ES2385330T3 - Procedimiento para analizar metabolitos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para analizar los metabolitos de una muestra biológica que comprende determinarcuantitativamente al menos 50 metabolitos en dicha muestra en un modo que dicha determinación cuantitativaresuelva diferencias de masas isotópicas dentro de un metabolito,estando caracterizado dicho procedimiento porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se hamantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de talforma que los metabolitos en dicha célula estén saturados con el isótopo con el que dicho compuesto metabolizableestá marcado en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica estáincrementado a al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas,esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en elque dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas.

Description

Procedimiento para analizar metabolitos

La presente solicitud se refiere a un procedimiento para analizar los metabolitos de una muestra biológica que comprende determinar cuantitativamente al menos 50 metabolitos en dicha muestra en un modo que dicha determinación cuantitativa resuelva diferencias de masas isotópicas dentro de un metabolito, caracterizándose dicho procedimiento porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se ha mantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de tal forma que los metabolitos en dicha célula se saturen con el isótopo el que con dicho compuesto metabolizable está marcado en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica se incrementa hasta al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas. Este procedimiento puede comprender adicionalmente, antes de determinar cuantitativamente los metabolitos, combinar la muestra biológica (es decir, la primera muestra biológica) con una segunda muestra biológica en la que los metabolitos no están marcados isotópicamente o están marcados isotópicamente de forma diferente a partir de su muestra biológica; y determinar en dichas muestras biológicas las cantidades relativas de metabolitos que difieren por su por su marca isotópica. También se revelan conjuntos de metabolitos marcados isotópicamente obtenibles aplicando este procedimiento, así como kits para facilitar la aplicación de este procedimiento y para los usos correspondientes.

La presente invención pertenece al campo de los análisis de metaboloma, también referido como de perfiles metabólicos, es decir el análisis cuantitativo de metabolitos en una muestra biológica con el propósito de investigar el estado de los organismos en particular con respecto a las redes reguladoras bioquímicas. En la técnica anterior, el metaboloma, además del proteoma, el transcriptoma y el genoma, ha llegado a ser la cuarta piedra angular de los análisis de sistemas biológicos. Solamente los análisis de metaboloma permiten entendimiento del uso de nutrientes, la capacidad biosintética de los organismos, la señalización y la comunicación mediada por medio de compuestos de bajo peso molecular y los procedimientos adaptativos bioquímicos. Por lo tanto se demandan análisis de perfiles de los cambios relativos de todos los metabolitos dentro de un organismo para un análisis de sistemas biológicos verdaderos.

Los análisis de metaboloma están aún en desarrollo temprano entre otras cosas porque, en contraste con los análisis de genoma, de transcriptoma y de proteoma, los análisis de metaboloma tienen que ocuparse de un intervalo de productos químicos altamente diversos que abarca sustancias desde volátiles de bajo peso molecular pequeños hasta polímeros. Convencionalmente, se usan plataformas diferentes y especializadas con el fin de analizar estas clases diferentes de compuestos. Mientras tanto, se han desarrollado plataformas analíticas aplicables universalmente para mezclas complejas de compuestos. Estas explotan masa molecular y retención cromatográfica en las así llamadas tecnologías compuestas, como CG-EM, HPLC-EM o MALDI-TOF. La cromatografía de gases de mesa acoplada a la espectrometría de masas (CG-EM) fue la primera plataforma tecnológica propuesta para análisis de metaboloma a gran escala (Trethewey, 1999). La elección de esta tecnología compuesta tuvo en cuenta la combinación ideal de separación cromatográfica insuperable con la selectividad alta, la sensibilidad alta y el intervalo dinámico de la detección de masas cuantitativa.. Además, tanto CG como espectrometría de masas por ionización de impacto electrónico (EI) presentan solamente efectos de matriz menores comparados con otras técnicas de EM, como por ejemplo desorción láser asistida por matriz/ionizaciónespectrometría de masas de dispersión (MALDI-TOF) (Guo, 2002) o cromatografía líquida acoplada a detección de masas (HPLC-EM) (Matuszewski, 2003). La alta reproducibilidad de los análisis de CG-EM de metabolitos, que usan rutinariamente reactivos de clorhidrato de metoxiamina (MEOX) y de N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (MSTFA, permitieron perfil de metabolitos basado en cuantificación externa de los derivados respectivos de metoxiamina (MX) y trimetilsililo (TMS) (Fiehn, 2000a; Roessner, 2000; Roessner, 2001). El alcance de los metabolitos abarcados está, sin embargo, limitado (1) por la volatilidad requerida de los metabolitos o derivados químicos estables de metabolitos inestables y (2) por la distribución de las concentraciones de metabolitos dentro de cada tipo de muestra. La carga de muestra máxima de cualesquiera análisis químicos multiparalelos se determina por los metabolitos predominantes. Los perfiles de metabolitos de CG-EM tienen un intervalo dinámico enorme de 4

o 5 órdenes de magnitud. El límite de cuantificación superior se ajusta por el requerimiento de reactivo químico en exceso y por efectos de deformación de pico debidos a sobrecarga cromatográfica. Así, las matrices biológicas desprovistas de metabolitos predominantes individuales prometen mejor potencial para análisis en multiparalelo altamente complejos (Fiehn, 2000a; Roessner, 2000).

Son concebibles dos estrategias principales hacia análisis de metaboloma más exhaustivos: (1) la elección de otras técnicas analíticas que puedan suplementar los análisis de CG-EM y (2) la aplicación de técnicas de prefraccionamiento y concentración para el enriquecimiento de los compuestos traza. Sin embargo, ambas estrategias son actualmente muy limitadas. Técnicas de EM complementarias, como por ejemplo MALDI-TOF-EM o HPLC-EM, están sujetas a interferencias fuertes, que son el resultado de las composiciones cambiantes de matrices biológicas complejas. Estos así llamados efectos de matriz pueden conducir incluso a la supresión completa de ionización y de señal de respuesta (Matuszewski, 2003; Guo, 2002). Por otro lado, la mayoría de las técnicas de prefraccionamiento y concentración dan como resultado pérdidas altas o altamente variables de metabolitos.

Estas desventajas que impiden el uso de técnicas de EM potencialmente más potentes en los estudios de perfiles de metabolitos pueden al menos en parte superarse incluyendo estándares internos en los análisis de metabolitos. En efecto, se requiere una estandarización cuantitativa minuciosa para cuantos metabolitos medidos sea posible. Esto permitiría ampliar el ámbito del perfil de metabolito a tales técnicas, debido a que ello permitiría una cuantificación exacta de los niveles de metabolitos para los que está disponible un estándar. A partir de las investigaciones sobre flujos metabólicos, se sabe que los metabolitos pueden marcarse in vivo con un isótopo estable (Wittmann, 2002). Sin embargo, los análisis de flujo están generalmente confinados a la investigación de rutas bioquímicas muy limitadas y no abarcan metabolitos en la amplitud que se requiere normalmente para perfil metabólico. En consecuencia, los compuestos de sustrato que se usan en tales estudios con el fin de marcar células con un isótopo estable son típicamente muy específicos para la ruta bioquímica particular a analizarse. Su producción es cara porque requiere síntesis química específica y prolija.

Para resumir, un enfoque factible para establecer un estándar cuantitativo para usar en realización de perfiles de metabolitos no se vislumbra en la técnica anterior. Esto se explica principalmente por la diversidad de las clases de compuestos a las que pueden pertenecer los metabolitos y por el hecho de que la mayoría de los metabolitos no se puede marcar después de la extracción tal como es posible para los tránscritos y proteínas químicamente uniformes (véase, por ejemplo, Gygi, 1999).

Así, el problema técnico que subyace a la presente invención es el suministro de medios y procedimientos que permitan mejorar los análisis de metabolomas estableciendo un estándar cuantitativo fiable para cuantos metabolitos sea posible con el fin de ampliar el alcance de tales análisis.

Este problema técnico se soluciona por el suministro de las realizaciones según se caracterizan en las reivindicaciones.

De acuerdo con ello, la presente solicitud se refiere a un procedimiento para analizar los metabolitos de una muestra biológica que comprende determinar cuantitativamente al menos 50 metabolitos en dicha muestra de un modo que dicha determinación cuantitativa resuelva diferencias de masas isotópicas dentro de un metabolito, caracterizándose dicho documento porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se ha mantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de tal forma que los metabolitos en dicha célula se saturen con el isótopo con el que dicho compuesto metabolizable está marcado en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica se incrementa hasta al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas.

La presente invención se basa en los experimentos descritos en los ejemplos adjuntos que muestran que es posible marcar sustancialmente todos los metabolitos posibles in vivo. La prueba de que este principio funciona se ha obtenido marcando células de levaduras con U-13C-glucosa. Este trabajo constituye el pilar principal para la realización de perfil de metaboloma exhaustivo, totalmente cuantitativo y facilitará grandemente desarrollos futuros dentro de este campo. Ello resolvió el problema técnico de estandarización por marcado diferencial de metabolitos con isótopos. De forma similar al marcado diferencial de muestras de tránscritos por sondas fluorescentes o de muestras de proteínas por marcado químico, es posible en el procedimiento de la presente invención marcar el metaboloma saturando el marcado in vivo con isótopos. Este concepto puede ser ampliamente explotado por un muestreo no tergiversado de marcas de metabolitos de espectros de masas (MST) y por perfil de metabolito de proporción isotópica (ITR). En particular, los extractos saturados por isótopos producidos por el procedimiento de la invención pueden usarse como una mezcla múltiple de estándares internos, donde cada componente de los perfiles de metabolitos resultantes se cuantificará de forma relativa a su respectivo isotopómero marcado totalmente (véanse ejemplo 4 y figura 2). Se prevé que estos logros, en particular la compilación de un primer compendio de MST que, de manera similar a EST, permiten evaluación cualitativa de la composición del metaboloma y la demostración de perfil de metabolito ITR totalmente cuantitativo, mejorarán grandemente los análisis de metaboloma.

En la técnica anterior, los estudios de marcado con isótopos son aproximaciones de rutina usadas para análisis de flujo de metabolitos (Wittmann, 2002; Christensen (1999); Wiechert, 2001). Estos estudios requieren compuestos marcados isotópicamente, que son caros y de disponibilidad limitada. En un experimento de flujo convencional, un compuesto marcado se suministra a organismos, que se hacen crecer previamente en medios con distribución de isótopos ambiental (dos Santos, 2003; Lee, 1991), dando como resultado el marcado de un compuesto metabolizable isotópicamente marcado específico correspondiente. Sin embargo, los estudios de flujo difieren del procedimiento de la invención porque generalmente implican el marcado parcial de los metabolitos de una célula. Esto se explica por el hecho de que los estudios de flujo requieren marcado parcial, es decir, incompleto. En contraste, el procedimiento de la presente invención logra marcado saturante lo que quiere decir un marcado de los metabolitos tan completo como sea posible dando el grado de marcado en el compuesto metabolizable marcado isotópicamente usado para marcar la célula a partir de la que se deriva la muestra biológica para análisis (para definiciones más detalladas véase más adelante).

Una ventaja del presente procedimiento es el hecho de que introduce una marca isotópica en el sitio que es ideal

para análisis metabólicos, a saber, la muestra biológica activa. En las tecnologías de la técnica anterior, se introduce a menudo una marca diferencial solamente en el curso de análisis químicos tales como en los procedimientos actualmente vigentes para análisis cuantitativos de proteoma (Aebersold, 2003) y de transcriptoma (Duggan, 1999). Estas tecnologías suponen por ejemplo técnicas de marcado de proteínas codificado por isótopos (Gygi, 1999) y de marcado de dos colores por sondas fluorescentes (Schena, 1995; Lockhart, 1996). Sin embargo, el marcar solamente después de extraer los respectivos compuestos de la célula puede introducir un sesgo en el resultado del marcado. Tales artefactos están excluidos del procedimiento de la invención.

Aparte de la incorporación de la marca en el curso de los análisis químicos, hay al menos un enfoque para marcar proteínas in vivo. Oda (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96 (1999), 6591-6596) describe el marcado de célula completa para análisis de proteoma usando el isótopo estable 15N. Sin embargo, el marcado del isótopo in vivo del grupo completo de metabolitos no se ha comunicado en la técnica anterior. En particular, usando el marcado con 13C de cultivos de levaduras, la presente invención demostró que se pueden generar análisis espectrales de masas de muestras marcadas diferencialmente, especialmente perfiles de 13C-ITR. En particular, los experimentos que subyacen en la presente invención sorprendentemente muestran que el marcado completo (es decir, saturante) de metabolitos podría lograrse en células de levadura. Los resultados obtenidos en las reivindicaciones adjuntas son sorprendentes porque no podía excluirse que las fuentes de carbono distintas del compuesto metabolizable marcado isotópicamente (en los ejemplos U-13C-glucosa) que están presentes en el medio podrían haber evitado un marcado isotópico amplio eficiente de los metabolitos.

Es casi imposible evitar en el medio la presencia de tales otras fuentes de carbono como por ejemplo nutrientes esenciales, tales como vitaminas, o marcadores auxotrópicos. El procesamiento de estos compuestos en las células cultivadas podría haber interferido gravemente con marcado con isótopos y por lo tanto podría haber evitado el marcado saturante requerido. Sin embargo, como se muestra en los experimentos de los ejemplos, la falta de marcado en la célula debido a la presencia de las fuentes de carbono no marcado en el medio está grandemente restringida a los compuestos en sí mismos o a los productos metabólicos directos de los mismos (véase el Ejemplo 1). Una mezcla de marca con compuestos no marcados esencialmente no tuvo lugar. Esto fue sorprendente y significa que el marcado con isótopos in vivo puede ser efectivamente aplicado para lograr amplia cobertura de los metabolitos con marcado isotópico.

Otro hallazgo sorprendente fue que la presencia de marca isotópica en los metabolitos no influye sustancialmente la distribución de niveles de metabolitos en la muestra cuando se compara con un perfil de metabolito obtenido a partir de una muestra no marcada correspondiente (es decir, una muestra, en la que las células se han alimentado con nutrientes en los que los isótopos están presentes en las proporciones que se dan en la naturaleza, es decir en proporciones ambientales). Esto es por ejemplo evidente a partir de los resultados representados en la figura 2 y se describe en el ejemplo 4. Esto no se podría haber habría esperado dado que se sabe que enzimas pueden discriminar entre isotopómeros. Por ejemplo, tales efectos se describen a partir de fisiología vegetal tal como para fijación de CO2 de RuBisCo y fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) (véase, por ejemplo, Le Roux-Swarthout, J. Plant Physiol. 157 (2000), 489-493) y a partir de de hongos, levaduras u otros microorganismos, por ejemplo, para piruvato decarboxilasa (PDC) y para el metabolismo de isoprenoides (véase, por ejemplo, Stivers, Biochem. 32 (1993), 13472-13482; Henn, Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000) 4180-4186; Londry, Appl. Environ. Microbiol. 69 (2003), 2942-2949). Así, era razonable esperar que, causado por la discriminación de isótopos, el marcado de metabolitos con isótopos influiría la distribución de los niveles de metabolitos en la muestra biológica. Pero, como se muestra en el presente documento, el marcado con isótopos de los metabolitos muestra una distribución que corresponde en gran medida a aquella obtenida de los metabolitos no marcados. Eso demuestra la idoneidad del procedimiento de la invención para estandarizar análisis de metabolitos.

Los resultados experimentales resumidos a continuación muestran que el procedimiento de la invención puede llegar a ser una herramienta indispensable para el desarrollo futuro del perfil de metabolito.

La presente invención se ejemplifica en el presente documento en experimentos usando un modelo de Saccharomyces cerevisiae que estaba sometido a marcado isotópico estable in vivo saturante por crecimiento en una fuente de 13C exclusiva (véanse, por ejemplo, figuras 1 y 9). El marcado in vivo de metabolitos en levaduras genera marcas de isotopómero que podrían detectarse diferencialmente por espectrometría de masas. Cuando se aplican como norma cuantitativa interna, los compuestos marcados con isótopos pueden facilitar análisis cuantitativos significativos si por ejemplo dos muestras, estando la una marcada de forma saturante y estando la otra no marcada (es decir, que tiene abundancias de isótopo ambiente) se comparan y la proporción relativa entre cada marca de isotopómero y el metabolito no marcado correspondiente se determina. De forma interesante, este principio de trabajo puede incluso facilitar esas tecnologías del espectro de masas tales como MALDI-TOF-EM que son propensas a efectos de supresión de la matriz y de variabilidad alta y que por lo tanto hasta ahora no se aplicaron para análisis de perfiles de metabolito cuantitativos. Un ejemplo de usar exitosamente el procedimiento de la invención aplicando MALDI-TOF-EM se expone en el presente documento (ejemplo 9 y figura 9). Esto significa que el procedimiento descrito en el presente documento puede permitir ampliar perfiles de metabolitos multiparalelos en principio al menos a todas las tecnologías basadas en espectrometría de masas.

Una ventaja adicional del procedimiento de la invención sobre los análisis de metaboloma convencionales es que permite realizar una prueba inmediata del origen metabólico de cualquier marca de los espectros de masas que se

detecta en muestras biológicas. Mientras que la diversidad de secuencias de proteínas y de ARNm proporciona información sobre las especies de origen por la información de secuencia contenida en ellas, el origen no es inmanente en la estructura de metabolitos por sí misma, salvo para el subgrupo de metabolitos secundarios específicos de especies. Sin embargo, tan pronto como se encuentra un par de MST marcado y no marcado, pueden descartarse inmediatamente artefactos químicos o contaminaciones de laboratorio.

Además, los desplazamientos masivos permiten una comprensión directa del número de carbonos presente en cada compuesto o fragmento. Esta propiedad del procedimiento de la invención aumenta la comprensión de la química de aquellas MST la naturaleza química de las cuales es desconocida y puede respaldar la identificación de MST por otras técnicas (Tabla 3).

De forma análoga a las marcas de secuencia expresadas (EST) se pueden usar MST identificadas y no identificadas como una herramienta altamente útil para caracterizar el metaboloma de cualquier muestra biológica. De nuevo en analogía a las herramientas para comparación de secuencia, MST pueden identificarse fácilmente por combinación de fragmentación de espectros de masas y retención cromatográfica. Además, las tecnologías de agrupación permiten una clasificación significativa de MST (figura 4) (Wagner, 2003).

Como una propiedad ventajosa adicional, el procedimiento de la invención permite una investigación rápida de la precisión de los procedimientos analíticos que se están desarrollando para perfiles de metabolitos. Además, ello hace análisis de metabolomas estandarizados cuantitativamente accesibles a muestras biológicas que se obtienen por pre-purificación y enriquecimiento de fracciones del extracto de metabolito total tomado de una muestra biológica, por ejemplo con el fin de detectar metabolitos traza. En la técnica anterior, tales muestras caen por debajo de los límites de detección de perfiles de CG-EM convencionales. La posibilidad del procedimiento de la invención para determinar cuantitativamente cantidades menores de metabolitos facilita dirigir análisis de co-respuesta a metabolitos que pueden proporcionar información directa sobre interacciones de metabolitos cuantitativas en sistemas biológicos. Tales interacciones pueden esperarse en base a consideraciones teóricas (Steuer, 2003). Las correspuestas de metabolito observadas pueden estar no acopladas o pueden seguir funciones lineales. La corespuesta de metabolitos puede ser constructiva o condicional con respecto al grupo de experimentos sometidos a investigación. En el ejemplo 8, se describen los análisis de co-respuesta de metabolitos que aplican el procedimiento de la invención. De acuerdo con ello, las co-respuestas de metabolitos pueden descubrirse y judgarse por un grupo de medidas de distancia diferentes, entre las que la distancia euclidiana es menos indicativa (figura 6). Las interacciones de metabolitos pueden reflejar definiciones de rutas canónicas (figura 7), pero también pueden permitir descubrir interacciones de rutas cruzadas (figura 8). Investigaciones sobre estas interacciones son altamente valiosas, porque pueden proporcionar comprensión de mecanismos comunes de control metabólico. Sin embargo, hasta la fecha, tales análisis están restringidos debido a la cobertura limitada de los datos de metaboloma. En base a la extensión de la extracción de datos de metabolitos que es posible aplicando el procedimiento de la invención, por ejemplo debido a la posibilidad de explotar MALDI-TOF para la determinación cuantitativa de niveles de metabolitos en una escala amplia, es concebible que la presente invención desarrolle adicionalmente los análisis cuantitativos de metaboloma, en particular para con compuestos traza y cofactores generales.

Como se explicó anteriormente, la presente invención pertenece al campo de los análisis de perfiles metabólicos o de metabolomas. Esto significa que el procedimiento de la invención es de uso para determinar cuantitativamente al menos 50 metabolitos en una muestra biológica.

El término "determinación cuantitativa" se refiere a la determinación de la cantidad relativa o absoluta de cada metabolito analizado en la muestra. Generalmente, una determinación tal conduce a un así llamado perfil de metabolitos perteneciente a la muestra biológica respectiva. Tales enfoques de perfiles de metabolitos se han llevado a cabo en muchos laboratorios y por lo tanto pertenecen a la técnica anterior.

Desde que se aplica marcado isotópico en el procedimiento de la invención, es necesario que la técnica usada para determinar cuantitativamente los metabolitos resuelva diferencias de masa isotópicas como pueden producirse en un metabolito. Los compuestos que difieren entre sí solamente por uno o más isótopos incorporados en la estructura química se refieren generalmente como "isotopómeros". La técnica utilizada para detectar los metabolitos debe por lo tanto ser capaz de discriminar entre dos compuestos que difieren en su masa por tan poco como una masa atómica relativa. Las técnicas correspondientes se conocen por el experto y se describen en la bibliografía. Implican diferentes clases de espectrometría de masas o RMN, como se describe adicionalmente en detalle adicional más adelante.

El término "marcador isotópico" se entiende que se refiere a compuestos que están marcados con un isótopo que no es el principal isótopo del elemento de dicho isótopo. "Marcado" significa en este contexto una proporción incrementada significativamente y para propósitos de detección, de forma útil del isótopo marcado según se compara con la abundancia de dicho isótopo que se da en la naturaleza, preferentemente la proporción del isótopo marcado está incrementada hasta al menos el 80 %, más preferentemente hasta al menos el 90 % e incluso más preferentemente hasta al menos el 95 % y lo más preferido hasta al menos el 99 % del total de todos los isótopos del elemento respectivo. El término "marcado isotópico" se refiere además preferencialmente a compuestos en los que está presente el isótopo de marca en la proporción anteriormente mencionada en cada posición posible dentro de la estructura química del compuesto. Sin embargo, el marcado parcial de los compuestos también puede ser de

utilidad en el contexto de la presente invención. Tales aplicaciones requieren que se apliquen los medios de corrección para la proporción de isotopómeros no marcados residuales. En este caso, el marcado debe ser saturante, es decir, las proporciones de isotopómeros para cada metabolito necesitan ser constantes en la muestra marcada, de tal forma que las proporciones de isotopómeros puedan determinarse en un experimento de control y usarse para la corrección matemática de los resultados de perfil de metabolitos. Preferentemente, el compuesto metabolizable marcado isotópicamente usado con el fin de marcar la célula contiene del elemento respectivo solamente el isótopo marca (en la proporción que sea técnicamente factible) como es el caso con U-13C-glucosa donde todos los seis átomos de carbono son el isótopo 13C.

El procedimiento de la presente invención se caracteriza porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se ha mantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de tal forma que los metabolitos en dicha célula están saturados con el isótopo con el que está marcado dicho compuesto metabolizable.

Es un elemento fundamental del procedimiento de la invención que los metabolitos se saturen con el marcado isotópico. "Saturado" (o "marcado saturante") significa que los metabolitos en la célula o la muestra biológica derivada de los mismos contienen una cantidad de marca isotópica que corresponde sustancialmente a la cantidad de marca en el compuesto metabolizable asumida por la célula con el fin de marcarla y que sustancialmente todos los metabolitos a analizarse contienen la marca isotópica. En particular, "marcado saturante" se refiere a una cantidad de marcado de los metabolitos a analizarse tal que estos metabolitos contengan globalmente al menos 80 %, aún más preferentemente al menos 90 % y lo más preferentemente al menos 95 % de la cantidad de marca isotópica según se presenta en el compuesto metabolizable marcado isotópicamente. El término "sustancialmente todos los metabolitos a analizarse contienen la marca isotópica" significa que al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, aún más preferentemente al menos el 95 % y lo más preferentemente al menos el 98 % de los metabolitos que se van a analizar se marcan, es decir, difieren en al menos una masa atómica del homólogo no marcado correspondiente. Preferentemente, sustancialmente todos los metabolitos a analizarse contienen la marca isotópica si al menos 50, aún más preferentemente al menos 100, incluso más preferentemente al menos 150 y lo más preferentemente al menos 200 o incluso al menos 300 metabolitos de la muestra biológica a analizarse contienen la marca isotópica.

Se pueden tolerar excepciones al marcado hasta saturación, sin embargo, deberían tenerse en cuenta cuando se analizan los datos de metabolitos obtenidos. Los metabolitos no marcados pueden estar presentes en la muestra biológica cuando, además del compuesto metabolizable marcado isotópicamente, otros compuestos, por ejemplo nutrientes esenciales como vitaminas o marcadores de auxotrofía, se han proporcionado a la célula por medio del medio de cultivo y estos compuestos no contienen la marca isotópica. Por lo tanto, puede ocurrir que las células que están marcadas hasta saturación contengan metabolitos no marcados que sean estos otros compuestos o productos metabólicos de los mismos.

