KR20220069949A - 유기 물질의 유도체의 제조방법 및 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 유도체의 신규한 제조방법을 제공한다. 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질을, 올레핀 화합물과 산성 조건 하에서 반응시켜서, 상기 유기 물질의 유도체를 얻는 것을 포함하고, 여기서, 상기 올레핀 화합물은, 적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는, 유기 물질의 유도체의 제조방법.
Description
본 발명은, 유기 물질의 유도체의 제조방법 및 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법에 관한 것이다.
생체 내에서는, 티올은 중요한 역할을 하고 있다. 예를 들어, 생체 내의 산화 환원 상태의 유지, 단백질의 기능의 제어, 중금속 등의 생체 이물의 해독 등의 역할을 하고 있다.
따라서, 생체 시료 등의 시료 중의 티올을 분석하는 시도가 종래부터 행해지고 있다. 예를 들어, 티올을, 전극 표면에서의 산화 환원 반응을 이용하여 전기 화학 검출기에 의해 분석하는 기술이 있다(비특허문헌 1, 2). 또한, 티올을 유도체로 변환하여 분석하는 시도도 행해지고 있다(비특허문헌 3 내지 8).
티올의 반응으로서는, 탄소-탄소 이중 결합과의 반응이 알려져 있다(비특허문헌 9, 10).
Anal. Biochem., 407 (2010) 151-159
Talanta, 84 (2011) 789-801
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ARKIVOC 2009 (viii) 187-198
그러나, 비특허문헌 1, 2의 분석 방법에서는 티올을 유도체화하지 않고 분석하기 때문에, 시료 또는 분석에 사용하는 용리액 등의 용존 산소에 의해 티올이 산화되기 쉽고, 안정된 분석 결과가 얻어지기 어렵다. 또한, 전기 화학 검출기는 티올에 대한 선택성이 충분하지 않고, 아미노산, 당, 기타 복잡한 협잡 성분을 갖는 샘플을 측정하는 경우, 협잡 성분에 의해 측정이 방해되는 경우가 있다. 또한, 전기 화학 검출기는 전극의 세정 등의 유지보수가 필요하며, 또한 사용에 따라 용이하게 검출 감도가 변동되어 불안정해지기 때문에 취급이 어렵다.
비특허문헌 3 내지 6의 기술에서는, 티올의 유도체화를 중성 조건 내지 염기성 조건으로 행하고 있다.
그러나, 본 발명자는, 중성 조건 내지 염기성 조건에서는, 티올의 산화 반응 및 티올과 디설파이드 화합물과의 교환 반응이 용이하게 진행되기 때문에, 티올의 분석이 어려운 것을 발견하였다. 따라서, 중성 조건 내지 염기성 조건으로 티올의 유도체화를 행하는 특허문헌 3 내지 6의 기술에서는, 티올의 정확한 분석이 어려운 경우가 있다.
한편으로, 비특허문헌 7, 8의 기술에서는, 산성 조건(pH 3.5)으로 티올을 유도체화하고 있지만, 반응성이 나쁘고, 장시간의 반응 또는 마이크로웨이브 인가와 같은 특수한 조건을 필요로 한다.
본 발명자는, 예의 검토한 결과, 특정 올레핀 화합물을, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질과 산성 조건 하에서 반응시킴으로써 얻어지는 유기 물질의 유도체가, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 분석에 유용함을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 상기 선행 기술은, (a) 특정 올레핀 화합물을, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질과 산성 조건 하에서 반응시키는 것 및 (b) 그러한 반응에 의해 얻어지는 유기 물질의 유도체가, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 분석에 유용한 것 중 어느 것도 교시도 시사도 되어 있지 않다.
즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
[1] 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질을, 올레핀 화합물과 산성 조건 하에서 반응시켜서, 상기 유기 물질의 유도체를 얻는 것을 포함하고,
여기서, 상기 올레핀 화합물은, 적어도 2개의 전자 구인 기(求引基)(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는, 유기 물질의 유도체의 제조방법.
[2] 상기 에틸렌 구조가 2개의 전자 구인 기를 갖는, [1]에 기재된 유도체의 제조방법.
[3] 2개의 전자 구인 기가, 상기 에틸렌 구조를 구성하는 동일한 탄소 원자에 결합되어 있는, [1] 또는 [2]에 기재된 유도체의 제조방법.
[4] 적어도 2개의 전자 구인 기가 동일한 기인, [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 유도체의 제조방법.
[5] 상기 올레핀 화합물이 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물인, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 유도체의 제조방법.
[화학식 (I)]
(단, EWG1 및 EWG2는 각각 독립적으로, 전자 구인 기를 나타내고, 이들이 결합되는 탄소 원자와 하나가 되어 환을 형성하고 있어도 좋다)
[6] 상기 전자 구인 기 또는 EWG1 및 EWG2가 각각 독립적으로, C(=O)-OR1, -S(=O)2-R2, -P(=O)(-OR3)2, 시아노, 할로겐 원자로 치환된 알킬, 카복시, 니트로, -S(=O)-R4, -C(=O)-R5 또는 -C(=O)-NR6R7이고,
여기서,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 1가의 탄화수소기 또는 1가의 복소환기를 나타내고, 이들은 치환기를 갖고 있어도 좋고,
R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로, 수소 원자, 1가의 탄화수소기 또는 1가의 복소환기를 나타내고, 이들은 치환기를 갖고 있어도 좋은, [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 유도체의 제조방법.
[7] 상기 산성 조건이 pH 6.0 미만의 조건인, [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 유도체의 제조방법.
[8] 상기 유기 물질이, 시스테인, 환원형 글루타티온, γ-글루타밀시스테인, 시스테이닐글리신, 호모시스테인, N-아세틸시스테인, 과황화 시스테인, 히포타우린, 과황화 글루타티온 및 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드성 화합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 유도체의 제조방법.
[9] 상기 유기 물질이 추가로 아미노기를 포함하고,
상기 유기 물질을 상기 올레핀 화합물과 산성 조건 하에서 반응시킨 후, 추가로 중성 또는 염기성 조건 하에서 반응시켜서, 상기 유기 물질의 유도체를 얻는 것을 포함하는, [1] 내지 [8] 중 어느 한 항에 기재된 유도체의 제조방법.
[10] (1) 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질을 포함하는 시료와,
적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물을,
산성 조건 하에서 혼합하여, 상기 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는 것 및
(2) 상기 처리 시료 중의 상기 유기 물질의 유도체를 분석하는 것을 포함하는, 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법.
[11] 상기 공정 (2)에서의 분석이,
(2a) 상기 처리 시료로부터 상기 유기 물질의 유도체를 분리하는 것 및
(2b) 분리된 상기 유기 물질의 유도체를 검출하는 것을 포함하는, [10]에 기재된 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법.
[12] 상기 시료가 디설파이드 화합물을 추가로 포함하는, [10] 또는 [11]에 기재된 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법.
[13] 상기 디설파이드 화합물이 산화형 글루타티온 및 시스틴으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인, [12]에 기재된 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법.
[14] 상기 유기 물질이 아미노기를 추가로 포함하고,
공정 (1)이,
(1') 상기 시료와 상기 올레핀 화합물을 산성 조건 하에서 혼합한 후, 추가로 중성 또는 염기성 조건 하에서 혼합하여, 상기 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는 것을 포함하는, [10] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법.
[15] 적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물을 포함하는, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 산성 조건 하에서의 유도체화제.
[16] [15]에 기재된 유도체화제를 포함하는, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 분석용 시약.
본 발명에 의하면, 설파닐(-SH), 셀라닐(-SeH) 및 설피노(-S(=O)-OH)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 유도체의 신규한 제조방법; 이러한 유기 물질을 포함하는 시료를 분석하는 신규한 방법을 제공할 수 있다.
[도 1] 도 1은, 시스테인의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 2] 도 2는, NEM-Cys의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 3] 도 3은, EMM-Cys의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 4] 도 4는, EMM에 의한 유도체화 히포타우린의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 5] 도 5는, EMM에 의해 유도체화된 시스테인 및 과황화 시스테인의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 6] 도 6은, 아미노산 애널라이저를 사용한 Cys, Cys2 및 아미노산의 일제 분석 결과를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 7] 도 7은, BPSE에 의한 티올 유도체의 크로마토그램의 일례이다.
[도 8] 도 8은, 유도체화된 카이랄 티올의 크로마토그램의 일례이다.
[도 9] 도 9는, pH 8.0에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 10] 도 10은, pH 7.0에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 11] 도 11는, pH 6.0에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 12] 도 12는, pH 2.5에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 13] 도 13은, pH 8.0, pH 7.0, pH 6.0 및 pH 2.5에서의 Cys의 피크 에리어 값의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 14] 도 14는, EMM에 의한 유도체화 시스테인의 피크 또는 유도체화 시스틴의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 2] 도 2는, NEM-Cys의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 3] 도 3은, EMM-Cys의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 4] 도 4는, EMM에 의한 유도체화 히포타우린의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 5] 도 5는, EMM에 의해 유도체화된 시스테인 및 과황화 시스테인의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 6] 도 6은, 아미노산 애널라이저를 사용한 Cys, Cys2 및 아미노산의 일제 분석 결과를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
[도 7] 도 7은, BPSE에 의한 티올 유도체의 크로마토그램의 일례이다.
[도 8] 도 8은, 유도체화된 카이랄 티올의 크로마토그램의 일례이다.
[도 9] 도 9는, pH 8.0에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 10] 도 10은, pH 7.0에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 11] 도 11는, pH 6.0에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 12] 도 12는, pH 2.5에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다.
[도 13] 도 13은, pH 8.0, pH 7.0, pH 6.0 및 pH 2.5에서의 Cys의 피크 에리어 값의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 14] 도 14는, EMM에 의한 유도체화 시스테인의 피크 또는 유도체화 시스틴의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
이하, 본 발명에 대하여 실시형태 및 예시물을 나타내어 상세하게 설명하다. 단, 본 발명은 이하에 나타내는 실시형태 및 예시물에 한정되는 것은 아니다. 또한, 「제」는, 단일의 물질이라도 좋고, 2종 이상의 물질로 구성되는 조성물이라도 좋다.
[1. 유기 물질의 유도체의 제조방법]
본 발명의 일 실시형태에 따른 유기 물질의 유도체의 제조방법은, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질을, 올레핀 화합물과 산성 조건 하에서 반응시켜서, 상기 유기 물질의 유도체를 얻는 것을 포함한다.
여기서, 상기 올레핀 화합물은, 적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함한다.
[1.1. 유기 물질]
유기 물질은, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하고, 바람직하게는 설파닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하고, 보다 바람직하게는 설파닐을 포함한다. 여기서, 설파닐은, -(S)n-SH으로 표시되는 기이고, 셀라닐은, -SeH로 표시되는 기이고, 설피노는, -(S=O)-OH로 표시되는 기이다.
이하, 「설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기」를, 「기 A」라고 말하는 경우가 있다.
본 발명에서는, 설파닐은, -(S)n-SH로 표시되는 기(n은 0 이상의 정수를 나타낸다)이다.
본 실시형태에 따른 유도체의 제조방법에 의하면, -S-SH 및 -S-S-SH와 같은 -(S)n-SH으로 표시되는 기(단, n은 1 이상의 정수이다)를 갖는 유기 물질(이하, 과황화물이라고도 함)도, 올레핀 화합물에 의해 유도체화할 수 있다. 이러한 과황화물(예를 들어, 과황화 시스테인)은 생체 내에서 산화 환원에 관한 중요한 역할을 갖고 있다. 본 실시형태에 따른 유도체의 제조방법에 의하면, 과황화물을, 그 산화 환원 상태를 유지한 채 유도화할 수 있으므로, 생체에서의 산화 환원 상태를 파악할 수 있다. 설파닐을 포함하는 유기 물질(특히, 혈액, 타액, 뇨, 분변 등의 생체 시료 중의 천연 유기 물질)의 종류 수 및 존재량의 많음 등의 관점에서, -(S)n-SH로 표시되는 기의 n은 바람직하게는 0, 1, 2 또는 3이고, 보다 바람직하게는 0, 1 또는 2이고, 보다 더 바람직하게는 0 또는 1이고, 특히 바람직하게는 0이다.
