of thiol, a reaction with a carbon-carbon double bond is known (Non-Patent Documents 9 and 10).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 since the thiol is analyzed without derivatization, the thiol is easily oxidized by the dissolved oxygen of the sample or the eluent used for the analysis, and stable analysis results can be obtained. Hateful. Also, the electrochemical detector is not sufficiently selective for thiols, and when measuring samples with amino acids, sugars and other complex contaminants, the contaminants can interfere with the measurement. Further, the electrochemical detector requires maintenance such as cleaning of electrodes, and the detection sensitivity easily fluctuates with use, which makes it unstable and difficult to handle.
  • Non-Patent Documents 3 to 6 thiol derivatization is performed under neutral to basic conditions.
  • the present inventor has found that it is difficult to analyze a thiol under neutral to basic conditions because the oxidation reaction of the thiol and the exchange reaction between the thiol and the disulfide compound easily proceed. Therefore, accurate analysis of thiols may be difficult with the techniques of Non-Patent Documents 3 to 6 that derivatize thiols under neutral to basic conditions.
  • Non-Patent Documents 7 and 8 thiols are derivatized under acidic conditions (pH 3.5), but the reactivity is poor and special conditions such as long-term reaction or microwave application are required. ..
  • the present inventor has made an organic substance obtained by reacting a specific olefin compound with an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino under acidic conditions.
  • the derivative of the substance is useful for the analysis of an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, and have completed the present invention.
  • the prior art is to (a) react a particular olefin compound with an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino under acidic conditions, and (b) Neither teaching nor suggesting that the derivative of the organic substance obtained by such a reaction is useful for the analysis of an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino. ..
  • the present invention provides the following.
  • the olefin compound is a method for producing a derivative of an organic substance, which comprises an ethylene structure having at least two electron attracting groups (excluding halogen atoms).
  • the method for producing a derivative according to [1] wherein the ethylene structure has two electron attracting groups.
  • EWG 1 and EWG 2 each independently represent an electron attracting group, and may form a ring together with the carbon atom to which they are bonded.
  • R 7 here, R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a monovalent hydrocarbon group or a monovalent heterocyclic group, which may have a substituent.
  • R 5 , R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group, or a monovalent heterocyclic group, which may have substituents, [1 ] To [5], the method for producing a derivative according to any one of the following items. [7] The method for producing a derivative according to any one of [1] to [6], wherein the acidic condition is less than pH 6.0.
  • [8] A peptide in which the organic substance contains cysteine, reduced glutathione, ⁇ -glutamylcysteine, cystenylglycine, homocysteine, N-acetylcysteine, persulfide cysteine, hypotaurine, persulfide glutathione, and a cysteine residue.
  • the organic substance further contains an amino group and contains Any of [1] to [8], which comprises reacting the organic substance with the olefin compound under acidic conditions and then further reacting with the olefin compound under neutral or basic conditions to obtain a derivative of the organic substance.
  • the method for producing a derivative according to item 1. [10] (1) A sample containing an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, and An olefin compound containing an ethylene structure having at least two electron attracting groups (excluding halogen atoms).
  • a sample containing an organic substance which comprises mixing under acidic conditions to obtain a treated sample containing the derivative of the organic substance, and (2) analyzing the derivative of the organic substance in the treated sample. Analysis method.
  • the analysis in the step (2) is (2a) Separation of the derivative of the organic substance from the treated sample.
  • (2b) Detecting the separated derivative of the organic substance The method for analyzing a sample containing an organic substance according to [10].
  • [12] The method for analyzing a sample containing an organic substance according to [10] or [11], wherein the sample further contains a disulfide compound.
  • Step (1) is (1') The sample and the olefin compound are mixed under acidic conditions and then further mixed under neutral or basic conditions to obtain a treated sample containing a derivative of the organic substance.
  • a novel derivative of an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl (-SH), seranyl (-SeH), and sulfino (-S ( O) -OH).
  • Production method A novel method for analyzing a sample containing such an organic substance can be provided.
  • FIG. 1 is an example of a chromatogram showing a peak of cysteine.
  • FIG. 2 is an example of a chromatogram showing the peak of NEM-Cys.
  • FIG. 3 is an example of a chromatogram showing the peak of EMM-Cys.
  • FIG. 4 is an example of a chromatogram showing the peak of derivatized hypotaurine by EMM.
  • FIG. 5 is an example of a chromatogram showing peaks of cysteine derivatized by EMM and cysteine persulfide.
  • FIG. 6 is an example of a chromatogram showing the results of simultaneous analysis of Cys, Cys2, and amino acids using an amino acid analyzer.
  • FIG. 7 is an example of a chromatogram of a thiol derivative by BPSE.
  • FIG. 8 is an example of a chromatogram of derivatized chiral thiol.
  • FIG. 9 is a graph showing the time course of the peak area values of Cys and GSH at pH 8.0, respectively.
  • FIG. 10 is a graph showing the time course of the peak area values of Cys and GSH at pH 7.0, respectively.
  • FIG. 11 is a graph showing the time course of the peak area values of Cys and GSH at pH 6.0, respectively.
  • FIG. 12 is a graph showing the time course of the peak area values of Cys and GSH at pH 2.5, respectively.
  • FIG. 13 is a graph showing the time course of the peak area value of Cys at pH 8.0, pH 7.0, pH 6.0, and pH 2.5.
  • FIG. 14 is an example of a chromatogram showing a peak of derivatized cysteine or a peak of derivatized cystine by EMM.
  • the present invention will be described in detail by showing embodiments and examples. However, the present invention is not limited to the embodiments and examples shown below. Further, the “agent” may be a single substance or a composition composed of two or more kinds of substances.
  • an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino is reacted with an olefin compound under acidic conditions.
  • the olefin compound contains an ethylene structure having at least two electron attracting groups (excluding halogen atoms).
  • the organic substance contains one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, preferably contains one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl and sulfino, and more preferably sulfanyl.
  • sulfanyl is a group represented by-(S) n- SH
  • seranyl is a group represented by -SeH
  • sulfanyl is a group represented by ⁇ (S) n ⁇ SH (n represents an integer of 0 or more).
  • a group represented by-(S) n -SH such as -S-SH and -S-S-SH (where n is an integer of 1 or more).
  • An organic substance having (there is) hereinafter, also referred to as a persulfide
  • Such persulfide has an important role involved in redox in the living body.
  • the persulfide can be induced while maintaining its redox state, so that the redox state in the living body can be grasped.
  • It is represented by- (S) n- SH from the viewpoint of the number and abundance of organic substances containing sulfanyl (particularly, natural organic substances in biological samples such as blood, saliva, urine, and feces).
  • the n of the group is preferably 0, 1, 2, or 3, more preferably 0, 1 or 2, even more preferably 0 or 1, and particularly preferably 0.
  • seranyl is also a group represented by -SeH.
  • the selenium atom is an atom belonging to Group 16 like the sulfur atom in the periodic table, and exhibits the same reactivity as the sulfur atom. Therefore, since the reactivity of the selenium atom in the organic substance to the olefin compound is the same as the reactivity of the sulfur atom in the organic substance to the olefin compound, it can react well with the sulfur atom in the organic substance.
  • the olefin compound described below having an ethylene structure can react well with the selenium atom in the organic substance as well.
  • a plurality of one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino may be contained in one molecule of an organic substance.
  • the organic substance has one or more (eg, 2, 3, 4) functional groups in addition to one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino. May be.
  • the functional group include, but are not limited to, hydroxy, carboxy, amino, alkylamino, dialkylamino, alkyloxy, alkyloxycarbonyl, alkylcarbonyl and alkylcarbonyloxy.
  • the organic substance may contain an amino group in addition to the group A.
  • the amino group that the organic substance can contain in addition to the group A includes a mono-substituted amino group and a di-substituted amino group in addition to the unsubstituted amino group ( ⁇ NH 2).
  • the amino group that the organic substance can contain in addition to the group A one or more selected from the group consisting of an unsubstituted amino group and a monosubstituted amino group is preferable, and an unsubstituted amino group is more preferable.
  • the organic substance containing the group A may contain only one amino group in one molecule, or may contain a plurality of amino groups.
  • the number of amino groups contained in one molecule of an organic substance may be 1, 2, or 3, preferably 1 or 2, and more preferably 1.
  • the organic substance may be derived from a sample described later.
  • the organic substance may be a high molecular weight compound or a low molecular weight compound.
  • the organic substance is a low molecular weight compound.
  • the low molecular weight compound means a compound having a molecular weight of 1500 or less.
  • the molecular weight of the low molecular weight compound may be 1200 or less, 1000 or less, 900 or less, 800 or less, 700 or less, 600 or less, 500 or less, 400 or less, or 300 or less.
  • the molecular weight of the low molecular weight compound may also be 30, 40 or more, or 50 or more.
  • the low molecular weight compound may be an amino acid (eg, cysteine, selenocysteine), a peptidic compound, or a salt thereof.
  • the peptide compound is a compound having a structure obtained by condensing two or more amino acids.
  • the organic substance may be a peptide compound which is a polymer compound. Examples of peptide compounds that are polymer compounds include proteins such as albumin.
  • the organic substance may be a natural compound or a synthetic compound.
  • organic substances include cysteine, reduced glutathione, ⁇ -glutamylcysteine, cystenylglycine, homocysteine, N-acetylcysteine, persulfide cysteine (eg, S-mercaptocysteine, S-disulfanylcysteine, S).
  • the organic substance may be one kind alone or a combination of two or more kinds.
  • Organic substances include cysteine, reduced glutathione, ⁇ -glutamylcysteine, cystenylglycine, homocysteine, N-acetylcysteine, persulfide cysteine (eg, S-mercaptocysteine, S-disulfanylcysteine, S-trisulfanylcysteine). ), Hipotaurine, glutathione persulfide, and one or more selected from the group consisting of peptide compounds containing cysteine residues.
  • the peptidic compound containing a cysteine residue can be a low molecular weight compound (eg, oligopeptide) or a high molecular weight compound (eg, protein).
  • the olefin compound contains an ethylene structure (ethene structure) having at least two electron-withdrawing groups, and is a compound capable of reacting with sulfanyl, seranyl, or sulfino in an organic substance through the ethylene structure.
  • the electron attracting group does not include a halogen atom.
  • the number of electron attracting groups contained in the ethylene structure is usually 2 or more, usually 4 or less, preferably 2 or more and 3 or less, and more preferably 2.
  • the number of electron attracting groups is in the above range, the reactivity between the olefin compound and the organic substance is improved.
  • the electron attracting group may be monovalent or divalent.
  • the number of electron attracting groups contained in the ethylene structure means the number of bonds between the ethylene structure and the electron attracting groups. Therefore, when a certain electron attracting group is a divalent group and the electron attracting group is bonded to one ethylene structure by using two bonds, the electron attracting group possessed by the ethylene structure. The number of can be two.
  • the olefin compound preferably has two electron attracting groups bonded to the same carbon atom constituting the ethylene structure. Thereby, in the ethylene structure, the reactivity of one carbon atom to which the two electron attracting groups are bonded and the other carbon atom can be improved.
  • the attracting groups When two electron attracting groups are bonded to the same carbon atom in the ethylene structure, and when an electron attracting group is bonded to an adjacent carbon atom in the ethylene structure, the two electron attracting groups are obtained.
  • the attracting groups may form a ring together with the carbon atoms to which they are attached.
  • the olefin compound preferably has at least two electron attracting groups having the same ethylene structure.
  • the electron attracting groups having an ethylene structure are the same group, and the two identical electron attracting groups are bonded to the same carbon atom constituting the ethylene structure. It is more preferable to do so.
  • the ethylene structure has two identical electron attracting groups, and the two identical electron attracting groups are bonded to the same carbon atom constituting the ethylene structure to form two electrons. It is more preferable that two identical groups (which may be hydrogen atoms) are bonded to the carbon atom other than the carbon atom to which the attracting group is bonded. Thereby, it is possible to prevent the organic substance from being converted into two kinds of derivatives which are diastereomers by the reaction between the olefin compound and the organic substance.
  • the ethylene structure may have a group other than the electron attracting group.
  • groups other than the electron-withdrawing group that the ethylene structure can have include monovalent hydrocarbon groups, preferably from the group consisting of monovalent chain hydrocarbons and monovalent aromatic hydrocarbon groups.
  • the ethylene structure has no groups other than electron attracting groups.
  • Halogen-substituted alkyl eg, perfluoroalkyl such as trifluoromethyl, perchloroalkyl such as trichloromethyl
  • carboxy nitro
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 each independently represent a monovalent hydrocarbon group or a monovalent heterocyclic group, which may not have a substituent. , May have a substituent.
  • R 5 , R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group, or a monovalent heterocyclic group, which may not have a substituent and are substituted. It may have a group.
  • Examples of the monovalent hydrocarbon group include a monovalent chain hydrocarbon group, a monovalent alicyclic hydrocarbon group, and a monovalent aromatic hydrocarbon group.
  • the monovalent chain hydrocarbon group means a hydrocarbon group composed of only a chain structure and does not contain a cyclic structure in the main chain. However, the chain structure may be linear or branched. Examples of the monovalent chain hydrocarbon group include alkyl, alkenyl and alkynyl. The alkyl, alkenyl, and alkynyl may be linear or branched.
  • alkyl an alkyl having 1 to 12 carbon atoms is preferable, an alkyl having 1 to 6 carbon atoms is more preferable, and an alkyl having 1 to 4 carbon atoms is further preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms.
  • alkyl having 1 to 12 carbon atoms include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, and decyl. , Dodecyl.
  • an alkenyl having 2 to 12 carbon atoms is preferable, an alkenyl having 2 to 6 carbon atoms is more preferable, and an alkenyl having 2 to 4 carbon atoms is further preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms. Examples of the alkenyl having 2 to 12 carbon atoms include vinyl, propenyl, and n-butenyl.
  • alkynyl having 2 to 12 carbon atoms is preferable, alkynyl having 2 to 6 carbon atoms is more preferable, and alkynyl having 2 to 4 carbon atoms is even more preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms. Examples of alkynyl having 2 to 12 carbon atoms include ethynyl, propynyl, and n-butynyl.
  • alkyl is preferable.
  • the monovalent alicyclic hydrocarbon group means a hydrocarbon group containing only an alicyclic hydrocarbon as a ring structure and not containing an aromatic ring, and the alicyclic hydrocarbon is either monocyclic or polycyclic. It may be. However, it does not have to be composed only of alicyclic hydrocarbons, and a chain structure may be contained in a part thereof.
  • Examples of the monovalent alicyclic hydrocarbon group include cycloalkyl, cycloalkenyl, and cycloalkynyl, which may be monocyclic or polycyclic.
  • cycloalkyl a cycloalkyl having 3 to 12 carbon atoms is preferable, a cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and a cycloalkyl having 5 to 6 carbon atoms is further preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms.
  • Examples of cycloalkyl having 3 to 12 carbon atoms include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.
  • cycloalkenyl a cycloalkenyl having 3 to 12 carbon atoms is preferable, a cycloalkenyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and a cycloalkenyl having 5 to 6 carbon atoms is further preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms.
  • examples of the cycloalkenyl having 3 to 12 carbon atoms include cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, and cyclohexenyl.
  • cycloalkynyl having 3 to 12 carbon atoms is preferable, cycloalkynyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and cycloalkynyl having 5 to 6 carbon atoms is even more preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms.
  • Examples of cycloalkynyl having 3 to 12 carbon atoms include cyclopropynyl, cyclobutynyl, cyclopentinyl, and cyclohexynyl.
  • cycloalkyl is preferable.
  • the monovalent aromatic hydrocarbon group means a hydrocarbon group containing an aromatic ring structure. However, it does not have to be composed of only an aromatic ring, and may include a structure such as a chain structure or an alicyclic hydrocarbon structure as a part thereof. Therefore, the monovalent aromatic hydrocarbon group can be aralkyl.
  • the aromatic ring may be either a monocyclic ring or a polycyclic ring.
  • an aryl having 6 to 12 carbon atoms is preferable, an aryl having 6 to 10 carbon atoms is more preferable, and an aryl having 6 carbon atoms is further preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms. Examples of the aryl having 6 to 12 carbon atoms include phenyl and naphthyl.
  • Phenyl is preferable as the monovalent aromatic hydrocarbon group.
  • alkyl, cycloalkyl, and aryl are preferable, and alkyl or aryl is more preferable.
  • a monovalent heterocyclic group is a group obtained by removing one hydrogen atom from a cyclic compound containing a heterocycle.
  • the heteroatom constituting the heterocyclic group preferably contains at least one selected from the group consisting of an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a phosphorus atom, a boron atom and a silicon atom, and preferably contains an oxygen atom, a sulfur atom and a nitrogen atom. It is more preferable to include one or more selected from the group consisting of atoms.
  • the monovalent heterocyclic group is a monovalent aromatic heterocyclic group or a monovalent non-aromatic heterocyclic group.
  • the monovalent aromatic heterocyclic group refers to a heterocyclic group containing a ring having aromaticity.
  • an aromatic heterocyclic group having 1 to 15 carbon atoms is preferable, an aromatic heterocyclic group having 1 to 9 carbon atoms is more preferable, and an aromatic heterocyclic group having 1 to 6 carbon atoms is more preferable.
  • Group heterocyclic groups are more preferred.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms.
  • Examples of the monovalent aromatic heterocyclic group include pyrrolyl, furanyl, thiophenyl, pyridinyl, pyrariainyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, pyrazolyl, imidazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, triazolyl, tetrazolyl, indolyl, prynyl and anthraquinolyl.
  • the monovalent non-aromatic heterocyclic group refers to a heterocyclic group that does not contain a ring having aromaticity.
  • a non-aromatic heterocyclic group having 2 to 15 carbon atoms is preferable, a non-aromatic heterocyclic group having 2 to 9 carbon atoms is more preferable, and a non-aromatic heterocyclic group having 2 to 9 carbon atoms is more preferable.
  • the non-aromatic heterocyclic group of 6 is more preferable.
  • the number of carbon atoms of the substituent is not included in the number of carbon atoms.
  • Examples of the monovalent non-aromatic heterocyclic group include oxylanyl, aziridinyl, azetidinyl, oxetanyl, thietanyl, pyrrolidinyl, dihydrofuranyl, tetrahydrofuranyl, dioxolanyl, tetrahydrothiophenyl, pyrolinyl, imidazolidinyl, oxazolidinyl, piperidinyl and dihydropyranyl.
  • Tetrahydropyranyl Tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, piperazinyl, dihydrooxadinyl, tetrahydrooxadinyl, dihydropyrimidinyl, and tetrahydropyrimidinyl.
  • a 5-membered or 6-membered heterocyclic group is preferable.