El número y la selección de los metabolitos analizados en el procedimiento de la invención depende del objetivo a lograrse llevando a cabo el procedimiento de la invención. Es típico para perfiles metabólicos como el procedimiento de la invención tener como objetivo determinar cuantitativamente un subgrupo tan grande como sea posible de metabolitos con el fin de obtener tantos datos de metabolitos como sea posible. Aquí, la posibilidad para marcar en principio cada metabolito por el procedimiento de la invención es una gran ventaja por encima de los enfoques de la técnica anterior debido a que ello proporciona un estándar cuantitativo para cada metabolito a analizarse.

De acuerdo con ello, en una realización preferida del procedimiento de la invención, al menos 50, aún más preferentemente al menos 100, incluso más preferentemente al menos 150 y lo más preferentemente al menos 200

o incluso al menos 300 metabolitos se determinan cuantitativamente.

El término "metabolito" se refiere a cualquier sustancia, salvo para ADN, ARN o proteínas, dentro de una célula o producido por una célula, incluyendo sustancias segregadas, que se pueden determinar cuantitativamente aplicando el procedimiento de la invención, que es para lo que están disponibles técnicas adecuadas para determinar la cantidad. Preferentemente, estas sustancias no son macromoléculas (es decir, biopolímeros). Se prefieren particularmente metabolitos con un peso molecular bajo preferentemente los metabolitos tienen un peso molecular de no más de 4.000 Da, preferentemente no más de 2.000 Da, más preferentemente no más de 1.000 Da. Típicamente, los metabolitos a analizarse puede pertenecer a la siguiente lista no limitante de compuestos: hidratos de carbono (por ejemplo azúcares, oligo y polisacáridos tales como poliglucanos como por ejemplo almidón o polifructanos), alcoholes de azúcares, aminas, poliaminas, aminoalcoholes, compuestos alifáticos, alcoholes alifáticos, aminoácidos, lípidos, ácidos grasos, alcoholes grasos, ácidos orgánicos, fosfatos orgánicos, iones orgánicos, otros iones inorgánicos unidos a metabolitos, nucleósidos, nucleótidos, nucleótidos azúcares, purinas, pirimidinas, tales como adenina y uracilo, esteroles, terpenos, terpenoides, flavonas y flavonoides, glucósidos, carotenos, carotenoides, cofactores, ascorbato, tocoferol, vitaminas, polioles, aminas orgánicas y amidas tales como etanolamina y urea y/o compuestos heterocíclicos tales como ácido nicotínico.

Como es evidente a partir de los ejemplos adjuntos, el procedimiento de la invención también implica analizar metabolitos de los que se desconoce la naturaleza química. Sin embargo, los metabolitos (también referidos en el presente documento como "marcas de metabolitos de espectros de masas" o MST) de naturaleza química

desconocida pueden proporcionar datos informativos en la muestra biológica analizada. Está claro que, si un metabolito de naturaleza química desconocida se revela llevando a cabo el procedimiento de la invención que tiene una propiedad o valor diagnóstico o comportamiento característico o peculiaridad interesante, este metabolito puede caracterizarse aplicando procedimientos analíticos adecuados en la técnica.

En una realización particularmente preferida, el procedimiento de la invención se refiere a la determinación cuantitativa de los metabolitos que comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos orgánicos, poliaminas, polioles, nucleósidos, purinas, pirimidinas, adenina, uracilo, aminas orgánicas y amidas orgánicas tales como etanolamina y urea y/o compuestos heterocíclicos tales como ácido nicotínico.

El isótopo usado para marcar in vivo en conexión con la presente invención puede seleccionarse entre isótopos disponibles que pueden ser adecuados para aplicar el procedimiento de la invención. Como una selección preferida, una persona experta puede usar un isótopo para el que los compuestos isotópicamente marcados, metabolizables están disponibles, en particular comercialmente disponibles. Como una opción preferida adicional, los isótopos para usar en el procedimiento de la invención deberían ser tales que no dañen la viabilidad de las células de las que se toma la muestra biológica para análisis o que no interfieran con el metabolismo tal como influenciando la actividad de enzimas metabólicas. A este respecto, se prefiere así usar isótopos estables más que los radiactivos. Como un aspecto adicional, se debería tener en cuenta que elementos tales como carbono o hidrógeno se prefieren sobre elementos que están presentes en metabolitos más raramente con el fin de abarcar los metabolitos de una célula marcando in vivo tan completamente como sea posible. Los isótopos particularmente preferidos son 13C, 15N, 18O y2H, con preferencia particular de 13C.

El isótopo de marca se incorpora dentro de las células de las que se toma la muestra biológica manteniendo la célula en condiciones que permitan la captación de dicho compuesto. Esto significa que el compuesto debería ser uno que se capte fácilmente por las células y que también se metabolice fácilmente de tal forma que se asegure que se puede lograr saturación con la marca isotópica. Dependiendo de la clase de células u organismo a marcarse, la marca puede por ejemplo proporcionarse suministrando células cultivadas tales como células de levadura o células de mamífero con un nutriente, por ejemplo, una fuente de carbono si la marca es 13C. Si las células a marcarse están dentro de un microorganismo pluricelular, la marca puede incorporarse estando expuesto al compuesto metabolizable marcado a través del sustrato (por ejemplo el agua) si es una planta o inyectando el compuesto marcado dentro si el organismo es un animal, por ejemplo un vertebrado, en particular un mamífero.

Como el compuesto metabolizable marcado isotópicamente, deberían usarse sustancias que proporcionen una captación efectiva de la marca por la célula. Preferentemente, el compuesto puede estar totalmente marcado con el isótopo (es decir, ningún átomo del elemento respectivo en el compuesto es de otro isótopo que el isótopo marcado). Los compuestos marcados correspondientes pueden estar disponibles a partir de suministradores comerciales tales como aquellos mencionados en los ejemplos. Compuestos metabolizables marcados isotópicamente particularmente preferidos son U-13C-glucosa, 2H2O, H218O, U-13C-ácido acídico, 13C-carbonato, y 13C-ácido carbónico.

El término "muestra biológica" comprende cualquier cantidad de material que comprende células o derivados de una célula que es susceptible al procedimiento de la invención. De acuerdo con ello, el procedimiento se puede aplicar a cualquier tipo de célula, células procariotas o eucariotas, partículas víricas, células de tipo silvestre o transformadas, transducidas o fusionadas, o derivados de las mismas tales como preparaciones de membrana, liposomas y similares. Las células pueden además ser parte de un tejido, un órgano o un organismo completo, tal como una planta o un animal. Las células pueden estar en una forma que se da en la naturaleza o en una forma artificial tal como en una forma cultivada, por ejemplo cultivo celular, cultivo protoplástico, cultivo tisular o similares.

El término "derivado" usado en conexión con caracterizar la muestra biológica quiere decir cualquier tipo de medidas que una persona experta puede aplicar con el fin de modificar las células marcadas o el medio ambiente directo de las células, en el que el "medio ambiente directo" se caracteriza por la presencia de al menos un metabolito producido por las células, con el fin de preparar una muestra para usar en determinar cuantitativamente los metabolitos contenidos en ella aplicando el procedimiento de la invención. Tales medidas pueden por ejemplo implicar técnicas de preparación de muestras o de extracción típicas comunes a aquellos expertos en la técnica. El medio ambiente directo puede por ejemplo ser el espacio intracelular alrededor de una célula, el apoplasto, la pared celular, el espacio intersticial o el medio de cultivo. Además, la muestra biológica derivada de una célula puede ser una cierta parte de la célula, por ejemplo ciertos compartimentos celulares tales como plástidos, mitocondrias, el núcleo, vacuolas, etc. En una realización preferida de la presente invención, la muestra biológica comprende células de levadura o células vegetales.

Una "muestra biológica" en el contexto de la presente invención puede por ejemplo ser material fresco tal como un explante de tejido, un fluido corporal o una alícuota de un cultivo bacteriano o celular, preferentemente necesitado del medio de cultivo, que puede someterse directamente a extracción. Por otro lado, las muestras también pueden almacenarse durante un cierto periodo de tiempo, preferentemente en una forma que evita la degradación de los metabolitos en la muestra. Para este propósito, la muestra se puede congelar, por ejemplo en nitrógeno líquido, o se puede liofilizar. Las muestras se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos por la persona experta en la técnica y como se describen en la bibliografía. En particular, la preparación debería llevarse a cabo en un

medio adecuado a la técnica de retención respectiva aplicada. Además, se debería tener cuidado de que los respectivos compuestos a analizarse no se degraden durante el proceso de extracción. Las muestras biológicas para análisis de metabolitos pueden prepararse por ejemplo de acuerdo con procedimientos descritos en Roessner (2000).

En una realización preferida adicional, el procedimiento de la invención comprende adicionalmente fraccionar o purificar la muestra biológica de tal forma que la muestra contenga un subconjunto de los metabolitos contenidos en la célula de los que se deriva la muestra.

Por esta etapa de fraccionamiento y/o purificación adicional, es por ejemplo posible seleccionar metabolitos poco abundantes fuera de toda la reserva de metabolitos de modo que, sin esta etapa, estos metabolitos podrían no ser detectables por ejemplo porque sus señales estén sobreimpuestas con señales fuertes de metabolitos altamente abundantes. En la técnica anterior los procedimientos de perfiles de metabolitos, tales como fraccionamiento o purificación causarían la pérdida de la relación cuantitativa a otros metabolitos que volverían casi imposible la cuantificación de los metabolitos poco abundantes. Este problema se ha superado por la presente invención dado que los metabolitos marcados isotópicamente sirven como un estándar cuantitativo que puede co-fraccionarse/copurificarse con los metabolitos no marcados.

El fraccionamiento y/o la purificación se pueden llevar a cabo de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica. Está claro que preferentemente se deberían usar procedimientos que no cambian o al menos que solamente cambian a un grado tolerable la distribución de los metabolitos en la muestra.

La determinación cuantitativa de metabolitos en una muestra biológica se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento adecuado que pueda aclarar diferencias de masa dentro de un metabolito. Esto puede implicar diversas técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) y de espectrometría de masas (EM) que son conocidas para una persona experta en la técnica, por lo que se prefiere espectrometría de masas en el contexto de la presente invención. Se describen técnicas de RMN y de EM adecuadas diferentes por ejemplo en Wittmann (Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. 74 (2002), 39-64) y Szyperski (Q. Rev. Biophys. 31 (1998), 41-106). Los sistemas preferidos para técnicas de EM para usar en la presente invención implican la combinación de EM con cromatografía de gases (CG) como se usa habitualmente en los análisis de metabolitos en el estado de la técnica, tal como CG-EM descrita en los ejemplos adjuntos.

En casos de interpretación de fragmentos ambigua, los análisis que usan CG-EM-EM o las disposiciones en tándem de EM pueden respaldar la identificación de pares de fragmentos de isotopómeros. Por ejemplo, los sistemas de CG-EM con tecnología de atrapamiento iónico permiten la selección de fragmentos primarios individuales y la fragmentación de espectro de masas secundaria subsiguiente (Birkemeyer, 2003; Mueller, 2002). Estas huellas dactilares de espectro de masas EM-EM pueden permitir una identificación inequívoca de iones principales correspondientes.

La determinación de la cantidad de los metabolitos de interés se puede hacer de acuerdo con técnicas bien conocidas conocidas en la técnica anterior y familiares para las personas expertas en la técnica. Preferentemente, se aplican técnicas que permiten la identificación y cuantificación en una etapa y ventajosamente se adecúan para registrar los metabolitos respectivos contenidos en la muestra en una manera exhaustiva.

Procedimientos adicionales para determinar cuantitativamente los metabolitos para usar de acuerdo con la presente invención incluyen cromatografía líquida/espectrometría de masas (CL/EM), el uso de radiactividad en relación con procedimientos adecuados conocidos por la perdona experta, cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis capilar (CE), EM de inyección directa, EM de inyección de flujo, EM/EM, EM/EM/EM y combinaciones adicionales de etapas de EM (EMn), espectrometría de infrarrojos de transformación diferencial/espectrometría de masas (FT/EM), cromatografía de permeación de gel (GPC), TLC, CE, HPLC, GPC, cualquier otra técnica cromatográfica o electroforética o cualquier técnica espectrométrica de masas que está combinada en línea o fuera de línea a espectrometría de masas. Si es apropiado, cualquiera de los procedimientos anteriores se puede combinar.

Análisis no tergiversados ejemplares se describen en Fiehn (2000b). En este estudio, de diferentes mutantes de plantas, se detectaron 326 compuestos distintos (que varían de metabolitos polares primarios a esteroles) y se cuantificaron de forma relativa, incluyendo tanto compuestos identificados como compuestos no identificados, aplicando análisis de CG/EM. Otro ejemplo de análisis GC/EM que puede aplicarse en el procedimiento de la invención se ha descrito por Roessner (2001), donde se usó para estudiar exhaustivamente el metabolismo en tubérculos de patatas.

En una realización particularmente preferida del procedimiento de la invención, la espectrometría de masas usada es ionización de desorción láser asistida por matriz/espectrometría de masas de dispersión (MALDI-TOF).

Esta realización hace uso del hallazgo sorprendente de que el marcado in vivo saturante logrado por el procedimiento de la invención hace posible obtener datos de perfil metabólico cuantitativos.

Se prefiere además que el procedimiento de la invención como se describe más adelante implique que los metabolitos estén cromatográficamente separados antes de la determinación cuantitativa.

Esta realización preferida se refiere a la separación cromatográfica que ya se ha descrito anteriormente por referencia al ejemplo preferido particularmente de usar cromatografía de gases en ajustes tales como CG-EM o CG-EM-EM. Otros procedimientos de cromatografía adecuados tales como HPLC, RP-HPLC, HPLC de intercambio iónico, GPC, electroforesis capilar, electroforesis, TLC, separación microfluídica basada en chip, cromatografía por interacción de afinidad usando anticuerpos u otros dominios específicos de ligando se pueden usar también a este respecto.

En otra realización preferida, el procedimiento de la invención comprende adicionalmente la etapa de introducir estándares externos para uno o más metabolitos determinados cuantitativamente.

La introducción de estándares externos o de series de dilución externa permite la determinación de concentraciones de metabolitos en términos absolutos. En contraste, las realizaciones del procedimiento de la invención en las que no hay estándares externos o se aplican series de dilución estándar permiten la cuantificación exacta en términos relativos, es decir cambios de concentración observados en relación con las cantidades de referencia como se observan en muestras de control experimentales. La introducción de estándares externos y la provisión de tales estándares se puede llevar a cabo como se describe en la bibliografía y como se conoce por la persona experta en la técnica.

Como se ha mencionado anteriormente, el procedimiento de la invención incluye la determinación cuantitativa de metabolitos la naturaleza química de los cuales es todavía desconocida. De acuerdo con ello, en una realización preferida, este procedimiento comprende adicionalmente la etapa de identificar uno o más de los metabolitos que se determinan cuantitativamente.

Esta identificación se puede llevar a cabo por procedimientos analíticos conocidos por el experto y descritos en la bibliografía.

En una realización particularmente preferida, esta identificación comprende identificación por fragmentación secundaria.

Las técnicas de fragmentación secundarias se pueden llevar a cabo por procedimientos conocidos en la técnica anterior, en particular por GC-EM-EM o por otras técnicas de EMn. El registro separado y la comparación subsiguiente de los intermedios químicos de las rutas de fragmentación EM-EM de, por ejemplo, pares de isotopómeros con 13C se facilitan altamente proporcionando el número de átomos de carbono presentes dentro de cada fragmento de EM-EM observado.

En una forma especialmente preferida de esta realización, la identificación de los metabolitos comprende ionización de impacto electrónico, tecnología de EM-EM y/o análisis después de disminuir la muestra de iones moleculares o de fragmentos moleculares.

Tales técnicas se conocen por una persona experta en la técnica. En particular, los análisis después de disminuir la muestra se pueden llevar a cabo como se describe en el ejemplo 9 usando detección de NADH como un ejemplo.

En una realización preferida adicional, el procedimiento de la invención como se describe anteriormente se puede llevar a cabo en una forma tal que la célula a marcarse se ha mantenido en condiciones que permiten adicionalmente la captación de un compuesto metabolizable no marcado isotópicamente y dicho compuesto y/o dichos productos metabólicos de los mismos están determinados cuantitativamente. Preferentemente, la captación de los compuestos no marcados tiene lugar cuando la célula ya está saturada con la marca isotópica.

Preferentemente, esta realización implica comparar la cantidad determinada para el compuesto metabolizable no marcado isotópicamente y/o para dichos productos metabólicos del mismo con la cantidad obtenida llevando a cabo dicho procedimiento en proporción, pero sin la captación de dicho compuesto metabolizable no marcado.

La presente realización preferida se refiere a una solicitud de la presente invención que se refiere también como "marcado inverso". Este término se refiere a una inversión de los estudios convencionales de flujo (véase, por ejemplo, Wittmann, Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. 74 (2002), 39-64) en los que un metabolito marcado se añade a una célula y su destino se rastrea con el fin de analizar las rutas metabólicas. La presente realización preferida de la invención parece ser viable debido a la alta similitud de los perfiles de metabolitos de los cultivos de levaduras de δ13C ambiental y de 13 saturado (Figura 2 A, B). Además, en el ejemplo 2, se describe un experimento correspondiente en el que se añade L-lisina en forma no marcada al medio de cultivo después de que las células de levadura alcanzasen remarcado saturado. En un experimento adicional, se mostró el enriquecimiento del compuesto traza no marcado de ácido nicotínico y la incorporación de este resto en NAD(H) dentro de un metaboloma de levaduras saturadas de 13C (ejemplo 9).

La presente realización le permite alcanzar resultados similares a aquellos obtenidos en los estudios de flujo convencionales. Ello permite utilizar el suministro de sustancias relativamente baratas con composición de δ13C ambiente para la elucidación de ritas bioquímicas en el marco de un metaboloma saturado de 13C. Pero tiene la ventaja de que el metabolito específico la metabolización del cual se analizará no necesita proporcionarse en forma marcada, lo que a menudo es considerablemente caro. Más bien, en el procedimiento de acuerdo con la presente

realización, el metabolito a investigarse se puede usar en la forma no marcada más barata. Una ventaja adicional es la versatilidad incrementada de este enfoque comparado con estudios de flujo convencionales dado que virtualmente cada metabolito posible se puede poner a prueba o incluso más de un metabolito, sin ser dependiente de la disponibilidad del/de los metabolito(s) en forma marcada.

En una realización preferida adicional del procedimiento de la invención descrito anteriormente, una o más proteínas y/o tránscritos en dichas(s) muestra(s) está(n) determinado(s) y analizado(s) cuantitativamente, además de los metabolitos.

Esta realización se refiere a uno de los principales aspectos en la biología de sistemas que tiene como objetivo combinar datos del metaboloma con datos obtenidos a partir de análisis de transcriptoma y/o de proteoma con el fin de obtener una imagen completa de mecanismos reguladores en sistemas biológicos. En este contexto, es evidente que el procedimiento de la presente invención se puede combinar con procedimientos que determinan cuantitativamente tránscritos y/o proteínas a partir del mismo sistema biológico, en particular organismos o células, de los que los metabolitos se analizan cuantitativamente de acuerdo con el procedimiento de la invención. Los análisis de transcriptoma y proteoma así como la evaluación matemática y los análisis de correlación de los datos se pueden llevar a cabo por procedimientos descritos en la técnica anterior. Se contempla que, preferentemente, el análisis de transcriptoma y/o de proteoma dirigido en combinación con el análisis de metaboloma de acuerdo con la presente invención también puede beneficiarse de las ventajas del marcado in vivo. Así, si la determinación cuantitativa de los tránscritos o proteínas se lleva a cabo mediante técnicas adecuadas tales como la espectrometría de masa los tránscritos o proteínas pueden estar isotópicamente marcados tal como los metabolitos y por lo tanto usarse también como un estándar cuantitativo.

Se prefiere particularmente que la realización preferida se lleve a cabo de tal modo que dichos metabolitos y proteínas y/o tránscritos se determinen cada uno a partir de la misma muestra biológica.

Esta realización particularmente preferida se basa en una tecnología descrita en el documento WO 03/058238 y en Fiehn (Eur. J. Biochem. 270 (2003), 579-588). El procedimiento descrito en el mismo proporciona datos útiles para analizar cuantitativamente los metabolitos, proteínas y/o ARN en un material fuente biológico, en el que dicho análisis implica evaluación estadística adecuada y análisis de correlación de los datos obtenidos. En este procedimiento, la extracción, identificación y cuantificación de al menos dos clases de compuestos constituidos por metabolitos, proteínas y ARN se determinan cada una a partir de una muestra. De acuerdo con ello, en la presente realización particularmente preferida, la preparación de las muestras con el fin de determinar cuantitativamente los metabolitos y las proteínas y/o tránscritos se lleva a cabo aplicando las correspondiente enseñanzas del documento WO 03/058238. De este modo, se prefiere especialmente que (i) los metabolitos se extraigan de la muestra con al menos un disolvente o mezcla de disolventes; y (ii) el ARN se extraiga del resto de la muestra después de la etapa (i). De este modo, es una opción adicional que los metabolitos puedan extraerse adicionalmente del material celular que queda no disuelto todavía contenido en la muestra después de la etapa (ii). Preferentemente, la extracción se llevó a cabo usando una mezcla de disolventes que comprende al menos un disolvente altamente polar y al menos un disolvente lipófilo, ventajosamente una mezcla de disolventes que comprenden agua, metanol y cloroformo. Más preferentemente, esta mezcla de disolventes contiene agua, metanol y cloroformo en la proporción aproximada en volumen de 1:2,5:1. Ventajosamente, la extracción en la etapa (i) se lleva a cabo a una temperatura entre -60 °C y +4 °C.

Como una realización adicional preferida de la presente invención, el procedimiento como se describe anteriormente comprende adicionalmente, antes de determinación cuantitativa de los metabolitos, combinar la muestra biológica (es decir la primera muestra biológica) con una segunda muestra biológica en la que los metabolitos no están isotópicamente marcados o están isotópicamente marcados de forma diferente de la primera muestra biológica; y determinar en dichas muestras biológicas la cantidad relativa de metabolitos que difieren en su marca isotópica.

Preferentemente, la segunda muestra biológica no está isotópicamente marcada.

Por esta realización preferida, el procedimiento facilita la cuantificación de los datos de metabolitos que hasta ahora solamente fue posible usando muestras de metabolito externas como estándares cuantitativos. Aquí, los metabolitos marcados in vivo presentan el estándar cuantitativo para los metabolitos de la segunda muestra biológica. Esto permite el análisis de correlación de un amplio conjunto de metabolitos de dos muestras biológicas que corresponden a dos estados fenotípicos y/o genotípicos de las células de las que se derivan las muestras biológicas.

De acuerdo con ello, en una realización específicamente preferida, la primera y la segunda muestras biológicas corresponden a diferentes estados fenotípicos y/o genotípicos de las células comprendidas en las muestras o de las que se derivan las muestras. Aplicando esta realización al procedimiento de la invención, es posible encontrar correlaciones entra la diferencia en el estado fenotípico y/o genotípico y cambios en el perfil de metabolitos por ejemplo llevando a cabo análisis de metabolitos de co-respuesta.

El término "estado fenotípico" se refiere a diferencias en el fenotipo de la célula sometida a investigación o del organismo en el que ella reside. "Fenotipo" quiere decir cualquier clase de característica que se pueda detectar y que no sea una característica del genoma. Tales estados fenotípicos pueden ser por ejemplo identificables

visualmente tal como una diferencia morfológica o anatómica como pueden observarse en diferentes fases del desarrollo. Los estados fenotípicos podrán asimismo manifestarse por sí mismos por la composición de compuestos químicos o la aparición de una enfermedad. Por tanto, los estados fenotípicos pueden por ejemplo ser un estado saludable en comparación con uno o más estados patógenos, estados diferentes de la patogenicidad u organismos no infectados frente a uno o más organismos infectados.

El término "estado genotípico" refleja diferencias en el genoma de las células sometidas a investigación. Así, si las muestras se toman de estados genotípicos diferentes de una célula, el término "célula" se refiere específicamente a las células de acuerdo con la definición dada anteriormente que pertenecen a la misma unidad taxonómica, pero que difieren en al menos un rasgo genético. Específicamente, la "unidad taxonómica" es un género, preferentemente una especie y más preferentemente un rango taxonómico aún inferior como una raza, variedad, tipo de cultivo, cepa, aislado, población o similares. Lo más preferentemente, el rango taxonómico es una línea isogénica con varianza en solamente un número limitado, preferentemente tres, más preferentemente dos rasgos genéticos y lo más preferentemente un rasgo genético, en la que “rasgo genético "se refiere a una región cromosómica, un locus de gen o, como se prefiere, a un gen. Típicamente, las diferencias en el estado genotípico pueden ser diferencias entre un organismo de tipo silvestre y uno o más organismos mutantes o transgénicos correspondientes o entre diferentes organismos mutantes o transgénicos. Un cierto estado genotípico puede ser estable o transitorio como es el caso con células transducidas o transfectadas, que contienen por ejemplo un plásmido, un fago o un vector vírico. Ventajosamente, los organismos de diferente estado genotípico se analizan cuando están en la misma fase de desarrollo.