본 발명에서는 또한, 셀라닐은 -SeH로 표시되는 기이다. 셀레늄 원자는, 주기율표에서 황 원자와 마찬가지로 제16족에 속하는 원자이고, 황 원자와 동일한 반응성을 나타낸다. 따라서, 올레핀 화합물에 대한 유기 물질 중의 셀레늄 원자의 반응성은, 올레핀 화합물에 대한 유기 물질 중의 황 원자의 반응성과 동일하기 때문에, 유기 물질 중의 황 원자에 대하여 양호하게 반응할 수 있는 에틸렌 구조를 갖는 후술의 올레핀 화합물은, 유기 물질 중의 셀레늄 원자에 대해서도 동일하게 양호하게 반응할 수 있다.
설파닐, 셀라닐 및 설피노(-S(=O)-OH)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기는, 유기 물질 1분자 중에 복수개 포함되어 있어도 좋다.
또한, 유기 물질은, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기 이외에, 1개 또는 복수(예, 2개, 3개, 4개)의 관능기를 갖고 있어도 좋다.
관능기의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 하이드록시, 카복시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알킬옥시, 알킬옥시카보닐, 알킬카보닐, 알킬카보닐옥시를 들 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 유기 물질은, 기 A 이외에 아미노기를 포함하고 있어도 좋다. 여기서, 유기 물질이 기 A 이외에 포함할 수 있는 아미노기에는, 무치환된 아미노기(-NH2)에 더하여, 1치환 아미노기 및 2치환 아미노기가 포함된다. 유기 물질이 기 A 이외에 포함할 수 있는 아미노기로서는, 무치환된 아미노기 및 1치환 아미노기로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 바람직하고, 무치환된 아미노기가 보다 바람직하다. 기 A를 포함하는 유기 물질은, 1분자 중에 아미노기를 1개만 포함하고 있어도 좋고, 복수개 포함하고 있어도 좋다. 유기 물질 1분자에 포함되는 아미노기의 수는, 1개, 2개 또는 3개, 바람직하게는 1개 또는 2개, 보다 바람직하게는 1개라도 좋다.
유기 물질은, 후술하는 시료에 유래하는 것이라도 좋다.
유기 물질은, 고분자 화합물이라도 좋고, 저분자 화합물이라도 좋다. 바람직하게는, 유기 물질은 저분자 화합물이다.
저분자 화합물이란, 분자량 1,500 이하의 화합물을 말한다. 저분자 화합물의 분자량은, 1,200 이하, 1,000 이하, 900 이하, 800 이하, 700 이하, 600 이하, 500 이하, 400 이하 또는 300 이하라도 좋다. 저분자 화합물의 분자량은 또한, 30 이상, 40 이상 또는 50 이상이라도 좋다.
저분자 화합물은, 아미노산(예, 시스테인, 셀레노시스테인), 펩타이드성 화합물 또는 이들의 염이라도 좋다.
여기서, 펩타이드성 화합물이란, 2분자 이상의 아미노산이 축합하여 얻어지는 구조를 갖는 화합물이다.
유기 물질은, 고분자 화합물인 펩타이드성 화합물이라도 좋다. 고분자 화합물인 펩타이드성 화합물의 예로서는, 알부민 등의 단백질을 들 수 있다.
유기 물질은, 천연 화합물이라도 좋고, 합성 화합물이라도 좋다.
유기 물질의 구체예로서는, 시스테인, 환원형 글루타티온, γ-글루타밀시스테인, 시스테이닐글리신, 호모시스테인, N-아세틸시스테인, 과황화 시스테인(예, S-머캅토시스테인, S-디설파닐시스테인, S-트리설파닐시스테인), 히포타우린, 과황화 글루타티온, 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드성 화합물, 알릴머캅탄, 2-푸르푸릴티올, 3-머캅토-3-메틸부틸포르메이트, 3-설파닐-1-헥사놀, 티오펜-2-일메탄티올, 1,6-헥산디티올, 4-메틸-4-설파닐펜탄-2-온, 3-설파닐펜탄-2-온, 티오테르피네올, 4-메톡시-2-메틸부탄-2-티올을 들 수 있다.
유기 물질은, 1종 단독으로 있어도 좋고, 2종 이상의 조합이라도 좋다.
유기 물질은, 시스테인, 환원형 글루타티온, γ-글루타밀시스테인, 시스테이닐글리신, 호모시스테인, N-아세틸시스테인, 과황화 시스테인(예, S-머캅토시스테인, S-디설파닐시스테인, S-트리설파닐시스테인), 히포타우린, 과황화 글루타티온 및 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드성 화합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
여기서, 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드성 화합물은, 저분자 화합물(예, 올리고펩타이드) 또는 고분자 화합물(예, 단백질)일 수 있다.
[1.2. 올레핀 화합물]
올레핀 화합물은, 적어도 2개의 전자 구인 기를 갖는 에틸렌 구조(에텐 구조)를 포함하고, 상기 에틸렌 구조를 통하여 유기 물질 중의 설파닐, 셀라닐 또는 설피노와 반응할 수 있는 화합물이다. 다만, 본 명세서에 있어서, 전자 구인 기에는 할로겐 원자는 포함되지 않는다.
에틸렌 구조가 갖는 전자 구인 기는, 통상 2개 이상, 통상 4개 이하이고, 바람직하게는 2개 이상 3개 이하, 보다 바람직하게는 2개이다. 전자 구인 기의 개수가 상기 범위에 있음으로써, 올레핀 화합물과 유기 물질과의 반응성이 향상된다.
전자 구인 기는, 1가라도, 2가라도 좋다.
에틸렌 구조가 갖는 전자 구인 기의 개수는, 에틸렌 구조와 전자 구인 기의 결합의 본 수(本數)를 의미한다. 따라서, 한 전자 구인 기가 2가의 기이고, 그 전자 구인 기가, 2본의 결합손을 사용하여 하나의 에틸렌 구조에 결합하고 있는 경우, 에틸렌 구조가 갖는 전자 구인 기의 개수는 2개일 수 있다.
올레핀 화합물은, 바람직하게는, 2개의 전자 구인 기가, 에틸렌 구조를 구성하는 동일한 탄소 원자에 결합되어 있는 것이 바람직하다. 이로써, 에틸렌 구조에서, 2개의 전자 구인 기가 결합되는 한쪽의 탄소 원자와는 다른 쪽의 탄소 원자에서의 반응성을 향상시킬 수 있다.
에틸렌 구조에서의 동일한 탄소 원자에 2개의 전자 구인 기가 결합되어 있는 경우 및 에틸렌 구조에서의 인접하는 탄소 원자에 각각 전자 구인 기가 결합되어 있는 경우, 상기 2개의 전자 구인 기는, 이들이 결합하는 탄소 원자와 하나가 되어, 환을 형성하고 있어도 좋다.
올레핀 화합물은, 바람직하게는, 에틸렌 구조가 갖는 전자 구인 기 중 적어도 2개가 동일한 기인 것이 바람직하다.
올레핀 화합물은, 에틸렌 구조가 갖는 전자 구인 기 중 적어도 2개가 동일한 기이고, 상기 동일한 2개의 전자 구인 기가, 에틸렌 구조를 구성하는 동일한 탄소 원자에 결합되어 있는 것이 보다 바람직하다.
올레핀 화합물은, 에틸렌 구조가 2개의 동일한 전자 구인 기를 갖고, 상기 동일한 2개의 전자 구인 기가, 에틸렌 구조를 구성하는 동일한 탄소 원자에 결합되어, 2개의 전자 구인 기가 결합되는 탄소 원자와는 다른 쪽의 탄소 원자에, 2개의 동일한 기(수소 원자라도 좋다)가 결합되어 있는 것이 더욱 바람직하다.
이로써, 올레핀 화합물과 유기 물질과의 반응에 의해, 유기 물질이 디아스테레오머인 2종의 유도체로 변환되는 것을 막을 수 있다.
에틸렌 구조는, 전자 구인 기 이외의 기를 갖고 있어도 좋다.
에틸렌 구조가 가질 수 있는 전자 구인 기 이외의 기의 예로서는, 1가의 탄화수소기를 들 수 있고, 바람직하게는 1가의 쇄상 탄화수소 및 1가의 방향족 탄화수소기로 이루어지는 그룹로부터 선택되는 1종 이상이고, 보다 바람직하게는 알킬 및 아릴로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이다.
바람직하게는, 에틸렌 구조는, 전자 구인 기 이외의 기를 갖지 않는다.
전자 구인 기의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, -C(=O)-OR1, -S(=O)2-R2, -P(=O)(-OR3)2, 시아노, 할로겐 원자로 치환된 알킬(예, 트리플루오로메틸 등의 퍼플루오로알킬, 트리클로로메틸 등의 퍼클로로알킬), 카복시, 니트로, -S(=O)-R4, -C(=O)-R5 및 -C(=O)-NR6R7을 들 수 있다.
여기서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 1가의 탄화수소기 또는 1가의 복소환기를 나타내고, 이들은 치환기를 갖고 있지 않아도 좋고, 치환기를 갖고 있어도 좋다.
R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로, 수소 원자, 1가의 탄화수소기 또는 1가의 복소환기를 나타내고, 이들은 치환기를 갖고 있지 않아도 좋고, 치환기를 갖고 있어도 좋다.
1가의 탄화수소기로서는, 예를 들어, 1가의 쇄상 탄화수소기, 1가의 지환식 탄화수소기 및 1가의 방향족 탄화수소기를 들 수 있다.
1가의 쇄상 탄화수소기란, 쇄상 구조만으로 구성된 탄화수소기를 의미하고, 주쇄에 환상 구조를 포함하지 않는다. 단, 쇄상 구조는 직쇄상이라도 분기상이라도 좋다. 1가의 쇄상 탄화수소기로서는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐을 들 수 있다. 알킬, 알케닐 및 알키닐은 직쇄상 또는 분기상 중 어느 것이라도 좋다.
알킬로서는, 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬로서는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실을 들 수 있다.
알케닐로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알케닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐로서는, 예를 들어, 비닐, 프로페닐, n-부테닐을 들 수 있다.
알키닐로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알키닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐로서는, 예를 들어, 에티닐, 프로피닐, n-부티닐을 들 수 있다.
1가의 쇄상 탄화수소기로서는 알킬이 바람직하다.
1가의 지환식 탄화수소기란, 환 구조로서 지환식 탄화수소만을 포함하고 방향족환을 포함하지 않는 탄화수소기를 의미하고, 지환식 탄화수소는 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다. 단, 지환식 탄화수소만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 이의 일부에 쇄상 구조를 포함하고 있어도 좋다. 1가의 지환식 탄화수소기로서는, 예를 들어, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐을 들 수 있고, 이들은, 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다.
사이클로알킬로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알킬이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알킬이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알킬로서는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 들 수 있다.
사이클로알케닐로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알케닐이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알케닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알케닐로서는, 예를 들어, 사이클로프로페닐, 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐을 들 수 있다.
사이클로알키닐로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알키닐이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알키닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알키닐로서는, 예를 들어, 사이클로프로피닐, 사이클로부티닐, 사이클로펜티닐, 사이클로헥시닐을 들 수 있다.
1가의 지환식 탄화수소기로서는 사이클로알킬이 바람직하다.
1가의 방향족 탄화수소기란, 방향족 환 구조를 포함하는 탄화수소기를 의미한다. 단, 방향족환만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 이의 일부에 쇄상 구조, 지환식 탄화수소 구조 등의 구조를 포함하고 있어도 좋다. 따라서, 1가의 방향족 탄화수소기는 아르알킬일 수 있다. 방향족환은 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다. 1가의 방향족 탄화수소기로서는, 탄소 원자수 6 내지 12의 아릴이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6의 아릴이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 6 내지 12의 아릴로서는, 예를 들어, 페닐, 나프틸을 들 수 있다.
1가의 방향족 탄화수소기로서는, 페닐이 바람직하다.
이들 중에서도, 1가의 탄화수소기로서는, 알킬, 사이클로알킬, 아릴이 바람직하고, 알킬 또는 아릴이 보다 바람직하다.
1가의 복소환기란, 복소환을 포함하는 환식 화합물로부터, 수소 원자 1개를 제거한 기를 말한다. 복소환기를 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 산소 원자, 황 원자 및 질소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 1가의 복소환기는, 1가의 방향족 복소환기 또는 1가의 비방향족 복소환기이다.
1가의 방향족 복소환기란, 방향족성을 갖는 환을 포함하는 복소환기를 말한다. 1가의 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 1 내지 15의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 9의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 1가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 퓨리닐, 안트라퀴놀릴, 카바졸릴, 플루오레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 아크리디닐, 쿠마리닐, 크산테닐 및 프탈라지닐을 들 수 있다.