  • the substituent is preferably one or more selected from the group consisting of a monovalent hydrocarbon group (which may be further substituted with a halogen atom), nitro, cyano, and a halogen atom.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6, and R 7 are the same as the above definitions.
  • R 1 is preferably a monovalent hydrocarbon group, more preferably a monovalent chain hydrocarbon group, still more preferably an alkyl, and particularly preferably an alkyl having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 2 is preferably a monovalent hydrocarbon group, more preferably a monovalent aromatic hydrocarbon group, more preferably an aryl, particularly preferably phenyl.
  • R 3 is preferably a monovalent hydrocarbon group, more preferably a monovalent chain hydrocarbon group, and even more preferably an alkyl.
  • R 4 is preferably a monovalent hydrocarbon group, more preferably a monovalent aromatic hydrocarbon group, more preferably an aryl.
  • R 5 is preferably a monovalent hydrocarbon group, more preferably a monovalent aromatic hydrocarbon group, more preferably an aryl.
  • R 6 is preferably a hydrogen atom or a monovalent hydrocarbon group, and more preferably a hydrogen atom.
  • R 7 is preferably a hydrogen atom or a monovalent hydrocarbon group, more preferably a monovalent hydrocarbon group, and even more preferably a monovalent chain hydrocarbon group or a monovalent aromatic hydrocarbon group. And particularly preferably alkyl or aryl.
  • the olefin compound is preferably a compound represented by the following formula (I) from the viewpoint of improving reactivity with organic substances.
  • EWG 1 and EWG 2 each independently represent an electron attracting group, and may form a ring together with the carbon atom to which they are bonded.
  • EWG 1 and EWG 2 are preferably the same group. This makes it possible to prevent the derivative of the organic substance generated by the reaction of the olefin compound and the organic substance from becoming two kinds of derivatives which are diastereomers.
  • the olefin compound can be produced by a conventionally known method.
  • a commercially available product can be used as the olefin compound.
  • the organic substance and the olefin compound are reacted under acidic conditions. Thereby, the oxidation reaction of the group A contained in the organic substance can be suppressed.
  • an oxide such as a disulfide compound coexists in the reaction system, the reaction between the group A and the oxide can be suppressed. As a result, the organic substance can be efficiently converted into a derivative.
  • the acidic condition means that the reaction of the organic substance and the olefin compound is carried out in an acidic solution.
  • the organic substance and the olefin compound do not have to be completely dissolved in the acidic solution, and the reaction may be carried out in a state where the organic substance and the olefin compound are dispersed in the acidic solution.
  • the acidic solution usually has a pH of less than 7, preferably pH 6.5 or less, more preferably pH 6.0 or less, still more preferably less than pH 6.0, particularly preferably pH 5.5 or less, pH 5.25 or less, pH 5.0 or less,
  • the pH is 4.75 or less, pH 4.5 or less, or pH 4.25 or less, preferably pH 0.0 or more, and more preferably pH 2.0 or more.
  • the pH of the acidic solution By setting the pH of the acidic solution to the above range, it is possible to effectively suppress side reactions such as oxidation of organic substances and exchange reaction with disulfide compounds while suppressing decomposition of derivatives.
  • the pH of the acidic solution and the pH of the neutral or basic solution described later can be measured under the condition of a temperature of 25 ° C. by a pH meter using a glass electrode method.
  • the acidic solution is preferably a solution containing water.
  • the acidic solution may contain an organic solvent in addition to water.
  • the organic solvent a solvent that can be mixed with water at an arbitrary ratio is preferable.
  • examples of such organic solvents include alcohol solvents such as methanol and ethanol; nitrile solvents such as acetonitrile; aprotic polar solvents such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dioxane and tetrahydrofuran.
  • the weight of the organic solvent in the solution with respect to water is preferably 50% by weight or less, more preferably 10% by weight or less, still more preferably 5% by weight or less, and is usually 0. Weight% or more. More preferably, the acidic solution is an aqueous solution.
  • Acidic solutions usually contain acids.
  • acids include inorganic and organic acids.
  • inorganic acids include phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, and perchloric acid.
  • organic acids include formic acid, oxalic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, and cyanoacetic acid.
  • a buffer solution having a pH adjusted to a desired range may be used as the acidic solution.
  • the reaction temperature under acidic conditions is not particularly limited, but is preferably 50 ° C. or lower, more preferably 45 ° C. or lower, still more preferably 40 ° C. or lower, preferably 5 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher, and further. It is preferably 15 ° C. or higher.
  • the reaction time under acidic conditions is not particularly limited, but is preferably 60 minutes or less, more preferably 30 minutes or less, still more preferably 15 minutes or less, and usually 0 minutes or more.
  • the reaction under acidic conditions is carried out by mixing an organic substance and an olefin compound in an acidic solution.
  • the method of mixing the organic substance and the olefin compound in the acidic solution is not particularly limited.
  • Examples thereof include a method in which a solution containing the mixture is prepared, a buffer solution or the like is added thereto, the pH is adjusted to a desired range, and then an olefin compound is added and mixed.
  • an acidic solution containing the organic substance it is preferable to prepare an acidic solution containing the organic substance, add an olefin compound to the obtained solution, and mix the mixture.
  • the olefin compound may be added as it is or in the form of a solution dissolved in a solvent (water, organic solvent).
  • the concentration of the organic substance in the acidic solution is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 ⁇ mol / L to 100 mmol / L.
  • the amount of the olefin compound with respect to the organic substance is not particularly limited, but may be, for example, 1 to 100 in terms of molar ratio.
  • the organic substance contains an amino group in addition to the group A
  • the organic substance is reacted with the olefin compound under acidic conditions and then further under neutral or basic conditions (preferably basic conditions).
  • the reaction may be carried out to obtain a derivative of the organic substance.
  • the group A contained in the organic substance reacts with the olefin compound under acidic conditions and is converted into a substituent stable against side reactions such as oxidation.
  • an amino group (which may be an unsubstituted amino group, a monosubstituted amino group, or a disubstituted amino group) contained in the organic substance reacts with the olefin compound to form an olefin compound.
  • both the group A contained in the organic substance and the amino group contained in the organic substance react with the olefin compound to obtain a derivative in which both the group A and the amino group are converted.
  • Derivatives containing a more substituted amino group have manufacturing and analytical advantages over derivatives containing an amino group before substitution. Usually, the more substituted amino group has improved hydrophobicity as compared to the amino group before the substitution. Therefore, in liquid chromatography, it is often possible to easily set the separation conditions for derivatives of organic substances.
  • derivatives containing amino groups with a low degree of substitution eg, derivatives containing unsubstituted amino groups such as cysteine and reduced glutathione
  • HILIC sex interaction chromatography
  • retention is extremely strong, and separation conditions may not be easily set.
  • derivatives containing more substituted amino groups often have higher detection sensitivity with a mass spectrometer than derivatives containing amino groups before substitution.
  • Neutral or basic conditions mean that an organic substance reacted under acidic conditions (hereinafter, also referred to as a derivative under acidic conditions) is reacted with an olefin compound in a neutral or basic solution.
  • the derivative and the olefin compound under acidic conditions do not have to be completely dissolved in the solution, and the reaction may be carried out in a state where the derivative and the olefin compound under acidic conditions are dispersed in the solution.
  • the neutral or basic solution usually has a pH of 7 or more, preferably pH 7.5 or more, more preferably pH 8 or more, still more preferably pH 8.5 or more, preferably pH 11 or less, more preferably pH 10 or less, still more preferably pH 9. It is less than 5.5.
  • the neutral or basic solution is preferably a solution containing water.
  • the neutral or basic solution may contain an organic solvent in addition to water.
  • the organic solvent a solvent that can be mixed with water at an arbitrary ratio is preferable. Examples of such organic solvents include the organic solvents exemplified in the description of acidic solutions.
  • the neutral or basic solution is a solution containing water, the range of the weight of the organic solvent in the solution with respect to water may be the same as the preferred range mentioned in the description of the acidic solution. More preferably, the neutral or basic solution is an aqueous solution.
  • Basic solutions usually contain bases.
  • bases include inorganic bases and organic bases.
  • inorganic bases are metal hydroxides (eg sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide), metal carbonates (eg sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate), sodium phosphate, phosphate. Included are potassium, ammonia, sodium borate, and potassium borate.
  • organic bases include amines (eg, trimethylamine, triethylamine).
  • a buffer solution having a pH adjusted to a desired range may be used as a neutral or basic solution.
  • the reaction temperature under neutral or basic conditions is not particularly limited, but is preferably 50 ° C. or lower, more preferably 45 ° C. or lower, still more preferably 40 ° C. or lower, preferably 5 ° C. or higher, and more preferably 10 ° C. or lower. ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher.
  • the reaction time under neutral or basic conditions is not particularly limited, but is preferably 60 minutes or less, more preferably 30 minutes or less, still more preferably 15 minutes or less, and usually 0 minutes or more.
  • reaction under neutral or basic conditions is carried out by mixing the derivative and the olefin compound under acidic conditions in a neutral or basic solution.
  • the derivative under acidic conditions may be isolated from the acidic solution and then mixed with the olefin compound in a neutral or basic solution.
  • the liquidity of the acidic solution is adjusted to the desired neutral or basic pH and mixed with the olefin compound in the neutral or basic solution. You may.
  • the olefin compound when the derivative is mixed with the olefin compound in the solution without isolation under acidic conditions, the olefin compound may be newly added to the solution. Alternatively, an excess amount of the olefin compound may be added during the reaction under acidic conditions, and the excess olefin compound may be used for the reaction under neutral or basic conditions.
  • the method for producing a derivative of the present embodiment may include an arbitrary step in addition to the reaction step of reacting an organic substance with an olefin compound.
  • the arbitrary step include, for example, a step of diluting the reaction solution containing the derivative after the reaction step, and a step of isolating the derivative from the reaction solution.
  • the group A is converted into a group that is more stable against oxidation. Therefore, the derivative of the organic substance can be analyzed more accurately than the case where the organic substance is analyzed as it is.
  • the method for analyzing a sample containing an organic substance includes (1) a sample containing an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino.
  • step (1) a sample containing an organic substance containing one or more groups (group A) selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, and at least two electron attracting groups (however, halogen atoms).
  • group A groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, and at least two electron attracting groups (however, halogen atoms).
  • An olefin compound containing an ethylene structure having (excluding)) is mixed under acidic conditions to obtain a treated sample containing a derivative of an organic substance.
  • Examples of organic substances and preferable examples include the same examples as described above.
  • a plurality of kinds of organic substances may be contained in the sample.
  • samples containing organic substances are not particularly limited, and include biological samples derived from living organisms, synthetic samples obtained by organic synthesis reactions, and non-biological samples such as environmental samples existing in the natural environment. Can be mentioned.
  • Organisms from which biological samples are derived include, for example, mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep), animals such as birds, insects, mollusks, and microorganisms. , Plants, but are preferably mammals.
  • Types of biological samples include, for example, blood samples (eg, whole blood, serum, plasma), saliva, urine, feces, bile, sweat, tears, cerebrospinal fluid, culture medium used for culturing cells or microorganisms. , And tissues and cell extracts and the like.
  • Examples of the synthetic sample include a reaction product obtained by an organic synthesis reaction that produces an organic substance, and a medium used for culturing cells or microorganisms.
  • Examples of environmental samples include samples derived from soil, seawater, and freshwater.
  • the concentrations of the organic substance and the olefin compound in the sample are not particularly limited as long as they react to form a derivative of the organic substance and the product can be analyzed.
  • the concentrations of the organic substance and the olefin compound in the sample are, for example, 0.001 ⁇ mol / L to 1000 mmol / L, preferably 0.01 ⁇ mol / L to 100 mmol / L, and more preferably 0.1 ⁇ mol / L to 10 mmol / L. Yes, more preferably 1 ⁇ mol / L to 1 mmol / L.
  • the sample may be a sample that has undergone pretreatment such as deproteinization treatment.
  • pretreatment such as deproteinization treatment
  • the sample since the sample is treated under acidic conditions, it is not necessary to adjust the liquidity of the sample to neutral to basic after performing an acidic treatment such as a deproteinization treatment as a pretreatment.
  • the sample can be mixed with the olefin compound while keeping the liquid property of the sample acidic. Under acidic conditions, side reactions such as the oxidation reaction of group A and the exchange reaction between group A and disulfide are unlikely to proceed. Therefore, it is possible to suppress the progress of side reactions between the pretreatment and the analysis. As a result, the organic substance having the group A can be analyzed more accurately.
  • the sample may contain a disulfide compound.
  • the disulfide compound is a compound containing a group represented by —S—S—.
  • Disulfide compounds can be produced by oxidation of thiols.
  • a thiol eg, cysteine, reduced glutathione
  • a disulfide compound eg, cystine, oxidized glutathione
  • the group A such as sulfanyl, which is easily oxidized contained in the organic substance, is reacted with the olefin compound to convert the organic substance into a derivative, and then the analysis is performed.
  • the sample is treated under acidic conditions.
  • acidic conditions the exchange reaction between the thiol and the disulfide compound is unlikely to occur. Therefore, the abundance of organic substances contained in the sample can be accurately determined.
  • the disulfide compound that the sample can contain examples include a compound in which sulfanyl that can be contained in the organic substance is converted into disulfide by reacting between molecules, and more specifically, dimethyl disulfide, diethyl disulfide, and the like. Oxidized glutathione and cystine can be mentioned.
  • the disulfide compound that the sample may contain may contain an amino group.
  • the amino group that can be contained in the disulfide compound includes a mono-substituted amino group and a di-substituted amino group in addition to the unsubstituted amino group (-NH 2).
  • the amino group that can be contained in the disulfide compound one or more selected from the group consisting of an unsubstituted amino group and a monosubstituted amino group is preferable, and an unsubstituted amino group is more preferable.
  • the disulfide compound may contain only one amino group in one molecule, or may contain a plurality of disulfide compounds.
  • the number of amino groups that can be contained in one molecule of the disulfide compound is 1, 2, 3, or 4, preferably 1, 2, or 3, and more preferably 1 or 2. Good.
  • the sample comprises one or more selected from the group consisting of oxidized glutathione and cystine.
  • olefin compounds and preferable examples include the same examples as described above.
  • a processed sample containing a derivative of an organic substance is obtained by mixing a sample containing an organic substance and an olefin compound under acidic conditions.
  • the sample containing the organic substance and the olefin compound are mixed in an acidic solution.
  • the type of acidic solution and the pH of the acidic solution are described in [1.3. Reaction conditions] can be the same as the preferred example described.
  • the mixing method is not particularly limited, and for example, 1) a method of preparing a solution containing a sample containing an organic substance and an acidic solution having a desired pH value, adding an olefin compound to the solution, and mixing 2) the organic substance.
  • the treatment temperature and treatment time are not particularly limited, but [1.3.
  • the reaction conditions] can be the same as the preferable examples of the reaction temperature and reaction time described above.
  • the step (1) preferably includes the step (1').
  • step (1') the sample and the olefin compound are mixed under acidic conditions and then further mixed under neutral or basic conditions to obtain a treated sample containing a derivative of the organic substance.
  • the group A contained in the organic substance in the sample reacts with the olefin compound under acidic conditions and is converted into a substituent stable against side reactions such as oxidation.
  • the amino group which may be an unsubstituted amino group, a monosubstituted amino group, or a disubstituted amino group
  • the organic substance reacts with the olefin compound to cause a substituted amino group.
  • the amino group contained in the organic substance is a disubstituted amino group, it is converted to a substituted ammonio group to obtain a derivative of the organic substance.
  • the more substituted amino group has improved hydrophobicity, so that a derivative in which an amino group having a lower degree of substitution is converted into a more substituted amino group usually facilitates separation conditions in liquid chromatography. Can be set to, and separation is easy.
  • a derivative in which an amino group having a low degree of substitution is converted into a more substituted amino group usually has an increased detection sensitivity with a mass spectrometer.
  • the compound When the sample contains a compound containing an amino group having a low degree of substitution (for example, a disulfide compound containing an unsubstituted amino group), the compound is highly hydrophilic and is retained in reverse phase liquid chromatography. In some cases, the separation conditions cannot be easily set because the retention is extremely strong in hydrophilic interaction chromatography (HILIC).
  • HILIC hydrophilic interaction chromatography
  • a compound containing an amino group having a low degree of substitution such as a disulfide compound containing an unsubstituted amino group
  • the amino group reacts with the olefin compound to be converted to a more substituted amino group (or a substituted ammonio group if the amino group is a disubstituted amino group).
  • compounds such as disulfide compounds in which amino groups have been converted into more substituted amino groups can be easily separated by easily setting separation conditions in ordinary liquid chromatography.
  • the detection sensitivity of a normal mass spectrometer increases.
  • cysteine the organic substance that can be contained in the sample is cysteine and the disulfide compound that can be contained in the sample is cystine in which cysteine is dimerized.
  • a derivative of cysteine (first derivative) obtained by reacting the sulfanyl group of cysteine with the olefin compound in the treated sample under acidic conditions obtained by mixing the olefin compound and the sample under acidic conditions. And cystine is believed to be present.
  • Cysteine derivatives have one unsubstituted amino group, and cystine has two unsubstituted amino groups. Due to this, there is a large difference in hydrophobicity between the cysteine derivative and the cystine derivative. Therefore, it may not be easy to set conditions for simultaneously analyzing a cysteine derivative and cystine during analysis by liquid chromatography.
  • the treated sample may contain ,
  • a cysteine derivative (second derivative) obtained by reacting a sulfanyl group and an amino group with the olefin compound, and a cystine derivative obtained by reacting an amino group with the olefin compound are considered to exist.
  • step (1') in the step (1) it is possible to accurately and easily analyze the organic substance containing an amino group in addition to the group A in the sample.
  • the sample containing an organic substance and the olefin compound are mixed in an acidic solution and then further mixed in a neutral or basic solution.
  • the type of neutral or basic solution and the pH of the neutral or basic solution are described in [1.3. Reaction conditions] can be the same as the preferred example described.
  • the mixing method in a neutral or basic solution is not particularly limited.
  • a basic solution is added to the obtained mixed solution (treated sample under acidic conditions) to obtain neutrality of the mixed solution.
  • the pH is adjusted to a basic pH, and the sample and the olefin compound are further mixed in a neutral or basic solution; the mixed solution is added to the prepared neutral or basic solution and mixed.
  • the method can be mentioned.
  • the treatment temperature and treatment time under neutral or basic conditions are not particularly limited, but [1.3.
  • the reaction conditions] can be the same as the preferable examples of the reaction temperature and reaction time under neutral or basic conditions.
  • a processed sample containing a derivative of an organic substance can be obtained by mixing the sample containing an organic substance and the olefin compound in an acidic solution and then further mixing in a neutral or basic solution.
  • step (2) the derivative of the organic substance in the treated sample is analyzed.
  • Step (2) may include step (2a) and step (2b) in this order.