Está inmediatamente claro que los términos estados "fenotípicos" y "genotípicos" pueden solaparse. En particular, normalmente un estado genotípico, si la diferencia entre el/los rasgo(s) genético(s) se expresa(n) en el organismo, conduce(n) a una diferencia en el fenotipo.

De acuerdo con las explicaciones anteriores, en una realización preferida del procedimiento de la invención, los diferentes estados fenotípicos y/o genotípicos son diferentes fases de desarrollo, entornos, abastecimientos nutricionales, unidades taxonómicas, genomas de tipo silvestre y mutantes o transgénicos, estados infectados o no infectados, estados morbosos y saludables o fases diferentes de una patogenicidad.

En una realización preferida adicional del procedimiento de la invención como se describe anteriormente, dicho análisis implica adicionalmente evaluación estadística adecuada y análisis de correlación de los datos obtenidos y opcionalmente, análisis de redes.

Esto se refiere a cualquier procedimiento de análisis matemático que sea adecuado para procesar adicionalmente los datos cuantitativos proporcionados por el procedimiento de la invención. Estos datos representan la cantidad de los metabolitos analizados presentes en cada muestra bien en términos absolutos (por ejemplo, peso o moles por muestra de peso) o bien en términos relativos (es decir, normalizados a una cierta cantidad de referencia).

Los análisis cuantitativos implican evaluación estadística adecuada y análisis de correlación. Lo anterior incluye normalización al contenido total de los compuestos respectivos, corrección de los niveles precedentes y la combinación de los conjuntos de datos obtenidos a partir de diferentes experimentos (si se analiza más de una muestra) en una sola hoja de datos. Se conocen por el experto los procedimientos matemáticos y programas de ordenador correspondientes. Los ejemplos incluyen SAS, SPSS y systatR. Como la siguiente etapa, los datos pretratados estadísticamente pueden someterse a análisis de correlación de valores. Aquí series de pares de puntos de datos de los compuestos analizados se examinaron por correlación, si era positiva o negativa, por ejemplo usando el coeficiente de correlación de Pearson.

En una realización preferida, el análisis cuantitativo referido en el procedimiento de la invención implica adicionalmente análisis de red. Los análisis de red tienen como objetivo descubrir interacciones de orden superior de múltiples factores sobre la base de datos de correlación por pares. Si, de acuerdo con una de las realizaciones preferidas descritas anteriormente, los metabolitos y tránscritos y/o las proteínas se determinaron cuantitativamente, para los varios conjuntos de datos obtenidos, preferentemente cada uno obtenido a partir de una muestra, se pueden analizar correlaciones entre metabolitos y proteínas y/o tránscritos así como dentro de estas clases de compuestos con el fin de obtener información sobre la regulación de la red de sistemas biológicos, por ejemplo tras la perturbación genética o ambiental. Una perspectiva general exhaustiva de los procedimientos para analizar cuantitativamente los datos obtenidos de acuerdo con el procedimiento de la invención que incluyen análisis de componentes de principio, "análisis instantáneo", análisis de correlación de Pearson, información mutua y análisis de la red se puede encontrar en Fiehn (2001).

También se revela un conjunto de los metabolitos marcados isotópicamente obtenibles a partir de una muestra que comprende o se deriva de una célula que se ha mantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente tal que los metabolitos en dicha célula se saturaron con el isótopo con el que dicho compuesto metabolizable está marcado.

La presente divulgación se refiere también a tales células que pueden ser células como se describe anteriormente en conexión con el procedimiento de la invención.

Como se explicó anteriormente en el presente documento, los metabolitos marcados isotópicamente obtenidos a partir de una muestra biológica de conformidad con el procedimiento de la presente invención se pueden usar como un estándar cuantitativo para la determinación cuantitativa de los metabolitos de una segunda muestra biológica. Un conjunto de estos metabolitos marcados se puede usar para estandarizar resultados de un análisis de metaboloma llevado a cabo con las mismas especies de células como aquella a partir de la que se obtiene el grupo de los metabolitos. Sin embargo, también es factible que este conjunto pueda ser de uso para estandarizar datos de metabolitos obtenidos a partir de una especie diferente. Esto requeriría generalmente que los metabolitos del grupo sean idénticos a los metabolitos de la segunda muestra biológica. Puede determinarse o confirmarse la identidad usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Por ejemplo, los metabolitos marcados isotópicamente obtenidos a partir de levaduras se pueden usar como un estándar cuantitativo para metabolitos de células vegetales dado que, para un grupo considerable de cada uno de estos metabolitos, los metabolitos se solapan tal como los metabolitos de las rutas metabólicas primarias.

Como un uso adicional del conjunto de los metabolitos marcados isotópicamente, o de las células correspondientes que los contienen, se prevé que el conjunto o las células se puedan usar como un estándar cualitativo con el fin de identificar metabolitos a partir de una segunda muestra biológica no marcada.

El conjunto de los metabolitos se puede preparar de acuerdo con las anteriores explicaciones para llevar a cabo el procedimiento de la invención. Para los propósitos de almacenamiento y transporte de ese conjunto, se pueden aplicar los procedimientos correspondientes que sean adecuados con el fin de garantizar que la degradación de cada tipo de metabolito contenido en ello está al menos minimizado hasta un grado tolerable y que sean conocidos para una persona experta en la técnica.

El conjunto de los metabolitos marcados isotópicamente se puede usar como un estándar cuantitativo para determinar la cantidad de uno o más metabolitos en una muestra biológica.

También se describe en el presente documento un kit que comprende un compuesto metabolizable marcado isotópicamente y un manual para usar en llevar a cabo el procedimiento de la invención o el conjunto de metabolitos marcados isotópicamente.

Los componentes del kit pueden envasarse en recipientes tales como viales en una forma almacenable y transportable. Si fuera apropiado, uno o más de dichos componentes se pueden envasar en uno y el mismo recipiente.

Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de un compuesto marcado isotópicamente que puede metabolizarse por una célula para marcar al menos 50 metabolitos en dicha célula en una manera saturante en que la proporción del isótopo marcado de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica se incrementa a al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas. Tales usos podrán llevarse a cabo de acuerdo con las explicaciones mencionadas anteriormente para el procedimiento de la invención.

También se revela el uso de un compuesto marcado con isótopos que pueden metabolizarse por una célula para la determinación cuantitativa de metabolitos en una muestra biológica que comprende o que se deriva de dicha célula.

Tales usos podrán llevarse a cabo de acuerdo con las explicaciones mencionadas anteriormente para el procedimiento de la invención.

Asimismo, se revela el uso de un compuesto marcado isotópicamente que puede metabolizarse por una célula para analizar el perfil de metabolitos de una muestra biológica que comprende o que se deriva de dicha célula.

Tales usos podrán llevarse a cabo de acuerdo con las explicaciones mencionadas anteriormente para el procedimiento de la invención.

El alcance de protección se define por las reivindicaciones. Se puede recuperar bibliografía adicional concerniente a uno cualquiera de los procedimientos, usos y compuestos a a partir de bibliotecas públicas, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo se puede utilizar la base de datos públicos "Medline" que está disponible en Internet, por ejemplo en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Adicionalmente se conocen por la persona experta en la técnica bases de datos y direcciones, tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ y también se pueden obtener usando, por ejemplo, http://www.google.de. Una visión general de la información de patentes en biotecnología y una inspección de fuentes relevantes de información de patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para la conciencia actual se dan en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Además, el término "y/o" cuando se produce en el presente documento incluye el significado de "y", "o" y "todas o cualesquiera otras combinaciones de los elementos conectados por dicho término".

La presente invención se describe adicionalmente por referencia a las siguientes figuras, tablas y ejemplos.

Las figuras y las tablas muestran:

La figura 1 muestra los resultados de análisis cabeza-cola de espectros de masas de ionización de impacto electrónico de metabolitos de levaduras extraídos de perfiles de metabolitos de CG-EM.

Los metabolitos de levadura ácido succínico, glicina y ácido glutámico se trimetilsililaron antes de análisis de CG. Se indica el número de grupos funcionales sililados y el factor de aumento del intervalo de masas moleculares altas. Los espectros de masas cabeza-cola son de análisis de CG-EM aparte de los extractos de levaduras de δ13C y de levaduras saturadas de 13C. Las entradas a la derecha muestran los intervalos de fragmentos de M+ y de [M-15]+ de perfiles de metabolitos de proporción de isotopómeros marcados con 13C. Los pares de fragmentos de isotopómeros [M-15]+ de ácido succínico (2TMS), glicina (3TMS) y ácido glutámico (3TMS) son M/Z 247_251, M/Z 276_278 y M/Z 348_353. El ácido glutámico (3TMS) presentó iones moleculares abundantes, M+, M/Z 363_368.

La figura 2 representa una comparación del perfil de metabolito ITR (A, C) y su perfil de metabolito convencional (B, D).

Se trazan las respuestas de iones seleccionadas de pares de fragmentos de isotopómeros con 12C y con 13C, que representan la misma sustancia de extractos de levaduras (A, B) con δ13C ambiental y saturados con 13C y fragmentos que representan el mismo isotopómero en dos experimentos diferentes (Exp1 y Exp2) bien a partir de cultivo de levaduras con δ13C ambiental o bien a partir de cultivo de levaduras saturado con 13C. ITR se llevó a cabo en dos análisis de CG-EM (06, 10), mientras que se requirieron cuatro análisis de CG-EM para perfil de metabolito convencional (δ13C ambiental: 04, 08; saturado con 13Cd: 05, 09). Los coeficientes de correlación lineales de Pearson (r) y los coeficientes de variación promedio (cf) se muestran en las entradas.

La figura 3 representa un perfil de metabolito de CG-TOF-EM de cepa BY4741 de levaduras.

Las marcas por debajo del rastro de la corriente iónica total del perfil principal indican la deconvolución automatizada de componentes de espectros de masas con S/N ≥ 100 que se llevan a cabo por programa de procesamiento de datos de cromatografía de Pegasus. La entrada muestra rastros iónicos seleccionados de componentes deconvueltos del área sombreada del perfil principal. A isoleucina (2TMS), M/Z = 158; B treonina (2TMS), M/Z = 117; C prolina (2TMS), M/Z = 142; D glicina (3TMS), M/Z = 174; E ácido 2,2,3,3-d4-succínico (2TMS), M/Z = 251; F ácido succínico (2TMS); M/Z = 247 (factor de magnificación 10). La presencia de ácido 2,2,3,3-d4-succínico resultó de la adición estándar de un isotopómero deuterado.

La figura 4 representa un árbol de agrupación de MST identificadas y no identificadas a partir de extractos de la cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4741 y compuestos estándar puros. MST se clasificaron en grupos por agrupación hierática de una matriz simétrica completa de valores correspondientes de espectros de masas por parejas. Se clasificaron 18 grupos de MST en un punto de corte en aproximadamente el 50 % de la diversidad (los grupos de MST se describen en el ejemplo 6).

La figura 5 muestra los resultados de análisis de componente principal basados en perfiles de metabolitos de CGTOF-EM de extractos de un cultivo de lote individual de la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae (A595 ~ 1,8). Se emplearon cuatro de las estrategias de muestreo (n = 16), a saber desactivación en metanol frío (MEOH), recogida sobre disco de filtro (FILTRO), recogida por centrifugación sin lavado de medio (GIRO) y recogida por ciclos de lavado y centrifugación repetidos (SPINW). Los lavados se llevaron a cabo con medio SD libre de glucosa. Los componentes principales 1, 2 y 3 abarcaron 57,4 %, 24,2 %, y 6,4 % de la varianza total del grupo de datos del perfil. Las respuestas de metabolitos se normalizaron a la respuesta de metabolitos promedio observada en cada muestra, Se indica la desviación estándar relativa promedio (RSD) de cada uno de los procedimientos de muestreo.

La figura 6 proporciona los resultados de una comparación de cuatro medidas de co-respuesta aplicadas a los perfiles de metabolitos de cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae (A595 ~ 1,8). El coeficiente de correlación de Kendall se compara con la distancia euclidiana (A), con la información mutua (B) y con el coeficiente de correlación de Pearson (C). Cada tupla representa una co-respuesta metabolito/metabolito. Las flechas indican la posición de las gráficas dobles ejemplares presentadas en escala logarítmica decimal doble a la derecha. Se emplearon cuatro estrategias de muestreo (n = 16), a saber, MEOH, FILTRO, GIRO Y SPINW. Las técnicas de muestreo son como se describen en el seno de la leyenda de la figura 5.

La figura 7 muestra las gráficas dobles de metabolitos en escala logarítmica decimal doble representando comportamiento de correspuesta de intermedios y de un producto del ciclo de ácido tricarboxílico. El ácido oxalacético estuvo por debajo de los límites de detección en perfiles de CG-TOF-EM de levadura. A, ácido málico/ácido aspártico; B, ácido málico/ácido cítrico; C, ácido fumárico/ácido málico; D, ácido succínico/ácido fumárico. Las técnicas de muestreo son como se describen en la leyenda para la figura 5.

La figura 8 muestra los vecinos más cercano y más distante comunes de ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico, según se describe por el coeficiente de correlación de Kendall. Los valores de los coeficientes de correlación se codificaron por el estilo de línea, ≥ 0,6 línea seguida ≤ -0,5 línea discontinua.

La figura 9 muestra un espectro MALDI-TOF-EM de iones positivos continuos de un extracto de levaduras marcado con δ13C con ácido 2,5-dihidroxibenzoico como un grupo de matriz para el intervalo de masas esperado de aductos de NAD+ (NADH), a saber iones moleculares protonados a m/z 664,1 (666,13) y aductos de sodio a m/z 686,09 (688,12), respectivamente. La entrada (12C/13C) muestra una representación de barras de la región iónica molecular protonada a partir de análisis de MALDI-TOFF de la proporción de 13C-isotopómero (13C-ITR). M/z 679,26 y 681,25 representan NAD+ protonada y NADH, que se marcaron con 15 átomos 13C. Los extractos de levaduras saturadas con 13C mostraron exclusivamente los iones marcados en el intervalo 677-685 de m/z (datos no mostrados).

La figura 10 representa un análisis cabeza a cola de las marcas identificadoras después de la disminución de fuente (PSD) a partir de análisis de MALDI-TOF-EM por separado de extractos de levaduras marcados con δ13C ambiental (12C PSD) y con 13C-saturado (13C PSD). Diferencias de m/z evidentes de iones parentales y fragmentos fueron 15, 10 y 5 uma. La ventana de masa requerida para el aislamiento de iones parentales (± 3 uma) y los análisis PSD subsiguientes no permitieron seguimiento aparte de NAD+ y de NADH a partir de mezclas.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención:

Diseño Experimental

Información de cepa y marcado in vivo

Las cepas de Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MATa; his3a1; leu2a0; met15a0; ura3a0) y BY4742 (MATa; his3a1; leu2a0; lys2a0; ura3a0) se obtuvieron a partir del proyecto de deleción de gen EUROFAN II mundial (colección EUROSCARF, Frankfurt, Alemania, http://www.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col index.html) (Kelly, 2001; Winzeler, 1999). Las cepas se cultivaron durante 16-24 horas en cultivos por lotes de 25-250 ml de medio mínimo definido de síntesis (SD) con suplementado auxotrópico y con glucosa marcada con δ13 ambiental a 20 g I-1 como una fuente de carbono principal (Castrillo, 2003). Para marcar con 13C in vivo se reemplazó glucosa ambiental por U-13C-gIucosa (átomo al 99 %, Isotech Inc., Miamisburg, EE.UU.). Los suplementos auxotrópicos y vitamínicos no se marcaron.

Para el control de los componentes de medio SD residual en preparaciones celulares a partir de cultivos de levaduras los medios contenían lactosa a 4 g I-1 (β-D-galactopiranosil-(1,4)-D-glucosa, Fluka, Buchs, Suiza), que no se utilizan en Saccharomyces cerevisiae.

Preparados celulares a partir de cultivos de levaduras

Para todos los experimentos se tomaron alícuotas de 5 ml de cultivos por lotes de levaduras durante toda una noche a A595 ~ 1,8. Los procedimientos de muestreo fueron: (1) MEOH, desactivación en metanol frío a -50 °C, centrifugación subsiguiente y aspiración de sobrenadante (MEOH) (Castrillo, 2003; González, 1997) con solución de desactivación no tamponada (véase más adelante);

(2) FILTRO, recogida a vacío sobre discos de filtro de membrana hidrófilos de 0,65 μm Durapore PVDF (Millipore GmbH, Schwalbach, Alemania); (3) GIRO, recogida por centrifugación suave y aspiración completa de sobrenadante sin lavado subsiguiente; (4) SPINW, recogida por 2 ciclos de centrifugación suave y lavado repetidos con medios de SD libres de carbohidratos. Todos los procedimientos se llevaron a cabo a 28 °C si no se menciona lo contrario. Las preparaciones celulares bien se procesaron inmediatamente o bien se congelaron de golpe en nitrógeno líquido. El muestreo de rutina era MEOH, si no se indica lo contrario. Según se somete a seguimiento por la molécula rasteadora de lactosa todos los procedimientos de toma de muestras salvo SPINW contenían cantidades bajas de componentes de medios residuales. Se llevaron a cabo experimentos de control con medios de SD recién preparados y se llevaron a cabo análisis del medio libre de células inicial y en el momento de toma de muestras (datos no mostrados).

Preparación de metabolitos de levadura intracelular

Extracción de metanol/cloroformo caliente (15 minutos a 70 °C), fraccionamiento de fase líquida en metanol/agua (1:1, v/v), secado por centrifugación a vacío y tratamiento subsiguiente con reactivos clorhidrato de metoxiamina (MEOX) y N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (MSTFA) para perfiles de metabolito de levadura convencionales se disminuyó de escala como se describe previamente (Wagner, 2003). Para los análisis de CG-TOF-EM de muestras de levaduras se omitió el fraccionamiento líquido por adición de agua al extracto de metanol/cloroformo inicial. En cambio el volumen completo del extracto, ~700 μl, se secó por centrifugación al vacío.

La suplementación de solución de desactivación o de extracción con sistemas tampón recomendados (Castrillo, 2003; González, 1997) para la preparación de metabolitos de levaduras intracelulares conducen a fuertes interferencias de las sustancias tampón con metoxiaminación, sililación, o actuación cromatográfica de las preparaciones de muestra finales. Por lo tanto, las sustancias tamponadoras tuvieron que evitarse para perfil de CG-EM.

Perfiles de metabolitos de proporción de isotopómero C13 (ITR)

Los extractos de metabolitos de levaduras intracelulares a partir de cultivos de δ13C ambiental y de cultivos saturados de 13C se combinaron en cantidades iguales antes de la centrifugación a vacío. El extracto saturado de 13C se trató como un isótopo estable marcado, mezcla estándar interna multiplex. Cada componente de los perfiles de metabolito resultantes se cuantificó por el uso del compuesto saturado de 13C respectivo. Para este propósito se calcularon proporciones de respuesta 12C/13C de pares de fragmentos de isotopómeros preseleccionados (tabla 2). Se asignaron pares de isotopómeros de fragmentos específicos manualmente a cada metabolito identificado o no identificado usando entradas espectrales de masas a partir de la recogida de marcas de metabolitos espectrales de masas (MST; véase más adelante). Antes de formarse respuestas de proporciones de fragmentos saturados de 13C se corrigieron para la contribución de isotopómeros marcados con 13C a preparaciones marcadas con δ13C ambiental.

Tecnologías CG-EM

Se llevaron a cabo perfiles de CG-EM convencionales con un sistema de CG-EM de tipo de cuatro polos, a saber un cromatógrafo de gases GC8000 acoplado a un espectrómetro de masas Voyager, que se operó por programa MassLab (ThermoQuest, Manchester, Reino Unido). Fueron modificaciones al procedimiento de perfiles de CD-EM inicial (Fiehn, 2000a; Fiehn, 2000b), inyección de muestra de 1 μl en modo sin división de flujo, uso de un desnivel de temperatura de 5 °C min-1 con temperatura final ajustada a 350 °C en una columna capilar de Rtx-5Sil EM de 30 m x 0,25 mm de diámetro interno con una columna de seguridad integrada (Restek GmbH, Bad Homburg, Alemania) y el uso de mezclas de alcano para la determinación de índices temporales de retención. Estos cambios reflejan la optimización reciente que se llevó a cabo con un sistema de CG-TOF-EM de Pegasus II (Leco, St. Joseph, EE.UU.). Todos los experimentos de CG-TOF-EM se hicieron en un sistema de CG-TOF-EM de Pegasus II como se detalló anteriormente para un intervalo diverso de muestras vegetales (Wagner, 2003)

Tecnologías de MALDI-TOF-EM

Los extractos de levaduras se analizaron por MALDI-TOF-EM (Voyager DE-PRO Biospectrometry Workstation, Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.) ajustado para detección de ion positiva en modo reflectrón (Lerouxel, 2002). Ajustes para reflectrón MALDI-TOF-EM y PSD fueron como se recomendó por el fabricante. Una matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (10 mg ml-1) se mezcló 1:1 (v/v) con fracciones polares de extractos de levadura o de compuestos puros, que se disolvieron en metanol: agua (1:1, v/v). La cristalización lenta por secado de aire fue esencial para la desorción y la ionización por láser de NAD+ y NADH; las muestras microcristalinas presentaron supresión de señal completa. Un estudio ejemplar usando la misma matriz de MALDI-TOF-EM demostró previamente que MALDI-TOF-EM estandarizada de isótopo estable presentó curvas estándar precisas dos órdenes de magnitud por encima y produjo resultados cuantitativos de acuerdo con análisis cromatográficos de gases en paralelo (Kang, 2001).

Generación de una biblioteca de MST de compendio

MST (Tabla 3) se obtuvo por deconvolución automatizada de cromatogramas CD-TOF-EM (programa ChromaTOF™, LECO, St. Joseph, EE.UU.). Los espectros de masas se recogieron en bibliotecas proporcionadas por NIST98 y programa AMDIS (http://chemdata.nist.gov/mass-spc/Srch_v1.7/index.html y http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/; Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, Gaithersburg, EE.UU.) (Stein, 1999; Ausloos, 1999). MST se anotó manualmente y se corrigió para los errores obvios causados por deconvolución automatizada. Los espectros de masas de baja intensidad y los espectros de masas truncados o condensados que resultaron de co-elución de compuestos se rechazaron salvo para demostración de la presencia de un isotopómero marcado.

Identificación y clasificación de las marcas de metabolitos de espectros de masas (MST)

Se identificaron MST por experimentos de adición estándar supervisados mensualmente con sustancias disponibles comerciales puras. Los criterios requeridos para la identificación de sustancias fueron co-elución cromatográfica y similitud de espectros de masas alta de MST observada en muestras de levaduras para sustancias estándar (Wagner, 2003). La co-elución y la similitud se describieron por índice de tiempo de retención y por valores de coincidencia de espectros de masas, respectivamente. MST no identificadas se analizaron provisionalmente por la mejor coincidencia con una biblioteca de EM ajustada de sustancias estándar y entradas estándar a partir de la biblioteca comercial NIST98 (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, Gaithersburg, EE.UU.). Se han clasificado MST por análisis en racimo jerárquicos aglomerantes usando medida de distancia euclidea y unión promedio (tabla 5, figura 4). Los análisis en racimo se aplicaron a una matriz completa de valores coincidentes de espectro de masas de dos en dos según se describe anteriormente (Wagner, 2003). Se co-clasificaron MST de levaduras y una selección de espectros de masas de EI-TOF a partir de sustancias estándar puras.

Análisis estadísticos y visualización de los perfiles de metabolitos

Los análisis de componentes principales (PCA), la agrupación jerárquica, el cálculo de la distancia euclidiana, del coeficiente de correlación de Pearson y de Kendall y la información mutua se calcularon usando la publicación de edición estándar de paquete de programas informáticos S-Plus 2000 3 (Insightful, Berlín, Alemania), el lenguaje de programación R versión 1.6.1 y 1.6.2 (http://www.r-project.org) y el recurso de la world wide web MetaGeneAlyse

versión 1.3 (http://metaqenealyse.mpimp-qolm.mpq.de/) (Daub, 2003). El modelo para representación de redes metabólicas fue como se sugirió (Jeong, 2000) y la superposición de coeficientes de correlación estuvo de acuerdo con análisis de modularidad en redes metabólicas (Ravasz, 2002). La visualización y el trazado de redes se llevó a cabo usando el algoritmo de Pajek (Batagelj, 1998) disponible en http://vlado.fmf.uni-Ij.si/pub/redes/pajek/.

Cálculo de los perfiles de metabolitos

Cada metabolito se representó por un valor de respuesta único. Dentro de los perfiles de CG-EM se pueden representar metabolitos individuales por derivados múltiples, que se detectan por MST respectivas y cada MST se puede representar por más de un fragmento específico (referido a tabla 2 y figura 1). En estos casos una respuesta de metabolito compuesto aditivo se calculó en lugar de seleccionar una MST única y el fragmento correspondiente.

La respuesta de metabolitos se normalizó a la intensidad de señal promedio de todos los MST, que se observaron dentro de cada cromatograma de CG-EM. Esta estrategia de normalización de datos fue obligatoria antes de la comparación de las tecnologías de muestreo y de los análisis de co-respuesta de metabolitos, porque tecnologías de muestreo variables tuvieron recuperaciones variables y diferentes de células viables a partir del mismo cultivo por lotes. Por ejemplo, cada ciclo de lavado de muestreo de SPINW redujo sucesivamente la recuperación de células viables (datos no mostrados). Los intentos fracasaron para identificar un metabolito constitutivo, que permitiera realizar un seguimiento de forma exacta del número y el tamaño de células de levaduras viables en cada preparación.