1가의 비방향족 복소환기란, 방향족성을 갖는 환을 포함하지 않는 복소환기를 말한다. 1가의 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 2 내지 15의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 9의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 비방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 1가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 옥시라닐, 아지리디닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 피페라지닐, 디하이드록사지닐, 테트라하이드록사지닐, 디하이드로피리미디닐 및 테트라하이드로피리미디닐을 들 수 있다.
이들 중에서도, 1가의 복소환기로서는 5원 또는 6원의 복소환기가 바람직하다.
치환기의 예로서는,
1가의 탄화수소기(추가로 할로겐 원자로 치환되어 있어도 좋다),
1가의 복소환기(추가로 할로겐 원자로 치환되어 있어도 좋다),
-O-Rs1(여기서, Rs1는 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-(C=O)-Rs2(여기서, Rs2는 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-(C=O)-O-Rs3(여기서, Rs3는 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-O-(C=O)-Rs4(여기서, Rs4는 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-N(Rs5)2(여기서, 복수 있는 Rs5는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-(C=O)-N(Rs6)2(여기서, 복수 있는 Rs6는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-N(Rs7)-(C=O)-Rs8(여기서, Rs7는 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다. Rs8는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-SO2-Rs9(여기서, Rs9는 하이드록시 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
-S(=O)-Rs10(여기서, Rs10은 하이드록시 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다),
니트로,
시아노 및
할로겐 원자를 들 수 있다.
여기서, 할로겐 원자의 예로서는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드 원자를 들 수 있고, 바람직하게는 불소 원자 또는 염소 원자이다.
치환기는, 바람직하게는, 1가의 탄화수소기(추가로 할로겐 원자로 치환되어 있어도 좋다), 니트로, 시아노 및 할로겐 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이다.
전자 구인 기는,
바람직하게는, -C(=O)-OR1, -S=(O)2-R2, -Ｐ(=O)(-OR3)2, 시아노, 할로겐 원자로 치환된 알킬, 카복시, 니트로, -S(=O)-R4, -C(=O)-R5 및 -C(=O)-NR6R7로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이고,
보다 바람직하게는, -C(=O)-OR1, -S(=O)2-R2, -Ｐ(=O)(-OR3)2, 시아노, 할로겐 원자로 치환된 알킬 및 카복시로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이고,
더욱 바람직하게는, -C(=O)-OR1, -S(=O)2-R2, -P(=O)(-OR3)2 및 시아노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이다.
여기서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 상기 정의와 같다.
R1은, 바람직하게는 1가의 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 1가의 쇄상 탄화수소기이며, 더욱 바람직하게는 알킬이고, 특히 바람직하게는 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬이다.
R2는, 바람직하게는 1가의 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 1가의 방향족 탄화수소기이며, 더욱 바람직하게는 아릴이고, 특히 바람직하게는 페닐이다.
R3은, 바람직하게는 1가의 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 1가의 쇄상 탄화수소기이며, 더욱 바람직하게는 알킬이다.
R4는, 바람직하게는 1가의 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 1가의 방향족 탄화수소기이며, 더욱 바람직하게는 아릴이다.
R5는, 바람직하게는 1가의 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 1가의 방향족 탄화수소기이며, 더욱 바람직하게는 아릴이다.
R6는, 바람직하게는 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 수소 원자이다.
R7은, 바람직하게는 수소 원자 또는 1가의 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 1가의 탄화수소기이며, 더욱 바람직하게는 1가의 쇄상 탄화수소기 또는 1가의 방향족 탄화수소기이고, 특히 바람직하게는 알킬 또는 아릴이다.
올레핀 화합물은, 바람직하게는, 유기 물질과의 반응성의 향상 등의 관점으로부터 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물이다.
[화학식 (I)]
화학식 (I)에 있어서, EWG1 및 EWG2는 각각 독립적으로, 전자 구인 기를 나타내고, 이들이 결합하는 탄소 원자와 하나가 되어, 환을 형성하고 있어도 좋다.
전자 구인 기의 바람직한 예는, 상기 예와 동일하다.
EWG1 및 EWG2는, 바람직하게는 같은 기이다. 이로써, 올레핀 화합물과 유기 물질과의 반응에 의해 생기는 유기 물질의 유도체가, 디아스테레오머인 2종의 유도체가 되는 것을 막을 수 있다.
올레핀 화합물은 종전 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 올레핀 화합물로서 시판품을 사용할 수 있다.
[1.3. 반응 조건]
본 실시형태의 제조방법에서는, 유기 물질과 올레핀 화합물을 산성 조건 하에서 반응시킨다. 이로써, 유기 물질이 갖는 기 A의 산화 반응을 억제할 수 있다. 또한 반응계에 디설파이드 화합물 등의 산화물이 공존하는 경우에는, 기 A와 상기 산화물과의 반응을 억제할 수 있다. 그 결과, 유기 물질을 효율적으로 유도체로 변환할 수 있다.
산성 조건 하란, 유기 물질 및 올레핀 화합물의 반응을 산성 용액 중에서 행하는 것을 의미한다. 유기 물질 및 올레핀 화합물은, 산성 용액 중에 전부 용해되어 있지 않아도 좋고, 유기 물질 및 올레핀 화합물이 산성 용액 중에 분산되어 있는 상태에서 반응을 행하여도 좋다.
산성 용액은, 통상 pH 7 미만, 바람직한 pH 6.5 이하, 보다 바람직하게는 pH 6.0 이하, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 미만, 특히 바람직하게는 pH 5.5 이하, pH 5.25 이하, pH 5.0 이하, pH 4.75 이하, pH 4.5 이하 또는 pH 4.25 이하이고, 바람직하게는 pH 0.0 이상, 보다 바람직하게는 pH 2.0 이상이다. 산성 용액의 pH를 상기 범위로 함으로써, 유도체의 분해를 억제하면서, 유기 물질의 산화, 디설파이드 화합물과 교환 반응 등의 부반응을 효과적으로 억제할 수 있다.
여기서, 산성 용액의 pH 및 후술하는 중성 또는 염기성 용액의 pH는, 유리 전극법을 이용한 pH계에 의해 온도 25℃의 조건에서 측정할 수 있다.
산성 용액은, 바람직하게는 물을 포함하는 용액이다. 산성 용액은, 물 이외에 유기 용매를 포함하고 있어도 좋다. 유기 용매로서는, 물과 임의의 비율로 혼합할 수 있는 용매가 바람직하다. 이러한 유기 용매의 예로서는, 메탄올, 에탄올 등의 알코올 용매; 아세토니트릴 등의 니트릴 용매; 디메틸설폭사이드, 디메틸 포름아미드, 디옥산, 테트라하이드로푸란 등의 비프로톤성 극성 용매를 들 수 있다.
산성 용액이 물을 포함하는 용액인 경우, 물에 대한 용액 중의 유기 용매의 중량은, 바람직하게는 50중량% 이하, 보다 바람직하게는 10중량% 이하, 더욱 바람직하게는 5중량% 이하이고, 통상 0중량% 이상이다.
보다 바람직하게는, 산성 용액은 수용액이다.
산성 용액은 통상 산을 포함한다. 산의 예로서는, 무기산 및 유기산을 들 수 있다. 무기산의 예로서는, 인산, 염산, 황산 및 과염소산을 들 수 있다. 유기산의 예로서는, 포름산, 옥살산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 메탄설폰산, 트리플루오로메탄설폰산, 톨루엔설폰산 및 시아노아세트산을 들 수 있다.
산성 용액으로서, pH를 원하는 범위로 조정한 완충액을 사용해도 좋다.
산성 조건 하에서의 반응 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 50℃ 이하, 보다 바람직하게는 45℃ 이하, 더욱 바람직하게는 40℃ 이하이고, 바람직하게는 5℃ 이상, 보다 바람직하게는 10℃ 이상, 더욱 바람직하게는 15℃ 이상이다.
산성 조건 하에서 반응 시간은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 60분간 이하, 보다 바람직하게는 30분 이하, 더욱 바람직하게는 15분 이하이고, 통상 0분간 이상이다.
통상 산성 조건 하에서의 반응은, 유기 물질 및 올레핀 화합물을 산성 용액 중에서 혼합함으로써 행한다.
산성 용액 중에서 유기 물질 및 올레핀 화합물을 혼합하는 방법에 특별히 한정은 없고, 예를 들어, 1) 유기 물질을 포함하는 산성 용액을 조제하고, 이것에 올레핀 화합물을 첨가하여 혼합하는 방법, 2) 유기 물질을 포함한 용액을 조제하고, 이것에 완충액 등을 첨가하여 pH를 원하는 범위로 조정한 후, 올레핀 화합물을 첨가하여 혼합하는 방법을 들 수 있다.
유기 물질의 산화 반응을 억제하는 관점에서, 유기 물질을 포함하는 산성 용액을 조제하고, 얻어진 용액에 올레핀 화합물을 첨가하여 혼합하는 것이 바람직하다. 올레핀 화합물은, 그대로의 형태로 또는 용매(물, 유기 용매)에 용해시킨 용액 형태로 첨가해도 좋다.
산성 용액 중의 유기 물질의 농도는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 0.1μmol/L 내지 100mmol/L로 해도 좋다.
올레핀 화합물의 유기 물질에 대한 양은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 몰 비율로, 1 내지 100으로 해도 좋다.
상기 유기 물질이 기 A 이외에 아미노기를 포함하는 경우, 상기 유기 물질을 상기 올레핀 화합물과 산성 조건 하에서 반응시킨 후, 추가로 중성 또는 염기성 조건(바람직하게는 염기성 조건 하)으로 반응시켜서, 상기 유기 물질의 유도체를 얻어도 좋다.
이로써, 유기 물질에 포함되는 기 A가, 산성 조건 하에서 상기 올레핀 화합물과 반응하여 산화 등의 부반응에 대하여 안정된 치환기로 변환된다. 이어서, 중성 또는 염기성 조건 하에서, 유기 물질에 포함되는 아미노기(무치환 아미노기, 1치환 아미노기, 2치환 아미노기일 수 있다)가 상기 올레핀 화합물과 반응하여, 올레핀 화합물에 유래하는 치환기를 갖는 치환 아미노기(유기 물질에 포함되는 아미노기가 2치환 아미노기인 경우에는, 치환 암모니오기)로 변환된다.
이러한 제조방법에 의해, 유기 물질이 포함하는 기 A 및 유기 물질이 포함할 수 있는 아미노기 양쪽이 상기 올레핀 화합물과 반응하여, 기 A 및 아미노기 양쪽이 변환된 유도체가 얻어진다.
보다 치환된 아미노기를 포함하는 유도체는, 치환되기 전의 아미노기를 포함하는 유도체와 비교하여, 제조 및 분석 상의 이점을 갖는다. 통상, 보다 치환된 아미노기는, 치환되기 전의 아미노기와 비교하여 소수성이 향상된다. 따라서, 액체 크로마토그래피에 있어서, 유기 물질의 유도체의 분리 조건을 용이하게 설정할 수 있는 경우가 많다. 한편, 치환 정도가 낮은 아미노기를 포함하는 유도체(예: 시스테인, 환원형 글루타티온 등의 무치환 아미노기를 포함하는 유도체)는 친수성이 높기 때문에, 역상 액체 크로마토그래피에 있어서 유지가 약하고, 또한 친수성 상호 작용 크로마토그래피(HILIC)에서는 유지가 극히 강하여, 분리 조건을 용이하게 설정할 수 없는 경우가 있다. 또한, 보다 치환된 아미노기를 포함하는 유도체는, 치환되기 전의 아미노기를 포함하는 유도체와 비교하여, 질량 분석기에서의 검출 감도가 높은 경우가 많다.
중성 또는 염기성 조건 하란, 산성 조건 하에서 반응시킨 유기 물질(이하, 산성 조건 하 유도체라고도 함)을 올레핀 화합물과 중성 또는 염기성 용액 중에서 반응시키는 것을 의미한다. 산성 조건 하 유도체 및 올레핀 화합물은 용액 중에 전부 용해되어 있지 않아도 좋고, 산성 조건 하 유도체 및 올레핀 화합물이 용액 중에 분산되어 있는 상태에서 반응을 행하여도 좋다.
중성 또는 염기성 용액은, 통상 pH 7 이상, 바람직하게는 pH 7.5 이상, 보다 바람직하게는 pH 8 이상, 더욱 바람직하게는 pH 8.5 이상이고, 바람직하게는 pH 11 이하, 보다 바람직하게는 pH 10 이하, 더욱 바람직하게는 pH 9.5 이하이다. 중성 또는 염기성 용액의 pH를 상기 범위로 함으로써, 유기 물질이 포함할 수 있는 아미노기와 올레핀 화합물의 반응을 촉진시켜 유도체의 분해를 억제할 수 있다.