  • step (2a) the derivative of the organic substance is separated from the treated sample in the step (1). Separation can be performed by any method capable of separating the derivative from a substance other than the derivative (for example, a disulfide compound) contained in the treated sample. Examples of the separation method include, but are not limited to, liquid chromatography, supercritical fluid chromatography (SFC), capillary electrophoresis (CE), and gas chromatography (GC).
  • SFC supercritical fluid chromatography
  • CE capillary electrophoresis
  • GC gas chromatography
  • the separation method may be appropriately selected depending on the type and properties of the contaminants contained in the sample and the types and properties of the derivative of the organic substance.
  • a method of separation liquid chromatography is preferable, and high performance liquid chromatography (HPLC) is more preferable.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • liquid chromatography examples include reverse phase liquid chromatography, normal phase liquid chromatography, hydrophilic interaction chromatography (HILIC), ion exchange chromatography, and size exclusion chromatography.
  • HILIC hydrophilic interaction chromatography
  • ion exchange chromatography ion exchange chromatography
  • size exclusion chromatography examples include reverse phase liquid chromatography, normal phase liquid chromatography, hydrophilic interaction chromatography (HILIC), ion exchange chromatography, and size exclusion chromatography.
  • Examples of the stationary phase of reverse phase liquid chromatography include, but are not limited to, silica gel modified with a hydrophobic compound such as octadecylsilane.
  • Examples of the mobile phase include, but are not limited to, an organic solvent, an aqueous solution, and a mixed solvent thereof.
  • Preferred examples of the organic solvent include acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol and the like.
  • aqueous solution examples include water, an aqueous solution of formic acid, an aqueous solution of ammonium formate, an aqueous solution of trifluoroacetic acid, an aqueous solution of acetic acid, an aqueous solution of ammonium acetate, an aqueous solution of ammonium bicarbonate, and a buffer solution.
  • Examples of the stationary phase of normal phase liquid chromatography include, but are not limited to, silica gel and alumina.
  • Examples of the mobile phase include, but are not limited to, hexane, ethyl acetate, methylene chloride, isopropanol, ethanol, methanol, tetrahydrofuran and a mixed solvent thereof.
  • Examples of the stationary phase of hydrophilic interaction chromatography include, but are not limited to, silica gel and silica gel modified with aminopropyl, amide, diol, or cyano.
  • Examples of the mobile phase include, but are not limited to, an organic solvent, an aqueous solution, and a mixed solvent thereof.
  • Preferred examples of the organic solvent include acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol and the like.
  • aqueous solution examples include water, an aqueous solution of formic acid, an aqueous solution of ammonium formate, an aqueous solution of trifluoroacetic acid, an aqueous solution of acetic acid, an aqueous solution of ammonium acetate, an aqueous solution of ammonium bicarbonate, and a buffer solution.
  • Hydrophilic interaction chromatography is preferably used when separating highly hydrophilic objects having weak holding power in the stationary phase of reverse phase chromatography.
  • a disulfide compound such as cystine or oxidized glutathione, which is not derivatized by an olefin compound
  • a thiol derivative such as a cysteine derivative or a reduced glutathione derivative can be simultaneously analyzed by hydrophilic interaction chromatography.
  • the chiral compound in any liquid chromatography, by using a column (chiral column) loaded with a chiral filler, the chiral compound can be separated when the organic substance is a mixture of the chiral compounds.
  • a derivative of D-cysteine (which naturally has a small abundance ratio) and a derivative of L-cysteine can be separated by a chiral column.
  • step (2b) the separated derivative of the organic substance is detected.
  • the detection method are not particularly limited, but are limited to mass spectrometry using a mass spectrometer, detection of ultraviolet absorption (UV), photodiode array detection (PDA), fluorescence detection (FL), detection and induction of visible light absorption.
  • ICP Inductively coupled plasma emission spectroscopy
  • corona charged particle detection corona charged particle detection
  • RI differential refractive index detection
  • ELSD evaporation light scattering detection
  • the detection method may be appropriately selected depending on the type and property of the contaminants contained in the sample and the type and property of the derivative of the organic substance.
  • mass spectrometry ultraviolet absorption detection, fluorescence detection, visible light absorption detection, and inductively coupled plasma emission spectroscopic analysis are preferable, and mass spectrometry and ultraviolet absorption detection are more preferable. These detection methods may be used alone or in combination. These separation methods can be carried out by conventionally known methods.
  • the mass spectrometry method is not particularly limited, and a mass spectrometry method combining various ionization methods, various ion separation methods, and various detectors may be used.
  • Specific examples of mass spectrometers used in mass spectrometry include triple quadrupole mass spectrometers, time-of-flight mass spectrometers (TOF-MS), and ion trap mass spectrometers (eg, Orbitrap®). ) Mass spectrometer).
  • the analysis method of the present embodiment may include any step other than the steps (1) and (2).
  • An example of an arbitrary step is a step of derivatizing an amino acid with an amino acid derivatizing reagent such as ninhydrin or o-phthalaldehyde when a sample containing an amino acid is used as a sample.
  • the step of derivatizing the amino acid is preferably carried out after the step (1) and before the step (2).
  • cysteine and cystine are usually difficult to analyze simultaneously using an amino acid analyzer. This is because cysteine and cystine usually have the same retention time when derivatized by an amino acid derivatizing agent.
  • cysteine and cystine by performing step (1), of cysteine and cystine, only cysteine reacts with the olefin compound and is converted into a derivative, so that the retention time of cysteine after being derivatized by the amino acid derivatizing agent is cystine. It will usually be different from the retention time of. Therefore, according to the analysis method of the present embodiment, cysteine and cystine can be analyzed simultaneously using an amino acid analyzer.
  • the agent according to one embodiment of the present invention is a derivatizing agent under acidic conditions of an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, and has at least two electrons.
  • sulfanyl containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, and has at least two electrons.
  • Examples of olefin compounds and preferable examples include the same examples as described above. Further, examples of organic substances and preferable examples include the same examples as described above.
  • the conditions for producing a derivative using a derivatizing agent are acidic.
  • the derivatization of the organic substance is carried out in an acidic solution containing a derivatizing agent.
  • the type of acidic solution and the pH of the acidic solution are described in [1.3. Reaction conditions] can be the same as the preferred example described.
  • the concentration of the olefin compound in the derivatizing agent depends on the dilution ratio of the derivatizing agent, but is, for example, 0.001 ⁇ mol / L to 1000 mol / L, preferably 0.01 ⁇ mol / L to 100 mol / L, and more preferably 0.01 ⁇ mol / L to 100 mol / L. It is 0.1 ⁇ mol / L to 10 mol / L, and more preferably 1 ⁇ mol / L to 1 mol / L.
  • the reagent according to one embodiment of the present invention is a reagent for analyzing an organic substance containing one or more groups selected from the group consisting of sulfanyl, seranyl, and sulfino, and includes the derivatizing agent.
  • Examples of olefin compounds and preferable examples include the same examples as described above. Further, examples of organic substances and preferable examples include the same examples as described above.
  • the concentration of the olefin compound in the analytical reagent depends on the dilution ratio of the analytical reagent, but is, for example, 0.001 ⁇ m / L to 1000 mol / L, preferably 0.01 ⁇ mol / L to 100 mol / L, and more preferably 0.01 ⁇ m / L to 100 mol / L. It is 0.1 ⁇ mol / L to 10 mol / L, and more preferably 1 ⁇ mol / L to 1 mol / L.
  • the analytical reagent is preferably used in a sample analysis method including the steps (1) and (2).
  • Cys-SH S-mercaptocysteine
  • Cys-SSH S-disulfanylcysteine
  • Example A Example using EMM and NEM
  • Example A1 Reaction of EMM, NEM and cysteine (Cys) under acidic conditions
  • the reactivity of EMM and NEM under acidic conditions was estimated from the amount of residual Cys after the reaction.
  • the EMM derivatized Cys peak was confirmed by LC-MS / MS.
  • L-Cysteine hydrochloride (manufactured by Sigma) was dissolved in a 0.1% formic acid solution (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., diluted with pure water) so as to have a concentration of 10 mmol / L.
  • the derivatizing agent EMM (manufactured by Asta Tech) is dissolved in acetonitrile (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 10 ⁇ L / mL
  • the derivatizing agent NEM (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in acetonitrile at 10 mg / mL. I let you.
  • the sample solution was analyzed by LC-MS / MS under the following conditions.
  • the LC used was an Agilent 1200 series (manufactured by Agilent), and the tandem mass spectrometer used a 3200 QTRAP system (manufactured by Sciex).
  • FIG. 1 is an example of a chromatogram showing a peak of cysteine.
  • FIG. 2 is an example of a chromatogram showing the peak of NEM-Cys.
  • FIG. 3 is an example of a chromatogram showing the peak of EMM-Cys.
  • Cys can be derivatized with a high reaction rate by NEM or EMM under acidic conditions and mild temperature conditions (room temperature).
  • room temperature mild temperature conditions
  • the reaction rate was higher than that of NEM.
  • Cys which is a chiral compound
  • was derivatized by NEM diastereomers were generated and the NEM-Cys peak was split into two.
  • Cys is derivatized by EMM, diastereomers do not occur and peak splitting does not occur.
  • Example A2 Simultaneous detection and quantification of EMM derivatized thiols (separation by reverse phase LC)
  • six types of thiol compounds derivatized by EMM under acidic conditions were simultaneously separated and detected using LC-MS / MS.
  • the sample solution was analyzed by LC-MS / MS.
  • the LC used was Nexera (manufactured by Shimadzu Corporation), and the tandem mass spectrometer used was the Triple Quad 6500 system (manufactured by Siex).
  • Example A3 sulfinic acid, not only the thiol (-SH), sulfinic acid (-SO 2 H) also has nucleophilic, is derivatized with EMM agent, it can be analyzed It was confirmed.
  • Hypotaurine (manufactured by Sigma) was dissolved in 0.01 mol / L hydrochloric acid to a concentration of 1 mmol / L. 10 ⁇ L of the above standard hypotaurine solution was added to 60 ⁇ L of 20 mmol / L sodium phosphate buffer (pH 2.5), 10 ⁇ L of EMM acetonitrile solution (10 ⁇ L / mL) was added, and the mixture was stirred and left at room temperature for 10 minutes. 920 ⁇ L of 0.1% formic acid solution was added and stirred well to prepare a sample solution.
  • the sample solution was analyzed by LC-MS / MS under the following conditions.
  • the LC used was an Agilent 1200 series (manufactured by Agilent), and the tandem mass spectrometer used a 3200 QTRAP system (manufactured by Sciex).
  • FIG. 4 is an example of a chromatogram showing the peak of derivatized hypotaurine by EMM.
  • sulfinic acid such as hypotaurine can be derivatized and analyzed by EMM under acidic conditions.
  • Example A4 Analysis of persulfide
  • Cysteine persulfide (Cys-SH and Cys-SSH) was used as the persulfide.
  • Cysteine persulfide has an important function related to redox in a living body. Therefore, in the present invention, if derivatization is possible while maintaining the redox state of persulfide, it is useful for grasping the redox state in a living body.
  • the sample solution was analyzed by LC-MS / MS under the following conditions.
  • the LC used was an Agilent 1200 series (manufactured by Agilent), and the tandem mass spectrometer used a 3200 QTRAP system (manufactured by Sciex).
  • FIG. 5 is an example of a chromatogram showing peaks of cysteine derivatized by EMM and cysteine persulfide.
  • persulfides such as cysteine persulfide can be derivatized and analyzed by EMM under acidic conditions.
  • Example A5 Simultaneous analysis of Cys, Cys2, and amino acids using an amino acid analyzer
  • Cys, Cys2, and amino acids can be analyzed simultaneously using an amino acid analyzer.
  • the sample is treated with EMM to derivatize Cys and Cys2, then the amino acids are separated from the sample using an ion exchange column, and then the amino acids are derivatized with ninhydrin by the post-column derivatization method, Cys, Cys2. , And amino acids were analyzed all at once.
  • Cys and Cys2 are usually eluted from the column at the same time, so that it is usually difficult to analyze Cys and Cys2 at the same time.
  • Amino acid mixed standard solution, H type (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (L-aspartic acid, L-threonine, L-serine, L-glutamic acid, L-proline, glycine, L-alanine, L-cystine, L-valine , L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-lysine, L-histidine, ammonium chloride, L-arginine (2.5 mmol / L each)) 10 mmol per 100 ⁇ L 25 ⁇ L of / L cysteine hydrochloride aqueous solution and 125 ⁇ L of pure water were added to prepare a mixed standard solution.
  • FIG. 6 is an example of a chromatogram showing the results of simultaneous analysis of Cys, Cys2, and amino acids using an amino acid analyzer. From the above results, it can be seen that Cys, Cys2, and various amino acids can be analyzed at the same time by treating a sample containing Cys, Cys2, and various amino acids under acidic conditions and analyzing with a normal amino acid analyzer.
  • Example B Example using BPSE
  • Example B1 Derivatization and analysis by BPSE
  • thiol can be derivatized by BPSE and can be analyzed.
  • An example of the reaction between BPSE and thiol is shown below.
  • FIG. 7 is an example of a chromatogram of a thiol derivative by BPSE.
  • the thiol can be derivatized by BPSE under acidic conditions, separated by column chromatography, and detected by a UV detector. It is expected that the amino acid having sulfanyl is converted to a highly hydrophobic amino acid by derivatization, and can be well separated and detected from other low hydrophobic amino acids by column chromatography using an ODS (C18) column.
  • ODS ODS
  • Example B2 Separation and detection of chiral thiol
  • chiral thiol is derivatized by BPSE and can be separated and detected by column chromatography using a chiral column.
  • FIG. 8 is an example of a chromatogram of derivatized chiral thiol.
  • Example and Reference Example C Evaluation of reactivity of olefin compound
  • the reactivity of the olefin compound (derivatizing agent) including EMM and BPSE with Cys was evaluated.
  • the olefin compounds used in this example and the reference example and their abbreviations are shown below.
  • pH 2.5 or 7.0 sodium phosphate buffer solution (20 mM) was used as a buffer solution.
  • Derivatization by EMM was further carried out using pH 3.25 or 4.25 sodium citrate (200 mM) and pH 6.0 sodium phosphate buffer solution (20 mM) as a buffer solution.
  • FIGS. 9 to 12. 9, 10, 11 and 12 are graphs showing the time course of the peak area values of Cys and GSH at pH 8.0, pH 7.0, pH 6.0, and pH 2.5, respectively.
  • the 0-minute data of pH 6.0, 7.0, and 8.0 were considered to have not been treated with a buffer solution, and were shared with the 0-minute data of pH 2.5.
  • FIG. 13 is a graph showing the time course of the peak area value of Cys at pH 8.0, pH 7.0, pH 6.0, and pH 2.5.
  • the 0-minute data of pH 6.0, 7.0, and 8.0 were considered to have not been treated with a buffer solution, and were shared with the 0-minute data of pH 2.5.
  • Example E Derivatization of sulfanyl group and amino group
  • cysteine or cystine is mixed with EMM under acidic conditions, and then the liquidity of the solution is further made basic to obtain cysteine or cystine.
  • the amino group (-NH 2 ) having a reaction with EMM was derivatized to cysteine or cystine. That is, after the sulfanyl group (-SH) of cysteine reacts with EMM under acidic conditions and is converted into a substituent that is stable against oxidation, the amino group of cysteine is converted under basic conditions. Derivatives were obtained by reacting with EMM. Under acidic conditions, amino groups usually do not react with EMMs.
  • disulfide compounds such as cystine, which have an amino group but no sulfanil group, usually do not react with EMMs and are not derivatized.
  • the amino group reacts with the EMM under basic conditions to be derivatized.
  • the hydrophobicity of the disulfide compound which is not derivatized under acidic conditions, can be increased, and the separation by liquid chromatography can be facilitated.
  • the detection sensitivity of the derivative with a mass spectrometer can be increased.
  • Cysteine or cystine (manufactured by Sigma) was dissolved in 0.01 mol / L hydrochloric acid to a concentration of 250 ⁇ mol / L to prepare a standard product.
  • 20 ⁇ L of this standard, 20 ⁇ L of a 10% trichloroacetic acid aqueous solution, and 40 ⁇ L of 0.1 mol / L hydrochloric acid were mixed and stirred well.
  • 50 ⁇ L of this solution was mixed with 300 ⁇ L of 20 mmol / L sodium phosphate buffer (pH 2.5), 50 ⁇ L of EMM acetonitrile solution (10 ⁇ L / mL) was added, and the mixture was stirred and allowed to stand at 40 ° C.
  • FIG. 14 is an example of a chromatogram showing a peak of derivatized cysteine or a peak of derivatized cystine by EMM.