Ejemplo 1: Determinación de la extensión de saturación marcando con 13C in vivo

Con el fin de determinar la completitud de marcado con 13C in vivo (saturación), se alimentaron células de levadura (cepa de levadura BY 4741; Kelly, 2001; Winzeler, 1999) con U-13C-glucosa como la única fuente de carbono salvo suplementos auxotrópicos y vitamínicos, es decir, biotina, pantotenato, ácido fólico, inositol, niacina, ácido paminobenzoico, piridoxina, riboflavina, tiamina, bases de nitrógeno de extracto de bacto-levaduras sin aminoácidos, histidina, leucina, metionina, uracilo y sales inorgánicas, es decir, sulfato de amonio, ácido bórico, sulfato de cobre, yoduro de potasio, cloruro férrico, sulfato de manganeso, molibdato de sodio, sulfato de cinc, fosfato potásico, sulfato de magnesio, cloruro sódico, cloruro de calcio que no estaban marcados y extractos de estas células de levadura se examinaron por CG-EM de impacto electrónico convencional para el contenido de diferentes metabolitos. Como se determinó por los perfiles de espectros de masas resultantes, la mayoría de los metabolitos detectables a partir de las células de levadura estuvo marcado por completo. En detalle, la composición de (δ13C)isotopómeros de carbono 12C/13C ambiental (es decir, que se da en la naturaleza) se encontró para uracilo, metionina, histidina, ácido nicotínico e inositol en extractos preparados a partir de cultivos suplementados con U-13Cglucosa. Se observaron frecuentemente leucina y ácido pantoténico no marcados, sin embargo estos metabolitos solamente fueron abundantes a niveles cercanos a los límites de detección. Otras vitaminas abarcadas por medios SD, por ejemplo biotina, ácido fólico, ácido p-aminobenzoico, piridoxina, riboflavina y tiamina, estuvieron por debajo del límite de detección o no fueron accesibles por tecnología CG-EM.

Además, homocisteína e inositol-fosfato se detectaron desprovistos de re-marcado. Un conjugado de inositol todavía no identificado que presenta similitud alta con galactinol se marcó parcialmente y uridina llevó 5 átomos 13C de 9 posibles. Estos hallazgos indican: (1) síntesis de homocisteína de metionina por 5-metiltetrahidropteroiltri-Lglutamato: L-homocisteína-S-metiltransferasa (EC 2.1.1.14; MET6), (2) una ruta de inositol a inositol-fosfato posiblemente a través de actividad de fosfatidilinositol sintasa (2.7.8.11; PIS) y de fosfolipasa C (3.1.4.11; PLC1) y

(3) uracilo desoxidado por acción de uracilo-fosforribosiltransferasa (EC 2.4.2.9; FUR1) y de fosfatasa subsiguiente.

Ejemplo 2: “Marcado inverso" de células de levadura

La suplementación de L-lisina de cepa de levadura BY 4741 se probó en cultivos saturados de 13C. Lisina es la sustancia marcadora auxotrópica complementaria de la segunda cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 usada por el proyecto de deleción de genes mundial EUROFAN II (Kelly, 2001; Winzeler, 1999). Se suprimió el marcado con 13C en la cepa BY4741 cuando se suplementó con el aminoácido. Además, se acumuló ácido 2-aminoadípico solamente en la cepa BY4742. Este resultado indica que la síntesis bidireccional de L-lisina y la ruta de degradación que comprende las actividades de L-aminoadipato-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.31; lsy2, lys5), NADP+-, sacaropina deshidrogenasa que forma L-glutamato (EC 1.5.1.10; lys9) y NAD+-, sacaropina deshidrogenasa que forma L-lisina (EC 1.5.1.7; lys1) está interrumpida.

Ejemplo 3: Identificación de pares de isotopómeros marcados con 12C y 13C

La identificación fiable de pares de isotopómeros marcados con 12C y 13C que representan el mismo metabolito es un prerrequisito para asegurar perfiles de metabolitos de proporción de isotopómeros (ITR). Los pares de isotopómeros se pueden identificar en base a fragmentación de espectro de masas así como por retención cromatográfica. Los experimentos de CG-EM iniciales demostraron que derivados de compuestos deuterados comercialmente disponibles tuvieron significativamente índices de retención (RI) menores que los compuestos no deuterados. Por ejemplo, 2,3,3,3-D4-alanina (2 TMS), ácido 2,3,3-D3-aspártico (3 TMS), alanina (2,3,3,3-D4 3 TMS), ácido 2,2,3,3D4-succínico (2 TMS), y 2,3,4,4,4,5,5,5-08-valina (2) TMS eluyeron 1,1, 1,8, 2,3, 2,5, y 3,8 unidades de RI antes que sus respectivos isotopómeros no deuterados.

En contraste, compuestos comercialmente disponibles de 13C presentaron solamente cambios menores en RI. Esta observación se confirmó por una selección de 66 marcas de metabolitos de espectros de masas (MST) marcadas con 13C observadas en los perfiles de CG-EM estándar. Este análisis conjunto de MST se seleccionó de acuerdo con pureza de pico espectral de masa alta y de acuerdo con presencia de al menos un fragmento abundante y específico que podría emplearse para cuantificación de iones selectiva y para seguimiento de RI. La selección comprendió derivados de aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares, alcoholes de azúcares, fosfatos de azúcares y un conjunto de 34 MST no identificadas. La lista completa que incluye todos los pares de fragmentos de isotopómeros de CG-EI-EM disponibles y evaluados manualmente se enumera en la tabla 2 (véase más adelante). Rl de compuestos marcados con 13C fue en promedio solamente 0,28 (± 0,53 SD) unidades más pequeña que aquellas de compuestos no marcados. Este ligero cambio de Rl fue equivalente a aproximadamente 0,3 segundos de tiempo de retención.

La interpretación del patrón de fragmentación EI-EM de pares de isotopómeros de δ13C y de 13C permitieron verificación de la identidad de metabolitos. Los espectros de masas de EI típicos de ácido succínico (2 TMS), glicina (3 TMS), y ácido glutámico (3TMS) se muestran en la figura 1. Los análisis de la cabeza a la cola de δ13C ambiental y espectros de masas de 13C-EI permitieron una identificación fácil de pares de fragmento de isotopómeros para usar en perfiles metabólicos ITR. Por ejemplo, ácido glutámico (C5H9NO4) forma un derivado de TMS con la fórmula de suma C14H33NO4Si3 y con un peso molecular de 363. El ion molecular M+, m/z 363, y el fragmento [M-15]+, m/z 348, que se genera por una pérdida neutra típica de radical CH3 a partir de un grupo TMS, corresponden a iones que se caracterizan por m/z 368 y m/z 353 en los que todos los 5 átomos de carbono del ácido glutámico están marcados con 13C. El fragmento [m-117]+, m/z 246, puede compararse con el fragmento de 13C-isotopómero, m/z

250. Estos fragmentos están formados por pérdida neutra de un grupo carboxilo trimetilsililado, que contiene de uno de los 5 átomos de carbono del ácido glutámico. Los fragmentos de M+ y [M-15]+ de ácido succínico de δ13C ambiental y saturado de 13C (2 TMS), glicina (3 TMS) y ácido glutámico (3TMS) se muestran en las entradas de la figura 1. Estos espectros de masas mezclados se obtuvieron a partir de perfiles de metabolitos de 13C-ITR, es decir de análisis combinados de extractos de levaduras de δ13C ambiental y de 13C-saturado en cromatogramas individuales. Los ejemplos elegidos demuestran la necesidad de corregir perfiles de metabolitos de 13C-ITR para abundancia de 13C-isotopómero ambiental, especialmente cuando los fragmentos espectrales de masas disponibles para perfiles de metabolitos de 13C-ITR contienen solamente 1 o 2 átomos de carbono marcados.

Ejemplo 4: Comparación de perfiles de 13C-ITR con perfiles de metabolitos producidos convencionalmente

Los perfiles de metabolitos de 13C-ITR producidos combinando cantidades equivalentes de extractos saturados de δ13C-y de 13C en análisis de CG-EM se compararon con perfiles de CG-EM convencionales, es decir, separados, de los mismos extractos. Se usó para esta comparación el ajuste de las MST de levaduras usadas para esta composición. Cada MST se cuantificó por hasta 3 pares de fragmentos de isotopómeros validados manualmente de la tabla 2 (véase más adelante). Este experimento se llevó a cabo con el fin de establecer si el perfil de metabolito de ITR que utiliza estandarización interna para cada uno de los compuestos marcados con 13C es equivalente al perfil de metabolitos convencional. La última aproximación se mostró previamente operando exitosamente por cuantificación externa (Fiehn, 2000a; Roessner, 2000).

Se hicieron crecer dos cultivos de levaduras de la misma colonia en medio SD líquido. Un cultivo se suplementó con δ13C-glucosa ambiental, el segundo con U-13C-glucosa. Los extractos de estos cultivos se analizaron bien por separado o bien combinados para 13C-ITR antes de derivatización. Un experimento inicial (Exp1) se repitió tomando una segunda muestra a partir del mismo cultivo después de un intervalo temporal de 15 minutos (Exp2).

Se llevaron a cabo dos comparaciones en base a los perfiles de metabolitos resultantes. (1) Comparación de Exp1 con Exp2 demostró la variabilidad analítica, por medio de re-analizar los mismos cultivos (Figuras 2C y 2D). (2) Comparación de las respuestas de CG-EM y de los pares de fragmentos marcado y no marcado mostraron el efecto de saturación con 13C en perfiles metabólicos (Figuras 2A y 2B). Ambas comparaciones se hicieron bien por realización de perfil de metabolito ITR (Figuras 2A y 2C; análisis de ITR CG-EM 06 y 10) o por la realización de perfiles de metabolitos convencionales (Figuras 2B y 2D; análisis de CG-EM de δ13C ambiental 04 y 08; análisis de CG-EM 05 y 09 de 13C-saturado). Los análisis de CG-EM 04, 05 y 06 representaron Exp1, mientras que los análisis 08, 09, y 10 comprendieron Exp2. Se aplicó a la comparación de los experimentos el coeficiente de correlación lineal de Pearson así como la influencia de saturación de 13 en los perfiles metabólicos demostró la equivalencia de perfil de metabolito de ITR y de perfil de metabolito convencional (figura 2, entrada).

El coeficiente de variación promedio se determinó usando todos los pares de fragmentos que contribuyeron a cada una de las comparaciones. De nuevo los resultados de perfil de metabolito de ITR y de perfil de metabolito convencional fueron equivalentes, sin embargo, los coeficientes de promedio de correlación fueron menores en análisis de perfiles de metabolitos de ITR (figura 2, entrada).

La mayoría de los isotopómeros del cultivo marcado con 13C estaban presentes en cantidades casi iguales a los isotopómeros de 12C del cultivo de δ13C ambiental. La proporción de isotopómeros 12C/13C promedio de todos los pares para el ajuste de prueba completo de MST fue 0,79 (± 0,40 SD). Sin embargo, algunas sustancias presentaron diferencias extremas, variando las proporciones entre 0,01 y 2,98. Estas observaciones indicaron que el proceso de saturación de 13C solo puede alterar los niveles de metabolitos. Por lo tanto, los análisis de perfil de metabolito de ITR de múltiples muestras se estandarizarían por extractos a partir de un cultivo saturado de 13C grande individual y

se corregirían por el error sistemático de marcado con 13C.

Ejemplo 5: Preparación de un compendio de MST

Las compilaciones de MST a partir de muestras biológicas representan un enfoque análogo secuenciando proyectos de marcas de secuencias expresadas (EST). Los autores de la presente invención caracterizaron los metabolitos principales relevantes de muestras de levaduras, espectros de masas obtenidos e índices de tiempo de retención para identificación de metabolitos fiable y finalmente generaron medios para cuantificación relativa de metabolitos específicos.

Recientemente, la tecnología de CG-TOF-EM (van Deursen, 2000; Wagner, 2003) se adaptó a los perfiles metabólicos de levaduras. Los sistemas de CG-TOF-EM de exploración rápida se adecúan de forma ideal para los proyectos de compendios de metabolitos. Estos sistemas permiten deconvolución automatizada y exhaustiva de componentes de espectros de masas a partir de muestras altamente complejas sin intervención del usuario. Además, esta tecnología novedosa combina las ventajas de alta resolución cromatográfica y reproducibilidad con la reproducibilidad y la velocidad de adquisición de tecnología de EM de dispersión no de exploración igualmente altas. Se usó marcado de isótopos estables in vivo facilitando una de las etapas que más tiempo consumen en establecer perfiles de metabolitos de cualquier tipo de muestra biológica dada, es decir la tarea de diferenciar entre MST que se originan a partir de metabolismo de levaduras y MST que representan contaminaciones experimentales. La marca de isótopos estables se introdujo como una fuente de carbono químicamente definida y predominante y se usó detectando todas las conversiones metabólicas que se originan a partir de esta fuente de carbono. La complejidad aparente de los perfiles metabólicos iniciales de extractos polares fue inferior que los perfiles generados por ejemplo a partir de fuentes vegetales. Los autores de la presente invención incrementaron la eficiencia final de análisis de CG-TOF-EM multiparalelos adaptando perfiles metabólicos a extractos de cloroformo y metanol a partir de levaduras que contienen metabolitos lipídicos además de los metabolitos obtenidos por extracción polar como se describe anteriormente. Los intentos adicionales incrementando la cantidad de extracto de levadura a aplicarse a análisis de CG-TOF-EM con el fin de maximizar el número de compuestos sometidos a seguimiento simultáneamente se limitaron a efectos de matriz, que se llevaron a cabo por cuatro compuestos predominantes, ácido fosfórico (3TMS), glicerol (3TMS), glucosa (MX, 5TMS) y trehalosa (8TMS). Los efectos de matriz resultaron (1) a partir de ácido fosfórico en exceso sin extractos, que redujeron la fuerza de sililación del reactivo de MSTFA y (2) a partir de la sobrecarga cromatográfica de derivados que produjeron artefactos de deformación de picos en la proximidad de picos principales. La cantidad final de extracto de levaduras se ajustó evitando estos efectos de matriz (figura 3). Así se incrementó la eficiencia de análisis de CG-TOF-EM multiparalelos, que por el momento es sin introducir prefraccionamiento y protocolos de enriquecimiento que consuman tiempo.

Un compendio de marcas de metabolitos de GC-TOF-EM se compilaron por separado a partir de extractos de levaduras de δ13C ambiental y de levaduras saturadas de 13C a partir de cultivos por lotes durante toda una noche de la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae. Con el fin de obtener muestras diferentes los perfiles de metabolitos de los que se pueden comparar, se aplicaron diferentes protocolos de toma de muestras, a saber desactivación en metanol frío (MEOH), recogida sobre disco de filtro (FILTRO), recogida por centrifugación sin lavado de medios (GIRO) y recogida por ciclos de centrifugación y lavado repetidos (SPINW). El grupo inicial de espectros de masas obtenidos automáticamente se sometió a curado manualmente seleccionando MST de origen metabólico. Los criterios aplicados para curado fueron: aparición repetida del componente de espectro de masas (n > 3), composición de fragmentos reproducibles, señal para ruido > 50 y presencia de un isotopómero 13C coeluyente. Se incluyeron los espectros de masas de derivados de metabolitos desprovistos de carbono y los derivados de metabolitos que se originan a partir de suplementado auxotrópico y de vitaminas de δ13C ambiental. El compendio de MST se representa en la tabla 3.

Ejemplo 6: Identificación y clasificación de MST

Para la identificación de MST, se emplearon algoritmos de coincidencia de espectros de masas, que están contenidos en programa informático de búsqueda y comparación de espectros de masas públicamente disponible (Stein, 1999; Ausloos, 1999). Los procedimientos subyacentes son análogos a aquellos empleados en los análisis de BLAST de EST. Se compararon MST con colecciones de EM comerciales y una biblioteca de EI-TOF-EM a medida. Las mejores coincidencias se asignaron para una identificación preliminar (tabla 3). Sin embargo, la presencia de múltiples isómeros químicos con patrones de fragmentación de espectros de masas casi idénticos se hace necesaria para experimentos de adición estándar con el fin de obtener una identificación precisa. Los autores de la presente invención han muestrado 180 MST (tabla 3) e identificado 78 marcas que representaron 67 metabolitos de levaduras (tabla 1). El intervalo de compuestos identificados comprendió aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares, polioles, purinas y pirimidinas, compuestos fosforilados, ácidos grasos y esteroles (tabla 1).

Se ha establecido previamente una clasificación no sesgada, automatizada de MST (Wagner, 2003). Este enfoque hacia una clasificación de los espectros de masas no sesgada utiliza la observación de que dos espectros de masas del mismo compuesto no solamente coinciden de la mejor manera sino que también tienen valores de coincidencia similares cuando se comparan con otros espectros de masas, incluso altamente diferentes. Este procedimiento de clasificación de MST se aplicó a MST de levadura y se obtuvo un marco de espectros de masas conocido a partir de experimentos de adición estándar. Los autores de la presente invención infirieron 19 grupos de MST a partir de

agrupación jerárquica de aglomeración por enlace promedio de distancias euclidianas y un punto de corte en aproximadamente diversidad al 50 % (figura 4 y tabla 5). Los grupos de MST comprendían alcanos que se incluyeron para estandarización de Rl (grupo 1; 0/7 no se identificaron), di-y tri-sacáridos (grupo 2; 4/17 no se identificaron), piranósidos de hexosa (grupo 3; 8/9 no se identificaron), ácidos hexónicos e inositol (grupo 4; 4/10 no se identificaron), metoxiaminas de aldohexosa (grupo 5; 3/12 no se identificaron), un grupo de MST no identificadas similares a los polioles (grupo 6; 5/5 no se identificaron), y metoxiaminas de cetohexosa y de pentosa (grupo 7; 0/14 no se identificaron), hexitoles, pentitoles y hexonolactonas (grupo 8; 2/19 no se identificaron), un grupo de ácidos cafeoilquínicos estándar (grupo 9; 0/8 no se identificaron), ácidos orgánicos y nucleósidos de purina (grupo 10; 8/34 no se identificaron), polioles C3-C5, hidroxiácidos y azúcares (grupo 11; 9/30 no se identificaron), fosfatos (grupo 12; 9/34 no se identificaron), aminas y aminoácidos con grupo amino primario (grupo 14; 8/26 no se identificaron), ácidos grasos y esteroles (grupo 15; 7/15 no se identificaron), un grupo estándar de ácidos fenilpropanoicos (grupo 16; 0/9 no se identificaron), un grupo heterogéneo de compuestos mayoritariamente cíclicos que comprenden residuos fenil-, indoil-, imidazol-, pirimidina-y purina-(grupo 17; 12/31 no se identificaron) y un grupo dominado por aminoácidos (grupo 18; 9/60 no se identificaron). Grupo 0 (17 MST) y grupo 3 (4 MST) representaron espectros de masas con clasificación poco clara. La mayoría de esos espectros de masas, que representaron compuestos idénticos se encontró que eran vecinos más cercanos o se clasificaron como pertenecientes a las mismas ramas del árbol de agrupación. El espectro de masas de leucina (2TMS) se introdujo por duplicado con el fin de someter a seguimiento la posición de un par de espectros de masas idénticos dentro del árbol de agrupación (figura 4). Algunos MST de levadura de grupo 0, a saber metionina (2TMS), adenina (2TMS) y prolina (2TMS), no se clasificaron como se esperaba. Esta observación fue causada por errores de deconvolución automatizada, debido a la baja abundancia o debido a la co-elución de otras MST. El agrupamiento después de sustitución de la matriz por un valor de coincidencia umbral mínimo permitió agrupación de espectros de masas clasificados erróneamente, menos la clasificación poco conocida de aquellas MST sin similitud alta con otras MST o con EM estándar. Más detallado, preferentemente algoritmos de aprendizaje supervisado aplicados a matrices de valores adecuados así como directamente a espectros de masas y RI conducirán a resultados de clasificación mejorados y más precisos y a solidez incrementada de identificación.

Ejemplo 7: Aplicación de los análisis de perfiles de metabolitos

Los metabolitos están incrustados en una red de reacciones enzimáticas y de transporte rápidas. No inesperadamente, la co-respuesta de metabolitos se descubrió en ajustes de perfiles de metabolito a partir de muestras vegetales. Esta co-respuesta se debatió consecuentemente proporcionando información novedosa sobre mecanismos bioquímicos de interacciones de metabolitos. Debido a que las velocidades de conversiones metabólicas son en general significativamente más altas que las velocidades de recambio de proteínas o de recambio de ARNm, este tipo de análisis depende altamente de una desactivación rápida del metabolismo durante la preparación de la muestra. Sin embargo, la congelación rápida en nitrógeno líquido, que se describe anteriormente que es exitosa para muestras vegetales, no se puede aplicar a cultivos líquidos de levaduras. Por esta razón, se evaluaron cuatro regímenes de toma de muestras distintos. Estos se aplicaron a alícuotas de un cultivo por lotes individual. Las estrategias de toma de muestras son como se describe anteriormente (véase ejemplo 5), a saber, toma de muestras de MEOH, FILTRO, GIRO-y SPINW-por dos ciclos de lavado y centrifugación seguidos de medio SD sin fuente de carbohidratos. La perturbación metabólica inducida por las tecnologías de toma de muestras respectivas se sometió a seguimiento por perfiles de metabolitos de CG-TOF-EM.

Los análisis de componente principal (PCA) de todos los perfiles de metabolitos de CG-TOF-EM demostraron que cada una de las estrategias de toma de muestras mostró características metabólicas específicas (figura 5). La toma de muestras por ciclos repetidos de lavado y centrifugación (SPINW) con medio SD libre de glucosa era distinta de la toma de muestras de GIRO y de otros procedimientos de toma de muestras según se describen por el componente principal 1, que comprendía la mayor parte de la varianza, 57,4 %, de este experimento. El componente 2, que tenía el 24,2 % de varianza total, tomó muestras por centrifugación, es decir GIRO y SPINW, por separado, de otras tecnologías de toma de muestras. El componente 3 que comprende el 6,4 % de la varianza total aún permitió separación de muestras de MEOH y de filtro. Todos los componentes principales subsiguientes fueron de valor descriptivo bajo con respecto al efecto de las cuatro tecnologías de toma de muestras. Los análisis de las primeras tres cargas de componentes mostraron que lisina, asparragina, leucina, homoserina, metionina, arabinosa, glicerol, ácido octadecanoico, y 15 MST no identificadas contribuyeron enormemente a la varianza introducida por la elección de perturbación experimental.

Todos los procedimientos de muestreo probados tenían un intervalo similar de reproducibilidad según se indicó por la desviación estándar relativa promedio (RSD) de todas las medidas de metabolitos replicadas (figura 5). Sin embargo, la reproducibilidad de medidas de metabolitos fueron en algunos casos mucho más bajas que las observadas en muestras de plantas. Por ejemplo, el procedimiento más ampliamente aceptado, es decir la toma de muestras de cultivos de levaduras en metanol frío (MEOH), presentó variación alta para ácido aspártico y ácido glutámico, RSD del 67,2 % y del 91,6 %, respectivamente. Esta varianza alta no fue causada por una tendencia a lo largo del tiempo de muestreo o por análisis de CG-TOF-EM. En cambio, los autores de la presente invención han demostrado que otras estrategias de toma de muestras permitieron medidas altamente reproducibles de estos compuestos, y se indicaron por ejemplo por RSD del 18,0 % con ácido aspártico después de toma de muestras de FILTRO y por RSD del 7,0 % con ácido glutámico después de toma de muestras de SPINW.

Los datos proporcionados en el presente documento apuntan a la conclusión de que algunas reservas de metabolitos estuvieron en transición rápida durante la toma de muestras o entre las tomas de muestras. Con respecto a algunos metabolitos, por ejemplo ácido aspártico (figura 7a) y ácido glutámico, la toma de muestras de GIRO rápido fue altamente similar a la toma de muestras de MEOH en mostrar rápidamente reservas de metabolitos. Finalmente, las técnicas de toma de muestras más lentas, como FILTRO y SPINW, permiten aparentemente ajuste de reservas de metabolitos estables antes de la toma de muestras.

Ejemplo 8: Análisis de co-respuesta a metabolito

Los análisis presentados en el ejemplo 7 parecen reflejar los tamaños de reservas que cambian rápidamente de algunos metabolitos. Así, las perturbaciones metabólicas, que estaban causadas por los procedimientos de toma de muestras, se emplearon con el fin de ganar conocimiento de metabolitos/interacciones de metabolitos. Se aplicaron cuatro medidas de co-respuesta, a saber coeficiente de correlación de Pearson, coeficiente de correlación de Kendall, información mutua (Steuer, 2002) y distancia euclidiana, caracterizando todas las combinaciones de metabolitos por pares.

El coeficiente de correlación de Pearson y el coeficiente de correlación de Kendall se aplicaron rastreando corespuesta lineal, que se comunicó que prevalecía en análisis similares de plantas. La combinación de ambas pruebas paramétricas y no paramétricas permitió una evaluación preliminar de la importación de medidas periféricas en cada co-respuesta de metabolitos. Solamente una fracción pequeña de co-respuestas de metabolitos lineales patentes estuvo causada por medidas de metabolitos periféricas (figura 6C). Cuando se comparan los coeficientes de correlación de Kendall y de Pearson, que se aplicaron a los mismos pares de metabolitos, los autores de la presente invención observaron una relación sigmoidea con correlación lineal positiva y negativa distribuida casi equitativamente. Un ejemplo típico de una co-respuesta lineal negativa que se refiere al par de metabolitos glicina/uracilo se muestra en la figura 6C.