중성 또는 염기성 용액은, 바람직하게는 물을 포함하는 용액이다. 중성 또는 염기성 용액은 물 이외에 유기 용매를 포함하고 있어도 좋다. 유기 용매로서는, 물과 임의의 비율로 혼합할 수 있는 용매가 바람직하다. 이러한 유기 용매의 예로서는, 산성 용액의 설명에서 예시된 유기 용매를 들 수 있다.
중성 또는 염기성 용액이 물을 포함하는 용액인 경우, 물에 대한 용액 중의 유기 용매의 중량의 범위는, 상기 산성 용액의 설명에서 거론한 바람직한 범위와 동일한 범위로 할 수 있다. 보다 바람직하게는, 중성 또는 염기성 용액은 물 용액이다.
염기성 용액은 통상 염기를 포함한다. 염기의 예로서는, 무기 염기 및 유기 염기를 들 수 있다. 무기 염기의 예로서는, 금속 수산화물(예, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘), 금속 탄산염(예, 탄산 나트륨, 탄산수소 나트륨, 탄산 칼륨), 인산 나트륨, 인산 칼륨, 암모니아, 붕산 나트륨 및 붕산 칼륨을 들 수 있다. 유기 염기의 예로서는, 아민(예, 트리메틸아민, 트리에틸아민)을 들 수 있다.
중성 또는 염기성 용액으로서, pH를 원하는 범위로 조정하는 완충액을 사용해도 좋다.
중성 또는 염기성 조건 하에서 반응 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 50℃ 이하, 보다 바람직하게는 45℃ 이하, 더욱 바람직하게는 40℃ 이하이고, 바람직하게는 5℃ 이상, 보다 바람직하게는 10℃ 이상, 더욱 바람직하게는 15℃ 이상이다.
중성 또는 염기성 조건 하에서의 반응 시간은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 60분간 이하, 보다 바람직하게는 30분간 이하, 더욱 바람직하게는 15분간 이하이고, 통상 0분간 이상이다.
통상 중성 또는 염기성 조건 하에서의 반응은, 산성 조건 하 유도체 및 올레핀 화합물을 중성 또는 염기성 용액 중에서 혼합함으로써 행한다.
산성 조건 하 유도체를 산성 용액으로부터 단리하고 나서, 중성 또는 염기성 용액 중에서 올레핀 화합물과 혼합해도 좋다. 또는 산성 조건 하 유도체를 산성 용액으로부터 단리하지 않고, 산성 용액의 액성을 원하는 대로 하는 중성 또는 염기성 pH로 조정하여, 중성 또는 염기성 용액 중에서 올레핀 화합물과 혼합해도 좋다.
상기와 같이 산성 조건 하 유도체를 단리하지 않고 올레핀 화합물과 용액 중에서 혼합할 경우, 올레핀 화합물을 새로이 용액 중에 첨가해도 좋다. 또는 산성 조건 하에서의 반응시에, 올레핀 화합물을 과잉량 첨가해 두고, 잉여가 되는 올레핀 화합물을 중성 또는 염기성 조건 하에서의 반응에 사용하는 것으로 해도 좋다.
유기 물질의 유도체의 생성은, 예를 들어, 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 등의 방법에 의해 확인할 수 있다.
본 실시형태의 유도체의 제조방법은, 유기 물질을 올레핀 화합물과 반응시키는 반응 공정 이외에 임의의 공정을 포함할 수 있다. 임의의 공정의 예로서는, 예를 들어, 반응 공정 후, 유도체를 포함하는 반응제를 희석하는 공정, 반응액으로부터 유도체를 단리하는 공정을 들 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 유기 물질의 유도체는, 기 A가 산화에 대하여 보다 안정적인 기로 변환되어 있다. 따라서, 유기 물질을 그대로 분석하는 경우와 비교해서, 유기 물질의 유도체는 보다 정확하게 분석될 수 있다.
[2. 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법]
본 발명의 일 실시형태에 따른, 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법은, (1) 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질을 포함하는 시료와,
적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물을,
산성 조건 하에서 혼합하여, 상기 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는 것 및
(2) 상기 처리 시료 중의 상기 유기 물질의 유도체를 분석하는 것을 포함한다.
[2.1. 공정 (1)]
공정 (1)에서는, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기(기 A)를 포함하는 유기 물질을 포함하는 시료와, 적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물을 산성 조건 하에서 혼합하여, 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는다.
유기 물질의 예 및 바람직한 예로서는, 상기와 동일한 예를 들 수 있다. 복수 종의 유기 물질이 시료 중에 포함되어 있어도 좋다.
유기 물질을 포함하는 시료의 예로서는, 특별히 한정되지 않고, 생물 유래의 생물학적 시료 및 유기 합성 반응에 의해 얻어지는 합성 시료, 천연 환경 중에 존재하는 환경 시료 등의 비생물학적 시료를 들 수 있다. 생물학적 시료가 유래하는 생물로서는, 예를 들어, 포유 동물(예, 인간, 원숭이, 쥐, 생쥐, 토끼, 소, 돼지, 말, 염소, 양), 조류 등의 동물, 곤충, 연체 동물, 미생물, 식물을 들 수 있는데, 바람직하게는 포유 동물이다. 생물학적 시료의 종류로서는, 예를 들어, 혈액 시료(예, 전혈, 혈청, 혈장), 타액, 뇨, 분변, 담즙, 땀, 눈물, 뇌 척수액, 세포 또는 미생물의 배양에 사용한 배양액 및 조직 및 세포 추출액 등을 들 수 있다. 합성 시료로서는, 예를 들어, 유기 물질을 발생시키는 유기 합성 반응에 의해 얻어지는 반응 생성물, 세포 또는 미생물 배양에 사용하는 배지를 들 수 있다. 환경 시료로서는, 예를 들어, 토양, 해수 및 담수 유래 등의 시료를 들 수 있다.
시료에서의 유기 물질 및 올레핀 화합물의 농도는, 이들이 반응하여 유기 물질의 유도체가 생성되고, 또한 상기 생성물을 분석할 수 있는 농도인 한 특별히 한정되지 않는다. 시료에서의 유기 물질 및 올레핀 화합물의 각 농도는, 예를 들어 0.001μmol/L 내지 1,000mmol/L이고, 바람직하게는 0.01μmol/L 내지 100mmol/L, 보다 바람직하게는 0.1μmol/L 내지 10mmol/L이며, 더욱 바람직하게는 1μmol/L 내지 1mmol/L이라도 좋다.
시료는, 예를 들어 제단백질 처리 등의 전처리를 행한 시료라도 좋다.
본 실시형태에서의 분석 방법에서는, 산성 조건 하에서 시료를 처리하므로, 예를 들어 전처리로서 제단백질 처리 등의 산성 처리를 행한 후에, 시료의 체액을 중성 내지 염기성으로 조정하지 않아도 좋고, 시료의 액성을 산성으로 유지한 채, 시료를 올레핀 화합물과 혼합할 수 있다. 산성 조건 하에서는, 기 A의 산화 반응, 기 A와 디설파이드의 교환 반응 등의 부반응은 진행하기 어렵다. 따라서, 전처리를 행한 후, 분석까지의 동안에 부반응이 진행하는 것을 억제할 수 있다. 그 결과, 기 A를 갖는 유기 물질을 보다 정확하게 분석할 수 있다.
시료는 디설파이드 화합물을 포함할 수 있다. 디설파이드 화합물은 -S-S-로 표시되는 기를 포함하는 화합물이다. 디설파이드 화합물은 티올의 산화에 의해 발생할 수 있다.
예를 들면, 생체 시료에 있어서, 티올(예, 시스테인, 환원형 글루타티온)과 디설파이드 화합물(예, 시스틴, 산화형 글루타티온)과의 존재비의 정보는 생체 시료의 산화 환원 상태를 아는 데 유용하다.
본 실시형태의 분석 방법에서는, 유기 물질에 포함되는 산화되기 쉬운 설파닐 등의 기 A를 올레핀 화합물과 반응시켜서, 유기 물질을 유도체로 변환하고나서 분석을 행한다. 또한, 본 실시형태의 분석 방법에서는, 산성 조건 하에서 시료를 처리한다. 상기와 같이, 산성 조건 하에서는, 티올와 디설파이드 화합물과의 교환 반응이 일어나기 어렵다. 따라서, 시료 중에 포함되는 유기 물질의 존재량을 정확히 결정할 수 있다.
시료가 포함할 수 있는 디설파이드 화합물의 예로서는, 상기 유기 물질이 가질 수 있는 설파닐이, 분자 간에서 반응하여 디설파이드로 변환되어 있는 화합물을 들 수 있고, 더욱 구체적으로는, 디메틸디설파이드, 디에틸디설파이드, 산화형 글루타티온 및 시스틴을 들 수 있다.
시료가 포함할 수 있는 디설파이드 화합물은 아미노기를 포함할 수 있다. 여기서, 디설파이드 화합물이 포함할 수 있는 아미노기에는, 무치환된 아미노기(-NH2)에 더하여, 1치환 아미노기 및 2치환 아미노기가 포함된다. 디설파이드 화합물이 포함할 수 있는 아미노기로서는, 무치환된 아미노기 및 1치환 아미노기로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 바람직하고, 무치환된 아미노기가 보다 바람직하다. 디설파이드 화합물은, 1분자 중에 아미노기를 1개만 포함하고 있어도 좋고, 복수개 포함하고 있어도 좋다. 디설파이드 화합물 1분자에 포함될 수 있는 아미노기의 수는 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개라도 좋다.
일 실시형태에서는, 시료는, 산화형 글루타티온 및 시스틴으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함한다.
올레핀 화합물의 예 및 바람직한 예로서는 상기와 동일한 예를 들 수 있다.
유기 물질을 포함하는 시료와 올레핀 화합물을 산성 조건 하에서 혼합함으로써, 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는다.
바람직하게는, 유기 물질을 포함하는 시료와 올레핀 화합물과의 혼합을 산성 용액 중에서 행한다. 산성 용액의 종류 및 산성 용액의 pH는, [1.3. 반응 조건]에서 기술한 바람직한 예와 동일하게 할 수 있다.
혼합 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 1) 유기 물질을 포함하는 시료와 원하는 pH값을 갖는 산성 용액을 포함하는 용액을 조제하고, 여기에 올레핀 화합물을 첨가하여 혼합하는 방법, 2) 유기 물질을 포함하는 시료를 희염산, 용매 등으로 희석하여 용액으로 하고, 여기에 완충액 등을 첨가하여 pH를 원하는 범위로 조정한 후, 올레핀 화합물을 첨가하여 혼합하는 방법을 들 수 있다.
처리 온도 및 처리 시간은, 특별히 한정되지 않지만, [1.3. 반응 조건]에서 기술한 반응 온도 및 반응 시간의 바람직한 예와 동일하게 할 수 있다.
유기 물질이 기 A에 추가로 아미노기를 포함하는 경우, 공정 (1)은 공정 (1')을 포함하는 것인 것이 바람직하다.
공정 (1')에서는, 상기 시료와 상기 올레핀 화합물을 산성 조건 하에서 혼합한 후, 추가로 중성 또는 염기성 조건 하에서 혼합하여, 상기 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는다.
상기와 같이, 시료 중의 유기 물질에 포함되는 기 A는, 산성 조건 하에서 상기 올레핀 화합물과 반응하여, 산화 등의 부반응에 대하여 안정된 치환기로 변환된다. 이어서, 중성 또는 염기성 조건 하에서, 유기 물질에 포함되는 아미노기(무치환 아미노기, 1치환 아미노기, 2치환 아미노기일 수 있다)가 상기 올레핀 화합물과 반응하여 치환 아미노기(유기 물질에 포함되는 아미노기가 2치환 아미노기인 경우에는, 치환 암모니오기)로 변환되어, 유기 물질의 유도체가 얻어진다. 보다 치환된 아미노기는, 상기와 같이 소수성이 향상되어 있으므로, 치환 정도가 낮은 아미노기가 보다 치환된 아미노기로 변환된 유도체는, 통상 액체 크로마토그래피에서 분리 조건을 용이하게 설정할 수 있고, 분리가 용이하다. 또한, 치환 정도가 낮은 아미노기가 보다 치환된 아미노기로 변환된 유도체는, 통상 질량 분석기로의 검출 감도가 상승한다.