  • cysteine by reacting cysteine with EMM under acidic conditions, the sulfanyl group reacts with EMM, and then by making the solution basic, the amino group reacts with two molecules of EMM. It can be seen that cysteine is derivatized. Cystine is derivatized by making the reaction solution basic so that two amino groups react with four molecules of EMM. That is, the above results show that cysteine can be analyzed by LC-MS / MS as a compound that has reacted with the EMM3 molecule and cystine as a compound that has reacted with the EMM4 molecule.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の誘導体の新規な製造方法を提供する。スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質を、オレフィン化合物と酸性条件下で反応させて、前記有機物質の誘導体を得ることを含み、ここで、前記オレフィン化合物は、少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含む、有機物質の誘導体の製造方法。

Description

有機物質の誘導体の製造方法、及び有機物質を含む試料の分析方法
　本発明は、有機物質の誘導体の製造方法、及び有機物質を含む試料の分析方法に関する。
　生体内では、チオールは重要な役割を果たしている。例えば、生体内の酸化還元状態の維持、タンパク質の機能の制御、重金属などの生体異物の解毒などの役割を果たしている。
　したがって、生体試料などの試料中のチオールを分析する試みが、従来から行われている。例えば、チオールを、電極表面での酸化還元反応を利用して、電気化学検出器により分析する技術がある（非特許文献１、２）。また、チオールを誘導体へ変換し、分析する試みも行われている（非特許文献３～８）。
　チオールの反応としては、炭素－炭素二重結合との反応が知られている（非特許文献９、１０）。
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４０７（２０１０）１５１－１５９ Ｔａｌａｎｔａ，８４（２０１１）７８９－８０１ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７（１９６９）５０２－５２２ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２０（２００６）６５６－６６１ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ（１９９６）４２：５１５ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，Ｖｏｌｕｍｅ８４４，Ｉｓｓｕｅｓ１－２，４　Ｊｕｎｅ１９９９，Ｐａｇｅｓ　３６１－３６９ Ｓｃｉ　Ｒｅｐ，６（２０１６）２１４３３ Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｂ　Ａｎａｌｙｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，１０８３（２０１８）１２－１９ Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ７２２，　Ｉｓｓｕｅ　１，１４．Ｍａｙ　１９６９，Ｐａｇｅｓ　２２２－２２４ ＡＲＫＩＶＯＣ　２００９（ｖｉｉｉ）１８７－１９８
　しかしながら、非特許文献１、２の分析方法では、チオールを誘導体化せずに分析するため、試料又は分析に使用する溶離液などの溶存酸素によりチオールが酸化されやすく、安定した分析結果が得られにくい。また、電気化学検出器はチオールに対する選択性が十分ではなく、アミノ酸、糖、その他複雑な夾雑成分を有するサンプルを測定する場合、夾雑成分により測定が妨害されることがある。さらに、電気化学検出器は、電極の洗浄等のメンテナンスが必要であり、また使用に伴い容易に検出感度が変動し、不安定となるため取り扱いが難しい。
　非特許文献３～６の技術では、チオールの誘導体化を中性条件～塩基性条件で行っている。
　しかし、本発明者は、中性条件～塩基性条件では、チオールの酸化反応及びチオールとジスルフィド化合物との交換反応が容易に進行するために、チオールの分析が難しいことを見出した。したがって、中性条件～塩基性条件でチオールの誘導体化を行う非特許文献３～６の技術では、チオールの正確な分析が難しい場合がある。
　一方で、非特許文献７、８の技術では、酸性条件（ｐＨ３．５）でチオールを誘導体化しているが、反応性が悪く、長時間の反応もしくはマイクロウェーブ印加といった特殊な条件を必要とする。
　本発明者は、鋭意検討した結果、特定のオレフィン化合物を、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質と酸性条件下で反応させることにより得られる有機物質の誘導体が、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の分析に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。上記先行技術は、（ａ）特定のオレフィン化合物を、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質と酸性条件下で反応させること、並びに（ｂ）そのような反応により得られる有機物質の誘導体が、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の分析に有用であることのいずれも教示も示唆もしていない。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
　［１］　スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質を、オレフィン化合物と酸性条件下で反応させて、前記有機物質の誘導体を得ることを含み、
　ここで、前記オレフィン化合物は、少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含む、有機物質の誘導体の製造方法。
　［２］　前記エチレン構造が、２個の電子求引基を有する、［１］に記載の誘導体の製造方法。
　［３]　２個の電子求引基が、前記エチレン構造を構成する同一の炭素原子に結合している、［１］又は［２］に記載の誘導体の製造方法。
　［４］　少なくとも２個の電子求引基が、同一の基である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
　［５］　前記オレフィン化合物が、下記式（Ｉ）で表される化合物である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （但し、ＥＷＧ１及びＥＷＧ２は、各々独立して、電子求引基を表し、これらが結合する炭素原子と一緒になって、環を形成していてもよい。）
　［６］　前記電子求引基、又はＥＷＧ１及びＥＷＧ２が、各々独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ１、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｒ２、－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＲ３）２、シアノ、ハロゲン原子で置換されたアルキル、カルボキシ、ニトロ、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ５、又は－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６Ｒ７であり、
　ここで、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、各々独立して、１価の炭化水素基又は１価の複素環基を表し、これらは置換基を有していてもよく、
　Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、各々独立して、水素原子、１価の炭化水素基、又は１価の複素環基を表し、これらは置換基を有していてもよい、［１］～［５］のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
　［７］　前記酸性条件が、ｐＨ６．０未満の条件である、［１］～［６］のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
　［８］　前記有機物質が、システイン、還元型グルタチオン、γ－グルタミルシステイン、システイニルグリシン、ホモシステイン、Ｎ－アセチルシステイン、過硫化システイン、ヒポタウリン、過硫化グルタチオン、及び、システイン残基を含むペプチド性化合物からなる群より選択される１種以上である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
　［９］　前記有機物質が、更にアミノ基を含み、
　前記有機物質を、前記オレフィン化合物と酸性条件下で反応させた後、更に中性又は塩基性条件下で反応させて前記有機物質の誘導体を得ることを含む、［１］～［８］のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
　［１０］　（１）スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質を含む試料と、
　少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物とを、
　酸性条件下で混合して、前記有機物質の誘導体を含む処理試料を得ること、及び
　（２）前記処理試料中の、前記有機物質の誘導体を分析すること、を含む、有機物質を含む試料の分析方法。
　［１１］　前記工程（２）における分析が、
　（２ａ）前記処理試料から、前記有機物質の誘導体を分離すること、
　（２ｂ）分離された前記有機物質の誘導体を検出すること、
を含む、［１０］に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
　［１２］　前記試料が、更にジスルフィド化合物を含む、［１０］又は［１１］に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
　［１３］　前記ジスルフィド化合物が、酸化型グルタチオン及びシスチンからなる群より選択される１種以上である、［１２］に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
　［１４］　前記有機物質が、更にアミノ基を含み、
　工程（１）が、
　（１’）前記試料と、前記オレフィン化合物とを、酸性条件下で混合した後、更に中性又は塩基性条件下で混合して、前記有機物質の誘導体を含む処理試料を得ることを含む、［１０］～［１３］のいずれか１項に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
　［１５］　少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物を含む、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の酸性条件下での誘導体化剤。
　［１６］　［１５］に記載の誘導体化剤を含む、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の分析用試薬。
　本発明によれば、スルファニル（－ＳＨ）、セラニル（－ＳｅＨ）、及びスルフィノ（－Ｓ（＝Ｏ）－ＯＨ）からなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の誘導体の新規な製造方法；かかる有機物質を含む試料を分析する新規な方法を提供できる。
図１は、システインのピークを示すクロマトグラムの一例である。 図２は、ＮＥＭ－Ｃｙｓのピークを示すクロマトグラムの一例である。 図３は、ＥＭＭ－Ｃｙｓのピークを示すクロマトグラムの一例である。 図４は、ＥＭＭによる誘導体化ヒポタウリンのピークを示すクロマトグラムの一例である。 図５は、ＥＭＭにより誘導体化されたシステイン及び過硫化システインのピークを示すクロマトグラムの一例である。 図６は、アミノ酸アナライザーを使用したＣｙｓ、Ｃｙｓ２、及びアミノ酸の一斉分析結果を示すクロマトグラムの一例である。 図７は、ＢＰＳＥによるチオール誘導体のクロマトグラムの一例である。 図８は、誘導体化されたキラルチオールのクロマトグラムの一例である。 図９は、ｐＨ８．０におけるＣｙｓ及びＧＳＨのピークエリア値の経時変化をそれぞれ表すグラフである。 図１０は、ｐＨ７．０におけるＣｙｓ及びＧＳＨのピークエリア値の経時変化をそれぞれ表すグラフである。 図１１は、ｐＨ６．０におけるＣｙｓ及びＧＳＨのピークエリア値の経時変化をそれぞれ表すグラフである。 図１２は、ｐＨ２．５におけるＣｙｓ及びＧＳＨのピークエリア値の経時変化をそれぞれ表すグラフである。 図１３は、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ６．０、及びｐＨ２．５におけるＣｙｓのピークエリア値の経時変化を表すグラフである。 図１４は、ＥＭＭによる誘導体化システインのピーク又は誘導体化シスチンのピークを示すクロマトグラムの一例である。
　以下、本発明について実施形態及び例示物を示して詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施形態及び例示物に限定されるものではない。また、「剤」は、単一の物質であってもよく、二種以上の物質から構成される組成物であってもよい。
［１．有機物質の誘導体の製造方法］
　本発明の一実施形態に係る有機物質の誘導体の製造方法は、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質を、オレフィン化合物と酸性条件下で反応させて、前記有機物質の誘導体を得ることを含む。
　ここで、前記オレフィン化合物は、少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含む。
［１．１．有機物質］
　有機物質は、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含み、好ましくはスルファニル及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含み、より好ましくはスルファニルを含む。ここで、スルファニルは、－（Ｓ）ｎ－ＳＨで表される基であり、セラニルは、－ＳｅＨで表される基であり、スルフィノは、－（Ｓ＝Ｏ）－ＯＨで表される基である。
　以下、「スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基」を、「基Ａ」ということがある。
　本発明では、スルファニルは、－（Ｓ）ｎ－ＳＨで表される基（ｎは、０以上の整数を表す）である。
　本実施形態に係る誘導体の製造方法によれば、－Ｓ－ＳＨ及び－Ｓ－Ｓ－ＳＨのような－（Ｓ）ｎ－ＳＨで表される基（ただし、ｎは、１以上の整数である。）を有する有機物質（以下、過硫化物ともいう。）も、オレフィン化合物により誘導体化できる。かかる過硫化物（例えば、過硫化システイン）は、生体内において酸化還元に関わる重要な役割を有している。本実施形態に係る誘導体の製造方法によれば、過硫化物を、その酸化還元状態を保持したまま誘導化できるため、生体における酸化還元状態を把握することができる。スルファニルを含む有機物質（特に、血液、唾液、尿、糞便等の生体試料中の天然有機物質）の種類数及び存在量の多さ等の観点より、－（Ｓ）ｎ－ＳＨで表される基のｎは、好ましくは０、１、２、又は３であり、より好ましくは０、１又は２であり、さらにより好ましくは０又は１であり、特に好ましくは０である。
　本発明ではまた、セラニルは、－ＳｅＨで表される基である。セレン原子は、周期表において硫黄原子と同じく第１６族に属する原子であり、硫黄原子と同様の反応性を示す。したがって、オレフィン化合物に対する有機物質中のセレン原子の反応性は、オレフィン化合物に対する有機物質中の硫黄原子の反応性と同様であるため、有機物質中の硫黄原子に対して良好に反応することができるエチレン構造を有する後述のオレフィン化合物は、有機物質中のセレン原子に対しても同様に良好に反応することができる。
　スルファニル、セラニル、及びスルフィノ（－Ｓ（＝Ｏ）－ＯＨ）からなる群より選択される１種以上の基は、有機物質一分子中に複数個含まれていてもよい。
　また、有機物質は、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基の他に、１個又は複数（例、２個、３個、４個）の官能基を有していてもよい。
　官能基の例としては、特に限定されないが、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシが挙げられる。
　一実施形態において、有機物質は、基Ａの他に、アミノ基を含んでいてもよい。ここで、有機物質が基Ａの他に含みうるアミノ基には、無置換のアミノ基（－ＮＨ２）に加えて、一置換アミノ基及び二置換アミノ基が包含される。有機物質が基Ａの他に含みうるアミノ基としては、無置換のアミノ基及び一置換アミノ基からなる群より選択される一種以上が好ましく、無置換のアミノ基がより好ましい。基Ａを含む有機物質は、一分子中にアミノ基を１個のみ含んでいてもよく、複数個含んでいてもよい。有機物質一分子に含まれるアミノ基の数は、１個、２個、又は３個、好ましくは１個又は２個、より好ましくは１個であってよい。
　有機物質は、後述の試料に由来するものであってよい。
　有機物質は、高分子化合物であってもよく、低分子化合物であってもよい。好ましくは、有機物質は低分子化合物である。
　低分子化合物とは、分子量１５００以下の化合物をいう。低分子化合物の分子量は、１２００以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、又は３００以下であってもよい。低分子化合物の分子量はまた、３０以上、４０以上、又は５０以上であってもよい。
　低分子化合物は、アミノ酸（例、システイン、セレノシステイン）、ペプチド性化合物、又はこれらの塩であってもよい。
　ここで、ペプチド性化合物とは、２分子以上のアミノ酸が縮合して得られる構造を有する化合物である。
　有機物質は、高分子化合物であるペプチド性化合物であってもよい。高分子化合物であるペプチド性化合物の例としては、アルブミンなどのタンパク質が挙げられる。
　有機物質は、天然化合物であってもよく、合成化合物であってもよい。
　有機物質の具体例としては、システイン、還元型グルタチオン、γ－グルタミルシステイン、システイニルグリシン、ホモシステイン、Ｎ－アセチルシステイン、過硫化システイン（例、Ｓ－メルカプトシステイン、Ｓ－ジスルファニルシステイン、Ｓ－トリスルファニルシステイン）、ヒポタウリン、過硫化グルタチオン、システイン残基を含むペプチド性化合物、アリルメルカプタン、２－フルフリルチオール、３－メルカプト－３－メチルブチルホルメート、３－スルファニル－１－ヘキサノール、チオフェン－２－イルメタンチオール、１，６－ヘキサンジチオール、４－メチル－４－スルファニルペンタン－２－オン、３－スルファニルペンタン－２－オン、チオテルピネオール、４－メトキシ－２－メチルブタン－２－チオールが挙げられる。
　有機物質は、１種単独であってもよいし、２種以上の組み合わせであってもよい。
　有機物質は、システイン、還元型グルタチオン、γ－グルタミルシステイン、システイニルグリシン、ホモシステイン、Ｎ－アセチルシステイン、過硫化システイン（例、Ｓ－メルカプトシステイン、Ｓ－ジスルファニルシステイン、Ｓ－トリスルファニルシステイン）、ヒポタウリン、過硫化グルタチオン、及びシステイン残基を含むペプチド性化合物からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
　ここで、システイン残基を含むペプチド性化合物は、低分子化合物（例、オリゴぺプチド）又は高分子化合物（例、タンパク質）でありうる。
［１．２．オレフィン化合物］
　オレフィン化合物は、少なくとも２個の電子求引基を有するエチレン構造（エテン構造）を含み、当該エチレン構造を介して有機物質中のスルファニル、セラニル、又はスルフィノと反応することができる化合物である。ただし、本明細書において、電子求引基には、ハロゲン原子は含まれない。
　エチレン構造が有する電子求引基は、通常２個以上、通常４個以下であり、好ましくは２個以上３個以下、より好ましくは２個である。電子求引基の個数が、前記範囲にあることにより、オレフィン化合物と有機物質との反応性が向上する。
　電子求引基は、１価であっても、２価であってもよい。
　エチレン構造が有する電子求引基の個数は、エチレン構造と電子求引基との結合の本数を意味する。したがって、ある電子求引基が、２価の基であり、その電子求引基が、２本の結合手を用いて一つのエチレン構造に結合している場合、エチレン構造が有する電子求引基の個数は、２個でありうる。
　オレフィン化合物は、好ましくは、２個の電子求引基が、エチレン構造を構成する同一の炭素原子に結合していることが好ましい。これにより、エチレン構造において、２個の電子求引基が結合する一方の炭素原子とは他方の炭素原子における反応性を向上させうる。
　エチレン構造における同一の炭素原子に２個の電子求引基が結合している場合、及び、エチレン構造における隣接する炭素原子にそれぞれ電子求引基が結合している場合、当該２個の電子求引基は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、環を形成していてもよい。
　オレフィン化合物は、好ましくは、エチレン構造が有する電子求引基のうち、少なくとも２個が、同一の基であることが好ましい。
　オレフィン化合物は、エチレン構造が有する電子求引基のうち、少なくとも２個が、同一の基であり、当該同一である２個の電子求引基が、エチレン構造を構成する同一の炭素原子に結合していることがより好ましい。
　オレフィン化合物は、エチレン構造が２個の同一の電子求引基を有し、当該同一である２個の電子求引基が、エチレン構造を構成する同一の炭素原子に結合し、２個の電子求引基が結合する炭素原子とは他方の炭素原子に、２個の同一の基（水素原子であってもよい）が結合していることが更に好ましい。
　これにより、オレフィン化合物と有機物質との反応により、有機物質が、ジアステレオマーである２種の誘導体へ変換されることを防ぎうる。
　エチレン構造は、電子求引基以外の基を有していてもよい。
　エチレン構造が有しうる電子求引基以外の基の例としては、１価の炭化水素基が挙げられ、好ましくは１価の鎖状炭化水素及び１価の芳香族炭化水素基からなる群より選択される１種以上であり、より好ましくはアルキル及びアリールからなる群より選択される１種以上である。
　好ましくは、エチレン構造は、電子求引基以外の基を有さない。
　電子求引基の例としては、特に限定されないが、－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ１、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｒ２、－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＲ３）２、シアノ、ハロゲン原子で置換されたアルキル（例、トリフルオロメチルなどのパーフルオロアルキル、トリクロロメチルなどのパークロロアルキル）、カルボキシ、ニトロ、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ５、及び－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６Ｒ７が挙げられる。
　ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、各々独立して、１価の炭化水素基又は１価の複素環基を表し、これらは置換基を有していなくてもよく、置換基を有していてもよい。
　Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、各々独立して、水素原子、１価の炭化水素基、又は１価の複素環基を表し、これらは置換基を有していなくてもよく、置換基を有していてもよい。
　１価の炭化水素基としては、例えば、１価の鎖状炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基、及び１価の芳香族炭化水素基が挙げられる。
　１価の鎖状炭化水素基とは、鎖状構造のみで構成された炭化水素基を意味し、主鎖に環状構造を含まない。ただし、鎖状構造は直鎖状であっても分岐状であってもよい。１価の鎖状炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルが挙げられる。アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、直鎖状、又は分岐状のいずれであってもよい。