Información mutua de pares de metabolitos trazada sobre el coeficiente de correlación de Kendall muestra un mínimo al final del coeficiente de correlación de Kendall, a cero. La medida de información mutua confirmó la corespuesta lineal positiva y negativa. Además, los pares de metabolitos seleccionados con información mutua alta y con coeficiente de correlación de Kendall baja permiten discriminar co-respuesta no lineal o, como se muestra para glicina y alanina (Figura 6B), co-respuesta de metabolito lineal condicional.

La distancia euclidea demostró ser una medida aparentemente independiente de correlación lineal (Figura 6A) o de información mutua (datos no mostrados). La distancia euclidea, sin embargo, fue muy eficaz en seleccionar corespuestas de metabolitos que presentaron varianza baja de ambos metabolitos.

Puesto que cada una de las medidas de correlación tuvo propiedades diferentes, se hace abstención en el presente trabajo de clasificación de metabolitos libres de hipótesis global por análisis de racimo en base a cualquier distancia individual medida. En lugar de seleccionando intermedios y productos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, los autores de la presente invención plantearon la pregunta como si los metabolitos de una ruta común pudieran estar correlacionados. Ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido aspártico, y ácido cítrico estaban cubiertos porel análisis de los cultivos de levaduras CG-TOF-EM presentadas en el presente documento. Ácido aconítico, ácido isocítrico y ácido 2-oxoglutárico pueden analizarse por perfiles de CG-TOF-EM pero estaban por debajo de los límites de detección en este experimento. En una primera aproximación, los autores de la presente invención se centraron en aquellas co-respuestas de metabolitos que se refieren a vínculos directos por reacciones bioquímicas (figura 7). Se observaron correlaciones altamente lineales para ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico, que se mantuvieron a lo largo de todos los tipos de toma de muestras (figuras 7C y 7D). En cambio, ácido málico y ácido cítrico o ácido aspártico, respectivamente, adoptaron aparentemente estados específicos de toma de muestras (figuras 7A y 7B). Estos estados fueron bien lineales (figuras 7A y 7B; subgrupo de FILTRO) o de naturaleza altamente variable y no lineal. Otros metabolitos, que se sabe que están directamente vinculados entre sí por reacciones bioquímicas, también se encontró que estaban correlacionados, por ejemplo lanosta-8,24-dien-3-beta-ol y ergosterol, glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato, o ácido hexadecanoico y ácido octadecanoico.

Además, las interacciones que no siguieron definiciones de rutas clásicas se encontraron en el grupo de datos de co-respuestas de metabolitos. Por ejemplo, los autores de la presente invención seleccionaron un grupo de metabolitos correspondientes a partir de una ruta bioquímica de interés, a saber ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico y buscaron vecinos más cercanos comunes. Los 3 vecinos más cercanos de este grupo de ácidos orgánicos fueron ácido glicérico y dos metabolitos no identificados según se judga por coeficiente de correlación de Kendall positivo, además lisina, glicina y ácido glutámico estaban más distantes según se judga por coeficiente de correlación de Kendall negativo. Una visión general de este análisis se muestra como una representación de red (figura 8).

Ejemplo 9: Perfil de metabolitos de 13C-ITR por espectrometría de masas MALDI-TOF

Se mostró que el perfil de metabolitos por GC-TOF-EM abarca aproximadamente el 11 % de los 584 metabolitos de levaduras que se predijeron por reconstrucción a escala genómica (Forster, 2003). Sin embargo, este enfoque está restringido principalmente por el alcance limitado de la tecnología CG-TOF-EM. La prevalencia de clases de

compuestos específicas con propiedades comunes es inherente a esta así como a cualquier otra tecnología analítica. Por esta razón, se ha demostrado en relación con la presente invención que el perfil de metabolitos usando marcado in vivo con 13C puede ampliarse a MALDI-TOF-EM. MALDI-TOF-ES representa una tecnología de los espectros de masas, que (1) no puede basarse en cromatografía para la confirmación de identidad, (2) es altamente sensible a efectos de supresión de matriz durante la desorción y durante la ionización láser y (3) no es adecuada para calibración cuantitativa externa. Sin embargo, el uso de MALDI-TOF para cuantificación con sustancias estándar internas que están marcadas con isótopos estables es un procedimiento aceptado en relación con análisis de flujo de metabolitos (Wittmann, 2002; Wittmann, 2001). Mediante nicotinamida adenina dinucleótido (NADH; C21H29N7O14P2), se eligió un co-factor metabólico ubícuo que permitió la demostración de prerrequesitos esenciales para el enfoque de 13C-ITR.

Los extractos de levadura se trataron como se describe anteriormente (véase ejemplo 4) proporcionando muestras de un tercer experimento (Exp3). Estas muestras se recogieron cada una a partir de los mismos cultivos por lotes. Se analizaron extractos con composición de δ13C ambiental, extractos con metabolitos saturados de 13C y una mezcla a partes iguales de ambos extractos. El rastreo de los espectros de MALDI-TOF a partir del extracto de δ13C ambiental reveló iones moleculares protonados de NAD+ y NADH a m/z 664,11 y m/z 666,13, así como aductos de sodio a m/z 686,09 y 688,12 (figura 9). Estas identificaciones estaban respaldadas por preparaciones comerciales de NAD+ y NADH. La resolución de masas del sistema de MALDI-TOF no permitió separación del ion de 12C-NADH mono-isotópico a partir del isotopómero A+2 de NAD+ ambiental. Por lo tanto, de manera similar a la cuantificación de glicina (3TMS) (figura 1), se requerirá la conexión para la determinación de NADH en presencia de NAD+. Además, MALDI-TOF generó un marco de señales espaciadas uniformemente continuas (figura 9).

Dentro de la muestra mezclada (figura 9, entrada), los autores de la presente invención encontraron isotopómeros de los iones moleculares protonados de NAD+ y NADH, que contenían 15 átomos de 13C de 21 átomos de carbono presentes en NAD(H). Estaban presentes cantidades pequeñas de aductos de sodio marcados (datos no mostrados). La presencia de solamente 15 átomos de carbono marcados estuvo de acuerdo con la incorporación de restos de nicotinamida no marcados en NAD(H), que se originan a partir del suplemento vitamínico de ácido nicotínico contenido en el medio SD de levaduras. La presencia de ácido nicotínico no marcado (C6H5NO2) en extractos de levadura marcados con 13C se demostró anteriormente (ejemplo 1).

La identificación de NAD(H) dentro de los extractos de levadura se confirmó por los rastros identificativos de disminución de la fuente posterior (PSD) del racimo de iones moleculares protonados que se registraron por separado a partir de los extractos de levaduras de δ13C ambiental y saturado con 13 (figura 10). De manera similar a la comparación de patrón de fragmentación de CG-EI-EM de isotopómeros (figura 1), los análisis de cabeza a cola de los rastros identificativos de PSD permiten la verificación de la elección correcta de pares de isotopómeros. Además, los análisis de fragmentos de la 12C-PSD y la 13C-PSD revelaron la pérdida sucesiva de tres restos que contenían 5 átomos de carbono cada uno, a saber dos unidades de ribosa y un elemento constitutivo de la adenina, como se indicó por diferencias de masas de 5, 10 y 15, respectivamente. Debido a la resolución restringida de de los análisis de PSD, no pudieron obtenerse a partir de mezclas los rastros identificativos separados de los iones protonados de NAD+ y NADH. Sin embargo, las preparaciones comercialmente disponibles de NAD+ y NADH indicaron que algunos fragmentos de PSD, por ejemplo el fragmento m/z 649,4 [M-17]+, fueron altamente específicos. El fragmento m/z 649,4 puede resultar de pérdida neutra facilitada de NH3 a partir del ion molecular de NADH protonado. Las preparaciones de MALDI-TOF de NAD+ comercialmente disponibles presentaron cantidades variables de NADH principalmente en forma de un ion m/z 666,13, mientras que NAD+ no fue detectable en preparaciones de NADH. Este último hallazgo indicó que el procedimiento de MALDI-TOF elegido genera un ambiente reductor para análisis químicos que requiere seguimiento.

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Wittmann, C. y Heinzle E. Application of MALDI-TOF MS to lysine-producing Corynebacterium glutamicum. A novel approach for metabolic flux analyses. Eur. J. Biochem. 268, 2441-2455 (2001).

-

Wittmann, C. Metabolic flux analyses using mass spectrometry. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 74, 39-64 (2002).

Tabla 1

Tabla de metabolitos de levaduras, que estaban representados por al menos una marca de los espectros de masas (MST). La identificación de MST se llevó a cabo por los experimentos de adición estándar. La identificación incluyó co-elución, similitud de masa espectral y presencia de isotopómeros marcados de forma diferencial.

Aminoácidos Ácidos grasos

Ácido 2-aminoadípico Ácido 9-(Z)-octadecenoico Alanina Ácido hexadecanoico Arginina Ácido octadecanoico Asparragina Ácido octadecenoico Ácido aspártico Cisteína Esteroles Ácido glutámico Ergosterol Glutamina Lanosta-8,24-dien-3-beta-ol Glicina Histidina Azúcares Homocisteína alfa-D-metilglucopiranósido Homoserina Arabinosa Isoleucina Ribosa Leucina Fructosa Lisina Fucosa Metionina Glucosa Ornitina Isomaltosa Fenilalanina Manosa Prolina Trehalosa Ácido piroglutámico Serina Polioles

Treonina Eritritol Triptófano Glicerol Tirosina mio-inositol Valina Manitol

Ribitol

Ácidos orgánicos Sorbitol Ácido citramálico Ácido cítrico Fosfatos Ácido eritrónico Fructosa-6-fosfato Ácido fumárico Glucosa-6-fosfato Ácido glucónico Galactosa-6-fosfato Ácido glicérico Ácido glicérico-3-fosfato Ácido málico Glicerol-2-fosfato Ácido pantoténico Glicerol-3-fosfato Ácido succínico Ácido fosfórico

Varios

Adenina Etanolamina Ácido nicotínico Uracilo Urea

Tabla 2

La tabla incluye todos los pares de fragmentos de isotopómeros de CG-EI-EM evaluados de derivados de metabolitos identificados y no identificados usados para perfil de metabolitos de 13. La tabla comprende los nombres de los derivados de metabolitos o de las coincidencias mejores, identificador de espectro de masas (EM-ID) para referir de forma cruzada con tabla 3, proporción masa frente a carga (M/Z) que caracteriza los pares de isotopómeros de fragmentos e índices de desviación de índices de tiempos de retención (ΔRI).

Tabla 3

Archivo de datos en el formato *..mspa que contiene todos los espectros de masa de CG-EI-TOF-EM curados de MST de extractos de la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae.

El nombre del espectro se designa para permitir clasificar de acuerdo con isotopómero, índice de tiempo de retención, experimento y nombre, por ejemplo 2C_1625.9_1274EC17_Ácido glutámico (3TMS) or 12C_1802.0_1313EC75_1706; Xilitol (5TMS)]. Los índices de tiempo de retención son como se observan en el experimento indicado. Los nombres representan identificaciones por co-elución y ajuste de espectros de masasb; los nombres entre paréntesis indican compuestos no identificados e incluyen la mejor coincidencia de espectros de masas. El campo ID químico se usa para espectros de masas de isotopómeros de grupo por un ID de espectro de masas común (EM-ID), por ejemplo 163001-10-1 y 163001-11-1 representan isotopómeros de δ13C ambiental y saturados con 13C de ácido glutámico (3TMS).Este identificador no representa un número de registro de CAS. El formato de este campo se predefine por programa AMDIS.

a El formato de fichero *.msp puede ser importado en programas de comparación de espectros de masas NIST98 y NIST02 (para descargarse de http://chemdata.nist.gov/masa-spc/Srch_v1.7/index.html o programa AMDIS (para descargarse de http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/).

b Se marcaron los subproductos observados en preparaciones de sustancias de referencia (BP).

Tabla 5

Tabla de MST identificadas y no identificadas a partir de extractos de la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae y de compuestos estándar puros. MST se clasificarán en grupos por agrupación jerárquica de la matriz simétrica completa de valores de coincidencia de espectros de masas por pares (tabla 4). El árbol de agrupación resultante se muestra en la figura 4.

Tabla 2

DERIVADO [MEJOR COINCIDENCIA, NOMBRE]

EM-ID PÁR DE ISOTOPÓMEROS M/Z ΔRI

Alanina (2TMS)

110001 116_118 190_192 218_221 0,00 0,00 0,18

Glicina (3TMS)

133001 174_175 248_249 276_278 0,00 0,00 0,36

Treonina (2TMS)

132001 117_119 248_249 276_278 0,57 0,93 -0,75

Alanina (3TMS)

138002 188_190 100_102 262_264 0,00 0,00 0,18

Serina (3TMS)

138001 204_206 0,30

Ácido aspártico (3TMS)

152002 232_235 292_294 306_309 0,00 0,00 0,25

Ácico piroglutámico (2TMS)

153002 156_160 230_234 258_263 0,00 0,23 0,23

Ácido glutámico (3TMS)

163001 246_250 128_131 230_274 0,23 0,00 0,23

Fenilalanina (2TMS)

164001 218_220 192_200 266_274 0,45 0,45 0,23

Asparragina (3TMS)

168001 116_118 0,00

Ornitina (3TMS)

176006 174_175 348_353 0,23 0,00

Ornitina (4TMS)

182002 142_146 174_175 420_425 0,00 0,23 0,00

Arginina (5TMS)

183001 157_161 256_261 373_379 0,25 0,20 0,43

Tirosina (2TMS)

189006 179_186 91_98 0,25 0,71

Lisina (4TMS)

192003 156_161 174_175 317_322 1,67 0,00 0,27

Lisina (3TMS)

186002 174_175 200_206 258_264 0,00 0,00 0,00

Tirosina (3TMS)

194002 218_220 280_288 354_362 0,58 0,00 0,00

Glicerol

129003 218_221 280_288 354_262 0,00 0,20 0,00

Metoxiamina fructosa (5TMS)

187002 217_220 307_310 0,23 0,45

Metoxiamina fructosa {BP} (5TMS)

188004 307_310 217_220 0,96 0,00

Metoxiamina manosa (5TMS)

188002 205_207 217_220 319_323 0,23 0,00 0,23

Metoxiamina glucosa (5TMS)

189002 364_368 343_349 291_294 -0,06 0,24 0,00

(continuación)

DERIVADO [MEJOR COINCIDENCIA, NOMBRE]

EM-ID PÁR DE ISOTOPÓMEROS M/Z ΔRI

Metoxiamina glucosa {BP} (5TMS)

191001 364_368 343_349 291_294 1,12 1,97 1,39

Manitol (6TMS)

193002 217_220 319_323 1,06 0,00

Sorbitol (6TMS)

193001 217_220 319_323 0,00 0,00

Trehalosa (8TMS); alfa-D-Glc(1,1)-alfa-D-Glc

274002 451_457 243_248 435_441 3,32 3,28 3,32

Ácido succínico (2TMS)

134001 247_251 172_176 248_252 0,18 0,55 0,67

Ácido citramálico (3TMS)

148001 115_118 247_251 259_264 0,39 0,39 0,20

Ácido málico (3TMS)

149001 233_236 245_249 335_339 0,00 0,39 0,18

Ácido cítrico (4TMS)

182004 273_278 247_352 465_471 0,23 0,23 0,23

Glicerol-3-fosfato (4TMS)

177002 455_448 0,10

Metoxiamina fructosa-6fosfato (6TMS)

232002 217_220 459_462 0,00 0,00

Metoxiamina glucosa-6fosfato (6TMS)

233002 471_475 160_162 -0,32 0,32

[644; 2-metil-1,3-butanodiol (2TMS)]

140003 117_119 306_309 0,00 0,36

[700; 2-metil-1,2-propanodiol (2TMS)]

141003 131_134 292_294 277_279 0,00 0,00 0,36

[725; ácido 2-cetooctanoico (2TMS)]

146003 185_191 212_219 287_294 0,18 0,36 0,18

[545; ácido 2,3dimetilsuccínico (2TMS)]

149003 291_298 275_281 207_209 0,18 0,18 0,18

[815; etil-3(2H)-tiofenona]

150003 128_131 0,14

[729; éster metílico de N,Ndimetilisina]

151003 128_131 84_88 0,71 0,00

[680; ácido 2,3dimetilsuccínico (2TMS)]

158003 287_294 377_384 0,45 0,23

[882; ornitina (3TMS)]

162001 142_146 348_353 115_117 0,00 0,43 0,00

[548; leucina (2TBS)]

165002 315_320 200_203 330_335 0,00 0,00 -0,25

[612; ácido 4-aminobutírico (2TBS)]

175003 112_118 274_280 376_383 0,23 0,25 0,58

[636; 4R-acetamido-2,3-(Z)epoxi-4-(E)-hidroxiciclohexano (1TMS)]

176005 184_189 0,23

[829; ácido orótico (3TMS)]

176003 254_258 357_362 269_274 0,25 0,00 -0,23

[757; dimetoxiamina 2-desoxipentos-3-ilosa (2TMS)]

176004 231_235 315_321 0,00 0,61

(continuación)

DERIVADO [MEJOR COINCIDENCIA, NOMBRE]

EM-ID PÁR DE ISOTOPÓMEROS M/Z ΔRI

[812; D-xilofuranosa (4TMS)]

177004 305_308 -0,15

[731; eritrosa (3TMS)]

184003 117_119 217_220 204_206 0,23 0,23 0,45

[826; éster metílico del ácido beta-[[(5-metil-2tienil)metileno]bencenoacético]

187004 241_245 431_437 153_157 0,20 0,00 0,23

[772; D-glucosa (5TMS)]

189005 204_206 0,10

[793; D-galactono-1,4-lactona (4TMS)]

196004 217_220 243_248 361_367 0,00 0,00 0,55

[945; beta-D-glucopiranosa (5TMS)]

197002 191_192 204_206 217_220 0,00 0,00 0,00

[775; dopamina (4TMS)]

200002 174_175 317_324 169_174 0,00 0,55 0,55

[680; glicerol-2-fosfato (4TMS)]

203004 243_248 258_263 319_323 0,58 0,58 0,85

[766; beta-Dmetilglucopiranósido (4TMS)]

203003 204_206 259_264 319_323 0,00 0,00 0,00

[607; putrescina (4TMS)]

204003 375_379 -0,18

[756; beta-Dmetilglucopiranósido (4TMS)]

209004 204_206 319_323 243_248 0,27 0,27 0,55

[662; metoxiamina ribosa-5fosfato {BP} (5TMS)]

211004 299_299 315_315 0,00 0,00

[648; etilamina (2TMS)]

216002 174_175 217_220 345_349 0,00 0,00 -0,27

[705; ácido 2-cetoglucónico (5TMS)]

217002 437_442 257_262 217_220 0,00 0,00 0,27

[733; treitol (4TMS)]

218001 217_220 0,27

[715; eritritol (4TMS)]

226001 373_382 217_220 0,46 0,32

[945; uridina (3TMS)]

248002 217_220 259_264 0,32 0,32

[644; eritritol (4TMS)]

252002 446_454 217_220 0,64 0,00

[895; metoxiamina (8TMS)]

281001 204_206 361_367 0,32 0,32

[542; metoxiamina maltosa {BP} (8TMS)]

282003 204_206 0,80

Tabla 3

NOMBRE: 13C_1731.2_1313ecll_Ribitol (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 173001-11-1 RI: 1731 T.R.: 10,550 NÚMERO DE PICOS: 41

NOMBRE: 13C_1318.4_1313ec16_Prolina (2TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 132003-11-1 RI: 1318 T.R.: 6,620 NÚMERO DE PICOS: 19

NOMBRE: 13C_1318. 9_1313EC16_Treonina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 132001-11-1 RI: 1319

20 T.R.: 6,627 NÚMERO DE PICOS: 58

NOMBRE: 13C_1413.9_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 141004-11-1 RI: 1414 T.R.: 7,745 NÚMERO DE PICOS: 27

NOMBRE: 13C_1420.9_1313ec16_Alanina {BP} (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 142001-11-1 RI: 1421 T.R.: 7,827 NÚMERO DE PICOS: 34

15 NOMBRE: 13C_1489.8_1313EC16_Ácido Málico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 149001-11-1 RI: 1490 T.R.: 8,637

20 NÚMERO DE PICOS: 59

NOMBRE: 13C_1495.3_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 150003-11-1 RI: 1495 T.R.: 8,703 NÚMERO DE PICOS: 52

NOMBRE: 13C_1521.6_1313EC16_Ácido aspártico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 152002-11-1 RI: 1522

10 T.R.: 8,925 NÚMERO DE PICOS: 74

NOMBRE: 13C_1594.8_1313EC16_

15 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 159001-11-1 RI: 1595 T.R.: 9,493 NÚMERO DE PICOS: 33

NOMBRE: 13C_1630.8_1313ec16_Ácido glutámico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 163001-11-1 RI: 1631 T.R.: 9,772 NÚMERO DE PICOS: 83

NOMBRE: 13C_1640.6_1313ec16_Fenilalanina (2TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 164001-11-1 RI: 1641 T.R.: 9,848 NÚMERO DE PICOS: 69

NOMBRE: 13C_1707.8_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 171003-11-1 RI: 1708 T.R.: 10,369 NÚMERO DE PICOS: 168

NOMBRE: 13C_1720.2_1313EC16_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 172005-11-1 RI: 1720

T.R.: 10,465 NÚMERO DE PICOS: 47

5 NOMBRE: 13C_1746. 9_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 175003-11-1 RI: 1747 T.R.: 10,672

10 NÚMERO DE PICOS: 13

NOMBRE: 13C_1769.9_1313ec16_Glicerol-3-fosfato (4TMS)

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 177002-11-1 15 RI: 1770

T.R.: 10,850

NÚMERO DE PICOS: 108

NOMBRE: 13C_1771.0_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 177003-11-1. RI: 1771 T.R.: 10,859 NÚMERO DE PICOS: 41

10 NOMBRE: 13C_1784.2_1313ec16_Glutamina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 178001-11-1 RI: 1784 T.R.: 10,961

15 NÚMERO DE PICOS: 88

NOMBRE: 13C_1821.6_1313ec16_Ornitina (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 182002-11-1 RI: 1822 T.R.: 11,252 NÚMERO DE PICOS: 70

NOMBRE: 13C_18 2 9. 5_1313ec16_Arginina (5TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 183001-11-1 RI: 1830 T.R.: 11,313 NÚMERO DE PICOS: 91

NOMBRE: 13C_1835.5_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 184003-11-1 RI: 1836 T.R.: 11,359 NÚMERO DE PICOS: 91

NOMBRE: 13C_1843.2_1313EC16_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 184004-11-1 RI: 1843 T.R.: 11,419 NÚMERO DE PICOS: 29

NOMBRE: 13C_1870.4_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 187004-11-1 RI: 1870 T.R.: 11,629 NÚMERO DE PICOS: 85

NOMBRE: 13C_1879.2_1313ec16_Adenina (2TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 188005-11-1 RI: 1879 T.R.: 11,698 NÚMERO DE PICOS: 8

NOMBRE: 13C_1892.4_1313ec16_Tirosina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 189006-11-1 RI: 1892

20 T.R.: 11,800 NÚMERO DE PICOS: 102

NOMBRE: 13C_1940.3_1313EC16_Tirosina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 194002-11-1 RI:1940 T.R.: 12,115 NÚMERO DE PICOS: 99

NOMBRE: 13C_1294.2_1313ECll_Glicerol (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 129003-11-1 RI: 1294 T.R.: 6,336

NÚMERO DE PICOS: 46

NOMBRE: 13CJL326. 8_1313ECll_Glicina (3.TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 133001-11-1 RI: 1327 T.R.: 6,720 NÚMERO DE PICOS: 59

10 NOMBRE: 13C_1340.7_1313ECll_Ácido succínico (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 134 001-11-1 RI: 1341 T.R.: 6,883

15 NÚMERO DE PICOS: 25

NOMBRE: 13C_1380.4_1313ECll_Alanina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 138002-11-1

20 RI: 1380 T.R.: 7,350

NÚMERO DE PICOS: 50

NOMBRE: 13C_1381.6_1313ECll_Serina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 138001-11-1 RI: 1382 T.R.: 7,365 NÚMERO DE PICOS: 58

10 NOMBRE: 13C_1405.3_1313EC1l_Treonina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 140001-11-1 RI: 1405 T.R.: 7,644

15 NÚMERO DE PICOS: 71

NOMBRE: 13C_1411.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 141003-11-1 RI: 1411 T.R.: 7,711 NÚMERO DE PICOS: 27

NOMBRE: 13C_14 4 0. 4_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 144003-11-1 RI: 1440 T.R.: 8,056 NÚMERO DE PICOS: 54

NOMBRE: 13C_1458.8__1313ECll_Homoserina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 146001-11-1 RI: 1459

20 T.R.: 8,273 NÚMERO DE PICOS: 67

NOMBRE: 13C_14 64.4_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 146003-11-1 RI: 1464 T.R.: 8,339 NÚMERO DE PICOS: 50

NOMBRE: 13C_14 67,2_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 147003-11-1 RI: 1467 T.R.: 8,372 NÚMERO DE PICOS: 57