시료 중에, 치환 정도가 낮은 아미노기를 포함하는 화합물(예를 들어, 무치환 아미노기를 포함하는 디설파이드 화합물)이 포함되어 있는 경우에는, 상기 화합물은 친수성이 높기 때문에, 역상 액체 크로마토그래피에서 유지가 약하고, 또한 친수성 상호 작용 크로마토그래피(HILIC)에서는 유지가 극히 강하여, 분리 조건을 용이하게 설정할 수 없는 경우가 있다.
이와 같이 시료 중에 치환 정도가 낮은 아미노기를 포함하는 화합물이 포함되어 있는 경우라도, 무치환 아미노기를 포함하는 디설파이드 화합물 등의 치환 정도가 낮은 아미노기를 포함하는 화합물은, 중성 또는 염기성 조건 하에서 아미노기가 상기 올레핀 화합물과 반응하여, 보다 치환된 아미노기(아미노기가 2치환 아미노기인 경우에는, 치환 암모니오기)로 변환된다. 유기 물질의 유도체와 마찬가지로, 아미노기가 보다 치환된 아미노기로 변환된 디설파이드 화합물 등의 화합물도, 통상 액체 크로마토그래피에서 분리 조건을 쉽게 설정할 수 있고, 분리가 용이하다. 또한, 통상 질량 분석기로의 검출 감도가 상승한다.
예를 들어, 시료 중에 포함될 수 있는 유기 물질이 시스테인이고, 시료 중에 포함될 수 있는 디설파이드 화합물이, 시스테인이 이량화된 시스틴인 경우의 분석 방법에 대하여 설명한다. 산성 조건 하에서 상기 올레핀 화합물과 시료를 혼합하여 얻어지는 산성 조건 하의 처리 시료 중에는, 시스테인이 갖는 설파닐기가 상기 올레핀 화합물과 반응하여 얻어지는, 시스테인의 유도체(제1 유도체) 및 시스틴이 존재한다고 생각된다.
시스테인의 유도체는 무치환된 아미노기를 1개 갖고, 시스틴은 무치환된 아미노기를 2개 갖는다. 이에 기인하여, 시스테인의 유도체와 시스틴의 유도체는 소수성에 큰 차이가 생긴다. 따라서, 액체 크로마토그래피에 의한 분석시에, 시스테인의 유도체와 시스틴을 동시에 분석하기 위한 조건을 설정하는 것이 용이하지 않은 경우가 있다.
한편, 시료와 상기 올레핀 화합물을 산성 조건 하에서 혼합한 후, 추가로 중성 또는 염기성 조건 하에서 혼합하여, 중성 또는 염기성 조건 하에서의 처리 시료를 얻는 경우, 처리 시료 중에는, 설파닐기 및 아미노기가 상기 올레핀 화합물과 반응해서 얻어지는 시스테인의 유도체(제2 유도체)와, 아미노기가 상기 올레핀 화합물과 반응하여 얻어지는 시스틴의 유도체가 존재한다고 생각된다.
시스테인 및 시스틴의 각각의 아미노기가 상기 올레핀 화합물과 반응하므로, 시스테인의 유도체(제2 유도체)와 시스틴의 유도체와의 소수성의 차이가 작아지고, 액체 크로마토그래피에 의한 분석시에, 시스테인의 유도체와 시스틴을 동시에 분석하기 위한 조건을 설정하는 것이 비교적 용이해진다.
따라서, 공정 (1)을 공정 (1')을 포함하는 것으로 함으로써, 시료 중에서의, 기 A 이외에 아미노기를 포함하는 유기 물질을 정확하고 용이하게 분석할 수 있다.
공정 (1')에서는, 바람직하게는 유기 물질을 포함하는 시료와 상기 올레핀 화합물을 산성 용액 중에서 혼합한 후, 추가로 중성 또는 염기성 용액 중에서 혼합한다. 중성 또는 염기성 용액의 종류 및 중성 또는 염기성 용액의 pH는, [1.3. 반응 조건]에서 기술한 바람직한 예와 동일하게 할 수 있다.
중성 또는 염기성 용액 중에서의 혼합 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 산성 용액 중에서 시료와 상기 올레핀 화합물을 혼합한 후, 얻어진 혼합액(산성 조건 하의 처리 시료)에 염기성 용액을 첨가하여, 혼합액의 액성을 원하는 대로 하는 중성 또는 염기성 pH로 조정하여, 중성 또는 염기성 용액 중에서 추가로 시료와 상기 올레핀 화합물을 혼합하는 방법; 준비한 중성 또는 염기성 용액 중에 상기 혼합액을 첨가하여 혼합하는 방법을 들 수 있다.
중성 또는 염기성 조건 하에서의 처리 온도 및 처리 시간은, 특별히 한정되지 않지만, [1.3. 반응 조건]에서 기술한 중성 또는 염기성 조건 하에서의 반응 온도 및 반응 시간의 바람직한 예와 동일하게 할 수 있다.
유기 물질을 포함하는 시료와 상기 올레핀 화합물을 산성 용액 중에서 혼합한 후, 추가로 중성 또는 염기성 용액 중에서 혼합함으로써, 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻을 수 있다.
[2.2. 공정 (2)]
공정 (2)에서는, 처리 시료 중의 유기 물질의 유도체를 분석한다.
공정 (2)는, 공정 (2a) 및 공정 (2b)를 이러한 순서로 포함하고 있어도 좋다.
[2.2.1. 공정 (2a)]
공정 (2a)에서는, 공정 (1)에서의 처리 시료로부터 유기 물질의 유도체를 분리한다.
분리는, 처리 시료에 포함되는 유도체 이외의 물질(예를 들어, 디설파이드 화합물)과 유도체가 분리될 수 있는 임의의 방법에 의해 행할 수 있다.
분리 방법의 예로서는, 특별히 한정되지 않으나, 액체 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피(SFC), 모세관 전기 영동법(CE) 및 가스 크로마토그래피(GC)를 들 수 있다. 시료에 포함되는 협잡물의 종류 및 성질, 및 유기 물질의 유도체의 종류 및 성질에 따라 적절히 분리 방법을 선택해도 좋다. 분리 방법으로서는, 액체 크로마토그래피가 바람직하고, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)가 보다 바람직하다. 이들 분리 방법은, 종전 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 이들 분리 방법은 단독으로 이용해도 병용해도 좋다.
액체 크로마토그래피의 예로서는, 역상 액체 크로마토그래피, 순상 액체 크로마토그래피, 친수성 상호 작용 크로마토그래피(HILIC), 이온 교환 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토그래피를 들 수 있다.
역상 액체 크로마토그래피의 고정상의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 옥타데실실란 등의 소수성 화합물로 수식된 실리카 겔을 들 수 있다. 또한, 이동상의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 유기 용매, 수용액 및 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 유기 용매의 바람직한 예로서는, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등을 들 수 있다. 수용액의 바람직한 예로서는, 물, 포름산 수용액, 포름산 암모늄 수용액, 트리플루오로아세트산 수용액, 아세트산 수용액, 아세트산 암모늄 수용액, 탄산수소 암모늄 수용액, 완충액 등을 들 수 있다.
순상 액체 크로마토그래피의 고정상의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 실리카 겔 및 알루미나를 들 수 있다. 또한, 이동상의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 헥산, 아세트산 에틸, 염화 메틸렌, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로푸란 및 이들의 혼합 용매를 들 수 있다.
친수성 상호 작용 크로마토그래피의 고정상의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 실리카 겔 및 아미노프로필, 아미드, 디올 또는 시아노로 수식된 실리카 겔을 들 수 있다. 또한, 이동상의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 유기 용매, 수용액 및 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 유기 용매의 바람직한 예로서는, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등을 들 수 있다. 수용액의 바람직한 예로서는, 물, 포름산 수용액, 포름산 암모늄 수용액, 트리플루오로아세트산 수용액, 아세트산 수용액, 아세트산 암모늄 수용액, 탄산수소 암모늄 수용액, 완충액 등을 들 수 있다.
친수성 상호 작용 크로마토그래피는, 역상 크로마토그래피의 고정상에서는 유지력이 약한, 친수성이 높은 대상을 분리할 경우에 바람직하게 사용된다. 예를 들어, 올레핀 화합물에 의해 유도체화되지 않는 시스틴, 산화형 글루타티온 등의 디설파이드 화합물과, 시스테인의 유도체, 환원형 글루타티온의 유도체 등의 티올 유도체를 친수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 동시에 분석할 수 있다.
어느 액체 크로마토그래피에서도, 카이랄인 충전제를 장전한 칼럼(카이랄 칼럼)을 사용함으로써, 유기 물질이 카이랄 화합물의 혼합물인 경우에 카이랄 화합물을 분리할 수 있다.
예를 들어, D-시스테인(천연에서는 존재 비율이 작음)의 유도체와, L-시스테인의 유도체를 카이랄 컬럼에 의해 분리할 수 있다.
[2.2.2. 공정 (2b)]
공정 (2b)에서는 분리된 유기 물질의 유도체를 검출한다.
검출 방법의 예로서는, 특별히 한정되지 않지만, 질량 분석기에 의한 질량 분석법, 자외선 흡수의 검출(UV), 포토다이오드 어레이 검출(PDA), 형광 검출(FL),가시 광선 흡수의 검출, 유도 결합 플라스마 발광 분광 분석법(ICP), 코로나 하전화 입자 검출, 시차 굴절률 검출(RI) 및 증발 광산란 검출(ELSD)을 들 수 있다. 시료에 포함되는 협잡물의 종류 및 성질, 및 유기 물질의 유도체의 종류 및 성질에 따라 적절히 검출 방법을 선택해도 좋다.
검출 방법으로서는, 질량 분석, 자외선 흡수의 검출, 형광 검출, 가시광선 흡수의 검출 및 유도 결합 플라스마 발광 분광 분석법이 바람직하고, 질량 분석 및 자외선 흡수의 검출이 보다 바람직하다. 이들 검출 방법은, 단독으로 이용해도, 병용해도 좋다.
이들 분리 방법은 종전 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
질량 분석법은, 특별히 한정되지 않고, 각종 이온화 방법, 각종 이온 분리 방법, 각종 검출기를 조합한 질량 분석법을 사용해도 좋다.
질량 분석법에 사용하는 질량 분석계의 구체예로서는, 삼련 사중극형 질량 분석계, 비행 시간형 질량 분석계(TOF-MS) 및 이온 트랩형 질량 분석기(예, Orbitrap(등록상표) 질량 분석기)를 들 수 있다.
[2.3. 임의의 공정]
본 실시형태의 분석 방법은, 상기 공정 (1) 및 (2) 이외에 임의의 공정을 포함하고 있어도 좋다.
임의의 공정의 예로서는, 시료로서 아미노산을 포함하는 시료를 사용한 경우에, 닌하이드린, o-프탈알데히드 등의 아미노산 유도체화 시약에 의해 아미노산을 유도체화하는 공정을 들 수 있다. 아미노산을 유도체화하는 공정은, 상기 공정 (1) 후, 공정 (2) 전에 행하는 것이 바람직하다.
이러한 임의의 공정을 포함함으로써, 예를 들어 이하의 이점을 얻을 수 있다.
예를 들어, 시스테인 및 시스틴은, 통상 아미노산 애널라이저를 이용하여 동시에 분석한 것이 어렵다. 시스테인 및 시스틴은, 아미노산 유도체화제에 의해 유도체화되면, 통상 유지 시간이 같은 정도가 되기 때문이다. 그러나, 공정 (1)을 행함으로써, 시스테인 및 시스틴 중 시스테인만이 올레핀 화합물과 반응하여 유도체로 변환되기 때문에, 아미노산 유도체화제에 의해 유도체화된 후의 시스테인의 유지 시간이 시스틴의 유지 시간과 통상 다르게 된다. 따라서, 본 실시형태의 분석 방법에 의해, 시스테인 및 시스틴을 아미노산 애널라이저를 이용하여 동시에 분석할 수 있다.
[3. 유기 물질의 산성 조건 하에서의 유도체화제]
본 발명의 일 실시형태에 따른 제는, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 산성 조건 하에서의 유도체화제이고, 적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물을 포함한다.
올레핀 화합물의 예 및 바람직한 예로서는, 상기와 동일한 예를 들 수 있다. 또한 유기 물질의 예 및 바람직한 예로서는, 상기와 동일한 예를 들 수 있다. 유도체화제를 사용하여 유도체를 제조할 때의 조건은 산성이다. 바람직하게는, 유기 물질의 유도체화는, 유도체화제를 포함하는 산성 용액 중에서 행한다. 산성 용액의 종류 및 산성 용액의 pH는, [1.3. 반응 조건]에서 기술한 바람직한 예와 동일하게 할 수 있다.