　アルキルとしては、炭素原子数１～１２のアルキルが好ましく、炭素原子数１～６のアルキルがより好ましく、炭素原子数１～４のアルキルが更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数１～１２のアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシルが挙げられる。
　アルケニルとしては、炭素原子数２～１２のアルケニルが好ましく、炭素原子数２～６のアルケニルがより好ましく、炭素原子数２～４のアルケニルが更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２～１２のアルケニルとしては、例えば、ビニル、プロペニル、ｎ－ブテニルが挙げられる。
　アルキニルとしては、炭素原子数２～１２のアルキニルが好ましく、炭素原子数２～６のアルキニルがより好ましく、炭素原子数２～４のアルキニルが更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２～１２のアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ｎ－ブチニルが挙げられる。
　１価の鎖状炭化水素基としては、アルキルが好ましい。
　１価の脂環式炭化水素基とは、環構造として脂環式炭化水素のみを含み、芳香族環を含まない炭化水素基を意味し、脂環式炭化水素は単環、多環のいずれであってもよい。ただし、脂環式炭化水素のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造を含んでいてもよい。１価の脂環式炭化水素基としては、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルが挙げられ、これらは、単環、多環のいずれであってもよい。
　シクロアルキルとしては、炭素原子数３～１２のシクロアルキルが好ましく、炭素原子数３～６のシクロアルキルがより好ましく、炭素原子数５～６のシクロアルキルが更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３～１２のシクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
　シクロアルケニルとしては、炭素原子数３～１２のシクロアルケニルが好ましく、炭素原子数３～６のシクロアルケニルがより好ましく、炭素原子数５～６のシクロアルケニルが更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３～１２のシクロアルケニルとしては、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルが挙げられる。
　シクロアルキニルとしては、炭素原子数３～１２のシクロアルキニルが好ましく、炭素原子数３～６のシクロアルキニルがより好ましく、炭素原子数５～６のシクロアルキニルが更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３～１２のシクロアルキニルとしては、例えば、シクロプロピニル、シクロブチニル、シクロペンチニル、シクロヘキシニルが挙げられる。
　１価の脂環式炭化水素基としては、シクロアルキルが好ましい。
　１価の芳香族炭化水素基とは、芳香族環構造を含む炭化水素基を意味する。ただし、芳香族環のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造、脂環式炭化水素構造などの構造を含んでいてもよい。したがって、１価の芳香族炭化水素基は、アラルキルでありうる。芳香族環は単環、多環のいずれであってもよい。１価の芳香族炭化水素基としては、炭素原子数６～１２のアリールが好ましく、炭素原子数６～１０のアリールがより好ましく、炭素原子数６のアリールが更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数６～１２のアリールとしては、例えば、フェニル、ナフチルが挙げられる。
　１価の芳香族炭化水素基としては、フェニルが好ましい。
　これらの中でも、１価の炭化水素基としては、アルキル、シクロアルキル、アリールが好ましく、アルキル又はアリールがより好ましい。
　１価の複素環基とは、複素環を含む環式化合物から、水素原子１個を除いた基をいう。複素環基を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。１価の複素環基は、１価の芳香族複素環基、又は１価の非芳香族複素環基である。
　１価の芳香族複素環基とは、芳香族性を有する環を含む複素環基をいう。１価の芳香族複素環基としては、炭素原子数１～１５の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数１～９の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数１～６の芳香族複素環基が更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インドリル、プリニル、アントラキノリル、カルバゾニル、フルオレニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、アクリジニル、クマリニル、キサンテニル、及びフタラジニルが挙げられる。
　１価の非芳香族複素環基とは、芳香族性を有する環を含まない複素環基をいう。１価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数２～１５の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数２～９の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数２～６の非芳香族複素環基が更に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の非芳香族複素環基としては、例えば、オキシラニル、アジリジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ジヒドロオキサジニル、テトラヒドロオキサジニル、ジヒドロピリミジニル、及びテトラヒドロピリミジニルが挙げられる。
　これらの中でも、１価の複素環基としては、５員又は６員の複素環基が好ましい。
　置換基の例としては、
　１価の炭化水素基（更にハロゲン原子により置換されていてもよい）、
　１価の複素環基（更にハロゲン原子により置換されていてもよい。）、
　－Ｏ－Ｒｓ１（ここで、Ｒｓ１は水素原子又は１価の炭化水素基を表す。）、
　－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｓ２（ここで、Ｒｓ２は水素原子又は１価の炭化水素基を表す。）、
　－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－Ｒｓ３（ここで、Ｒｓ３は水素原子又は１価の炭化水素基を表す。）、
　－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｓ４（ここで、Ｒｓ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表す。）、
　－Ｎ（Ｒｓ５）２（ここで、複数あるＲｓ５は、各々独立して、水素原子又は１価の炭化水素基を表す。）、
　－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｓ６）２（ここで、複数あるＲｓ６は、各々独立して、水素原子又は１価の炭化水素基を表す。）、
　－Ｎ（Ｒｓ７）－（Ｃ＝Ｏ）－Ｒｓ８（ここで、Ｒｓ７は水素原子又は１価の炭化水素基を表す。Ｒｓ８は１価の炭化水素基を表す。）、
　－ＳＯ２－Ｒｓ９（ここで、Ｒｓ９はヒドロキシ又は１価の炭化水素基を表す。）、
　－Ｓ（＝Ｏ）－Ｒｓ１０（ここで、Ｒｓ１０はヒドロキシ又は１価の炭化水素基を表す。）、
　ニトロ、
　シアノ、及び
　ハロゲン原子
が挙げられる。
　ここで、ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子又は塩素原子である。
　置換基は、好ましくは、１価の炭化水素基（更にハロゲン原子により置換されていてもよい）、ニトロ、シアノ、及びハロゲン原子からなる群より選択される１種以上である。
　電子求引基は、
　好ましくは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ１、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｒ２、－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＲ３）２、シアノ、ハロゲン原子で置換されたアルキル、カルボキシ、ニトロ、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ５、及び－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６Ｒ７からなる群より選択される１種以上であり、
　より好ましくは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ１、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｒ２、－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＲ３）２、シアノ、ハロゲン原子で置換されたアルキル、及びカルボキシからなる群より選択される１種以上であり、
　更に好ましくは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ１、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｒ２、－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＲ３）２、及びシアノからなる群より選択される１種以上である。
　ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は前記定義と同様である。
　Ｒ１は、好ましくは１価の炭化水素基であり、より好ましくは１価の鎖状炭化水素基であり、更に好ましくはアルキルであり、特に好ましくは炭素原子数１～４のアルキルである。
　Ｒ２は、好ましくは１価の炭化水素基であり、より好ましくは１価の芳香族炭化水素基であり、更に好ましくはアリールであり、特に好ましくはフェニルである。
　Ｒ３は、好ましくは１価の炭化水素基であり、より好ましくは１価の鎖状炭化水素基であり、更に好ましくはアルキルである。
　Ｒ４は、好ましくは１価の炭化水素基であり、より好ましくは１価の芳香族炭化水素基であり、更に好ましくはアリールである。
　Ｒ５は、好ましくは１価の炭化水素基であり、より好ましくは１価の芳香族炭化水素基であり、更に好ましくはアリールである。
　Ｒ６は、好ましくは水素原子又は１価の炭化水素基であり、より好ましくは水素原子である。
　Ｒ７は、好ましくは水素原子又は１価の炭化水素基であり、より好ましくは１価の炭化水素基であり、更に好ましくは１価の鎖状炭化水素基又は１価の芳香族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル又はアリールである。
　オレフィン化合物は、好ましくは、有機物質との反応性の向上等の観点より、下記式（Ｉ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式（Ｉ）において、ＥＷＧ１及びＥＷＧ２は、各々独立して、電子求引基を表し、これらが結合する炭素原子と一緒になって、環を形成していてもよい。
　電子求引基の好ましい例は、前記の例と同様である。
　ＥＷＧ１及びＥＷＧ２は、好ましくは同じ基である。これにより、オレフィン化合物と有機物質との反応により生じる有機物質の誘導体が、ジアステレオマーである２種の誘導体となることを防ぎうる。
　オレフィン化合物は、従前公知の方法により、製造されうる。また、オレフィン化合物として、市販品を用いることができる。
［１．３．反応条件］
　本実施形態の製造方法では、有機物質とオレフィン化合物とを、酸性条件下で反応させる。これにより、有機物質が有する基Ａの酸化反応を抑制しうる。また反応系にジスルフィド化合物などの酸化物が共存する場合には、基Ａと当該酸化物との反応を抑制しうる。その結果、有機物質を効率的に誘導体へ変換できる。
　酸性条件下とは、有機物質及びオレフィン化合物の反応を、酸性溶液中で行うことを意味する。有機物質及びオレフィン化合物は、酸性溶液中にすべて溶解していなくともよく、有機物質及びオレフィン化合物が酸性溶液中に分散している状態で反応を行ってもよい。
　酸性溶液は、通常ｐＨ７未満、好ましくはｐＨ６．５以下、より好ましくはｐＨ６．０以下、更に好ましくはｐＨ６．０未満、特に好ましくは、ｐＨ５．５以下、ｐＨ５．２５以下、ｐＨ５．０以下、ｐＨ４．７５以下、ｐＨ４．５以下、又はｐＨ４．２５以下であり、好ましくはｐＨ０．０以上、より好ましくはｐＨ２．０以上である。酸性溶液のｐＨを、前記範囲とすることにより、誘導体の分解を抑制しつつ、有機物質の酸化、ジスルフィド化合物と交換反応などの副反応を効果的に抑制できる。
　ここで、酸性溶液のｐＨ及び後述する中性又は塩基性溶液のｐＨは、ガラス電極法を用いたｐＨ計により、温度２５℃の条件で測定しうる。
　酸性溶液は、好ましくは、水を含む溶液である。酸性溶液は、水以外に、有機溶媒を含んでいてもよい。有機溶媒としては、水と任意の割合で混合しうる溶媒が好ましい。かかる有機溶媒の例としては、メタノール、エタノールなどのアルコール溶媒；アセトニトリルなどのニトリル溶媒；ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの非プロトン性極性溶媒が挙げられる。
　酸性溶液が、水を含む溶液である場合、水に対する溶液中の有機溶媒の重量は、好ましくは５０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下、更に好ましくは５重量％以下であり、通常０重量％以上である。
　より好ましくは、酸性溶液は、水溶液である。
　酸性溶液は、通常酸を含む。酸の例としては、無機酸及び有機酸が挙げられる。無機酸の例としては、リン酸、塩酸、硫酸、及び過塩素酸が挙げられる。有機酸の例としては、ギ酸、シュウ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、及びシアノ酢酸が挙げられる。
　酸性溶液として、ｐＨを所望の範囲に調整した緩衝液を用いてもよい。
　酸性条件下での反応温度は、特に限定されないが、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４５℃以下、更に好ましくは４０℃以下であり、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃以上、更に好ましくは１５℃以上である。
　酸性条件下での反応時間は、特に限定されないが、好ましくは６０分間以下、より好ましくは３０分間以下、更に好ましくは１５分間以下であり、通常０分間以上である。
　通常酸性条件下での反応は、有機物質及びオレフィン化合物を、酸性溶液中で混合することにより行う。
　酸性溶液中で有機物質及びオレフィン化合物を混合する方法に特に限定はなく、例えば、１）有機物質を含む酸性溶液を調製し、これにオレフィン化合物を添加して混合する方法、２）有機物質を含む溶液を調製し、これに緩衝液などを添加して、ｐＨを所望の範囲に調整した後、オレフィン化合物を添加して混合する方法が挙げられる。
　有機物質の酸化反応を抑制する観点から、有機物質を含む酸性溶液を調製し、得られた溶液に、オレフィン化合物を添加して混合することが好ましい。オレフィン化合物は、そのままの形態で、又は溶媒（水、有機溶媒）に溶解させた溶液の形態で、添加してもよい。
　酸性溶液中の有機物質の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌとしてもよい。
　オレフィン化合物の有機物質に対する量は、特に限定されないが、例えば、モル比率で、１～１００としてもよい。
　前記有機物質が、基Ａの他にアミノ基を含む場合、前記有機物質を前記オレフィン化合物と酸性条件下で反応させた後、更に中性又は塩基性条件下（好ましくは塩基性条件下）で反応させて前記有機物質の誘導体を得てもよい。
　これにより、有機物質に含まれる基Ａが、酸性条件下で前記オレフィン化合物と反応して酸化などの副反応に対して安定な置換基に変換される。次いで、中性又は塩基性条件下で、有機物質に含まれるアミノ基（無置換アミノ基、一置換アミノ基、二置換アミノ基でありうる。）が前記オレフィン化合物と反応して、オレフィン化合物に由来する置換基を有する、置換アミノ基（有機物質に含まれるアミノ基が二置換アミノ基である場合には、置換アンモニオ基）に変換される。
　かかる製造方法により、有機物質が含む基Ａ及び有機物質が含みうるアミノ基の双方が前記オレフィン化合物と反応して、基Ａ及びアミノ基の双方が変換された誘導体が得られる。
　より置換されたアミノ基を含む誘導体は、置換される前のアミノ基を含む誘導体と比較して、製造及び分析上の利点を有する。通常、より置換されたアミノ基は、置換される前のアミノ基と比較して疎水性が向上する。そのため、液体クロマトグラフィーにおいて、有機物質の誘導体の分離条件を容易に設定できることが多い。一方、置換程度の低いアミノ基を含む誘導体（例：システイン、還元型グルタチオン等の、無置換アミノ基を含む誘導体）は、親水性が高いため、逆相液体クロマトグラフィーにおいて保持が弱く、また親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）においては保持が極めて強く、分離条件を容易に設定できない場合がある。また、より置換されたアミノ基を含む誘導体は、置換される前のアミノ基を含む誘導体と比較して、質量分析計での検出感度が高いことが多い。
　中性又は塩基性条件下とは、酸性条件下で反応させた有機物質（以下、酸性条件下誘導体ともいう。）を、オレフィン化合物と中性又は塩基性溶液中で反応させることを意味する。酸性条件下誘導体及びオレフィン化合物は、溶液中にすべて溶解していなくともよく、酸性条件下誘導体及びオレフィン化合物が溶液中に分散している状態で反応を行ってもよい。
　中性又は塩基性溶液は、通常ｐＨ７以上、好ましくはｐＨ７．５以上、より好ましくはｐＨ８以上、更に好ましくはｐＨ８．５以上であり、好ましくはｐＨ１１以下、より好ましくはｐＨ１０以下、更に好ましくはｐＨ９．５以下である。中性又は塩基性溶液のｐＨを、前記範囲とすることにより、有機物質が含みうるアミノ基とオレフィン化合物との反応を促進させ、誘導体の分解を抑制できる。
　中性又は塩基性溶液は、好ましくは、水を含む溶液である。中性又は塩基性溶液は、水以外に、有機溶媒を含んでいてもよい。有機溶媒としては、水と任意の割合で混合しうる溶媒が好ましい。かかる有機溶媒の例としては、酸性溶液の説明において例示された有機溶媒が挙げられる。
　中性又は塩基性溶液が、水を含む溶液である場合、水に対する溶液中の有機溶媒の重量の範囲は、前記酸性溶液の説明において挙げた好ましい範囲と同様の範囲としうる。より好ましくは、中性又は塩基性溶液は、水溶液である。
　塩基性溶液は、通常塩基を含む。塩基の例としては、無機塩基及び有機塩基が挙げられる。無機塩基の例としては、金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム）、金属炭酸塩（例、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム）、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、アンモニア、ホウ酸ナトリウム、及びホウ酸カリウムが挙げられる。有機塩基の例としては、アミン（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン）が挙げられる。
　中性又は塩基性溶液として、ｐＨを所望の範囲に調整した緩衝液を用いてもよい。
　中性又は塩基性条件下での反応温度は、特に限定されないが、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４５℃以下、更に好ましくは４０℃以下であり、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃以上、更に好ましくは１５℃以上である。
　中性又は塩基性条件下での反応時間は、特に限定されないが、好ましくは６０分間以下、より好ましくは３０分間以下、更に好ましくは１５分間以下であり、通常０分間以上である。
　通常中性又は塩基性条件下での反応は、酸性条件下誘導体及びオレフィン化合物を、中性又は塩基性溶液中で混合することにより行う。
　酸性条件下誘導体を酸性溶液から単離してから、中性又は塩基性溶液中でオレフィン化合物と混合してもよい。または、酸性条件下誘導体を酸性溶液から単離することなく、酸性溶液の液性を所望とする中性又は塩基性のｐＨに調整して、中性又は塩基性溶液中でオレフィン化合物と混合してもよい。
　前記のとおり酸性条件下誘導体を単離せずにオレフィン化合物と溶液中で混合する場合、オレフィン化合物を新たに溶液中に添加してもよい。または、酸性条件下における反応の際に、オレフィン化合物を過剰量添加しておき、余剰となるオレフィン化合物を、中性又は塩基性条件下での反応に用いることとしてもよい。
　有機物質の誘導体の生成は、例えば、液体クロマトグラフィー、質量分析法などの方法により確認できる。
　本実施形態の誘導体の製造方法は、有機物質をオレフィン化合物と反応させる反応工程の他に、任意の工程を含みうる。任意の工程の例としては、例えば、反応工程の後、誘導体を含む反応液を希釈する工程、反応液から誘導体を単離する工程が挙げられる。
　前記の方法により製造された有機物質の誘導体は、基Ａが、酸化に対してより安定な基に変換されている。したがって、有機物質をそのまま分析する場合と比較して、有機物質の誘導体は、より正確に分析されうる。
［２．有機物質を含む試料の分析方法］
　本発明の一実施形態に係る、有機物質を含む試料の分析方法は、（１）スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質を含む試料と、
　少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物とを、
　酸性条件下で混合して、前記有機物質の誘導体を含む処理試料を得ること、及び
　（２）前記処理試料中の、前記有機物質の誘導体を分析すること、を含む。
［２．１．工程（１）］
　工程（１）では、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基（基Ａ）を含む有機物質を含む試料と、少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物とを、酸性条件下で混合して、有機物質の誘導体を含む処理試料を得る。
　有機物質の例及び好ましい例としては、前記と同様の例が挙げられる。複数種の有機物質が、試料中に含まれていてもよい。
　有機物質を含む試料の例としては、特に限定されず、生物由来の生物学的試料、並びに、有機合成反応により得られる合成試料、天然環境中に存在する環境試料などの非生物学的試料が挙げられる。生物学的試料が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類等の動物、昆虫、軟体動物、微生物、植物が挙げられるが、好ましくは哺乳動物である。生物学的試料の種類としては、例えば、血液試料（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、糞便、胆汁、汗、涙、脳脊髄液、細胞もしくは微生物の培養に使用した培養液、並びに組織及び細胞抽出液等が挙げられる。合成試料としては、例えば、有機物質を生じる有機合成反応により得られる反応生成物、細胞もしくは微生物の培養に使用する培地が挙げられる。環境試料としては、例えば、土壌、海水、及び淡水由来等の試料が挙げられる。
　試料における有機物質及びオレフィン化合物の濃度は、これらが反応して有機物質の誘導体が生成し、かつその生成物を分析できるような濃度である限り特に限定されない。試料における有機物質及びオレフィン化合物の各濃度は、例えば０．００１μｍｏｌ／Ｌ～１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１ｍｍｏｌ／Ｌであってもよい。
　試料は、例えば除タンパク処理などの前処理を行った試料であってもよい。
　本実施形態における分析方法では、酸性条件下で試料を処理するので、例えば前処理として除タンパク処理などの酸性処理を行った後に、試料の液性を中性～塩基性に調整しなくてもよく、試料の液性を酸性に保ったまま、試料をオレフィン化合物と混合できる。酸性条件下では、基Ａの酸化反応、基Ａとジスルフィドとの交換反応などの副反応は進行しにくい。したがって、前処理を行った後、分析までの間に、副反応が進行することを抑制できる。その結果、基Ａを有する有機物質をより正確に分析できる。
　試料は、ジスルフィド化合物を含みうる。ジスルフィド化合物は、－Ｓ－Ｓ－で表される基を含む化合物である。ジスルフィド化合物は、チオールの酸化により生じうる。