NOMBRE: 13C_1473.2_1313EC11_

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 147002-11-1 RI: 1473 T.R.: 8,442 NÚMERO DE PICOS: 64

NOMBRE: 13C_1481.0_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 148002-11-1

10 RI: 1481 T.R.: 8,534 NÚMERO DE PICOS: 16

NOMBRE: 13C_1503.6_1313ECll_Eritritol (4 TMS)

15 COMENTARIOS: Kopka, J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 150002-11-1 RI: 1504 T.R.: 8,786 NÚMERO DE PICOS: 56

NOMBRE: 13C_1506.4_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 151002-11-1 RI: 1506 T.R.: 8,808 NÚMERO DE PICOS: 68

NOMBRE: 13C_1513.8_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 151003-11-1 RI: 1514 T.R.: 8,865 NÚMERO DE PICOS: 67

NOMBRE: 13C_1528.8_1313ECll_ácido piroglutámico (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 153002-11-1 RI: 1529

20 T.R.: 8,981 NÚMERO DE PICOS: 56

NOMBRE: 13C_1537.7_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 154002-11-1 RI: 1538 T.R.: 9,050 NÚMERO DE PICOS: 66

NOMBRE: 13C_1561.l_1313ECll_Fenilalanina (1TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 157001-11-1 RI: 1561 T.R.: 9,232 NÚMERO DE PICOS: 85

NOMBRE: 13C_1575.2_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 157002-11-1 RI: 1575 T.R.: 9,341 NÚMERO DE PICOS: 57

NOMBRE: 13C_1580.5_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 158002-11-1 RI: 1581

T.R: 9,382 NÚMERO DE PICOS: 104

NOMBRE: 13C_1581.9_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 158003-11-1 RI: 1582 T.R.: 9,393 NÚMERO DE PICOS: 86

NOMBRE: 13C_1623.1_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 162001-11-1 RI: 1623 T.R.: 9,712 NÚMERO DE PICOS: 90

NOMBRE: 13C_1652.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 165002-11-1 RI: 1652 T.R.: 9,937 NÚMERO DE PICOS: 30

10 NOMBRE: 13C_1659.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 166002-11-1 RI: 1659 T.R.: 9,991

15 NÚMERO DE PICOS: 24

NOMBRE: 13C_1670.3_1313ECll_metoxiamina arabinosa (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1670 RI: 1670 RI: 1670 Número de CAS: 167002-11-1

20 RI: 1670 T.R.: 10,078

FUENTE: C:\KOPKA\AMDIS32\LIB\File2.msp NÚMERO DE PICOS: 63

NOMBRE: 13C_1683.3_1313ecll_Asparragina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 168001-11-1 RI: 1683 T.R.: 10,179 NÚMERO DE PICOS: 90

10 NOMBRE: 13C_1713.4_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1713 RI: 1713 Número de CAS: 171008-11-1 RI: 1713 T.R.: 10,412

15 FUENTE: C:\KOPKA\AMDIS32\LIB\File2.msp NÚMERO DE PICOS: 115

NOMBRE: 13C_1758.0_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 176005-11-1 RI: 1758 T.R.: 10,758 NÚMERO DE PICOS: 108

NOMBRE: 13C_1763.8_1313ECll_Ornitina (3TMS); Arginina {BP} (3TMS) 10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 176006-11-1

RI: 1764 T.R.: 10,803 NÚMERO DE PICOS: 81

5 NOMBRE: 13C_1774.2_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 177004-11-1 RI: 1774 T.R.: 10,884

10 NÚMERO DE PICOS: 50

NOMBRE: 13C_1794,5_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 179002-11-1

15 RI: 1795 T.R.: 11,041 NÚMERO DE PICOS: 162

NOMBRE: 13C_1809.0_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 181005-11-1 RI: 1809 T.R.: 11,153 NÚMERO DE PICOS: 13

10 NOMBRE: 13C_1813.5_1313ECll_Ácido-3-fosfato-glicérico (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 181003-11-1 RI: 1814 T.R.: 11,189

15 NÚMERO DE PICOS: 40

NOMBRE: 13C_1852.0_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 185004-11-1 RI: 1852 T.R.: 11,487 NÚMERO DE PICOS: 33

NOMBRE: 13C_1878.9_1313ECll_alfa-D-metilglucopiranósido (4TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 188006-11-1 RI: 1879 T.R.: 11,695 NÚMERO DE PICOS: 45

NOMBRE: 13C_1882.2_1313ECll_Metoxiamina manosa (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 188002-11-1 RI: 1882

20 T.R.: 11,721 NÚMERO DE PICOS: 62

NOMBRE: 13C_1888. 8_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 189005-11-1 RI: 1889 T.R.:11,772 NÚMERO DE PICOS: 5

NOMBRE: 13C_1893.5_1313ECll_Metoxiamina glucosa (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 189002-11-1 RI: 1894 R.T.: 11,808 NÚMERO DE PICOS: 91

NOMBRE: 13C_1914.8_1313ECll_Metoxiamina glucosa {BP} (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 191001-11-1 RI: 1915

T.R.: 11,953 NÚMERO DE PICOS: 68

NOMBRE: 13C_1931.9_1313ECll_Sorbitol (6TMS); Glucitol (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 193001-11-1 RI: 1932 T.R.: 12,062 NÚMERO DE PICOS: 7 9

NOMBRE: 13C_1956.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 196004-11-1 RI: 1956

15 T.R.: 12,216 NÚMERO DE PICOS: 94

NOMBRE: 13C_19 7 3.5_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer 20 Número de CAS: 197002-11-1

RI: 1974 T.R.: 12,326 NÚMERO DE PICOS: 61

5 NOMBRE: 13C_1999.9_1313ECll_Ácido glucónico (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 200001-11-1 RI: 2000 T.R.: 12,494

10 NÚMERO DE PICOS: 62

NOMBRE: 13C_2026.0_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 203003-11-1

15 RI: 2026 T.R.: 12,660 NÚMERO DE PICOS: 53

NOMBRE: 13C_2028.6_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 203002-11-1 RI: 2029 T.R.: 12,676 NÚMERO DE PICOS: 88

NOMBRE: 13C_2039.3_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 204003-11-1 RI: 2039 T.R.: 12,745 NÚMERO DE PICOS: 56

NOMBRE: 13C_2048.0_1313ECll_Ácido hexadecanoico (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 205001-11-1 RI: 2048 T.R.: 12,800 NÚMERO DE PICOS: 86

10 NOMBRE: 13C_2087.2_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 209004-11-1 RI: 2087 T.R.: 13,049

15 NÚMERO DE PICOS: 65

NOMBRE: 13C_2063.4_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 206001-11-1 RI: 2063 T.R.: 12,898 NÚMERO DE PICOS: 296

NOMBRE: 13C_2025. 7_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 203004-11-1 RI: 2026

T.R.: 12,686 NÚMERO DE PICOS: 343 NOMBRE: 13C_2003.6_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 200002-11-1 RI: 2004 T.R.: 12,518 NÚMERO DE PICOS: 114

NOMBRE: 13C_1878.0_1313EC1l_Metoxiamina fructosa {BP} (5TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 188004-11-1 RI: 1878 T.R.: 11,688 NÚMERO DE PICOS: 68 NOMBRE: 13C_1824.4_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 1820.06-11-1 RI: 1824 T.R.: 11,274 NÚMERO DE PICOS: 205 NOMBRE: 13C_1822.9_1313ECll_Ácido cítrico (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 182004-11-1 RI: 1823 T.R.: 11,261 NÚMERO DE PICOS: 145

NOMBRE: 13C_1741.3_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 174003-11-1 RI: 1741 T.R.: 10,629 NÚMERO DE PICOS: 33

NOMBRE: 13C_1694.3_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 169001-11-1 RI: 1694 T.R.: 10,264 NÚMERO DE PICOS: 44

NOMBRE: 13C_1673.0_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 167003-11-1 RI: 1673

10 T.R.: 10,101 NÚMERO DE PICOS: 60

NOMBRE: 13C_1562.0_1313ECll_Cisteína (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

15 Número de CAS: 156002-11-1 RI: 1562 T.R.: 9,232 NÚMERO DE PICOS: 115 NOMBRE: 13C_1279.2_1313EC16_Serina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 128001-11-1 RI: 1279 T.R.: 6,160 NÚMERO DE PICOS: 40

NOMBRE: 13C_1220.5_1313ECll_Valina (2TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 122001-11-1 RI: 1221 T.R.: 5,509 NÚMERO DE PICOS: 25

NOMBRE: 13C_1314.0_1313EC16_Isoleucina (2TMS)

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 132002-11-1 RI: 1314 T.R.: 6,570 NÚMERO DE PICOS: 27

NOMBRE: 13C_1354.8_1313ECll_Ácido glicérico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 135003-11-1

10 RI: 1355 T.R.: 7,049 NÚMERO DE PICOS: 14

NOMBRE: 13C_1372. 0_1313ECll_Ácido fumárico (2TMS)

15 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 137001-11-1 RI: 1372 T.R.: 7,282 NÚMERO DE PICOS: 124 NOMBRE: 13C_1449.3_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 144007-11-1 RI: 1449 T.R.: 8,163 NÚMERO DE PICOS: 308 NOMBRE: 13C_1726.4_1313ECll_Metoxiamina fucosa (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 173002-11-1 RI: 1726 T.R.: 10,512 NÚMERO DE PICOS: 37

NOMBRE: 13C_1785.2_1313EC0 7_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 179001-11-1 RI: 1785 T.R.: 10,978 NÚMERO DE PICOS: 337

NOMBRE: 13C_1802.7_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 180002-11-1 RI: 1803 T.R.: 11,114 NÚMERO DE PICOS: 85 NOMBRE: 13C_1805.7_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 181004-11-1 RI: 1806 T.R.: 11,136 NÚMERO DE PICOS: 125

10 NOMBRE: 13C_1842.0_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 184002-11-1 RI: 1842 T.R.: 11,427 NÚMERO DE PICOS: 140

5 NOMBRE: 13C_1847.4_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 185003-11-1 RI: 1847 T.R.: 11,461

10 NÚMERO DE PICOS: 205 NOMBRE: 13C_1869.l_1313ECll_Metoxiamina fructosa (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 187002-11-1 RI: 1869 T.R.: 11,620 NÚMERO DE PICOS: 110 NOMBRE: 13C_2137.1_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 214003-11-1 RI: 2137 T.R.: 13,366 NÚMERO DE PICOS: 65

NOMBRE: 13C_2246.0_1313EC16_Ácido octadecanoico (1TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 225002-11-1 RI: 2246 T.R.: 14,010 NÚMERO DE PICOS: 87 NOMBRE: 13C_2327.6_1313EC16_Metoxiamina glucosa-6-fosfato (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 233002-11-1 RI: 2328 T.R.: 14,442 NÚMERO DE PICOS: 51

NOMBRE: 13C_2748.0_1313ec16_trehalosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,1)-alfa-D-Glc

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer. Número de CAS: 274002-11-1 RI: 2748 T.R.: 16,667 NÚMERO DE PICOS: 110 NOMBRE: 13C_3269.3_1313EC16_Ergosterol (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 327001-11-1 RI: 3269 T.R.: 19,000 NÚMERO DE PICOS: 216 NOMBRE: 13C_210 9.4_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 211004-11-1 RI: 2109 T.R.: 13,190 NÚMERO DE PICOS: 70 NOMBRE: 13C_2114.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 211003-11-1 RI: 2114 T.R.: 13,220 NÚMERO DE PICOS: 23

NOMBRE: 13C_2125.1_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 213003-11-1 RI: 2125 T.R.: 13,290 NÚMERO DE PICOS: 42

NOMBRE: 13C_2131.2_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 213001-11-1 RI: 2131

20 T.R.: 13,328 NÚMERO DE PICOS: 160 NOMBRE: 13C_2155.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 216003-11-1 RI: 2155 T.R.: 13,481 NÚMERO DE PICOS: 35

10 NOMBRE: 13C_2162.2_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 216002-11-1 RI: 2162 T.R.: 13,526 NÚMERO DE PICOS: 93

NOMBRE: 13C_2168.8_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 217002-11-1 RI: 2169 T.R.: 13,568 NÚMERO DE PICOS: 18

NOMBRE: 13C_2179.9_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 218001-11-1 RI: 2180

15 T.R.: 13,638 NÚMERO DE PICOS: 57

NOMBRE: 13C_2217.6_1313EC11_9-(Z)-ácido octadecenoico (1TMS)

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 222001-11-1 RI: 2218 T.R.: 13,859 NÚMERO DE PICOS: 98

NOMBRE: 13C_2224.7_1313ECll_Ácido octadecenoico (1TMS) COMENTARIOS: Kopka. J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 223003-11-1 RI: 2225 T.R.: 13,897 NÚMERO DE PICOS: 101 NOMBRE: 13C_2343.5_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 234001-11-1 RI: 2344 T.R.: 14,526 NÚMERO DE PICOS: 23

NOMBRE: 13C_2383.1_1313EC11_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 238002-11-1 RI: 2383 T.R.: 14,735 NÚMERO DE PICOS: 24

NOMBRE: 13C_2475.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 248002-11-1 RI: 2475

20 T.R.: 15,223

NÚMERO DE PICOS: 120

NOMBRE: 13C_2732.8_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 273002-11-1 RI: 2733 T.R.: 16,587 NÚMERO DE PICOS: 64

10 NOMBRE: 13C_2814.8_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 281001-11-1 RI: 2815 T.R.: 17,009

15 NÚMERO DE PICOS: 53 NOMBRE: 13C_2825.9_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 283001-11-1 RI: 2826 T.R.: 17,058 NÚMERO DE PICOS: 36

10 NOMBRE: 13C_2872.6_1313ECll_Metoxiamina isomaltosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc (8TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 287001-11-1 RI: 2873 T.R.: 17,266

15 NÚMERO DE PICOS: 58

NOMBRE: 13C_2907.8_1313ECll_Metoxiamina isomaltosa {BP} (8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc (8TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 291002-11-1

20 RI: 2908 T.R.: 17,423 NÚMERO DE PICOS: 72

NOMBRE: 13C_2932.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 293001-11-1 RI: 2932 T.R.: 17,530 NÚMERO DE PICOS: 96

NOMBRE: 13C_2517.7_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 252002-11-1 RI: 2518

15 T.R.: 15,448 NÚMERO DE PICOS: 254

NOMBRE: 13C_24 91. 6_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 249001-11-1 RI: 2492 T.R.: 15,310

NÚMERO DE PICOS: 205

NOMBRE: 13C_3307.7_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 331001-11-1 RI: 3308 T.R.: 19,156 NÚMERO DE PICOS: 141 NOMBRE: 13C_3401.6_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 340002-11-1 RI: 3402 T.R.: 19,533 NÚMERO DE PICOS: 214 NOMBRE: 13C_34 94 .1_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 349001-11-1 RI: 3494 T.R.: 19,905 NÚMERO DE PICOS: 70 NOMBRE: 13C_3334.7_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 334.001-11-1 RI: 3335 T.R.: 19,264 NÚMERO DE PICOS: 191 NOMBRE: 13C_3347.5_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 335001-11-1 RI: 3348 T.R.: 19,315 NÚMERO DE PICOS: 140 NOMBRE: 13C_3353.6_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J,MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 335002-11-1 RI: 3354 T.R.: 19,340 NÚMERO DE PICOS: 166 NOMBRE: 13C_2654.6_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 266001-11-1 RI: 2655 T.R.: 16,184 NÚMERO DE PICOS: 100 NOMBRE: 13C_2689.6_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 269002-11-1 RI: 2690 T.R.: 16,369 NÚMERO DE PICOS: 259 NOMBRE: 13C_2617.8_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 262001-11-1 RI: 2618 T.R.: 15,988 NÚMERO DE PICOS: 116 NOMBRE: 13C_3185.4_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 318001-11-1 RI: 3185 T.R.: 18,659 NÚMERO DE PICOS: 138 NOMBRE: 13C_2718.2_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 272002-11-1 RI: 2718 T.R.: 16,522 NÚMERO DE PICOS: 159 NOMBRE: 13C_2724.4_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 272001-11-1 RI: 2724 T.R.: 16,554 NÚMERO DE PICOS: 143

NOMBRE: 13C_2562.2_1313EC07_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 256001-11-1 RI: 2562 T.R.: 15,693 NÚMERO DE PICOS: 136

5 NOMBRE: 13C_2579.9_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 258001-11-1 RI: 2580 T.R.: 15,787

10 NÚMERO DE PICOS: 335

NOMBRE: 13C_2390.1_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 239001-11-1 RI: 2390 T.R.: 14,779 NÚMERO DE PICOS: 108 NOMBRE: 13C_2347.2_1313EC07_Metoxiamina glucosa-6-fosfato {BP} (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 235002-11-1 RI: 2347 T.R.: 14,551 NÚMERO DE PICOS: 96

10 NOMBRE: 13C_2313.4_1313EC07_Metoxiamina glucosa-6-fosfato (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 232001-11-1 RI: 2313 T.R.: 14,372 NÚMERO DE PICOS: 108

5 NOMBRE: 13C_2311.9_1313EC07_Metoxiamina fructosa-6-fosfato (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 232002-11-1 RI: 2312 T.R.: 14,363

10 NÚMERO DE PICOS: 135 NOMBRE: 13C_2257.9_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 226001-11-1 RI: 2258 T.R.: 14,076 NÚMERO DE PICOS: 138 NOMBRE: 13C_22 94.1_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 230001-11-1 RI: 2294 T.R.: 14,269 NÚMERO DE PICOS: 188 NOMBRE: 13C_2285.3_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 228001-11-1 RI: 2285 T.R.: 14,222 NÚMERO DE PICOS: 106

NOMBRE: 13C_1396.1_1313EC11_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 140003-11-1 RI: 1396 T.R.: 7,541 NÚMERO DE PICOS: 66

15 NOMBRE: 13C_1475.5_1313EC07_Ácido citramálico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 148001-11-1 RI: 1476

T.R.: 8,482 NÚMERO DE PICOS: 94

NOMBRE: 13C_1769.9_1313EC16_Glicerol-2-fosfato (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 174002-11-1 RI: 1736

10 T.R.: 10,586 NÚMERO DE PICOS: 421

NOMBRE: 13C_1755.8_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 176003-11-1-RI: 1756 T.R.: 10,758 NÚMERO DE PICOS: 124 NOMBRE: 13C_1761.5_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 176004-11-1 RI: 1762 T.R.: 10,791 NÚMERO DE PICOS: 88

10 NOMBRE: 13C_1796.3_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 180001-11-1 RI: 1796 T.R.: 11,063 NÚMERO DE PICOS: 145

5 NOMBRE: 13C_3379.6_1313EC07_Lanosta-8,24-dien-3-beta-ol (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 338001-11-1 RI: 3380 T.R.: 19,444

10 NÚMERO DE PICOS: 303

NOMBRE: 13C_3079.3_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 308001-11-1 RI: 3079 T.R.: 18,190 NÚMERO DE PICOS: 175

NOMBRE: 13C_2679.5_1313EC07_

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 268001-11-1 RI: 2680 T.R.: 16,316 NÚMERO DE PICOS: 157 NOMBRE: 13C_1924.2_1313EC07_Manitol (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 193002-11-1 RI: 1924 T.R.: 12,015 NÚMERO DE PICOS: 125 NOMBRE: 13C_1546.0_1313EC07_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 154001-11-1 RI: 1546 T.R.: 9,114 NÚMERO DE PICOS: 256 NOMBRE: 13C_1281.6_1313EC07_Etanolamina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1282 RI: 1282 Número de CAS: 128002-11-1 RI: 1282 T.R.: 6,144

117 NOMBRE: 13C_1283.2_1313ECll_Urea (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 127002-11-1 RI: 1283 T.R.: 6,186 NÚMERO DE PICOS: 410

NOMBRE: 13C_2223.0_1313EC16_Triptófano (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 223001-11-1 RI: 2223 T.R.: 13,883 NÚMERO DE PICOS: 161 NOMBRE: 13C_27 67.9_1313EC16_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 277004-11-1 RI: 2767 T.R.: 16,765 NÚMERO DE PICOS: 93 NOMBRE: 13C_1915.4_2119DC05_Lisina (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 192003-11-1 RI: 1915 T.R.: 28,691 NÚMERO DE PICOS: 222 NOMBRE: 13C_1920.1_2119 DCO5_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 192007-11-1 RI: 1920 T.R.: 28,753 NÚMERO DE PICOS: 81

NOMBRE: 13C_1858.l_2119DC05_Lisina (3TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1858 RI: 1858 Número de CAS: 186002-11-1 RI: 1858 T.R.: 27,441 FUENTE: C:\KOPKA\AMDIS32\LIB\File2.msp NÚMERO DE PICOS: 119 NOMBRE: 13C_1490.2_2119DC05_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 149003-11-1 RI: 1490 T.R.: 20,226 NÚMERO DE PICOS: 155 NOMBRE: 13C_2816. 0_2119DC05_ COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 282003-11-1 RI: 2816 T.R.: 41,157 NÚMERO DE PICOS: 36

NOMBRE: 12C_1731.5_1313EC36_Ribitol (5TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 173001-10-1 RI: 1731 T.R.: 10,548 NÚMERO DE PICOS: 84 NOMBRE: 12C_1316.0_1313EC36_Isoleucina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 132002-10-1 RI: 1316 T.R.: 6,560 NÚMERO DE PICOS: 44

NOMBRE: 12C_1436,0_1313EC36_[619; 2-(3',4'-bishidroxifenil)-2-oxoetilamina (4TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 143003-10-1 RI: 1436 T.R.: 7,989 NÚMERO DE PICOS: 26

NOMBRE: 12C_1459.3_1313EC36_Homoserina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 146001-10-1 RI: 1459 T.R.: 8,266 NÚMERO DE PICOS: 72

NOMBRE: 12C_1495.6_1313EC36_[815; etil-3(2H)-tiofenona] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 150003-10-1 RI: 1496 T.R.: 8,698 NÚMERO DE PICOS: 56

NOMBRE: 12C_151-4.1_1313EC36_[729; N,N-éster metílico del ácido N-dimetillisina] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 151003-10-1 RI: 1514

15 T.R.: 8,860 NÚMERO DE PICOS: 29

NOMBRE: 12C_1538.2_1313EC36_[596; Ácido N-acetilglutámico (2TMS)]

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 154002-10-1 RI: 1538 T.R.: 9,048 NÚMERO DE PICOS: 61

NOMBRE: 12C_1623.5_1313EC36_[882; Ornitina (3TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 162001-10-1

10 RI: 1624 T.R.: 9,710 NÚMERO DE PICOS: 109

NOMBRE: 12C_1640.8_1313EC36_Fenilalanina (2TMS)

15 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 164001-10-1 RI: 1641 T.R.: 9,844 NÚMERO DE PICOS: 63

5 NOMBRE: 12C_1673.2_1313EC36_[NA] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 167003-10-1 RI: 1673 T.R.: 10,095

10 NÚMERO DE PICOS: 66

NOMBRE: 12C_1708.2_1313EC36_[499; ácido 2-etil-3-hidroxi-3-metilvalérico (2TMS)]

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 171003-10-1 15 RI: 1708

T.R.: 10,367

NÚMERO DE PICOS: 91 NOMBRE: 12C_1720.9_1313EC36_[NA] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 172005-10-1 RI: 1721 T.R.: 10,465 NÚMERO DE PICOS: 56

NOMBRE: 12C_1747.3_1313EC36_[612; 4-Ácido aminobutírico (2TBS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 175003-10-1 RI: 1747 T.R.: 10,670 NÚMERO DE PICOS: 19

NOMBRE: 12C_1784.4_1313EC36_Glutamina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 178001-10-1

RI: 1785 T.R.: 10,958 NÚMERO DE PICOS: 107

NOMBRE: 12C_1843.5_1313EC36_[919; D-xilopiranosa (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 184004-10-1 RI: 1844

10 T.R.: 11,416 NÚMERO DE PICOS: 29

NOMBRE: 12C_1858.1_1313EC36_Lisina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1858 RI: 1858

15 Número de CAS: 186002-10-1 RI: 1858 T.R.: 11,530 FUENTE: C:\KOPKA\AMDIS32\LIB\File2.msp NÚMERO DE PICOS: 99 NOMBRE: 12C_1888.7_1313EC36_[772; D-glucosa (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 189005-10-1 RI: 1889 T.R.: 11,768 NÚMERO DE PICOS: 6

NOMBRE: 12C_1892.7_1313EC36_Tirosina (2TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 189006-10-1 RI: 1893 T.R.: 11,798 NÚMERO DE PICOS: 47

NOMBRE: 12C_1? 73.7_1313EC36_[945; beta-D-glucopiranosa (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 197002-10-1

20 RI: 1974 T.R.: 12,324 NÚMERO DE PICOS: 66

NOMBRE: 12C_1924.5_1313EC16_Histidina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 192006-10-1 RI: 1925 T.R.: 12,015 NÚMERO DE PICOS: 83

NOMBRE: 12C_2091.2_1313ECll_Mioinositol (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 209002-10-1 RI: 2091

15 T.R.: 13,074 NÚMERO DE PICOS: 112 NOMBRE: 12C_1293.1_1313EC75_Glicerol (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 129003-10-1 RI: 1293 T.R.: 6,323 NÚMERO DE PICOS: 58

10 NOMBRE: 12C_1317.6_1313EC75_Treonina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 132001-10-1 RI: 1318 T.R.: 6,611