유도체화제 중의 올레핀 화합물의 농도는, 유도체화제의 희석률에도 따르지만, 예를 들어 0.001μmol/L 내지 1,000mol/L이고, 바람직하게는 0.01μmol/L 내지 100mol/L, 보다 바람직하게는 0.1μmol/L 내지 10mol/L이고, 더욱 바람직하게는 1μmol/L 내지 1mol/L이라도 좋다.
[4. 유기 물질의 분석용 시약]
본 발명의 일 실시형태에 따른 시약은, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 분석용 시약이고, 상기 유도체화제를 포함한다.
올레핀 화합물의 예 및 바람직한 예로서는, 상기와 동일한 예를 들 수 있다. 또한 유기 물질의 예 및 바람직한 예로서는, 상기와 동일한 예를 들 수 있다.
분석용 시약 중의 올레핀 화합물의 농도는, 분석용 시약의 희석률에도 따르지만, 예를 들어 0.001μm/L 내지 1,000mol/L이고, 바람직하게는 0.01μmol/L 내지 100mol/L, 보다 바람직하게는 0.1μmol/L 내지 10mol/L이고, 더욱 바람직하게는 1μmol/L 내지 1mol/L이라도 좋다.
분석용 시약은, 바람직하게는, 상기 공정 (1) 및 공정 (2)를 포함하는, 시료의 분석 방법에서 사용된다.
실시예
다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 하기 조작은, 특별히 언급하지 않는 한, 대기압 하, 상온에서 행하였다.
[약어의 설명]
하기에서, 약어는 이하의 의미를 나타낸다.
(올레핀 화합물(유도체화제))
EMM: Diethyl methylenemalonate
BPSE: 1,1-Bis(phenylsulfonyl)ethylene
BEPE: 1,1-Bis(diethoxyphosphoryl)ethylene
NEM: N-Ethylmaleimide
상기 화학식에 있어서, 「ph」는 페닐을 나타내고, 「Et」는 에틸을 나타낸다.
(유기 물질(함칼코겐 화합물))
· 티올류
Cys: 시스테인
Cys2: 시스틴
GSH: 글루타티온· 환원형
GSSG: 글루타티온· 산화형
gEC: γ-글루타밀시스테인
CG: 시스테이닐글리신
Hcy: 호모시스테인
NAC: N-아세틸시스테인
· 과황화 시스테인류
Cys-SH: S-mercaptocysteine
Cys-SSH: S-disulfanylcysteine
(장치·분석법 등)
LC-MS/MS: 액체 크로마토그래프-탠덤 질량 분석 장치
HILIC: Hydrophilic Interaction Chromatography(친수성 상호 작용 크로마토그래피)
[실시예 A: EMM, NEM을 이용한 실시예]
[실시예 A1] 산성 조건에서의, EMM, NEM과 시스테인(Cys)의 반응
본 실시예에서는, EMM 및 NEM의 산성 조건 하에서의 반응성을, 반응 후의 잔존 Cys량으로부터 추정하였다. 또한, EMM 유도체화 Cys 피크를 LC-MS/MS로 확인하였다.
(A1-1. 유도체의 제조)
L-시스테인 염산염(Sigma 제조)을 10mmol/L이 되도록, 0.1% 포름산 용액(후지 필름 와코 쥰야쿠 제조, 순수(純水)로 희석하여 조제)에 용해하였다. 유도체화제 EMM(Asta Tech 제조)은 아세토니트릴(후지 필름 와코 쥰야쿠 제조)에 10μL/mL이 되도록, 유도체화제 NEM(와코 쥰야쿠 제조)은 아세토니트릴에 10mg/mL가 되도록 각각 용해시켰다. 시스테인 용액 10μL에 대하여 유도체화제 용액(EMM 또는 NEM) 10μL 또는 아세토니트릴을 10μL을 첨가하고, 실온에서 10분간 방치하였다. 반응 후, 0.1% 포름산을 980μL 첨가하고 잘 교반해서 샘플 용액으로 하였다.
(A1-2. 유도체의 분석)
LC-MS/MS로 하기 조건으로 샘플 용액을 분석하였다. LC는 Agilent1200 시리즈(Agilent 제조), 탠덤 질량 분석 장치는 3200QTRAP 시스템(Sciex 제조)을 이용하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A액: 0.1% 포름산, 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 5-80% B(0-8min), 80% B(8-10min), 80-5% B(10-10.5min), 5% B(10.5-15min)
· 칼럼: XBridge C18 3.5μm, 2.1×100mm(Waters 제조)
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 0.4mL/min
· Injection volume: 1μL
(MS/MS 조건)
아래 표의 조건으로 행하였다. 아래 표에 있어서, 「NEM-Cys」 및 「EMM-Cys」는 각각 NEM에 의해 유도체화된 Cys, EMM에 의해 유도체화된 Cys를 나타낸다.
(분석 결과)
비유도체화 Cys의 피크를 1.36분에, NEM-Cys 피크를 각각 2.00, 2.14분(디아스테레오머가 생기기 때문에 2개 피크가 관측된다)에, EMM-Cys 피크를 8.23분에 확인하였다. 각각의 피크를 적분하였다. 측정은 2회 행하고, 결과는 2회의 측정의 평균값으로 하였다.
유도체화율은, 하기 수학식 (1)에 의해 산출하였다.
[수학식 (1)]
분석 결과를 아래 표에 나타낸다. 또한, 크로마토그램의 일례를 도 1 내지 도 3에 나타낸다.
도 1은, 시스테인의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
도 2는, NEM-Cys의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
도 3은, EMM-Cys의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
이상의 결과에 의하면, 산성 조건 하, 온화한 온도 조건(실온)에서, NEM 또는 EMM에 의해 Cys를 높은 반응률로 유도체화할 수 있음을 알 수 있다. 특히, EMM을 사용한 경우에는, NEM과 비교하여 높은 반응률을 나타내었다. 또한, NEM에 의해 카이랄 화합물인 Cys를 유도체화하면, 디아스테레오머가 생겨 NEM-Cys 피크가 2개로 분열하였다. 한편 EMM에 의해 Cys를 유도체화하면, 디아스테레오머는 생기지 않고, 피크의 분열은 일어나지 않는다.
[실시예 A2] EMM 유도체화 티올류의 일제 검출 및 정량(역상 LC에 의한 분리)
본 실시예에서는, 산성 조건으로 EMM에 의해 유도체화한 6종류의 티올 화합물을 LC-MS/MS를 이용하여 일제 분리·검출을 행하였다.
(A2-1. 유도체의 제조)
L-시스테인 염산염, 글루타티온·환원형(GSH)(후지 필름 와코 쥰야쿠사 제조), D, L-호모시스테인(Hcy)(Sigma사 제조), 시스테이닐글리신(CG)(Bachem사 제조), γ-글루타밀시스테인(gEC)(Sigma사 제조), N-아세틸시스테인(NAC)(쥰세이 카가쿠사 제조)를 각 25μmol/L 포함하는 0.01mol/L 염산 표준 티올 혼합 용액(후지 필름 와코 쥰야쿠사 제조를 순수로 희석)을 제작하였다. 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5)(나카라이 테스크사 제조를 순수로 희석) 60μL에 대하여 상기 표준 티올 용액 10μL를 첨가하고, EMM 아세토니트릴 용액(10μL/mL) 10μL을 첨가, 교반하여 실온 하 10분 방치하였다. 220μL의 0.1% 포름산 용액을 첨가하여 잘 교반하여, 샘플 용액으로 하였다.
(A2-2. 유도체의 분석)
LC-MS/MS로 샘플 용액을 분석하였다. LC는 Nexera(시마즈 세사쿠쇼 제조), 탠덤 질량 분석 장치는 Triple Quad 6500 시스템(Sciex 제조)을 이용하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A액: 0.1% 포름산, 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 15-20% B(0-2.5min), 20-90% B(2.5-4.0min), 90% B(4.0-6.0min), 90-15% B(6.0-6.2min), 15% B(6.2-8.0min)
· 칼럼: L-Column ODS, 3μm, 2.1×50mm(화학 물질 평가 연구 기구 제조)에 가드 칼럼으로서 Inertsil ODS-3,3μm, 1.5×10mm Guard column for UHPLC(GL-Science 제조)를 부착한 것
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 0.4mL/min
· Injection volume: 1μL
(MS/MS 조건)
아래 표의 조건으로 행하였다.
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표에 나타낸다.
이상의 결과에 의하면, EMM에 의해 다양한 티올류를 유도체화하고, 역상 LC로 일제히 유도체화된 티올류를 분리하고, MS/MS로 검출을 할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 A3] 설핀산의 분석
본 실시예에서는, 티올(-SH)뿐만 아니라 설핀산(-SO2H)도 구핵성이 있고, EMM제에 의해 유도체화되어 분석 가능한 것을 확인하였다.
(A3-1. 유도체의 제조)
히포타우린(Sigma 제조)를 1mmol/L의 농도가 되도록 0.01mol/L 염산에 용해하였다. 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5) 60μL에 대하여 상기 표준 히포타우린 용액 10μL을 첨가하고, EMM 아세토니트릴 용액(10μL/mL) 10μL을 첨가, 교반하여 실온 하 10분 방치하였다. 920μL의 0.1% 포름산 용액을 첨가하여 잘 교반하여, 샘플 용액으로 하였다.
(A3-2. 유도체의 분석)
LC-MS/MS로 하기 조건으로 샘플 용액을 분석하였다. LC는 Agilent1200 시리즈(Agilent 제조), 탠덤 질량 분석 장치는 3200QTRAP 시스템(Sciex 제조)를 이용하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A 용액: 0.1% 포름산, 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 15-40% B(0-3.0min), 40-90% B(3.0-3.2min), 90% B(3.2-5.5min), 90-15% B(5.5-5.8min), 15% B(5.8-9.5min)
· 칼럼: L-Column ODS, 3μm, 2.1×50mm(화학 물질 평가 연구 기구 제조)에 가드 칼럼으로서 Inertsil ODS-3,3μm, 1.5×10mm Guard column for UHPLC(GL-Science 제조)를 부착한 것
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 0.4mL/min
· Injection volume: 10μL
(MS/MS 조건)
아래 표의 조건으로 행하였다.
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표에 나타낸다. 또한 크로마토그램의 일례를 도 4에 나타낸다.
도 4는, EMM에 의한 유도체화 히포타우린의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
이상의 결과에 의하면, 산성 조건 하, EMM에 의해, 히포타우린과 같은 설핀산을 유도체화할 수 있고, 분석할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 A4] 과황화물의 분석
본 실시예에서는, 과황화물의 유도체화 및 분석이 가능함을 확인하였다. 과황화물로서, 과황화 시스테인(Cys-SH 및 Cys-SSH)을 사용하였다.
과황화 시스테인은, 생체에서 산화 환원에 관한 중요한 작용을 갖고 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 과황화물의 산화 환원 상태를 유지한 채 유도체화가 가능하면, 생체에서의 산화 환원 상태를 파악하는데 유용하다.
(A4-1. 유도체의 제조)
pH 6.7 포름산 암모늄 용액(후지 필름 와코 쥰야쿠 제조) 70μL에 대하여, 100mmol/L-시스테인 용액 10μL, 100mmol/L 황화 나트륨(후지 필름 와코 쥰야쿠 제조를 순수로 희석) 수용액 10μL, 0.1% 과산화수소 수용액(칸토 카가쿠 제조를 순수로 희석) 10μL를 혼합하고, 30℃에서 30분 반응시키고, 과황화 시스테인을 계 중 발생시켰다. 상기 용액 10μL에 대하여, 60μL의 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5), EMM 아세토니트릴 용액(10μL/mL) 10μL을 첨가, 교반하여 실온 하 10분 방치하였다. 420μL의 0.1% 포름산 용액을 첨가하고 잘 교반하여 샘플 용액으로 하였다.
(A4-2. 유도체의 분석)
LC-MS/MS로 하기 조건으로 샘플 용액을 분석하였다. LC는 Agilent1200 시리즈(Agilent 제조), 탠덤 질량 분석 장치는 3200QTRAP 시스템(Sciex 제조)을 이용하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A액: 0.1% 포름산, 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 15-40% B(0-3.0min), 40-90% B(3.0-3.2min), 90% B(3.2-5.5min), 90-15% B(5.5-5.8min), 15% B(5.8-9.5min)
· 칼럼: L-Column ODS, 3μm, 2.1×50mm(화학 물질 평가 연구 기구 제조)에 가드 칼럼으로서 Inertsil ODS-3, 3μm, 1.5×10mm Guard column for UHPLC(GL-Science 제조)를 부착한 것
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 0.4mL/min
· Injection volume: 10μL
(MS/MS 조건)
아래 표의 조건으로 행하였다.