　例えば、生体試料において、チオール（例、システイン、還元型グルタチオン）と、ジスルフィド化合物（例、シスチン、酸化型グルタチオン）との存在比の情報は、生体試料の酸化還元状態を知るうえで有用である。
　本実施形態の分析方法では、有機物質に含まれる酸化されやすいスルファニルなどの基Ａをオレフィン化合物と反応させて、有機物質を誘導体に変換してから分析を行う。また、本実施形態の分析方法では、酸性条件下で試料を処理する。前記のとおり、酸性条件下では、チオールとジスルフィド化合物との交換反応が起こりにくい。そのため、試料中に含まれる、有機物質の存在量を正確に決定することができる。
　試料が含みうるジスルフィド化合物の例としては、前記有機物質が有しうるスルファニルが、分子間で反応してジスルフィドへ変換されている化合物が挙げられ、更に具体的には、ジメチルジスルフィド、ジエチルジスルフィド、酸化型グルタチオン及びシスチンが挙げられる。
　試料が含みうるジスルフィド化合物は、アミノ基を含みうる。ここで、ジスルフィド化合物が含みうるアミノ基には、無置換のアミノ基（－ＮＨ２）に加えて、一置換アミノ基及び二置換アミノ基が包含される。ジスルフィド化合物が含みうるアミノ基としては、無置換のアミノ基及び一置換アミノ基からなる群より選択される一種以上が好ましく、無置換のアミノ基がより好ましい。ジスルフィド化合物は、一分子中にアミノ基を１個のみ含んでいてもよく、複数個含んでいてもよい。ジスルフィド化合物一分子に含まれうるアミノ基の数は、１個、２個、３個、又は４個、好ましくは１個、２個、又は３個、より好ましくは１個又は２個であってよい。
　一実施形態においては、試料は、酸化型グルタチオン及びシスチンからなる群より選択される１種以上を含む。
　オレフィン化合物の例及び好ましい例としては、前記と同様の例が挙げられる。
　有機物質を含む試料と、オレフィン化合物とを、酸性条件下で混合することにより、有機物質の誘導体を含む処理試料を得る。
　好ましくは、有機物質を含む試料と、オレフィン化合物との混合を、酸性溶液中で行う。酸性溶液の種類及び酸性溶液のｐＨは、［１．３．反応条件］において述べた好ましい例と同様とすることができる。
　混合方法は特に限定されず、例えば、１）有機物質を含む試料と所望のｐＨ値を有する酸性溶液とを含む溶液を調製し、これにオレフィン化合物を添加して混合する方法、２）有機物質を含む試料を希塩酸、溶媒などで希釈して溶液とし、これに緩衝液などを添加してｐＨを所望の範囲に調整した後、オレフィン化合物を添加して混合する方法が挙げられる。
　処理温度及び処理時間は、特に限定されないが、［１．３．反応条件］において述べた反応温度及び反応時間の好ましい例と同様とすることができる。
　有機物質が、基Ａに更にアミノ基を含む場合、工程（１）は、工程（１’）を含むものであることが好ましい。
　工程（１’）では、前記試料と、前記オレフィン化合物とを、酸性条件下で混合した後、更に中性又は塩基性条件下で混合して、前記有機物質の誘導体を含む処理試料を得る。
　前記のとおり、試料中の有機物質に含まれる基Ａは、酸性条件下で前記オレフィン化合物と反応して、酸化などの副反応に対して安定な置換基に変換される。次いで、中性又は塩基性条件下で、有機物質に含まれるアミノ基（無置換アミノ基、一置換アミノ基、二置換アミノ基でありうる。）が前記オレフィン化合物と反応して、置換アミノ基（有機物質に含まれるアミノ基が二置換アミノ基である場合には、置換アンモニオ基）に変換されて、有機物質の誘導体が得られる。より置換されたアミノ基は、前記のとおり、疎水性が向上しているので、置換程度の低いアミノ基がより置換されたアミノ基に変換された誘導体は、通常液体クロマトグラフィーにおいて分離条件を容易に設定でき、分離が容易である。また、置換程度の低いアミノ基がより置換されたアミノ基に変換された誘導体は、通常質量分析計での検出感度が上昇する。
　試料中に、置換程度の低いアミノ基を含む化合物（例えば、無置換アミノ基を含むジスルフィド化合物）が含まれている場合には、当該化合物は親水性が高いため、逆相液体クロマトグラフィーにおいて保持が弱く、また親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）においては保持が極めて強く、分離条件を容易に設定できない場合がある。
　このように試料中に置換程度の低いアミノ基を含む化合物が含まれている場合であっても、無置換アミノ基を含むジスルフィド化合物などの置換程度の低いアミノ基を含む化合物は、中性又は塩基性条件下で、アミノ基が前記オレフィン化合物と反応して、より置換されたアミノ基（アミノ基が二置換アミノ基である場合には、置換アンモニオ基）に変換される。有機物質の誘導体と同様、アミノ基がより置換されたアミノ基に変換されたジスルフィド化合物などの化合物も、通常液体クロマトグラフィーにおいて分離条件を容易に設定でき、分離が容易である。また、通常質量分析計での検出感度が上昇する。
　例えば、試料中に含まれうる有機物質がシステインであり、試料中に含まれうるジスルフィド化合物が、システインが二量化したシスチンである場合の分析方法について説明する。酸性条件下で前記オレフィン化合物と試料とを混合して得られる酸性条件下の処理試料中には、システインが有するスルファニル基が前記オレフィン化合物と反応して得られる、システインの誘導体（第１誘導体）及びシスチンが存在すると考えられる。
　システインの誘導体は、無置換のアミノ基を１個有し、シスチンは無置換のアミノ基を２個有する。これに起因して、システインの誘導体とシスチンの誘導体とは、疎水性に大きな差が生じる。したがって、液体クロマトグラフィーによる分析の際に、システインの誘導体とシスチンとを同時に分析するための条件を設定することが、容易ではない場合がある。
　一方、試料と前記オレフィン化合物とを酸性条件下で混合した後、更に中性又は塩基性条件下で混合して、中性又は塩基性条件下での処理試料を得る場合、処理試料中には、スルファニル基及びアミノ基が前記オレフィン化合物と反応して得られるシステインの誘導体（第２誘導体）と、アミノ基が前記オレフィン化合物と反応して得られるシスチンの誘導体とが存在すると考えられる。
　システイン及びシスチンのそれぞれのアミノ基が前記オレフィン化合物と反応するので、システインの誘導体（第２誘導体）と、シスチンの誘導体との疎水性の差が、小さくなり、液体クロマトグラフィーによる分析の際に、システインの誘導体とシスチンとを同時に分析するための条件を設定することが比較的容易となる。
　よって、工程（１）を、工程（１’）を含むものとすることにより、試料中における、基Ａの他にアミノ基を含む有機物質を正確かつ容易に分析することができる。
　工程（１’）では、好ましくは有機物質を含む試料と前記オレフィン化合物とを、酸性溶液中で混合した後、更に中性又は塩基性溶液中で混合する。中性又は塩基性溶液の種類及び中性又は塩基性溶液のｐＨは、［１．３．反応条件］において述べた好ましい例と同様とすることができる。
　中性又は塩基性溶液中での混合方法は特に限定されない。例えば、酸性溶液中で試料と前記オレフィン化合物とを混合した後、得られた混合液（酸性条件下の処理試料）に塩基性溶液を添加して、混合液の液性を所望とする中性又は塩基性のｐＨに調整して、中性又は塩基性溶液中で更に試料と前記オレフィン化合物とを混合する方法；用意した中性又は塩基性溶液中に、前記混合液を添加して混合する方法が挙げられる。
　中性又は塩基性条件下での処理温度及び処理時間は、特に限定されないが、［１．３．反応条件］において述べた中性又は塩基性条件下での反応温度及び反応時間の好ましい例と同様とすることができる。
　有機物質を含む試料と前記オレフィン化合物とを、酸性溶液中で混合した後、更に中性又は塩基性溶液中で混合することで、有機物質の誘導体を含む処理試料を得ることができる。
［２．２．工程（２）］
　工程（２）では、処理試料中の、有機物質の誘導体を分析する。
　工程（２）は、工程（２ａ）及び工程（２ｂ）をこの順で含んでいてもよい。
［２．２．１．工程（２ａ）]
　工程（２ａ）では、工程（１）における処理試料から、有機物質の誘導体を分離する。
　分離は、処理試料に含まれる誘導体以外の物質（例えば、ジスルフィド化合物）と誘導体とが分離されうる任意の方法により行いうる。
　分離の方法の例としては、特に限定されないが、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、及びガスクロマトグラフィー（ＧＣ）が挙げられる。試料に含まれる夾雑物の種類及び性質、並びに有機物質の誘導体の種類及び性質により、適宜分離の方法を選択してよい。分離の方法としては、液体クロマトグラフィーが好ましく、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）がより好ましい。これらの分離方法は、従前公知の方法により行いうる。これらの分離方法は、単独で用いても、併用してもよい。
　液体クロマトグラフィーの例としては、逆相液体クロマトグラフィー、順相液体クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
　逆相液体クロマトグラフィーの固定相の例としては、特に限定されないが、オクタデシルシランなどの疎水性化合物により修飾されたシリカゲルが挙げられる。また、移動相の例としては、特に限定されないが、有機溶媒、水溶液、及びこれらの混合溶媒が挙げられる。有機溶媒の好ましい例としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。水溶液の好ましい例としては、水、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、酢酸水溶液、酢酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液、緩衝液等が挙げられる。
　順相液体クロマトグラフィーの固定相の例としては、特に限定されないが、シリカゲル及びアルミナが挙げられる。また、移動相の例としては、特に限定されないが、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、イソプロパノール、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン及びこれらの混合溶媒が挙げられる。
　親水性相互作用クロマトグラフィーの固定相の例としては、特に限定されないが、シリカゲル、及び、アミノプロピル、アミド、ジオール、又はシアノにより修飾されたシリカゲルが挙げられる。また、移動相の例としては、特に限定されないが、有機溶媒、水溶液、及びこれらの混合溶媒が挙げられる。有機溶媒の好ましい例としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。水溶液の好ましい例としては、水、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、酢酸水溶液、酢酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液、緩衝液等が挙げられる。
　親水性相互作用クロマトグラフィーは、逆相クロマトグラフィーの固定相では保持力の弱い、親水性の高い対象を分離する場合に、好ましく用いられる。例えば、オレフィン化合物により誘導体化されない、シスチン、酸化型グルタチオンなどのジスルフィド化合物と、システインの誘導体、還元型グルタチオンの誘導体などの、チオール誘導体とを、親水性相互作用クロマトグラフィーにより同時に分析できる。
　いずれの液体クロマトグラフィーにおいても、キラルな充填剤を装填したカラム（キラルカラム）を用いることにより、有機物質がキラル化合物の混合物である場合に、キラル化合物を分離できる。
　例えば、Ｄ－システイン（天然では存在比率が小さい）の誘導体と、Ｌ－システインの誘導体とを、キラルカラムにより分離できる。
［２．２．２．工程（２ｂ）］
　工程（２ｂ）では、分離された有機物質の誘導体を検出する。
　検出の方法の例としては、特に限定されないが、質量分析計による質量分析法、紫外線吸収の検出（ＵＶ）、フォトダイオードアレイ検出（ＰＤＡ）、蛍光検出（ＦＬ）、可視光線吸収の検出、誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ）、コロナ荷電化粒子検出、示差屈折率検出（ＲＩ）、及び蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）が挙げられる。試料に含まれる夾雑物の種類及び性質、並びに有機物質の誘導体の種類及び性質により、適宜検出の方法を選択してよい。
　検出の方法としては、質量分析、紫外線吸収の検出、蛍光検出、可視光線吸収の検出、及び誘導結合プラズマ発光分光分析法が好ましく、質量分析及び紫外線吸収の検出がより好ましい。これらの検出方法は、単独で用いても、併用してもよい。
　これらの分離方法は、従前公知の方法により行いうる。
　質量分析法は、特に限定されず、各種イオン化方法、各種イオン分離方法、各種検出器を組み合わせた質量分析法を使用してよい。
　質量分析法に用いる質量分析計の具体例としては、三連四重極型質量分析計、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ－ＭＳ）、及びイオントラップ型質量分析計（例、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計）が挙げられる。
［２．３．任意の工程］
　本実施形態の分析方法は、前記工程（１）及び（２）以外に、任意の工程を含んでいてもよい。
　任意の工程の例としては、試料としてアミノ酸を含む試料を用いた場合に、ニンヒドリン、ｏ－フタルアルデヒドなどの、アミノ酸誘導体化試薬により、アミノ酸を誘導体化する工程が挙げられる。アミノ酸を誘導体化する工程は、前記工程（１）の後、工程（２）の前に行うことが好ましい。
　かかる任意の工程を含むことにより、例えば以下の利点が得られる。
　例えば、システイン及びシスチンは、通常アミノ酸アナライザーを用いて同時に分析することが難しい。システイン及びシスチンは、アミノ酸誘導体化剤により誘導体化されると、通常保持時間が同程度となるためである。しかし、工程（１）を行うことにより、システイン及びシスチンのうち、システインのみがオレフィン化合物と反応して誘導体へ変換されるため、アミノ酸誘導体化剤により誘導体化された後のシステインの保持時間がシスチンの保持時間と通常異なることとなる。そのため、本実施形態の分析方法により、システイン及びシスチンを、アミノ酸アナライザーを用いて同時に分析することができる。
［３．有機物質の酸性条件下での誘導体化剤］
　本発明の一実施形態に係る剤は、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の酸性条件下での誘導体化剤であり、少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物を含む。
　オレフィン化合物の例及び好ましい例としては、前記と同様の例が挙げられる。また有機物質の例及び好ましい例としては、前記と同様の例が挙げられる。誘導体化剤を用いて誘導体を製造する際の条件は、酸性である。好ましくは、有機物質の誘導体化は、誘導体化剤を含む酸性溶液中で行う。酸性溶液の種類及び酸性溶液のｐＨは、［１．３．反応条件］において述べた好ましい例と同様とすることができる。
　誘導体化剤中のオレフィン化合物の濃度は、誘導体化剤の希釈率にもよるが、例えば０．００１μｍｏｌ／Ｌ～１０００ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌであってもよい。
［４．有機物質の分析用試薬］
　本発明の一実施形態に係る試薬は、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の分析用試薬であり、前記誘導体化剤を含む。
　オレフィン化合物の例及び好ましい例としては、前記と同様の例が挙げられる。また有機物質の例及び好ましい例としては、前記と同様の例が挙げられる。
　分析用試薬中のオレフィン化合物の濃度は、分析用試薬の希釈率にもよるが、例えば０．００１μｍ／Ｌ～１０００ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌであってもよい。
　分析用試薬は、好ましくは、前記工程（１）及び工程（２）を含む、試料の分析方法において用いられる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。下記の操作は、特に断らない限り、大気圧下、常温で行った。
［略語の説明］
　下記において、略語は以下の意味を表す。
（オレフィン化合物（誘導体化剤））
　ＥＭＭ：Ｄｉｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｍａｌｏｎａｔｅ
　ＢＰＳＥ：１，１－Ｂｉｓ（ｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅ
　ＢＥＰＥ：１，１－Ｂｉｓ（ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅ
　ＮＥＭ：Ｎ－Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記化学式において、「Ｐｈ」はフェニルを表し、「Ｅｔ」はエチルを表す。
（有機物質（含カルコゲン化合物））
・チオール類
Ｃｙｓ：システイン
Ｃｙｓ２：シスチン
ＧＳＨ：グルタチオン・還元型
ＧＳＳＧ：グルタチオン・酸化型
ｇＥＣ：γ－グルタミルシステイン
ＣＧ：システイニルグリシン
Ｈｃｙ：ホモシステイン
ＮＡＣ：Ｎ－アセチルシステイン
・過硫化システイン類
Ｃｙｓ－ＳＨ：Ｓ－ｍｅｒｃａｐｔｏｃｙｓｔｅｉｎｅ
Ｃｙｓ－ＳＳＨ：Ｓ－ｄｉｓｕｌｆａｎｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（装置・分析法など）
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置
ＨＩＬＩＣ：Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（親水性相互作用クロマトグラフィー）
［実施例Ａ：ＥＭＭ、ＮＥＭを用いた実施例］
［実施例Ａ１］酸性条件における、ＥＭＭ、ＮＥＭとシステイン（Ｃｙｓ）との反応
　本実施例では、ＥＭＭ及びＮＥＭの酸性条件下での反応性を、反応後の残存Ｃｙｓ量から見積もった。また、ＥＭＭ誘導体化ＣｙｓピークをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（Ａ１－１．誘導体の製造）
　Ｌ－システイン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう、０．１％ギ酸溶液（富士フイルム和光純薬製、純水にて希釈して調製）に溶解した。誘導体化剤ＥＭＭ（Ａｓｔａ　Ｔｅｃｈ製）はアセトニトリル（富士フイルム和光純薬製）に１０μＬ／ｍＬとなるように、誘導体化剤ＮＥＭ（和光純薬製）はアセトニトリルに１０ｍｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ溶解させた。システイン溶液１０μＬに対して誘導体化剤溶液（ＥＭＭ又はＮＥＭ）１０μＬ、もしくはアセトニトリルを１０μＬを加え、室温で１０分間放置した。反応後、０．１％ギ酸を９８０μＬ加えてよく攪拌してサンプル溶液とした。
（Ａ１－２．誘導体の分析）
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて下記条件でサンプル溶液を分析した。ＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、タンデム質量分析装置は３２００ＱＴＲＡＰシステム（Ｓｃｉｅｘ製）を用いた。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：０．１％ギ酸、移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：５－８０％Ｂ（０－８ｍｉｎ）、８０％Ｂ（８－１０ｍｉｎ）、８０－５％Ｂ（１０－１０．５ｍｉｎ）、５％Ｂ（１０．５－１５ｍｉｎ）
・カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　Ｃ１８　３．５μｍ、２．１×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・カラム温度：４０℃
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１μＬ
　（ＭＳ／ＭＳ条件）
　下表の条件で行った。下表において、「ＮＥＭ－Ｃｙｓ」及び「ＥＭＭ－Ｃｙｓ」はそれぞれＮＥＭにより誘導体化されたＣｙｓ、ＥＭＭにより誘導体化されたＣｙｓを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（分析結果）
　非誘導体化Ｃｙｓのピークを１．３６分に、ＮＥＭ－Ｃｙｓピークをそれぞれ２．００、２．１４分（ジアステレオマーが生じるため２ピーク観測される。）に、ＥＭＭ－Ｃｙｓピークを８．２３分に確認した。それぞれのピークを積分した。測定は２回行い、結果は２回の測定の平均値とした。
　誘導体化率は、下記式（１）により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　分析結果を下表に示す。また、クロマトグラムの一例を図１－図３に示す。
　図１は、システインのピークを示すクロマトグラムの一例である。
　図２は、ＮＥＭ－Ｃｙｓのピークを示すクロマトグラムの一例である。
　図３は、ＥＭＭ－Ｃｙｓのピークを示すクロマトグラムの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　以上の結果によれば、酸性条件下、温和な温度条件（室温）において、ＮＥＭ又はＥＭＭにより、Ｃｙｓを高い反応率で誘導体化できることが分かる。特に、ＥＭＭを用いた場合は、ＮＥＭと比較して高い反応率を示した。また、ＮＥＭによりキラルな化合物であるＣｙｓを誘導体化すると、ジアステレオマーが生じてＮＥＭ－Ｃｙｓピークが２つに分裂した。一方ＥＭＭによりＣｙｓを誘導体化すると、ジアステレオマーは生じず、ピークの分裂は起こらない。
［実施例Ａ２］ＥＭＭ誘導体化チオール類の一斉検出及び定量（逆相ＬＣによる分離）
　本実施例では、酸性条件にてＥＭＭにより誘導体化した６種類のチオール化合物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて一斉分離・検出を行った。
（Ａ２－１．誘導体の製造）
　Ｌ－システイン塩酸塩、グルタチオン・還元型（ＧＳＨ）（富士フイルム和光純薬社製）、Ｄ，Ｌ－ホモシステイン（Ｈｃｙ）（Ｓｉｇｍａ社製）、システイニルグリシン（ＣＧ）（Ｂａｃｈｅｍ社製）、γ－グルタミルシステイン（ｇＥＣ）（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）（純正化学社製）を各２５μｍｏｌ／Ｌ含む０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸標準チオール混合溶液（富士フイルム和光純薬社製を純水で希釈）を作製した。２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）（ナカライテスク社製を純水で希釈）６０μＬに対して上記標準チオール溶液１０μＬを加え、ＥＭＭアセトニトリル溶液（１０μＬ／ｍＬ）１０μＬを添加、攪拌して室温下１０分放置した。２２０μＬの０．１％ギ酸溶液を加えてよく攪拌し、サンプル溶液とした。
（Ａ２－２．誘導体の分析）
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにてサンプル溶液を分析した。ＬＣはＮｅｘｅｒａ（島津製作所製）、タンデム質量分析装置はＴｒｉｐｌｅ　Ｑｕａｄ　６５００システム（Ｓｃｉｅｘ製）を用いた。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：０．１％ギ酸、移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：１５－２０％Ｂ（０－２．５ｍｉｎ）、２０－９０％Ｂ（２．５－４．０ｍｉｎ）、９０％Ｂ（４．０－６．０ｍｉｎ）、９０－１５％Ｂ（６．０－６．２ｍｉｎ）、１５％Ｂ（６．２－８．０ｍｉｎ）
・カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ，３μｍ，２．１×５０ｍｍ（化学物質評価研究機構製）にガードカラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３，３μｍ，１．５×１０ｍｍ　Ｇｕａｒｄ　ｃｏｌｕｍｎ　ｆｏｒ　ＵＨＰＬＣ（ＧＬ－Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を取り付けたもの
・カラム温度：４０℃
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１μＬ
　（ＭＳ／ＭＳ条件）
　下表の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（分析結果）
　分析結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　以上の結果によれば、ＥＭＭにより種々のチオール類を誘導体化し、逆相ＬＣにて一斉に誘導体化されたチオール類を分離し、ＭＳ／ＭＳにて検出をすることができることが分かる。
［実施例Ａ３］スルフィン酸の分析