15 NÚMERO DE PICOS: 51 NOMBRE: 12C_1318.4_1313EC75_Prolina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 132003-10-1 RI: 1318 T.R.: 6,620 NÚMERO DE PICOS: 32

NOMBRE: 12C_1338.0_1313EC75_Ácido succínico (2TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 134001-10-1 RI: 1338 T.R.: 6,850 NÚMERO DE PICOS: 32

NOMBRE: 12C_1378.1_1313EC75_Alanina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 138002-10-1 RI: 1378

20 T.R.: 7,321 NÚMERO DE PICOS: 54 NOMBRE: 12C_1381.0_1313EC75_Serina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 138001-10-1 RI: 1381 T.R.: 7,354 NÚMERO DE PICOS: 31

NOMBRE: 12C_1410.5_1313EC75_[700; 2-metil-1,2-propanediol (2TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 141003-10-1 RI: 1411 T.R.: 7,700 NÚMERO DE PICOS: 33

NOMBRE: 12C_1419.8_1313EC75_Alanina {BP} (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 142001-10-1 RI: 1420

20 T.R.: 7,810 NÚMERO DE PICOS: 38 NOMBRE: 12C_1464.2_1313EC75_[725; Ácido 2-cetooctanoico (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 146003-10-1 RI: 1464 T.R.: 8,330 NÚMERO DE PICOS: 82

NOMBRE: 12C_1520.6_1313EC75_Ácido aspártico (3TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 152002-10-1 RI: 1521 T.R.: 8,910 NÚMERO DE PICOS: 73 NOMBRE: 12C_1529.0_1313EC75_Ácido piroglutámico (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 153002-10-1 RI: 1529 T.R.: 8,976 NÚMERO DE PICOS: 63

NOMBRE: 12C_1659. 6_1313EC75_[910; ácido 2-cetoglucónico metoxiamina (4TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 166002-10-1 RI: 1660 T.R.: 9,991 NÚMERO DE PICOS: 40

NOMBRE: 12C_1755.7_1313EC75_[829; Ácido orótico (3TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 176003-10-1 RI: 1756

20 T.R.: 10,739 NÚMERO DE PICOS: 94

NOMBRE: 12C_1758.1_1313EC75_[636; 4R-acetamido-2,3-(Z)-epoxi-4-(E)

5 hidroxiciclohexano (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 176005-10-1 RI: 1758 T.R.: 10,757

10 NÚMERO DE PICOS: 89

NOMBRE: 12C_1763.9_1313EC75_Ornitina (3TMS); Arginina {BP} (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 176006-10-1

15 RI: 1764 T.R.: 10,803 NÚMERO DE PICOS: 96

NOMBRE: 12C_1769.9_1313EC75_Glicerol-3-fosfato (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 177002-10-1 RI: 1770 T.R.: 10,850 NÚMERO DE PICOS: 108

NOMBRE: 12C_1802.0_1313EC75_[706; Xilitol (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 180002-10-1 RI: 1802

T.R.: 11,098 NÚMERO DE PICOS: 69

5 NOMBRE: 12C_1813.0_1313EC75_Ácido glicérico-3-fosfato (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 181003-10-1 RI: 1813 T.R.: 11,184

10 NÚMERO DE PICOS: 69

NOMBRE: 12C_1819.8_1313EC75_Ornitina (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 182002-10-1

15 RI: 1820 T.R.: 11,237 NÚMERO DE PICOS: 105 NOMBRE: 12C_1827.9_1313EC75_Arginina (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 183001-10-1 RI: 1828 T.R.: 11,300 NÚMERO DE PICOS: 43

NOMBRE: 12C_1835.3_1313EC75_[731; Eritrosa (3TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka. J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 184003-10-1 RI: 1835 T.R.: 11,358 NÚMERO DE PICOS: 137 NOMBRE: 12C_1869.1_1313EC75_Metoxiamina fructosa (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 187002-10-1 RI: 1869 T.R.: 11,621 NÚMERO DE PICOS: 87

NOMBRE: 12C_1879.6_1313EC75_Metoxiamina fructosa {BP} (5TMS) 10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 188004-10-1

RI: 1880 T.R.: 11,703 NÚMERO DE PICOS: 81

NOMBRE: 12C_1931.9_1313EC75_Sorbitol (6TMS);. Glucitol (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 193001-10-1 RI: 1932

10 T.R.: 12,063 NÚMERO DE PICOS: 90

NOMBRE: 12C_1956.6_1313EC75_[793; D-galactono-1,4-lactona (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer 15 Número de CAS: 196004-10-1 RI: 1957

T.R.: 12,219 NÚMERO DE PICOS: 124

5 NOMBRE: 12C_1999.3_1313EC75_Ácido glucónico (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 200001-10-1 RI: 1999 T.R.: 12,490

10 NÚMERO DE PICOS: 87

NOMBRE: 12C_204 8.2_1313EC75_Ácido hexadecanoico (1TMS)

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 205001-10-1 RI: 2048 T.R.: 12,799 NÚMERO DE PICOS: 111

NOMBRE: 12C_2087.4_1313EC75_[756; beta-D-metilglucopiranósido (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 209004-10-1 RI: 2087 T.R.: 13,047 NÚMERO DE PICOS: 68

15 NOMBRE: 12C_2064.0_1191EC10_[770; 3,4,6-trishidroxifeniletanolamina (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 206001-10-1 RI: 2064 T.R.: 13,339 NÚMERO DE PICOS: 191

NOMBRE: 12C_2023.2_1160EC43_[766; beta-D-metilglucopiranósido (4TMS)]

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 203003-10-1 10 RI: 2023

T.R.: 13,133

NÚMERO DE PICOS: 92 NOMBRE: 12C_2002.2_1178EC16_[775; Dopamina (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 200002-10-1 RI: 2002 T.R.: 12,973 NÚMERO DE PICOS: 186 NOMBRE: 12C_1882.5_1274ECll_Metoxiamina manosa (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 188002-10-1 RI: 1883 T.R.: 12,225 NÚMERO DE PICOS: 114 NOMBRE: 12C_1882.4_1160EC15_Adenina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 188005-10-1 RI: 1882 T.R.: 12,217 NÚMERO DE PICOS: 37

10 NOMBRE: 12C_1850.9_1274EC11_[912; Ácido tetradecanoico (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 185004-10-1 RI: 1851 T.R.: 11,982

15 NÚMERO DE PICOS: 82 NOMBRE: 12C_1822. 5_1313EC75_Ácido cítrico (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 182004-10-1 RI: 1823 T.R.: 11,258 NÚMERO DE PICOS: 87

10 NOMBRE: 12C_1824.3_1191EC08_[570; Hipoxantina (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 182006-10-1 RI: 1824 T.R.: 11,718

15 NÚMERO DE PICOS: 163 NOMBRE: 12C_1771.1_1274EC11_[812; D-xilopiranosa (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 177004-10-1 RI: 1771 T.R.: 11,367 NÚMERO DE PICOS: 78 NOMBRE: 12C_1710.6_1274EC17_[817; Ribitol (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1711 RI: 1711 Número de CAS: 171008-10-1 RI: 1711 T.R.: 10,896 FUENTE: C:\KOPKA\AMDIS32\LIB\File2.msp NÚMERO DE PICOS: 148

NOMBRE: 12C_1682.1_1160ec15_Asparragina (3TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 168001-10-1 RI: 1682 T.R.: 10,676 NÚMERO DE PICOS: 96 NOMBRE: 12C_1653.8_1191ec10_[548; Leucina (2TBS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 165002-10-1 RI: 1654 T.R.: 10,407 NÚMERO DE PICOS: 176 NOMBRE: 12C_1509. 3_j_1178EC16_[622; Ácido parabánico (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 151002-10-1 RI: 1509 T.R.: 9,317 NÚMERO DE PICOS: 26

NOMBRE: 12C_1481.5_1160EC15_[815; (E)-4-metil-5-hidroxi-3-penten-2-ona (1TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 148002-10-1 RI: 1482 T.R.: 9,067 NÚMERO DE PICOS: 16

NOMBRE: 12C_1467. 9_1178ec16_[709; 2,5-diaminovalerolactama (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 147003-10-1 RI: 1468 T.R.: 8,883 NÚMERO DE PICOS: 105

10 NOMBRE: 12C_1474. 4_1191EC10_[NA] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 147002-10-1 RI: 1474 T.R.: 8,933

15 NÚMERO DE PICOS: 136 NOMBRE: 12C_1296.5_1191EC10_Ácido fosfórico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 129001-10-1 RI: 1297 T.R.: 6,913 NÚMERO DE PICOS: 89

NOMBRE: 12C_1220.2_1274EC17_Valina (2TMS) 10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept.Willmitzer Número de CAS: 122001-10-1

RI: 1220

T.R.: 6,122 NÚMERO DE PICOS: 55

NOMBRE: 12C_1282.1_1274EC17_Serina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 128001-10-1 RI: 1282

10 T.R.: 6,820 NÚMERO DE PICOS: 62

NOMBRE: 12C_1326.5_1274EC17_Glicina (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

15 Número de CAS: 133001-10-1 RI: 1327 T.R.: 7,320 NÚMERO DE PICOS: 48 NOMBRE: 12C_1352.5_1274EC17_Ácido glicérico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 135003-10-1 RI: 1353 T.R.: 7,614 NÚMERO DE PICOS: 78

10 NOMBRE: 12C_1394.9_1274EC17_[644; 2-metil-1,3-butanodiol (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 140003-10-1 RI: 1395 T.R.: 8,092

15 NÚMERO DE PICOS: 50

NOMBRE: 12C_1403.1_1274EC17_Treonina (3TMS)

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 140001-10-1 RI: 1403 T.R.: 8,183 NÚMERO DE PICOS: 98

NOMBRE: 12C_1414.0_127 4EC17_[590; 1-acetil-2-tiohidantoína]

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 141004-10-1 10 RI: 1414

T.R.: 8,306

NÚMERO DE PICOS: 71

NOMBRE: 12C_1440.3_1274EC17_[678; N,N-Di-(2-hidroxietil)metanamina (2TMS)] 15 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 144003-10-1 RI: 1440 T.R.: 8,603 NÚMERO DE PICOS: .63

5 NOMBRE: 12C_1488.2_1274EC17_Ácido málico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 149001-10-1 RI: 1488 T.R.: 9,143

10 NÚMERO DE PICOS: 79

NOMBRE: 12C_1565.1_1274EC17_Fenilalanina (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 157001-10-1

15 RI: 1565 T.R.: 9,777 NÚMERO DE PICOS: 49 NOMBRE: 12C_1573.9_1274EC17_[708; ácido 2,3-dimetilsuccínico (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 157002-10-1 RI: 1574 T.R.: 9,844 NÚMERO DE PICOS: 85

NOMBRE: 12C_1581.5_1274EC17_[680; Ácido 2,3-dimetilsuccínico (2TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 158003-10-1 RI: 1582 T.R.: 9,903 NÚMERO DE PICOS: 109 NOMBRE: 12C_1595.8_1274EC17_[639; Prolina (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 159001-10-1 RI: 1596 T.R.: 10,013 NÚMERO DE PICOS: 51

10 NOMBRE: 12C_1625.9_1274EC17_Ácido glutámico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 163001-10-1 RI: 1626 T.R.: 10,245

15 NÚMERO DE PICOS: 104 NOMBRE: 12CJL770.3_1274EC17_[NA] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 177003-10-1 RI: 1770 T.R.: 11,356 NÚMERO DE PICOS: 52

NOMBRE: 12C_1794. 4_1274ec17_[789; tiramina (3TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 179002-10-1 RI: 1794 T.R.: 11,541 NÚMERO DE PICOS: 53 NOMBRE: 12C_1806.4_1274EC17_[944; D-manopiranosa (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 181005-10-1 RI: 1806 T.R.: 11,634 NÚMERO DE PICOS: 148

10 NOMBRE: 12C_1868.5_1274EC17_[826; éster metílico del ácido beta-[[(5-metil-2-tienil)metileno]amino]-bencenoacético] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 187004-10-1 RI: 1869 T.R.: 12,112 NÚMERO DE PICOS: 78

NOMBRE: 12C_1877.4_1274EC17_alfa-D-metilglucopiranósido (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 188006-10-1 RI: 1877 T.R.: 12,180 NÚMERO DE PICOS: 207 NOMBRE: 12C_1889.9_1274ECl7_Metoxiamina glucosa (5TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 189002-10-1 RI: 1890 T.R.: 12,276 NÚMERO DE PICOS: 137

NOMBRE: 12C_1909.6_1274EC17_Metoxiamina glucosa {BP} (5TMS)

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 191001-10-1 RI: 1910 T.R.:12,415 NÚMERO DE PICOS: 65

NOMBRE: 12CJL915.4_127 4EC17_Lisina (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 192003-10-1

10 RI: 1915 T.R.: 12,451 NÚMERO DE PICOS: 122

NOMBRE: 12C_1938.9_1274EC17_Tirosina (3TMS) 15 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 194002-10-1

RI: 1939 T.R.: 12,600 NÚMERO DE PICOS: 79

NOMBRE: 12C_2023.7_1274EC17_[680; Glicerol-2-fosfato (4TMS)]

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 203004-10-1 10 RI: 2024

T.R.: 13,138

NÚMERO DE PICOS: 93

NOMBRE: 12C_2029.2_1274EC17_[910; ácido 9-(Z)-ácido-hexadecenoico (1TMS)]

15 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 203002-10-1 RI: 2029 T.R.: 13,173 NÚMERO DE PICOS: 136

5 NOMBRE: 12C_1675.0_1274EC11_[877; Ácido pirofospórico (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 168004-10-1 RI: 1675 T.R.: 10,627

10 NÚMERO DE PICOS: 96 NOMBRE: 12C_1673.8_1191EC10_Homocisteína (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 167001-10-1 RI: 1674 T.R.: 10,561 NÚMERO DE PICOS: 223 NOMBRE: 12C_1522.3_1313EC36_Metionina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 152001-10-1 RI: 1522 T.R.: 8,924 NÚMERO DE PICOS: 108 NOMBRE: 12C_1560.7_1191EC08_Cisteína (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 156002-10-1 RI: 1561 T.R.: 9,691 NÚMERO DE PICOS: 49

NOMBRE: 12C_1281.5_1313EC36_Etanolamina (3TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1282 RI: 1282 Número de CAS: 128002-10-1 RI: 1282 T.R.: 6,152 FUENTE: C:\KOPKA\AMDIS32\LIB\File2.msp

15 NÚMERO DE PICOS: 25 NOMBRE: 12C_1364.2_1313ECll_Uracilo (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 136001-10-1 RI: 1364 T.R.: 7,160 NÚMERO DE PICOS: 30

NOMBRE: 12C_1372.9_1313EC75_Ácido fumárico (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 137001-10-1 RI: 1373 T.R.: 7,260 NÚMERO DE PICOS: 37

15 NOMBRE: 12C_1450.0_1313EC75_[690; N,N-di-(2-hidroxietil)-metanamina (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 144007-10-1 RI: 1450 T.R.: 8,1600

20 NÚMERO DE PICOS: 162 NOMBRE: 12C_1503.9_1313EC75_Eritritol (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 150002-10-1 RI: 1504 T.R.: 8,781 NÚMERO DE PICOS: 181 NOMBRE: 12C_1694. 8_1313EC75_[746; Ácido ribónico-1,4-lactona (3TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 169001-10-1 RI: 1695 T.R.: 10,265 NÚMERO DE PICOS: 27

NOMBRE: 12C_1670.8_1313EC75_Metoxiamina arabinosa (4TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1671 RI: 1671 RI: 1671 Número de CAS: 167002-10-1 RI: 1671 T.R.: 10,078

15 FUENTE: C:\KOPKA\AMDIS32\LIB\File2.msp NÚMERO DE PICOS: 142 NOMBRE: 12C_1726.7_1313EC36_Metoxiamina fucosa (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer. Número de CAS: 173002-10-1 RI: 1727 T.R.: 10,513 NÚMERO DE PICOS: 58

10 NOMBRE: 12C_1784.9_1313EC75_[798; Ácido ribónico (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 179001-10-1 RI: 1785 T.R.: 10,966 NÚMERO DE PICOS: 44

NOMBRE: 12C_1806.2_1313EC75_[549; ácido 2-ceto-d-glucónico (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 181004-10-1 RI: 1806 T.R.: 11,131 NÚMERO DE PICOS: 57

NOMBRE: 12C_1842.1_1313EC75_[693; Ácido 2-furan-2-hidroxiacético (2TMS)]

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 184002-10-1 15 RI: 1842

T.R.: 11,411

NÚMERO DE PICOS: 122 NOMBRE: 12C_1848. 6_131.3EC75_[708; Metoxiamina glucosa (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 185003-10-1 RI: 1849 T.R.: 11,461 NÚMERO DE PICOS: 137 NOMBRE: 12C_2113.2_1313EC36_[697; metoxiamina ribosa-5-fosfato (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 211003-10-1 RI: 2113 T.R.: 13,210 NÚMERO DE PICOS: 16

NOMBRE: 12C_2225.2_1313EC36_ácido octadecenoico (1TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 223003-10-1 RI: 2225 T.R.: 13,896 NÚMERO DE PICOS: 126 NOMBRE: 12C_3270.3_1313ec36_Ergosterol (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 327001-10-1 RI: 3270 T.R.: 19,000 NÚMERO DE PICOS: 189 NOMBRE: 12C_1580. 7_1313EC75_[829; 1-feniletanol (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 158002-10-1 RI: 1581 T.R.: 9,378 NÚMERO DE PICOS: 10

NOMBRE: 12C_2109.7_1313EC75_[662; Metoxiamina ribosa-5-fosfato {BP} (5TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 211004-10-1 RI: 2110 T.R.: 13,188 NÚMERO DE PICOS: 47 NOMBRE: 12C_2125.3_1313EC75_[832; Dopamina (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 213003-10-1 RI: 2125 T.R.: 13,287 NÚMERO DE PICOS: 53

10 NOMBRE: 12C_2155.6_1313EC75_[795; Eritritol (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 216003-10-1 RI: 2156 T.R.: 13.479

15 NÚMERO DE PICOS: 106 NOMBRE: 12C_2162.3_1313EC75_[648; Etilamina (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 216002-10-1 RI: 2162 T.R.: 13.521 NÚMERO DE PICOS: 54

NOMBRE: 12C_2168.9_1313EC75_[705; ácido 2-cetoglucónico (5TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 217002-10-1 RI: 2169 T.R.: 13,563 NÚMERO DE PICOS: 52 NOMBRE: 12C_2180.5_1313EC75_[733; Treitol (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 218001-10-1 RI: 2181 T.R.: 13,637 NÚMERO DE PICOS: 128

10 NOMBRE: 12C_2245.5_1313EC75_Ácido octadecanoico (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 225002-10-1 RI: 2246 T.R.: 14,001

15 NÚMERO DE PICOS: 124 NOMBRE: 12C_2328.l_1313EC75_Metoxiamina glucosa-6-fosfato (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 233002-10-1 RI: 2328 T.R.: 14,440 NÚMERO DE PICOS: 123 NOMBRE: 12C_2383.7_1313EC75_[724; Glicerol (3TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 238002-10-1 RI: 2384 T.R.: 14,735 NÚMERO DE PICOS: 34

NOMBRE: 12C_2564.4_1313EC75_[945; Galactofuranosa-6-fosfato (7TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 256001-10-1 RI: 2564 T.R.: 15,695 NÚMERO DE PICOS: 263 NOMBRE: 12C_2619.2_1313EC75_[892; Sacarosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1, 2)-beta-D-Fru] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 262001-10-1 RI: 2619

188 T.R.: 15,985 NÚMERO DE PICOS: 126

NOMBRE: 12C_2656. 9_1313EC75_[559; Eritritol (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 266001-10-1 RI: 2657 T.R.: 16,186 NÚMERO DE PICOS: 42

NOMBRE: 12C_2733.0_1313EC75_[840; metoxiamina maltosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,4)-D-Glc] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 273002-10-1 RI: 2733

15 T.R.: 16,590 NÚMERO DE PICOS: 78 NOMBRE: 12C_2826.4_1313EC75_[855; Escualeno] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 283001-10-1 RI: 2 8 2 6 T.R.: 17,062 NÚMERO DE PICOS: 34

NOMBRE: 12C_2871.8_1313EC75_Metoxiamina isomaltosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc (8TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 287001-10-1 RI: 2872 T.R.: 17,263 NÚMERO DE PICOS: 126 NOMBRE: 12C_2906.7_1313EC75_Metoxiamina isomaltosa {BP} (8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc (8TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 291002-10-1 RI: 2907 T.R.: 17,418 NÚMERO DE PICOS: 64

NOMBRE: 12C_2811.2_1160EC39_[895; metoxiamina isomaltosa (8TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 281001-10-1 RI: 2811 T.R.: 17,476 NÚMERO DE PICOS: 89 NOMBRE: 12C_2518.0_1313EC75_[644; Eritritol (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 252002-10-1 RI: 2518 T.R.: 15,448 NÚMERO DE PICOS: 176 NOMBRE: 12C_24 93.1_1313EC75_[657; Eritritol (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 249001-10-1 RI: 2493 T.R.: 15,316 NÚMERO DE PICOS: 236 NOMBRE: 12C_2134.7_1274EC17_[904; Metoxiamina galactosa (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 214003-10-1 RI: 2135 T.R.: 13,842 NÚMERO DE PICOS: 108 NOMBRE: 12C_2128.7_1274EC17_[857; Manitol (6TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 213001-10-1 RI: 2129 T.R.: 13,.804 NÚMERO DE PICOS: 237 NOMBRE: 12C_2217.8_1274EC17_9-(Z)-Ácido octadecenoico (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 222001-10-1 RI: 2218 T.R.: 14,350 NÚMERO DE PICOS: 146 NOMBRE: 12C_2278. 6_1274EC17_[583; Eritritol (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 228001-10-1 RI: 2279 T.R.: 14,672 NÚMERO DE PICOS: 235 NOMBRE: 12C_2294.6_1274EC17_[877; beta-D-galactopiranósido-(1, 2)-glicerol (6TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 230001-10-1 RI: 2295 T.R.: 14,757 NÚMERO DE PICOS: 71 NOMBRE: 12C_2311-. 4_1274EC17_Metoxiamina galactosa-6-fosfato {6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 232001-10-1 RI: 2311 T.R.: 14,846 NÚMERO DE PICOS: 321

NOMBRE: 12C_2474. 9_1274EC17_[945; Uridina (3TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 248002-10-1 RI: 2475 T.R.: 15,711 NÚMERO DE PICOS: 131

NOMBRE: 12C_2687.5_1274EC17_[964; Trehalosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,1)-alfa-D-Glc] 10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 269002-10-1 RI: 2688

T.R.: 16,837 NÚMERO DE PICOS: 93

NOMBRE: 12C_2748.2_1274EC17_Trehalosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,1)-alfa-D-Glc COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 274002-10-1 RI: 2748.