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표에 나타낸다. 또한 크로마토그램의 일례를 도 5에 나타낸다.
도 5는, EMM에 의해 유도체화된 시스테인 및 과황화 시스테인의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
이상의 결과에 의하면, 산성 조건 하, EMM에 의해 과황화 시스테인과 같은 과황화물을 유도체화할 수 있고, 분석할 수 있다.
[실시예 A5] 아미노산 애널라이저를 사용한 Cys, Cys2 및 아미노산의 일제 분석
본 실시예에서는, 아미노산 애널라이저를 사용하여 Cys, Cys2 및 아미노산을 일제히 분석할 수 있음을 확인하였다.
(분석 방법 개요)
샘플을 EMM으로 처리하여 Cys 및 Cys2를 유도체화한 후, 이온 교환 컬럼을 이용하여 샘플로부터 아미노산을 분리하고, 그 다음에 포스트 칼럼 유도체화법에 의해 닌히드린으로 아미노산을 유도체화하고 Cys, Cys2 및 아미노산을 일제히 분석하였다.
또한, 아미노산 애널라이저에서는, 통상 Cys 및 Cys2는 동시에 칼럼으로부터 용출되기 때문에, 통상 Cys 및 Cys2를 동시에 분석하는 것은 곤란하다.
(A5-1. 유도체의 제조)
아미노산 혼합 표준액, H형(후지 필름 와코 쥰야쿠 제조)(L-아스파라긴산, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-프롤린, 글리신, L-알라닌, L-시스틴, L-발린, L-메티오닌, L-이소류신, L-류신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-라이신, L-히스티딘, 염화 암모늄, L-아르기닌을 각각 2.5mmol/L 포함하는 용액) 100μL에 대하여 10mmol/L의 시스테인 염산염 수용액 25μL, 순수 125μL를 첨가하여, 혼합 표준액을 제작하였다. 본품 100μL에 대하여, 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5) 200μL, EMM 아세토니트릴 용액(5μL/mL) 50μL를 첨가, 교반하여 실온에서 10분간 방치하였다. 반응 후, 650μL의 0.01mol/L 염산을 첨가하여, 샘플 용액으로 하였다.
(A5-2. 유도체의 분석)
하기 분석 장치에 의해, 샘플 용액을 분석하였다.
· 분석 장치: L-8900형 고속 아미노산 분석계(히타치 제조)
· 분석법: 메소드 패키지의 「생체액 분석법」 분석 시간 「148분」을 사용하였다.
(분석 결과)
시스테인 유도체는 유지 시간 40.3분에 용출되고, Cys2는 유지 시간 48.8분에 용출되었다. 기타 아미노산은 통상의 「생체액 분석법」 분석 시간 「148분」의 분석법에서의 유지 시간으로 용출되었다.
크로마토그램의 일례를 도 6에 나타낸다. 도 6은, 아미노산 애널라이저를 사용한 Cys, Cys2 및 아미노산의 일제 분석 결과를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
이상의 결과로부터, 산성 조건 하에서 Cys, Cys2 및 각종 아미노산을 포함하는 시료를 처리하여 통상의 아미노산 애널라이저로 분석함으로써, Cys, Cys2 및 각종 아미노산을 동시에 분석할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 B: BPSE를 이용한 실시예]
[실시예 B1] BPSE에 의한 유도체화 및 분석
본 실시예에서는, BPSE에 의해 티올을 유도체화할 수 있고, 분석할 수 있음을 확인하였다.
이하에, BPSE와 티올의 반응예를 나타낸다.
(B1-1. 유도체의 제조)
L-Cys, GSH, Hcy, CG, gEC, NAC를 10mmol/L 포함하는 0.01mol/L 염산 표준 티올 용액을 각각의 화합물에 대하여 제작하여, 표준 티올 용액을 6종류 제작하였다. 20mmol/L 인산 나트륨 완충 용액(pH 2.5) 60μL에 대하여 상기 표준 티올 용액 10μL을 첨가하고, BPSE 아세토니트릴 용액(10mg/mL) 10μL을 첨가, 교반하여 실온에서 10분간 방치하였다. 420μL의 0.1% 포름산 수용액을 첨가하고 잘 교반하여 샘플 용액으로 하였다.
(B1-2. 유도체의 분석)
LC로, 하기 조건으로 샘플 용액을 분석하였다. 피크는 HPLC-UV검출기에 의해 검출하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A액: 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5)
· 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 30% B(0-10min), 30-90% B(10-11min), 90% B(11-16min), 90-30% B(16-16.5min), 30% B(16.5-20min)
· 칼럼: Triart C18, 3μm, 150×4.6mm(와이엠씨 제조)
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 0.8mL/min
· Injection volume: 5μL
(검출 조건)
· 검출 파장: 260nm
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표에 나타낸다. 또한, 크로마토그램의 일례를 도 7에 나타낸다. 도 7은, BPSE에 의한 티올 유도체의 크로마토그램의 일례이다.
이상의 결과로부터, 산성 조건 하에서 BPSE에 의해 티올을 유도체화할 수 있고, 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리하고, UV 검출기에 의해 검출할 수 있음을 알 수 있다.
설파닐을 갖는 아미노산은, 유도체화에 의해 소수성이 높은 아미노산으로 변환되고, ODS(C18) 칼럼을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 소수성이 낮은 기타 아미노산과 양호하게 분리하여, 검출할 수 있음이 예상된다.
[실시예 B2] 카이랄 티올의 분리 및 검출
본 실시예에서는, BPSE에 의해 카이랄 티올을 유도체화하고, 카이랄 칼럼을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리 및 검출할 수 있음을 확인한다.
(B2-1. 유도체의 제조)
L-Cys, D-Cys(Sigma 제조)를 각각 5mmol/L 포함하는 D, L-시스테인 혼합 표준 용액을 0.1mol/L 염산을 사용하여 제작하였다. 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5) 60μL에 대하여 상기 표준 티올 용액 10μL을 첨가하고, BPSE 아세토니트릴 용액(10mg/mL) 10μL를 첨가, 교반하여 실온에서 10분간 방치하였다. 420μL의 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5)을 첨가하여 잘 교반하였다. 추가로 상기 용액을 이동상으로 10배 희석하고 샘플 용액으로 하였다.
(B2-2. 유도체의 분석)
LC로 하기 조건으로 샘플 용액을 분석하였다. 피크는 HPLC-UV 검출기로 검출하였다.
(LC 조건)
· 이동상: 메탄올/아세토니트릴/물(49/49/2(v/v/v))에 포름산 및 디에틸아민을 각각 50mmol/L, 25mmol/L의 농도가 되도록 첨가한 것을 아이소크라틱(isocratic) 조건으로 사용
· 칼럼: CHIRAL PAK(등록상표) ZWIX, 3μm, 150×3mm(다이셀 제조)
· 칼럼 온도: 25℃
· 유속: 0.4mL/min
· Injection volume: 10μL
(검출 조건)
· 검출 파장: 260nm
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표에 나타낸다. 또한, 크로마토그램의 일례를 도 8에 나타낸다. 도 8은, 유도체화된 카이랄 티올의 크로마토그램의 일례이다.
이상의 결과에 의해, 산성 조건 하, BPSE로 카이랄 티올을 유도체화하고, 카이랄 칼럼으로 분리하고, 검출할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 실시예의 방법에 의해, 천연에서는 존재량이 적은 D-Cys를 L-Cys와 분리하여 효율적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 및 참고예 C: 올레핀 화합물의 반응성 평가]
본 실시예 및 참고예에서는, EMM, BPSE을 포함하는 올레핀 화합물(유도체화제)에 대하여, Cys와의 반응성을 평가하였다.
본 실시예 및 참고예에서 사용한 올레핀 화합물 및 이들의 약칭을 하기에 나타낸다.
(C-1. 샘플 조제 및 유도체의 제조)
L-Cys 염산염 1수화물을 1mmol/L가 되도록 0.01mol/L 염산에 용해하였다. 상기 Cys 용액 10μL에 대하여, 각종 pH의 완충액 60μL, 유도체화제 용액(또는 아세토니트릴) 10μL를 첨가하고, 10분간 실온에서 정치하였다. 반응 후, 920μL의 0.1% 포름산 수용액을 첨가하여 샘플 용액으로 하였다.
유도체화제의 아세토니트릴 용액은 10mg/mL(고체) 또는 10μL/mL(액체)의 농도로 조정하였다. 완충액으로서, pH 2.5 또는 7.0의 인산 나트륨 완충 용액(20mM)을 사용하였다. EMM에 의한 유도체화에서는, 완충액으로서, 추가로 pH 3.25 또는 4.25의 시트르산 나트륨(200mM), pH 6.0 인산 나트륨 완충 용액(20mM)을 사용하여 행하였다.
(C-2. 유도체의 분석)
LC-MS/MS로, 하기 조건으로 샘플 용액을 분석하였다. LC는 Agilent1200 시리즈(Agilent 제조), 탠덤 질량 분석 장치는 3200QTRAP 시스템(Sciex 제조)을 사용하고, 선택 이온 검출(SIM) 모드에서 측정하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A액: 0.1% 포름산 수용액
· 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 10% B(0-1.0min), 10-90% B(1.0-5.0min), 90% B(5.0-6.5min), 90-10% B(6.5-7.0min), 10% B(7.0-10.0min)
· 칼럼: L-Column ODS, 3μm, 2.1×50mm(화학 물질 평가 연구 기구 제조)
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 0.4mL/min
· Injection volume: 10μL
(MS 조건)
하기 조건으로 행하였다.
DP(V)：46 EP(V)：8 CEP(V)：14
Cys 및 각종 유도체화제에 의해 유도체화된 Cys의 검출 조건 및 이의 유지 시간을 아래 표에 나타낸다. 아래 표에서 X-Cys의 표시는, 유도체화제 X에 의해 유도체화된 Cys를 의미한다.
또한, EBzM-Cys의 검출에서는, 디아스테레오머로서 2개의 피크가 관측되었으므로, 아래 표에는 각각의 유지 시간을 기재하였다.
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표에 나타낸다. Cys 반응률은, 상기 수학식 (1)에 의해 산출하였다. 또한, 「*」가 붙어진 항목은, 데이터가 존재하지 않는 것을 나타낸다.
pH 7.0에서는, 모든 제에서 유도체가 생성되어 검출되었다. pH 2.5의 산성 조건 하에서는, 2개의 전자 구인 기를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물(EMM, BPSE, Acry-CF3A, Acry-CF3E, EiPrM, EBzM, BEPE, CA)을 사용한 경우에 유도체가 생성되었다. 특히, 화학식 (I)로 표시되는 올레핀 화합물(EMM, BPSE, Acry-CF3A, Acry-CF3E, BEPE, CA)을 사용한 경우에, 높은 반응률로 유도체가 생성되었다.
또한, 유도체화제로서 EMM을 사용하여, 각종 완충액 중에서 반응을 행한 경우의 결과를 아래 표에 나타낸다.
이상의 결과에 의하면, pH가 6.0 이상에서 유도체화 Cys 피크 에리어 값이 감소되어 있는 것을 알 수 있다.
[참고예 D: 각종 pH 조건 하에서의 유기 물질의 거동]
본 참고예에서는, 각종 pH 조건 하에서의 유기 물질의 거동을 관찰함으로써, 산성 조건 하에서의 유기 물질의 안정성을 평가한다.
(D-1. 티올 교환 반응의 관찰)
(샘플 조제)
L-Cys 염산염 1수화물을 10mmol/L에, GSSG를 50mmol/L가 되도록 각각 0.01mol/L 염산에 용해하였다. Cys 용액(10mmol/L) 50μL에 대하여, 각종 인산 나트륨 완충액 850μL(pH 2.5, 6.0, 7.0 또는 8.0), GSSG 용액(50mmol/L) 100μL를 첨가하여 혼합 용액을 제작하였다.(최종적으로 용액 중에는 Cys가 0.5mmol/L, GSSG가 5mmol/L 존재하고 있다) 경시적으로 샘플링하고, BPSE에 의해 유도체화를 실시하고, 하기 조건의 LC에 의해 분석하여 Cys 및 GSH의 에리어 값을 측정하였다. 피크는 HPLC-UV 검출기에 의해 검출하였다.