　本実施例では、チオール（－ＳＨ）だけでなく、スルフィン酸（－ＳＯ２Ｈ）も求核性があり、ＥＭＭ剤により誘導体化されて、分析可能であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（Ａ３－１．誘導体の製造）
　ヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ製）を１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるよう、０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解した。２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）６０μＬに対して上記標準ヒポタウリン溶液１０μＬを加え、ＥＭＭアセトニトリル溶液（１０μＬ／ｍＬ）１０μＬを添加、攪拌して室温下１０分放置した。９２０μＬの０．１％ギ酸溶液を加えてよく攪拌し、サンプル溶液とした。
（Ａ３－２．誘導体の分析）
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて下記条件でサンプル溶液を分析した。ＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、タンデム質量分析装置は３２００ＱＴＲＡＰシステム（Ｓｃｉｅｘ製）を用いた。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：０．１％ギ酸、移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：１５－４０％Ｂ（０－３．０ｍｉｎ）、４０－９０％Ｂ（３．０－３．２ｍｉｎ）、９０％Ｂ（３．２－５．５ｍｉｎ）、９０－１５％Ｂ（５．５－５．８ｍｉｎ）、１５％Ｂ（５．８－９．５ｍｉｎ）
・カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ，３μｍ，２．１×５０ｍｍ（化学物質評価研究機構製）にガードカラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３，３μｍ，１．５×１０ｍｍ　Ｇｕａｒｄ　ｃｏｌｕｍｎ　ｆｏｒ　ＵＨＰＬＣ（ＧＬ－Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を取り付けたもの
・カラム温度：４０℃
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１０μＬ
　（ＭＳ／ＭＳ条件）
　下表の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（分析結果）
　分析結果を下表に示す。またクロマトグラムの一例を図４に示す。
　図４は、ＥＭＭによる誘導体化ヒポタウリンのピークを示すクロマトグラムの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　以上の結果によれば、酸性条件下、ＥＭＭにより、ヒポタウリンのようなスルフィン酸を誘導体化でき、分析できることがわかる。
［実施例Ａ４］過硫化物の分析
　本実施例では、過硫化物の誘導体化及び分析ができることを確認した。過硫化物として、過硫化システイン（Ｃｙｓ－ＳＨ及びＣｙｓ－ＳＳＨ）を用いた。
　過硫化システインは、生体において酸化還元に関わる重要な働きを有している。そのため、本発明において、過硫化物の酸化還元状態を保持したまま誘導体化が可能であれば、生体における酸化還元状態を把握するために有用である。
（Ａ４－１．誘導体の製造）
　ｐＨ６．７ギ酸アンモニウム溶液（富士フイルム和光純薬製）７０μＬに対し、１００ｍｍｏｌ／Ｌ－システイン溶液１０μＬ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫化ナトリウム（富士フイルム和光純薬製を純水で希釈）水溶液１０μＬ、０．１％過酸化水素水溶液（関東化学製を純水で希釈）１０μＬを混合し、３０℃で３０分反応させ、過硫化システインを系中発生させた。上記溶液１０μＬに対し、６０μＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）、ＥＭＭアセトニトリル溶液（１０μＬ／ｍＬ）１０μＬを添加、攪拌して室温下１０分放置した。４２０μＬの０．１％ギ酸溶液を加えてよく攪拌し、サンプル溶液とした。
（Ａ４－２．誘導体の分析）
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて下記条件でサンプル溶液を分析した。ＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、タンデム質量分析装置は３２００ＱＴＲＡＰシステム（Ｓｃｉｅｘ製）を用いた。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：０．１％ギ酸、移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：１５－４０％Ｂ（０－３．０ｍｉｎ）、４０－９０％Ｂ（３．０－３．２ｍｉｎ）、９０％Ｂ（３．２－５．５ｍｉｎ）、９０－１５％Ｂ（５．５－５．８ｍｉｎ）、１５％Ｂ（５．８－９．５ｍｉｎ）
・カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ，３μｍ，２．１×５０ｍｍ（化学物質評価研究機構製）にガードカラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３，３μｍ，１．５×１０ｍｍ　Ｇｕａｒｄ　ｃｏｌｕｍｎ　ｆｏｒ　ＵＨＰＬＣ（ＧＬ－Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を取り付けたもの
・カラム温度：４０℃
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１０μＬ
　（ＭＳ／ＭＳ条件）
　下表の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　（分析結果）
　分析結果を下表に示す。またクロマトグラムの一例を図５に示す。
　図５は、ＥＭＭにより誘導体化されたシステイン及び過硫化システインのピークを示すクロマトグラムの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　以上の結果によれば、酸性条件下、ＥＭＭにより過硫化システインのような過硫化物を誘導体化でき、分析できることが分かる。
［実施例Ａ５］アミノ酸アナライザーを使用したＣｙｓ、Ｃｙｓ２、及びアミノ酸の一斉分析
　本実施例では、アミノ酸アナライザーを使用して、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２、及びアミノ酸を一斉に分析できることを確認した。
（分析方法概略）
　サンプルをＥＭＭで処理して、Ｃｙｓ及びＣｙｓ２を誘導体化した後、イオン交換カラムを用いて、サンプルからアミノ酸を分離し、次いで、ポストカラム誘導体化法により、ニンヒドリンでアミノ酸を誘導体化し、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２、及びアミノ酸を一斉に分析した。
　なお、アミノ酸アナライザーでは、通常Ｃｙｓ及びＣｙｓ２は同時にカラムから溶出するため、通常Ｃｙｓ及びＣｙｓ２を同時に分析することは困難である。
（Ａ５－１．誘導体の製造）
　アミノ酸混合標準液，Ｈ型（富士フイルム和光純薬製）（Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－スレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－バリン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－リジン、Ｌ－ヒスチジン、塩化アンモニウム、Ｌ－アルギニンをそれぞれ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ含む溶液）１００μＬに対して１０ｍｍｏｌ／Ｌのシステイン塩酸塩水溶液２５μＬ、純水１２５μＬを加え、混合標準液を作製した。本品１００μＬに対し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）２００μＬ、ＥＭＭアセトニトリル溶液（５μＬ／ｍＬ）５０μＬを添加、攪拌して室温で１０分間放置した。反応後、６５０μＬの０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え、サンプル溶液とした。
（Ａ５－２．誘導体の分析）
　下記分析装置により、サンプル溶液を分析した。
・分析装置：Ｌ－８９００型高速アミノ酸分析計（日立製）
・分析法：メソッドパッケージの「生体液分析法」分析時間「１４８分」を使用した。
　（分析結果）
　システイン誘導体は、保持時間４０．３分で溶出し、Ｃｙｓ２は保持時間４８．８分で溶出した。その他のアミノ酸は通常の「生体液分析法」分析時間「１４８分」の分析法における保持時間で溶出した。
　クロマトグラムの一例を、図６に示す。図６は、アミノ酸アナライザーを使用したＣｙｓ、Ｃｙｓ２、及びアミノ酸の一斉分析結果を示すクロマトグラムの一例である。
　以上の結果から、酸性条件下でＣｙｓ、Ｃｙｓ２、及び各種アミノ酸を含む試料を処理して通常のアミノ酸アナライザーで分析することにより、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２、及び各種アミノ酸を同時に分析できることが分かる。
［実施例Ｂ：ＢＰＳＥを用いた実施例］
［実施例Ｂ１］ＢＰＳＥによる誘導体化及び分析
　本実施例では、ＢＰＳＥによりチオールを誘導体化でき、分析できることを確認した。
　以下に、ＢＰＳＥとチオールとの反応例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（Ｂ１－１．誘導体の製造）
　Ｌ－Ｃｙｓ、ＧＳＨ、Ｈｃｙ、ＣＧ、ｇＥＣ、ＮＡＣを１０ｍｍｏｌ／Ｌ含む０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸標準チオール溶液を各々の化合物に対して作製して、標準チオール溶液を６種類作製した。２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）６０μＬに対して上記標準チオール溶液１０μＬを加え、ＢＰＳＥアセトニトリル溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加、攪拌して室温で１０分間放置した。４２０μＬの０．１％ギ酸水溶液を加えてよく攪拌し、サンプル溶液とした。
（Ｂ１－２．誘導体の分析）
　ＬＣにて、下記条件でサンプル溶液を分析した。ピークは、ＨＰＬＣ－ＵＶ検出器により検出した。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）
・移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：３０％Ｂ（０－１０ｍｉｎ）、３０－９０％Ｂ（１０－１１ｍｉｎ）、９０％Ｂ（１１－１６ｍｉｎ）、９０－３０％Ｂ（１６－１６．５ｍｉｎ）、３０％Ｂ（１６．５－２０ｍｉｎ）
・カラム：Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８、３μｍ，１５０×４．６ｍｍ（ワイエムシィ製）
・カラム温度：４０℃
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：５μＬ
　（検出条件）
・検出波長：２６０ｎｍ
　（分析結果）
　分析結果を下表に示す。また、クロマトグラムの一例を図７に示す。図７は、ＢＰＳＥによるチオール誘導体のクロマトグラムの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　以上の結果より、酸性条件下でＢＰＳＥによりチオールを誘導体化でき、カラムクロマトグラフィーにより分離し、ＵＶ検出器により検出できることが分かる。
　スルファニルを有するアミノ酸は、誘導体化により疎水性の高いアミノ酸へ変換されて、ＯＤＳ（Ｃ１８）カラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより、疎水性の低いその他のアミノ酸と良好に分離し、検出できることが予想される。
［実施例Ｂ２］キラルチオールの分離及び検出
　本実施例では、ＢＰＳＥによりキラルチオールを誘導体化し、キラルカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより分離及び検出できることを確認する。
（Ｂ２－１．誘導体の製造）
　Ｌ－Ｃｙｓ、Ｄ－Ｃｙｓ（Ｓｉｇｍａ製）をそれぞれ５ｍｍｏｌ／Ｌ含むＤ，Ｌ－システイン混合標準溶液を０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を使用して作製した。２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）６０μＬに対して上記標準チオール溶液１０μＬを加え、ＢＰＳＥアセトニトリル溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加、攪拌して室温で１０分間放置した。４２０μＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を加えてよく攪拌した。さらにこの溶液を移動相にて１０倍希釈し、サンプル溶液とした。
（Ｂ２－２．誘導体の分析）
　ＬＣにて下記条件でサンプル溶液を分析した。ピークは、ＨＰＬＣ－ＵＶ検出器により検出した。
　（ＬＣ条件）
・移動相：メタノール／アセトニトリル／水（４９／４９／２（ｖ／ｖ／ｖ））にギ酸及びジエチルアミンをそれぞれ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、２５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるよう加えたものをアイソクラティック条件で使用
・カラム：ＣＨＩＲＡＬ　ＰＡＫ（登録商標）　ＺＷＩＸ、３μｍ，１５０×３ｍｍ（ダイセル製）
・カラム温度：２５℃
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１０μＬ
　（検出条件）
・検出波長：２６０ｎｍ
　（分析結果）
　分析結果を下表に示す。また、クロマトグラムの一例を図８に示す。図８は、誘導体化されたキラルチオールのクロマトグラムの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　以上の結果により、酸性条件下、ＢＰＳＥでキラルチオールを誘導体化し、キラルカラムで分離し、検出できることが分かる。したがって、実施例の方法により、天然では存在量の少ないＤ－Ｃｙｓを、Ｌ－Ｃｙｓと分離して効率的に検出できることが分かる。
［実施例及び参考例Ｃ：オレフィン化合物の反応性評価］
　本実施例及び参考例では、ＥＭＭ、ＢＰＳＥを含む、オレフィン化合物（誘導体化剤）について、Ｃｙｓとの反応性を評価した。
　本実施例及び参考例で用いたオレフィン化合物及びその略称を、下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（Ｃ－１．サンプル調製及び誘導体の製造）
　Ｌ－Ｃｙｓ塩酸塩一水和物を１ｍｍｏｌ／Ｌになるよう０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解した。このＣｙｓ溶液１０μＬに対し、各種ｐＨの緩衝液６０μＬ、誘導体化剤溶液（もしくはアセトニトリル）１０μＬを添加し、１０分間室温で静置した。反応後、９２０μＬの０．１％ギ酸水溶液を添加し、サンプル溶液とした。
　誘導体化剤のアセトニトリル溶液は１０ｍｇ／ｍＬ（固体）もしくは１０μＬ／ｍＬ（液体）の濃度で調整した。緩衝液として、ｐＨ２．５又は７．０リン酸ナトリウム緩衝溶液（２０ｍＭ）を用いた。ＥＭＭによる誘導体化では、緩衝液として、更にｐＨ３．２５又は４．２５クエン酸ナトリウム（２００ｍＭ）、ｐＨ６．０リン酸ナトリウム緩衝溶液（２０ｍＭ）を用いて行った。
（Ｃ－２．誘導体の分析）
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて、下記条件でサンプル溶液を分析した。ＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、タンデム質量分析装置は３２００ＱＴＲＡＰシステム（Ｓｃｉｅｘ製）を用い、選択イオン検出（ＳＩＭ）モードで測定した。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：０．１％ギ酸水溶液
・移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：１０％Ｂ（０－１．０ｍｉｎ）、１０－９０％Ｂ（１．０－５．０ｍｉｎ）、９０％Ｂ（５．０－６．５ｍｉｎ）、９０－１０％Ｂ（６．５－７．０ｍｉｎ）、１０％Ｂ（７．０－１０．０ｍｉｎ）
・カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ，３μｍ，２．１×５０ｍｍ（化学物質評価研究機構製）
・カラム温度：４０℃
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１０μＬ
　（ＭＳ条件）
　下記条件で行った。
ＤＰ（Ｖ）：４６　　ＥＰ（Ｖ）：８　　ＣＥＰ（Ｖ）：１４
　Ｃｙｓ及び各種誘導体化剤により誘導体化したＣｙｓの検出条件及びその保持時間を下表に示す。下表において、Ｘ－Ｃｙｓの表示は、誘導体化剤Ｘにより誘導体化されたＣｙｓを意味する。
　また、ＥＢｚＭ－Ｃｙｓの検出では、ジアステレオマーとして２本のピークが観測されたので、下表にはそれぞれの保持時間を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　（分析結果）
　分析結果を下表に示す。Ｃｙｓ反応率は、上記式（１）により算出した。また、「＊」が付された項目は、データが存在しないことを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　ｐＨ７．０では、すべての剤で誘導体が生成し、検出された。ｐＨ２．５の酸性条件下では、２個の電子求引基を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物（ＥＭＭ、ＢＰＳＥ、Ａｃｒｙ－ＣＦ３Ａ、Ａｃｒｙ－ＣＦ３Ｅ、ＥｉＰｒＭ、ＥＢｚＭ、ＢＥＰＥ、ＣＡ）を用いた場合に誘導体が生成した。特に、式（Ｉ）で表されるオレフィン化合物（ＥＭＭ、ＢＰＳＥ、Ａｃｒｙ－ＣＦ３Ａ、Ａｃｒｙ－ＣＦ３Ｅ、ＢＥＰＥ、ＣＡ）を用いた場合に、高い反応率で誘導体が生成した。
　また、誘導体化剤としてＥＭＭを用い、各種緩衝液中で反応を行った場合の結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　以上の結果によれば、ｐＨが６．０以上で、誘導体化Ｃｙｓピークエリア値が減少していることが分かる。
［参考例Ｄ：各種ｐＨ条件下での有機物質の挙動］
　本参考例では、各種ｐＨ条件下での有機物質の挙動を観察することにより、酸性条件下における有機物質の安定性を評価する。
（Ｄ－１．チオール交換反応の観察）
　（サンプル調製）
　Ｌ－Ｃｙｓ塩酸塩一水和物を１０ｍｍｏｌ／Ｌに、ＧＳＳＧを５０ｍｍｏｌ／Ｌになるようそれぞれ０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解した。Ｃｙｓ溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）５０μＬに対し、各種リン酸ナトリウム緩衝液８５０μＬ（ｐＨ２．５、６．０、７．０又は８．０）、ＧＳＳＧ溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）１００μＬを加え、混合溶液を作製した。（最終的に溶液中にはＣｙｓが０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＧＳＳＧが５ｍｍｏｌ／Ｌ存在している。）　経時的にサンプリングし、ＢＰＳＥにより誘導体化を実施し、下記条件のＬＣにより分析し、Ｃｙｓ及びＧＳＨのエリア値を測定した。ピークは、ＨＰＬＣ－ＵＶ検出器により検出した。
　（サンプリング及び誘導体化）
　混合溶液１０μＬに対し、１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸水溶液１０μＬ、ｐＨ２．５リン酸ナトリウム緩衝液８０μＬ、ＢＰＳＥアセトニトリル溶液（５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、１０分間室温に静置した。反応後、ｐＨ２．５リン酸ナトリウム緩衝液１００μＬを加え、サンプル溶液とした。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）
・移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：２５％Ｂ（０－８．０ｍｉｎ）、２５－９０％Ｂ（８．０－９．０ｍｉｎ）、９０％Ｂ（９．０－１１．０ｍｉｎ）、９０－２５％Ｂ（１１．０－１２．０ｍｉｎ）、２５％Ｂ（１２．０－１５．０ｍｉｎ）
・カラム：Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８、３μｍ，１５０×４．６ｍｍ（ワイエムシィ製）
・カラム温度：４０℃
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１０μＬ
　なお、本条件では、Ｃｙｓは６．３分、ＧＳＨは６．８分に溶出する。
　（検出条件）
・検出波長：２６０ｎｍ
　（分析結果）
　分析結果を下表及び図９～１２に示す。図９、１０、１１、及び１２は、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ６．０、及びｐＨ２．５におけるＣｙｓ及びＧＳＨのピークエリア値の経時変化をそれぞれ表すグラフである。なお、ｐＨ６．０、７．０、８．０の０分のデータは、緩衝液処理していないものであると考え、ｐＨ２．５の０分のデータと共通とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　以上の結果によれば、ｐＨ７．０以上の条件では、速やかにＣｙｓとＧＳＳＧとが反応して、交換反応により生じたＧＳＨが検出され、Ｃｙｓが減少することが分かる。
　一方、ｐＨ６．０以下の条件では、ＣｙｓとＧＳＳＧとの反応はほとんど進行せず、特にｐＨ２．５の条件では、交換反応の生成物であるＧＳＨは、１時間経過後においても検出されないことが分かる。
　これらの結果は、ジスルフィド化合物及びチオール化合物が同時に存在する試料であっても、酸性条件下において、チオール化合物を正確に分析できることを示す。
（Ｄ－２．チオール酸化反応の観察）
　（サンプル調製）
　Ｌ－Ｃｙｓ塩酸塩一水和物を１０ｍｍｏｌ／Ｌに、硫酸銅五水和物を０．１ｍｍｏｌ／Ｌになるようそれぞれ０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解した。Ｃｙｓ溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）５０μＬに対し、各種リン酸ナトリウム緩衝液８５０μＬ（ｐＨ２．５、６．０、７．０又は８．０）、硫酸銅水溶液（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）１００μＬを加え、混合溶液を作製した。（最終的に溶液中にはＣｙｓが０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸銅が０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ存在している。）　経時的にサンプリングし、ＢＰＳＥにより誘導体化を実施し、（Ｄ－１．チオール交換反応の観察）の条件と同じ条件でＬＣにより分析し、Ｃｙｓのエリア値を測定した。なお、分析法及び誘導体化法として（Ｄ－１．チオール交換反応の観察）と同じ方法を用いた。
　（分析結果）
　分析結果を下表及び図１３に示す。図１３は、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ６．０、及びｐＨ２．５におけるＣｙｓのピークエリア値の経時変化を表すグラフである。なお、ｐＨ６．０、７．０、８．０の０分のデータは、緩衝液処理していないものであると考え、ｐＨ２．５の０分のデータと共通とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　以上の結果によれば、ｐＨ７以上の条件では、Ｃｙｓが急速に減少し、Ｃｙｓが速やかに酸化されることが分かる。
　一方、ｐＨ６．０以下の条件では、Ｃｙｓはほとんど減少せず、Ｃｙｓの酸化反応がほとんど進行していないことが分かる。
　これらの結果は、酸性条件下では、チオール化合物の酸化反応が抑制されて、チオール化合物を正確に分析できることを示す。
［実施例Ｅ］スルファニル基及びアミノ基の誘導体化
　本実施例では、システイン又はシスチンを、酸性条件下でＥＭＭと混合した後、更に溶液の液性を塩基性にすることで、システイン又はシスチンが有するアミノ基（－ＮＨ２）がＥＭＭと反応して、システイン又はシスチンが誘導体化されることを確認した。