(샘플링 및 유도체화)
혼합 용액 10μL에 대하여, 10%(w/v) 트리클로로아세트산 수용액 10μL, pH 2.5 인산 나트륨 완충액 80μL, BPSE 아세토니트릴 용액(5mg/mL) 20μL를 첨가하고, 10분간 실온에 정치하였다. 반응 후, pH 2.5 인산 나트륨 완충액 100μL를 첨가하여 샘플 용액으로 하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A액: 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5)
· 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 25% B(0-8.0min), 25-90% B(8.0-9.0min), 90% B(9.0-11.0min), 90-25% B(11.0-12.0min), 25% B(12.0-15.0min)
· 칼럼: Triart C18, 3μm, 150×4.6mm(와이엠씨 제조)
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 1.0mL/min
· Injection volume: 10μL
또한, 본 조건에서는, Cys는 6.3분 GSH는 6.8분에 용출된다.
(검출 조건)
· 검출 파장: 260nm
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표 및 도 9 내지 12에 나타낸다. 도 9, 10, 11 및 12는, pH 8.0, pH 7.0, pH 6.0 및 pH 2.5에서의 Cys 및 GSH의 피크 에리어 값의 경시 변화를 각각 나타내는 그래프이다. 또한, pH 6.0, 7.0, 8.0의 0분의 데이터는, 완충액 처리되어 있지 않은 것이라고 생각하여, pH 2.5의 0분의 데이터와 공통으로 하였다.
이상의 결과에 의하면, pH 7.0 이상의 조건에서는, 신속하게 Cys와 GSSG가 반응하여, 교환 반응에 생긴 GSH가 검출되고, Cys가 감소하는 것을 알 수 있다.
한편, pH 6.0 이하의 조건에서는, Cys와 GSSG의 반응은 거의 진행하지 않고, 특히 pH 2.5의 조건에서는, 교환 반응의 생성물인 GSH는 1시간 경과 후에도 검출되지 않는 것을 알 수 있다.
이러한 결과는, 디설파이드 화합물 및 티올 화합물이 동시에 존재하는 시료라도, 산성 조건 하에서 티올 화합물을 정확히 분석할 수 있음을 나타낸다.
(D-2. 티올 산화 반응의 관찰)
(샘플 조제)
L-Cys 염산염 1수화물을 10mmol/L에, 황산 구리 5수화물을 0.1mmol/L가 되도록 각각 0.01mol/L 염산에 용해하였다. Cys 용액(10mmol/L) 50μL에 대하여, 각종 인산 나트륨 완충액 850μL(pH 2.5, 6.0, 7.0 또는 8.0), 황산 구리 수용액(0.1mmol/L) 100μL를 첨가하여 혼합 용액을 제작하였다.(최종적으로 용액 중에는 Cys가 0.5mmol/L, 황산 구리가 0.01mmol/L 존재하고 있다) 경시적으로 샘플링하고, BPSE에 의해 유도체화를 실시하고, (D-1. 티올 교환 반응의 관찰)의 조건과 동일한 조건으로 LC에 의해 분석하고, Cys의 에리어 값을 측정하였다. 또한, 분석 법 및 유도체화법으로서 (D-1. 티올 교환 반응의 관찰)과 같은 방법을 이용하였다.
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표 및 도 13에 나타낸다. 도 13은, pH 8.0, pH 7.0, pH 6.0 및 pH 2.5에서의 Cys의 피크 에리어 값의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 또한, pH 6.0, 7.0, 8.0의 0분의 데이터는 완충액 처리되어 있지 않은 것이라고 생각하여, pH 2.5의 0분의 데이터와 공통으로 하였다.
이상의 결과에 의하면, pH 7 이상의 조건에서는 Cys가 급속히 감소하고, Cys가 신속하게 산화되는 것을 알 수 있다.
한편, pH 6.0 이하의 조건에서는 Cys는 거의 감소하지 않고, Cys의 산화 반응이 거의 진행되어 있지 않음을 알 수 있다.
이러한 결과는, 산성 조건 하에서는, 티올 화합물의 산화 반응이 억제되어 티올 화합물을 정확히 분석할 수 있음을 나타낸다.
[실시예 E] 설파닐기 및 아미노기의 유도체화
본 실시예에서는, 시스테인 또는 시스틴을 산성 조건 하에서 EMM과 혼합한 후, 다시 용액의 액성을 염기성으로 함으로써, 시스테인 또는 시스틴이 갖는 아미노기(-NH2)가 EMM과 반응하여 시스테인 또는 시스틴이 유도체화되는 것을 확인하였다.
즉, 시스테인이 갖는 설파닐기(-SH)가 산성 조건 하에서 EMM과 반응하여, 산화에 대하여 안정된 치환기로 변환된 후, 시스테인이 갖는 아미노기가 염기성 조건 하에서 EMM과 반응하여, 유도체가 얻어졌다.
산성 조건 하에서는 통상 아미노기는 EMM과는 반응하지 않는다. 따라서, 산성 조건 하에서는, 아미노기를 갖지만 설파닐기를 갖지 않는 시스틴과 같은 디설파이드 화합물은, 통상 EMM과는 반응하지 않고 유도화되지 않는다. 그러나, 이러한 디설파이드 화합물이라도, 염기성 조건 하에서 아미노기가 EMM과 반응하여 유도체화되는 것이 확인되었다.
설파닐기뿐 아니라 아미노기를 EMM과 반응시킴으로써, 산성 조건 하에서는 유도체화되지 않는 디설파이드 화합물의 소수성을 높일 수 있고, 액체 크로마토그래피에 의한 분리를 용이하게 할 수 있다. 또한, 유도체의 질량 분석계에서의 검출 감도를 올릴 수 있다.
(E-1. 유도체의 제조)
시스테인 또는 시스틴(Sigma 제조)을 250μmol/L의 농도가 되도록 0.01mol/L염산에 용해하여 표품으로 하였다. 상기 표품 20μL, 10% 트리클로로아세트산 수용액 20μL, 0.1mol/L 염산 40μL를 혼합하고, 잘 교반하였다. 상기 용액 50μL를 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 2.5) 300μL와 혼합하고, EMM 아세토니트릴 용액(10μL/mL) 50μL를 첨가, 교반하여 40℃에서 5분간 정치하였다. 상기 용액 100μL를 취하여, 100mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 9.0) 200μL와 혼합하고, 추가로 교반하여 40℃에서 5분간 정치하엿다. 본 용액 15μL를 취하고, 50μL의 0.3% 포름산 용액을 첨가하여 잘 교반하여 분석용 샘플로 하였다.
(E-2. 유도체의 분석)
LC-MS/MS로 하기 조건으로 샘플 용액을 분석하였다. LC는 Agilent1290 Infinity II 시리즈(Agilent 제조), 탠덤 질량 분석 장치는 QTRAP5500 시스템(Sciex 제조)을 이용하였다.
(LC 조건)
· 이동상 A액: 0.1% 포름산, 이동상 B액: 아세토니트릴
· 그래디언트 조건: 30-60% B(0-6.0min), 60-90% B(6.0-7.5min), 90% B(7.5-9.0min), 90-30% B(9.0-9.1min), 30% B(9.1-10.0min)
· 칼럼: L-Column ODS, 3μm, 2.1×50mm(화학 물질 평가 연구 기구 제조)에 가드 칼럼으로서 Inertsil ODS-3,3μm, 1.5×10mm Guard column for UHPLC(GL-Science 제조)를 부착한 것
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 0.4mL/min
· Injection volume: 1μL
(MS/MS 조건)
아래 표의 조건으로 행하였다.
(분석 결과)
분석 결과를 아래 표에 나타낸다. 또한 크로마토그램의 일례를 도 14에 나타낸다.
아래 표 및 도 14에 있어서, 「3EMM-Cysteine」 및 「3EMM-Cys」란, 1분자의 시스테인이 3분자의 EMM과 반응해서 얻어지는 유도체를 의미한다. 「4EMM-Cystine」및 「4EMM-Cys2」란, 1분자의 시스틴이 4분자의 EMM과 반응해서 얻어지는 유도체를 의미한다.
도 14는, EMM에 의한 유도체화 시스테인의 피크 또는 유도체화 시스틴의 피크를 나타내는 크로마토그램의 일례이다.
이상의 결과에 의하면, 시스테인을 산성 조건 하에서 EMM과 반응시킴으로써 설파닐기가 EMM과 반응하고, 이어서 용액을 염기성으로 함으로써 아미노기가 2분자의 EMM과 반응하여, 시스테인이 유도체화되는 것을 알 수 있다.
시스틴은, 반응 용액을 염기성으로 함으로써, 2개의 아미노기가 4분자의 EMM과 반응하여 유도체화된다.
즉, 상기 결과는, 시스테인은 EMM 3분자와 반응한 화합물로서, 시스틴은 EMM 4분자와 반응한 화합물로서, LC-MS/MS로 분석할 수 있음을 나타낸다.
Claims (16)
- 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질을, 올레핀 화합물과 산성 조건 하에서 반응시켜서, 상기 유기 물질의 유도체를 얻는 것을 포함하고,
여기서, 상기 올레핀 화합물은 적어도 2개의 전자 구인 기(求引基)(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는, 유기 물질의 유도체의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 에틸렌 구조가 2개의 전자 구인 기를 갖는, 유도체의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 전자 구인 기가, 상기 에틸렌 구조를 구성하는 동일한 탄소 원자에 결합되어 있는, 유도체의 제조방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 전자 구인 기가 동일한 기인, 유도체의 제조방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올레핀 화합물이 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물인, 유도체의 제조방법.
[화학식 (I)]
(단, EWG1 및 EWG2는 각각 독립적으로, 전자 구인 기를 나타내고, 이들이 결합되는 탄소 원자와 하나가 되어 환을 형성하고 있어도 좋다) - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전자 구인 기 또는 EWG1 및 EWG2가 각각 독립적으로, C(=O)-OR1, -S(=O)2-R2, -P(=O)(-OR3)2, 시아노, 할로겐 원자로 치환된 알킬, 카복시, 니트로, -S(=O)-R4, -C(=O)-R5 또는 -C(=O)-NR6R7이고,
여기서,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 1가의 탄화수소기 또는 1가의 복소환기를 나타내고, 이들은 치환기를 갖고 있어도 좋고,
R5, R6 및 R7는 각각 독립적으로, 수소 원자, 1가의 탄화수소기 또는 1가의 복소환기를 나타내고, 이들은 치환기를 갖고 있어도 좋은, 유도체의 제조방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 조건이 pH 6.0 미만의 조건인, 유도체의 제조방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 물질이, 시스테인, 환원형 글루타티온, γ-글루타밀시스테인, 시스테이닐글리신, 호모시스테인, N-아세틸시스테인, 과황화 시스테인, 히포타우린, 과황화 글루타티온 및 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드성 화합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인, 유도체의 제조방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 물질이 추가로 아미노기를 포함하고,
상기 유기 물질을 상기 올레핀 화합물과 산성 조건 하에서 반응시킨 후, 추가로 중성 또는 염기성 조건 하에서 반응시켜서, 상기 유기 물질의 유도체를 얻는 것을 포함하는, 유도체의 제조방법. - (1) 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질을 포함하는 시료와,
적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물을,
산성 조건 하에서 혼합하여, 상기 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는 것 및
(2) 상기 처리 시료 중의 상기 유기 물질의 유도체를 분석하는 것을 포함하는, 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법. - 제10항에 있어서, 상기 공정 (2)에서의 분석이,
(2a) 상기 처리 시료로부터 상기 유기 물질의 유도체를 분리하는 것 및
(2b) 분리된 상기 유기 물질의 유도체를 검출하는 것을 포함하는, 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법. - 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 시료가 디설파이드 화합물을 추가로 포함하는, 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 디설파이드 화합물이 산화형 글루타티온 및 시스틴으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인, 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 물질이 아미노기를 추가로 포함하고,
공정 (1)이,
(1') 상기 시료와 상기 올레핀 화합물을 산성 조건 하에서 혼합한 후, 추가로 중성 또는 염기성 조건 하에서 혼합하여, 상기 유기 물질의 유도체를 포함하는 처리 시료를 얻는 것을 포함하는, 유기 물질을 포함하는 시료의 분석 방법. - 적어도 2개의 전자 구인 기(단, 할로겐 원자를 제외함)를 갖는 에틸렌 구조를 포함하는 올레핀 화합물을 포함하는, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 산성 조건 하에서의 유도체화제.
- 제15항에 기재된 유도체화제를 포함하는, 설파닐, 셀라닐 및 설피노로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 기를 포함하는 유기 물질의 분석용 시약.
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