　すなわち、システインの有するスルファニル基（－ＳＨ）が、酸性条件下でＥＭＭと反応して、酸化に対して安定である置換基に変換された後、システインの有するアミノ基が、塩基性条件下でＥＭＭと反応して、誘導体が得られた。
　酸性条件下では、通常アミノ基はＥＭＭとは反応しない。したがって、酸性条件下では、アミノ基を有するがスルファニル基を有さないシスチンのようなジスルフィド化合物は、通常ＥＭＭとは反応せず、誘導化されない。しかし、このようなジスルフィド化合物であっても、塩基性条件下でアミノ基がＥＭＭと反応して、誘導体化されることが確認された。
　スルファニル基だけでなく、アミノ基をＥＭＭと反応させることにより、酸性条件下では誘導体化されない、ジスルフィド化合物の疎水性を上げることができ、液体クロマトグラフィーによる分離を容易にできる。また、誘導体の質量分析計での検出感度を上げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（Ｅ－１．誘導体の製造）
　システインもしくはシスチン（Ｓｉｇｍａ製）を２５０μｍｏｌ／Ｌの濃度となるよう、０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解し、標品とした。この標品２０μＬ、１０％トリクロロ酢酸水溶液２０μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸４０μＬを混合し、よく攪拌した。この溶液５０μＬを、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）３００μＬと混合し、ＥＭＭアセトニトリル溶液（１０μＬ／ｍＬ）５０μＬを添加、攪拌して４０℃で５分間静置した。この溶液１００μＬをとり、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）２００μＬと混合し、さらに攪拌して４０℃で５分間静置した。本溶液１５μＬをとり、５０μＬの０．３％ギ酸溶液を加えてよく攪拌し、分析用サンプルとした。
（Ｅ－２．誘導体の分析）
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて下記条件でサンプル溶液を分析した。ＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ１２９０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩシリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、タンデム質量分析装置はＱＴＲＡＰ５５００システム（Ｓｃｉｅｘ製）を用いた。
　（ＬＣ条件）
・移動相Ａ液：０．１％ギ酸、移動相Ｂ液：アセトニトリル
・グラジエント条件：３０－６０％Ｂ（０－６．０ｍｉｎ）、６０－９０％Ｂ（６．０－７．５ｍｉｎ）、９０％Ｂ（７．５－９．０ｍｉｎ）、９０－３０％Ｂ（９．０－９．１ｍｉｎ）、３０％Ｂ（９．１－１０．０ｍｉｎ）
・カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ，３μｍ，２．１×５０ｍｍ（化学物質評価研究機構製）にガードカラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３，３μｍ，１．５×１０ｍｍ　Ｇｕａｒｄ　ｃｏｌｕｍｎ　ｆｏｒ　ＵＨＰＬＣ（ＧＬ－Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を取り付けたもの
・カラム温度：４０℃
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：１μＬ
　（ＭＳ／ＭＳ条件）
　下表の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　（分析結果）
　分析結果を下表に示す。またクロマトグラムの一例を図１４に示す。
　下表及び図１４において、「３ＥＭＭ－Ｃｙｓｔｅｉｎｅ」及び「３ＥＭＭ－Ｃｙｓ」とは、１分子のシステインが３分子のＥＭＭと反応して得られる誘導体を意味する。「４ＥＭＭ－Ｃｙｓｔｉｎｅ」及び「４ＥＭＭ－Ｃｙｓ２」とは、１分子のシスチンが４分子のＥＭＭと反応して得られる誘導体を意味する。
　図１４は、ＥＭＭによる誘導体化システインのピーク又は誘導体化シスチンのピークを示すクロマトグラムの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　以上の結果によれば、システインを酸性条件下でＥＭＭと反応させることにより、スルファニル基がＥＭＭと反応し、続いて溶液を塩基性にすることによりアミノ基が２分子のＥＭＭと反応して、システインが誘導体化されることがわかる。
　シスチンは、反応溶液を塩基性とすることにより、２個のアミノ基が４分子のＥＭＭと反応して誘導体化される。
　すなわち、前記結果は、システインはＥＭＭ３分子と反応した化合物として、シスチンはＥＭＭ４分子と反応した化合物として、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析できることを示す。

Claims (16)

  1. 　スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質を、オレフィン化合物と酸性条件下で反応させて、前記有機物質の誘導体を得ることを含み、
    　ここで、前記オレフィン化合物は、少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含む、有機物質の誘導体の製造方法。
  2. 　前記エチレン構造が、２個の電子求引基を有する、請求項１に記載の誘導体の製造方法。
  3. 　２個の電子求引基が、前記エチレン構造を構成する同一の炭素原子に結合している、請求項１又は２に記載の誘導体の製造方法。
  4. 　少なくとも２個の電子求引基が、同一の基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
  5. 　前記オレフィン化合物が、下記式（Ｉ）で表される化合物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （但し、ＥＷＧ１及びＥＷＧ２は、各々独立して、電子求引基を表し、これらが結合する炭素原子と一緒になって、環を形成していてもよい。）
  6. 　前記電子求引基、又はＥＷＧ１及びＥＷＧ２が、各々独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ１、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｒ２、－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＲ３）２、シアノ、ハロゲン原子で置換されたアルキル、カルボキシ、ニトロ、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ５、又は－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６Ｒ７であり、
    　ここで、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、各々独立して、１価の炭化水素基又は１価の複素環基を表し、これらは置換基を有していてもよく、
    　Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、各々独立して、水素原子、１価の炭化水素基、又は１価の複素環基を表し、これらは置換基を有していてもよい、請求項１～５のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
  7. 　前記酸性条件が、ｐＨ６．０未満の条件である、請求項１～６のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
  8. 　前記有機物質が、システイン、還元型グルタチオン、γ－グルタミルシステイン、システイニルグリシン、ホモシステイン、Ｎ－アセチルシステイン、過硫化システイン、ヒポタウリン、過硫化グルタチオン、及び、システイン残基を含むペプチド性化合物からなる群より選択される１種以上である、請求項１～７のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
  9. 　前記有機物質が、更にアミノ基を含み、
    　前記有機物質を、前記オレフィン化合物と酸性条件下で反応させた後、更に中性又は塩基性条件下で反応させて前記有機物質の誘導体を得ることを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の誘導体の製造方法。
  10. 　（１）スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質を含む試料と、
    　少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物とを、
    　酸性条件下で混合して、前記有機物質の誘導体を含む処理試料を得ること、及び
    　（２）前記処理試料中の、前記有機物質の誘導体を分析すること、を含む、有機物質を含む試料の分析方法。
  11. 　前記工程（２）における分析が、
    　（２ａ）前記処理試料から、前記有機物質の誘導体を分離すること、
    　（２ｂ）分離された前記有機物質の誘導体を検出すること、
    を含む、請求項１０に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
  12. 　前記試料が、更にジスルフィド化合物を含む、請求項１０又は１１に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
  13. 　前記ジスルフィド化合物が、酸化型グルタチオン及びシスチンからなる群より選択される１種以上である、請求項１２に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
  14. 　前記有機物質が、更にアミノ基を含み、
    　工程（１）が、
    　（１’）前記試料と、前記オレフィン化合物とを、酸性条件下で混合した後、更に中性又は塩基性条件下で混合して、前記有機物質の誘導体を含む処理試料を得ることを含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の有機物質を含む試料の分析方法。
  15. 　少なくとも２個の電子求引基（ただし、ハロゲン原子を除く。）を有するエチレン構造を含むオレフィン化合物を含む、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の酸性条件下での誘導体化剤。
  16. 　請求項１５に記載の誘導体化剤を含む、スルファニル、セラニル、及びスルフィノからなる群より選択される１種以上の基を含む有機物質の分析用試薬。
PCT/JP2020/036408 2019-09-26 2020-09-25 有機物質の誘導体の製造方法、及び有機物質を含む試料の分析方法 WO2021060517A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020227009967A KR20220069949A (ko) 2019-09-26 2020-09-25 유기 물질의 유도체의 제조방법 및 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법
JP2021548452A JPWO2021060517A1 (ja) 2019-09-26 2020-09-25
US17/700,721 US20220267264A1 (en) 2019-09-26 2022-03-22 Method for producing derivative of organic substance and method for analyzing sample containing organic substance

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019176047 2019-09-26
JP2019-176047 2019-09-26

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/700,721 Continuation US20220267264A1 (en) 2019-09-26 2022-03-22 Method for producing derivative of organic substance and method for analyzing sample containing organic substance

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021060517A1 true WO2021060517A1 (ja) 2021-04-01

Family

ID=75166315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/036408 WO2021060517A1 (ja) 2019-09-26 2020-09-25 有機物質の誘導体の製造方法、及び有機物質を含む試料の分析方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220267264A1 (ja)
JP (1) JPWO2021060517A1 (ja)
KR (1) KR20220069949A (ja)
WO (1) WO2021060517A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4316906A (en) * 1978-08-11 1982-02-23 E. R. Squibb & Sons, Inc. Mercaptoacyl derivatives of substituted prolines
JPS6323834A (ja) * 1986-07-16 1988-02-01 エニリチェルヘ・エセ・ピ・ア マロン酸誘導体
JP2015049201A (ja) * 2013-09-03 2015-03-16 株式会社 資生堂 システイン及びシスチンの定量方法及び定量試薬キット
JP2019517005A (ja) * 2016-02-26 2019-06-20 プロザイム，インコーポレイテッド 求核剤の標識を向上するためのビスピリジンの使用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4316906A (en) * 1978-08-11 1982-02-23 E. R. Squibb & Sons, Inc. Mercaptoacyl derivatives of substituted prolines
JPS6323834A (ja) * 1986-07-16 1988-02-01 エニリチェルヘ・エセ・ピ・ア マロン酸誘導体
JP2015049201A (ja) * 2013-09-03 2015-03-16 株式会社 資生堂 システイン及びシスチンの定量方法及び定量試薬キット
JP2019517005A (ja) * 2016-02-26 2019-06-20 プロザイム，インコーポレイテッド 求核剤の標識を向上するためのビスピリジンの使用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BANSAL, GEETI ET AL.: "Imparting mineral affinity to proteins with thiol-labile disulfide linkages", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH, PART A, vol. 74A, no. 4, 2005, pages 618 - 628, XP055812695 *
DE LUCCHI, OTTORINO ET AL.: "1,1- Bis(phenylsulfonyl)ethylene", E-EROS ENCYCLOPEDIA OF REAGENTS FOR ORGANIC SYNTHESIS, 2007, pages 1 - 3 *
ZHANG, SUFENG ET AL.: "Cleavage of disulfide-linked fetuin-bisphosphonate conjugates with three physiological thiols", BIOMACROMOLECULES, vol. 6, no. 5, 2005, pages 2800 - 2808, XP055029561, DOI: 10.1021/bm050273s *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220069949A (ko) 2022-05-27
US20220267264A1 (en) 2022-08-25
JPWO2021060517A1 (ja) 2021-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bachi et al. Redox proteomics: chemical principles, methodological approaches and biological/biomedical promises
Shimbo et al. Precolumn derivatization reagents for high‐speed analysis of amines and amino acids in biological fluid using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry
Huang et al. Use of isotope differential derivatization for simultaneous determination of thiols and oxidized thiols by liquid chromatography tandem mass spectrometry
Kuśmierek et al. Ultraviolet derivatization of low-molecular-mass thiols for high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis analysis
Ying et al. Thiol oxidation in signaling and response to stress: detection and quantification of physiological and pathophysiological thiol modifications
Conte et al. The chemistry of thiol oxidation and detection
Baez et al. Mass spectrometry in studies of protein thiol chemistry and signaling: opportunities and caveats
JP5030586B2 (ja) アミノ官能性化合物の分析方法及び装置
Forgacsova et al. Ultra-high performance hydrophilic interaction liquid chromatography–triple quadrupole tandem mass spectrometry method for determination of cysteine, homocysteine, cysteinyl-glycine and glutathione in rat plasma
Lu et al. S-sulfhydration/desulfhydration and S-nitrosylation/denitrosylation: a common paradigm for gasotransmitter signaling by H2S and NO
Vespalec et al. Enantiomeric separation of sulfur-and selenium-containing amino acids by capillary electrophoresis using vancomycin as a chiral selector
Martens-Lobenhoffer et al. Quantification of L-arginine, asymmetric dimethylarginine and symmetric dimethylarginine in human plasma: a step improvement in precision by stable isotope dilution mass spectrometry
Byun et al. Analysis of polyamines as carbamoyl derivatives in urine and serum by liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Salazar et al. Combination of an AccQ· Tag-ultra performance liquid chromatographic method with tandem mass spectrometry for the analysis of amino acids
Pucciarini et al. Development and validation of a chiral UHPLC-MS method for the analysis of cysteine enantiomers in biological samples
JP2018163155A (ja) アミノ酸の分析方法
Tanwar et al. Enantioresolution of amino acids: a decade’s perspective, prospects and challenges
Ortmayr et al. An integrated metabolomics workflow for the quantification of sulfur pathway intermediates employing thiol protection with N-ethyl maleimide and hydrophilic interaction liquid chromatography tandem mass spectrometry
Yan et al. Histochemical staining and quantification of dihydrolipoamide dehydrogenase diaphorase activity using blue native PAGE
Yuan et al. Thiol metabolomics of endothelial cells using capillary liquid chromatography mass spectrometry with isotope coded affinity tags
Zheng et al. A novel method for detecting amino acids derivatized with phenyl isothiocyanate by high-performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry
Lee et al. Quantitative liquid chromatography–electrospray ionization-mass spectrometry analysis of amine-containing metabolites derivatized with cyanuric chloride and methylamine isotopologues
Ferré et al. Separation and determination of cysteine enantiomers in plasma after derivatization with 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan
ES2385330T3 (es) Procedimiento para analizar metabolitos
WO2021060517A1 (ja) 有機物質の誘導体の製造方法、及び有機物質を含む試料の分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20870429

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021548452

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20870429

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1