10 T.R.: 17,158 NÚMERO DE PICOS: 213 NOMBRE: 12C_2929.8_1274EC17_[902; Melibiosa (8TMS); alfa-D-Gal-(1, 6)-D-Glc (8TMS)J COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 293001-10-1 RI: 2930 T.R.: 18,009 NÚMERO DE PICOS: 124 NOMBRE: 12C_3337.9_1191EC10_[700; Ergosta-5,7-dien-3-ol] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 334001-10-1 RI: 3338 T.R.: 19,741 NÚMERO DE PICOS: 90

10 NOMBRE: 12C_3350.3_1274EC11_[692; Ergosta-7,22-dien-3-ol (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 335001-10-1 RI: 3350

T.R.: 19,858 NÚMERO DE PICOS: 159

5 NOMBRE: 12C_3358.2_1191EC08_[693; Ergost-7-en-3-ol (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 335002-10-1 RI: 3358 T.R.: 19,826

10 NÚMERO DE PICOS: 48

NOMBRE: 12C_3401.9_1274EC11_805;

4,4-Dimetilcolesta-8,24-dien-3-ol (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 340002-10-1 RI: 3402 T.R.: 20,078 NÚMERO DE PICOS: 112

NOMBRE: 12C_3487.5_1191EC08_[568; 2,3-dihexadecanoilglicerol (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

10 Número de CAS: 146001-10-1 RI: 3488 T.R.: 20,373 NÚMERO DE PICOS: 103 NOMBRE: 12C_3301.9_1274EC11_[674; Ergosterol (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 331001-10-1 RI: 3302 T.R.: 19,651 NÚMERO DE PICOS: 335

NOMBRE: 12C_3183.2_1160EC23_[748; D-sedoheptulosa-7-fosfato (7TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 318001-10-1 RI: 3183 T.R.: 19,137 NÚMERO DE PICOS: 111

NOMBRE: 12C_2723.7_1160EC23_[777; Metoxiamina fructosa-6-fosfato (6TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 272001-10-1 RI: 2724 T.R.: 17,023 NÚMERO DE PICOS: 75 NOMBRE: 12C_2578.1_1274EC11_[734; 1-monooleoilglicerol (2TMS); 1-monohexadecenoilglicerol (1TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 258001-10-1 RI: 2578 T.R.: 16,266 NÚMERO DE PICOS: 108

10 NOMBRE: 12C_2386.9_1160EC23_[928; glucopiranosa-6-fosfato (6TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 239001-10-1 RI: 2387. T.R.: 15,242

15 NÚMERO DE PICOS: 78 NOMBRE: 12C_2310.0_1191EC10_Metoxiamina fructosa-6-fosfato (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 232002-10-1 RI: 2310 T.R.: 14,783 NÚMERO DE PICOS: 127

NOMBRE: 12C_2257.2_1160EC23_[715; Eritritol (4TMS)]

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 226001-10-1 RI: 2257 T.R.: 14,556 NÚMERO DE PICOS: 143

5 NOMBRE: 12C_2718.4_1313EC43_(824; D-sedoheptulosa-7-fosfato (7TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 272002-10-1 RI: 2718 T.R.: 16,521

10 NÚMERO DE PICOS: 469

NOMBRE: 12C_2347.2_1313EC43_Metoxiamina glucosa-6-fosfato {BP} (6TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 235002-10-1 RI: 2347 T.R.: 14,555 NÚMERO DE PICOS: 146 NOMBRE: 12C_2039.0_1313EC43_[607; Putrescina (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 204.003-10-1 RI: 2039 T.R.: 12,763 NÚMERO DE PICOS: 219 NOMBRE: 12C_1476.2_1313EC75_Ácido citramálico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 148001-10-1 RI: 1476 T.R.: 8,471 NÚMERO DE PICOS: 38 NOMBRE: 12C_1735.8_1313EC75_glicerol-2-fosfato (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 174002-10-1 RI: 1736 T.R.: 10,585 NÚMERO DE PICOS: 393

NOMBRE: 12C_1761.3_1313EC75_[757; Dimetoxiamina de 2-desoxi-pentos-3-ilosa (2TMS)] 218

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 176004-10-1 RI: 1762 T.R.: 10,782 NÚMERO DE PICOS: 86

NOMBRE: 12C_1796. 4_1313EC75_[646; 3-deoxiglucitol (5TMS)]

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

Número de CAS: 180001-10-1 10 RI: 1796

T.R.: 11,055

NÚMERO DE PICOS: 263 NOMBRE: 12C_3380.0_1274ECll_Lanosta-8,24-dien-3-beta-ol (1TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 338001-10-1 RI: 3380 T.R.: 19,985

220 NÚMERO DE PICOS: 215

NOMBRE: 12C_3081.9_1160EC23_[808; Adenosina-5'-monofosfato (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 308001-10-1 RI: 3082. T.R.: 18,685 NÚMERO DE PICOS: 174 NOMBRE: 12C_267 9.2_1160EC23_[837; alfa-D-fructofuranosa-1,6-bisfosfato (7TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 268001-10-1 RI: 2679 T.R.: 16,787 NÚMERO DE PICOS: 170 NOMBRE: 12C_2339.5_1160EC23_[882; Pseudouridina (5TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 234001-10-1 RI: 2340 T.R.: 14,991 NÚMERO DE PICOS: 133 NOMBRE: 12C_2651.1_1160EC15_[721; Adenosina (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 265001-10-1 RI: 2651 T.R.: 16,639 NÚMERO DE PICOS: 46

NOMBRE: 12C_1924.2_1313EC57_Manitol (6TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 193002-10-1 RI: 1924 T.R.: 12,009 NÚMERO DE PICOS: 126 NOMBRE: 12C_1920.1_1313EC57_[529; Ácido metiilcítrico (4TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 192007-10-1 RI: 1920 T.R.: 11,983 NÚMERO DE PICOS: 157 NOMBRE: 12C_1544.5_1313EC75_Ácido eritrónico (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 154001-10-1 RI: 1545 T.R.: 9,099 NÚMERO DE PICOS: 72

10 NOMBRE: 12C_1291.0_1185EK01_Leucina (2TMS)

COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 129002-10-1 RI: 1291 NÚMERO DE PICOS: 98

NOMBRE: 12C_1273.1_1313EC43_[938; Ácido sulfúrico (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 127005-10-1 RI: 1273

10 T.R.: 6,066 NÚMERO DE PICOS: 344 NOMBRE: 12C_12 69.8JL135EC4 4_Urea (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 127002-01-1 RI: 1270 T.R.: 402,296 RSN: 2975,0 NÚMERO DE PICOS: 51 NOMBRE: 12C_1723.7_1160EC15_2-Ácido aminoadípico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 172006-10-1 RI: 1724 T.R.: 10,996 NÚMERO DE PICOS: 183 NOMBRE: 12C_1739.1_1274ECll_Ácido aspártico (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 174003-10-1 RI: 1739 T.R.: 11,121 NÚMERO DE PICOS: 117

NOMBRE: 12C_2 225.6_117 8 EC2 0_Triptófano (3TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 223001-10-1 RI: 2226 T.R.: 14,362 NÚMERO DE PICOS: 95 NOMBRE: 12C_2770.4_1160EC15_[626; 5'-Metiltioadenosina (3TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 277004-10-1 RI: 2770 T.R.: 17,269 NÚMERO DE PICOS: 24

NOMBRE: 12C_1324.1_1313EC07_Ácido nicotínico (1TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 133004-10-1 RI: 1324 T.R.: 6,689 NÚMERO DE PICOS: 17

NOMBRE: 12C_2427.5_1313EC07_[931; mioinositol-1-fosfato (7TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 243001-10-1 RI: 2428

20 T.R.: 14,977 NÚMERO DE PICOS: 283 NOMBRE: 12C_2000.0_1313EC07_Ácido pantoténico (3TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

232 Número de CAS: 200006-10-1 RI: 2000 T.R.: 12,490 NÚMERO DE PICOS: 107

NOMBRE: 12C_1292.9_1313ECll_Leucina (2TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 129002-10-1 RI: 1293

10 T.R.: 6,287 NÚMERO DE PICOS: 4

NOMBRE: 12C_1490.1_2119DC04_[545; Ácido 2,3-dimetilsuccínico (2TMS)] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer

15 Número de CAS: 149003-10-1 RI: 1490 T.R.: 20,245 NÚMERO DE PICOS: 166 NOMBRE: 12C_2816.0_2119DC04_[542; Metoxiamina maltosa {BP} (8TMS); alfa-D-Glc-(1,4)-alfa-D-Glc] COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer Número de CAS: 282003-10-1 RI: 2816 T.R.: 41,182 NÚMERO DE PICOS: 75

NOMBRE: 12C_1685.1_1313EC57_Metoxiamina ribosa (4TMS)

10 COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1685 RI: 1685 RI: 1685 Número de CAS: 168002-10-1 RI: 1685 T.R.: 10,186 FUENTE: C:\NISTMS\AMDIS32\LIB\MS_RI.msp NÚMERO DE PICOS: 431 NOMBRE: 13C_1685. l_1313EC16_Metoxiamina ribosa (4TMS) COMENTARIOS: Kopka J, MPIMP, Dept. Willmitzer RI: 1685 RI: 1685 RI: 1685 Número de CAS: 168002-11-1 RI: 1685 T.R.: 10,202 FUENTE: C: amdis32 NISTMS\\\\ EM_RI.msp LIB NÚMERO DE PICOS: 272

Tabla 5

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

1 0 SCE 189005 1888,7 1313EC36 [772; D-glucosa (5TMS)] 2 0 SCE 272001 2723,7 1160EC23 [777; metoxiamina fructosa-6fosfato (6TMS)] 3 0 SCE 211003 213,2 1313EC36 [697; metoxiamina ribosa-5

fosfato (5TMS)] 4 0 SCE 158002 1580,7 1313EC75 [829; 1-feniletanol (1TMS)]5 0 SCE 167003 1673,2 1313EC36 [No disponible] 6 0 SCE 152001 1522,3 1313EC36 Metoxiamina (2TMS) Metionina 7 0 SCE 152002 1509,3 1178EC16 [622; ácido parabánico

(2TMS)] 8 0 SCE 183001 1827,9 1313EC75 Arginina (5TMS) Arginina 9 0 SCE 132003 1318,4 1313EC75 Prolina (2TMS) Prolina 10 0 SCE 168004 1675,0 1274EC11 [877; ácido pirofosfórico

(4TMS)] 11 0 SCE 277004 2770,4 1160EC15 [626; 5-metiltioadenosina

(3TMS)] 12 0 SCE 188005 1882,4 1160EC15 Adenina (2TMS) Adenina 13 0 SCE 283001 2826,4 1313EC75 [855; escualeno] 14 0 SCE 189006 1892,7 1313EC36 Tirosina (2TMS) Tirosina 15 0 1275,7 1135EC06 Ácido benzoico (1TMS) Contaminación Ácido benzoico 16 0 SCE 148002 1481,5 1160EC15 [815; (E)-4-metil-5-hidroxi-3

penten-2-ona (1TMS)]

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

17 0 3007,7 1164EK03 Ácido 5-cis-ácido Ácido 5-ciscafeoilquínico (6TMS) cafeoilquíno

18 1 3200,0 1135EC03 n-dotriacontano n-dotriacontano

19 1 3600,0 1135EC04 n-hexatriacontano n-hexatriacontano

20 1 2800,0 1129EC05 n-octacosano n-octacosano

21 1 2200,0 1135EC03 n-docosano n-docosano

22 1 1900,0 1135EC04 n-nonadecano n-nonadecano

23 1 1500,0 1135EC03 n-pentadecano n-pentadecano

24 1 1200,0 1135EC03 n-dodecano n-dodecano

25 2 SCE 273002 2733,0 1313EC75 [840; metoxiamina maltosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,4)-D-Glc]

26 2 SCE 291002 2906,7 131EC75 Metoxiamina isomaltosa {BP} Isomaltosa(8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc (8TMS)

27 2 SCE 281001 2811,2 1160EC39 [895; metoxiamina isomaltosa(8TMS)]

28 2 2836,1 1288EC38 Maltitol (9TMS); alfa-D-Glc-Maltitol (1,4)-D-sorbitol (9TMS)

29 2 SCE 287001 2871,8 131EC75 Metoxiamina isomaltosa Isomaltosa(8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc (8TMS)

30 2 2906,6 1344EC15 Metoxiamina isomaltosa {BP} Isomaltosa(8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc (8TMS)

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

31 2 2872,9 1344EC15 Metoxiamina isomaltosa Isomaltosa

(8TMS); alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc

(8TMS)

32 2 2765,9 1344EC78 Metoxiamina maltosa {BP} Maltosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,4)-D-Glc

33 2 2741,2 1344EC78 Metoxiamina maltosa (8TMS); Maltosa alfa-D-Glc-(1,6)-D-Glc

34 2 2709,9 1344EC79 Metoxiamina lactosa {BP} Lactosa

(8TMS); beta-D-Gal-(1,4)-D-

Glc

35 2 2693,9 1344EC76 Metoxiamina lactosa (8TMS); Lactosa beta-D-Gal-(1,4)-D-Glc

36 2 SCE 274002 2748,2 1274EC17 Trehalosa (8TMS); alfa-D-Glc-Trehalosa (1,1)-alfa-D-Glc

37 2 SCE 262001 2619,2 1313EC75 [892; sacarosa (8TMS); alfaD-Glc-(1,2)beta-D-Fru]

38 2 SCE 269002 2687,5 1274EC17 [964; Trehalosa (8TMS); alfaD-Glc-(1,1)-alfa-D-Glc]

39 2 3463,2 1288EC31 Melezitosa (11TMS)); alfa-D-Melezitosa

Glc-(1,3)beta-D-Fru-(2,1)-alfa

D-Glc

40 2 2744,2 1288EC01 Trehalosa (8TMS); alfa-D-Glc-Trehalosa (1,1)-alfa-D-Glc

41 2 2640,8 1194EK21 Sacarosa (8TMS); alfa-D-Glc-Sacarosa (1,2)-beta-D-Fru

42 3 SCE 184004 1843,5 1313EC36 [919; D-xilopiranosa (4TMS)]

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

43 3 SCE 230001 2294,6 1274EC17 [877; beta-Dgalactopiranósido-(1,2)glicerol (6TMS)]

44 3 SCE 293001 2929,8 1274EC17 [902; Melibiosa (8TMS); alfaD-Gal-(1,6)-D-Glc (8TMS)]45 3 SCE 197002 1973,7 1313EC36 [945; beta-D-glucopiranosa(5MS)] 46 3 SCE 181005 1806,4 1274EC17 [944; D-manopiranosa(5TMS)] 47 3 SCE 166002 1659,6 1313EC75 [910; metoxiamina del ácido 2-cetoglucónico (4TMS)48 3 SCE 209004 2087,4 1313EC75 [756; beta-Dmetilglucopiranósido (4TMS)]49 3 SCE 203003 2023,2 1160EC43 [766; beta-Dmetilglucopiranósido (4TMS)]50 3 1879,9 1344EC77 Alfa-D-metilglucopiranósido Alfa-D(4TMS) metilglucopiranósido51 4 SCE 248002 2474,9 1274EC17 [945; uridina (3TMS)]52 4 SCE 234001 2339,5 1160EC23 [882; pseudouridina (5TMS)]53 4 SCE 177004 1771,1 1274EC11 [812; D-xilofuranosa (4TMS)]54 4 SCE 209002 2091,2 1313EC11 Mio-inositol (6TMS) Mioinositol 55 4 2091,4 1288EC40 Mio-inositol (6TMS) Mioinositol 56 4 SCE 179001 1784,9 1313EC75 [798; ácido ribónico (5TMS)]57 4 SCE 200001 1999,3 1313EC75 Ácido glucónico (6TMS) Ácido gulónico 58 4 1997,0 1288EC09 Ácido glucónico (6TMS) Ácido gulónico

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]59 4 1991,6 2011EC38 Ácido galactónico (6TMS) Ácido galactónico 60 4 1959,2 2011EC40 Ácido gulónico (6TMS) Ácido gulónico 61 5 SCE 188002 1882,5 1244EC11 Metoxiamina manosa (5TMS) Manosa 62 5 SCE 185003 1848,6 131EC75 [708; metoxiaminma glucosa (5TMS)] 63 5 SCE 214003 2134,7 1274EC17 [904; metoxiamina galactosa (5TMS)] 64 5 SCE 191001 1909,6 1274EC17 Metoxiamina glucosa {BP} Glucosa (5TMS) 65 5 SCE 189002 1889,9 1274EC17 Metoxiamina glucosa (5TMS) Glucosa 66 5 SCE 213001 2128,7 1274EC17 [857; manitol (6TMS)]67 5 1908,5 1185EK16 Metoxiamina glucosa {BP} Glucosa (5TMS) 68 5 1906,6 1185EK19 Metoxiamina galactosa {BP} Galactosa (5TMS) 69 5 1894,9 1185EK17 Metoxiamina manosa {BP} Manosa (5TMS) 70 5 1889,8 1135EC00 Metoxiamina altrosa (5TMS) Altrosa 71 5 1883,7 1185EK19 Metoxiamina galactosa Galactosa (5TMS) 72 5 1879,8 1185EK17 Metoxiamina manosa (5TMS) Manosa 73 6 SCE 226001 2257,2 1160EC23 [715; eritritol (4TMS)]74 6 SCE 218001 2180,5 1313EC75 [733; treitol (4TMS)]75 6 SCE 216003 2155,6 1313EC75 [795; eritritol (4TMS)]

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

76 6 SCE 184003 1835,3 1313EC75 [731; eritrosa (3TMS)] 77 6 SCE 180002 1802,0 1313EC75 [706; xilitol (5TMS)] 78 7 1886,0 1344EC16 Metoxiamina del ácido 2-Ácido 2

cetoglucónico {BP} (5TMS) cetoglucónico

79 7 1869,2 1344EC16 Metoxiamina del ácido 2-Ácido 2cetoglucónico {BP} (5TMS) cetoglucónico

80 7 1862,2 2011EC39 Metoxiamina del ácido 2-ceto-Ácido 2-ceto-LL-gulónico {BP} (5TMS) gulónico

81 7 SCE 188004 1879,6 1313EC75 Metoxiamina fructosa {BP} Fructosa

(5TMS)

82 7 SCE 187002 1869,1 1313EC75 Metoxiamina fructosa (5TMS) Fructosa

83 7 1875,4 118EK18 Metoxiamina fructosa {BP} Fructosa

(5TMS) 84 7 1870,1 1135EC00 Metoxiamina sorbosa {BP} Sorbosa

(5TMS)

85 7 1866,7 1185EK18 Metoxiamina fructosa (5TMS) Fructosa

86 7 1865,3 1135EC00 Metoxiamina sorbosa (5TMS) Sorbosa

87 7 SCE 167002 1670,8 1313EC75 Metoxiamina arabinosa Arabinosa

(4TMS)

88 7 1681,9 1288EC26 Metoxiamina ribosa (4TMS) Ribosa

89 7 1666,9 1288EC25 Metoxiamina arabinosa Arabinosa

(4TMS)

90 7 1660,4 1288EC27 Metoxiamina xilosa (4TMS) Xilosa

91 7 1652,8 1288EC27 Metoxiamina xilosa {BP} Xilosa

(4TMS)

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

92 8 SCE 196004 1956,6 1313EC75 [793; D-galactono-1,4-lactona (4TMS)]

93 8 2766,5 1135EC00 Metoxiamina turanosa {BP} Turanosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,3)-D-Fru

94 8 2744,4 1135EC00 Metoxiamina turanosa Turanosa (8TMS); alfa-D-Glc-(1,3)-D-Fru

95 8 1921,2 2011EC40 D(-)-gulono-1,4-lactona D(-)-gulono-1,4(4TMS) lactona

96 8 1920,6 2011EC41 L(+)-gulono-1,4-lactona L(+)-gulono-1,4(4TMS) lactona

97 8 1886,5 2011EC38 L(+)-galactono-1,4-lactona L(+)-galactono-1,4(4TMS) lactona

98 8 1884,8 2011EC37 D(-)-galactono-1,4-lactona D(-)-galactono-1,4(4TMS) lactona

99 8 SCE 171008 1710,6 1274EC17 [817; ribitol (5TMS)]

100 8 1502,4 1288EC34 Eritritol (4TMS) Eritritol

101 8 SCE 193001 1931,9 1313EC75 Sorbitol (6TMS); glucitol Sorbitol (6TMS)

102 8 SCE 193002 1924,2 1313EC57 Manitol (6TMS) Manitol

103 8 1931,1 1288EC35 Sorbitol (6TMS); glucitol Sorbitol (6TMS)

104 8 1927,7 1288EC32 Manitol (6TMS) Manitol

105 8 SCE 173001 1731,5 1313EC36 Ribitol (5MTS) Ribitol

106 8 1726,6 1135EC25 Ribitol (5MTS) Ribitol

107 8 1935,5 1288EC36 Galactitol (6TMS) Galactitol

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

108 8 1710,0 1288EC37 Xilitol (5TMS) Xilitol 109 8 SCE 150002 1503,9 1313EC75 Eritritol (4TMS) Eritritol 110 8 1494,1 1135EC00 Treitol (4TMS) Treitol 111 9 3152,5 1164EK03 Ácido 1-cafeolefínico {BP}112 9 3138,7 1164EK03 Ácido 4-cafeolefínico {BP}113 9 3397,0 1164EK03 Ácido 1-trans-cafeolefínico Ácido 1-trans

(6TMS) cafeolefínico

114 9 3168,3 1164EK03 Ácido 4-trans-cafeolefínico Ácido 4-trans(6TMS) cafeolefínico

115 9 3009,1 1164EK03 Ácido 4-cis-cafeolefínico Ácido 4-cis(6TMS) cafeolefínico

116 9 3190,0 1164EK03 Ácido 5-trans-cafeolefínico Ácido 5-trans(6TMS) cafeolefínico

117 9 3113,7 1164EK03 Ácido 3-trans-cafeolefínico Ácido 3-trans(6TMS) cafeolefínico

118 9 2990,3 1164EK03 Ácido 5-cis-cafeolefínico Ácido 5-cis

(6TMS) cafeolefínico

119 10 2014,0 1288EC06 Ácido glucárico (6TMS) Ácido glucárico

120 10 1961,3 1288EC07 Metoxiamina del ácido Ácido galacturónico

galacturónico {BP} (5TMS)121 10 1940,3 1288EC07 Metoxiamina del ácido Ácido galacturónicogalacturónico (5TMS)122 10 SCE 172006 1723,7 1160EC15 Ácido 2-aminoadípico (3TMS) Ácido 2aminoadípico 123 10 2089,0 1288EC05 Alantoína (3TMS) Alantoína

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

124 10 2775,3 1344EC07 Guanosina (5TMS) Guanosina 125 10 2727,0 1344EC26 Adenosina (4TMS) Adenosina 126 10 2660,0 1135EC00 Xantosina (5TMS) Xantosina 127 10 1853,9 1164EK02 Dímero de ácido Ácido L(+)-Dímero de ácido

deshidroascórbico; ácido ascórbico forma deshidroascórbico;L(+)-ascórbico dímero de ácido ácido L(+)-ascórbico deshidroascórbico 128 10 1826,9 1313EC200 Ácido cítrico (4TMS) Ácido cítrico 129 10 1821,6 1288EC03 Ácido isocítrico (4TMS) Ácido isocítrico 130 10 1854,9 1164EK03 Ácido D(-)-quínico (5TMS) Ácido D(-)-quínico 131 10 1813,5 1313EC199 Ácido shikímico (4TMS) Ácido shikímico 132 10 SCE 175003 1747,3 1313EC36 [612; ácido ácido 4aminobutírico (2TBS)]

133 10 SCE 176004 1761,3 1313EC75 [757; dimetoxiamina de 2desoxi-pentos-3-xilosa(2TMS)]

134 10 SCE 169001 1694,8 1313EC75 [746; ácido ribónico-1,4lactona (3TMS)] 135 10 SCE 137001 1372,9 1313EC75 Ácido fumárico (2TMS) Ácido fumárico 136 10 1372,0 1288EC46 Ácido fumárico (2TMS) Ácido fumárico 137 10 1759,0 1344EC20 Ácido cis-aconítico (3TMS) Ácido cis-aconítico138 10 1608,3 2011EC27 Metoxiamina del ácido 2-Ácido 2cetoglutárico (2TMS) cetoglutárico 139 10 SCE 192007 1920,1 1313EC57 [761; ácido 2-hidroxi-3-metil2-butenoico (2TBS)]

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]140 10 SCE 182004 1822,5 1313EC75 Ácido cítrico (4TMS) Ácido cítrico 141 10 SCE 158003 1581,5 1274EC17 [680; ácido 2,3dimetilsuccínico (2TMS)]142 10 SCE 157002 1573,9 1274EC17 [708; ácido 2,3dimetilsuccínico (2TMS)]143 10 SCE 127002 1269,8 1313EC44 Urea (2TMS) Urea 144 10 1428,7 1344EC11 Ácido glutárico (2TMS) Ácido glutárico 145 10 SCE 148001 1476,2 1313EC75 Ácido citramálico (3TMS) < 146 10 1475,1 1288EC45 Ácido citramálico (3TMS) Ácido citramálico(3TMS) 147 10 SCE 134001 1338,0 1313EC75 Ácido succínico (2TMS) Ácido succínico 148 10 1346,0 2911EC29 Ácido succínico (2TMS) Ácido succínico 149 10 SCE 127005 1273,1 1313EC43 [938;ácido sulfúrico (2TMS)]150 10 SCE 146003 1464,2 1313EC75 [725; ácido 2-cetooctanoico(2TMS)] 151 10 1373,5 1164CC54 Ácido 2-metil-2-butenodioico Ácido 2-metil-2(2TMS) butenodioico 152 10 1336,4 2011EC31 Ácido maleico (2TMS) Ácido maleico

153 11 SCE 258001 2578,1 1274EC11 [734; 1-monooleoilglicerol(2TMS); 1-monooleoilglicerol (1TMS)]

154 11 SCE 174002 1735,8 1313EC75 Glicerol-2-fosfato (4TMS) Glicerol-2-fosfato 155 11 SCE 217002 2168,9 1313EC75 [705; ácido 2-cetoglucónico(5TSM)]

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

156 11 1730,5 1288EC39 Metoxiamina ramnosa {BP} Ramnosa (4TMS) 157 11 1745,0 1288EC30 Metoxiamina fucosa {BP} Fucosa (4TMS) 158 11 1731,6 1288EC30 Metoxiamina fucosa (4TMS) Fucosa 159 11 1722,2 1288EC39 Metoxiamina ramnosa (4TMS) Ramnosa 160 11 SCE 140003 1394,9 1274EC17 [644; 2-metil-1,3-butanodiol(2TMS)] 161 11 1412,3 1344EC09 Dímero de ácido láctico El ácido láctico Dímero de ácido (2TMS) forma dímero de láctico. ácido láctico 162 11 SCE 266001 2656,9 1313EC75 [559; eritritol (4TMS)]163 11 SCE 228001 2278,6 1274EC17 [583; eritritol (4TMS)]164 11 SCE 252002 2518,0 1313EC75 [644; eritritol (4TMS)]165 11 SCE 249001 2493,1 1313EC75 [657; eritritol (4TMS)]166 11 SCE 180001 1796,4 1313EC75 [646; 3-deoxiglucitol (5TMS)]167 11 1957,4 164EK02 Ácido D(-)-isoascórbico Ácido D(-)(4TMS) isoascórbico 168 11 1946,4 1164EK02 Ácido L(+)-ascórbico (4TMS) Ácido L(+)ascórbico 169 11 SCE 135003 1352,5 1274EC17 Ácido glicérico (3TMS) Ácido glicérico

170 11 1639,3 1135EC00 Ácido tartárico (4TMS): ácido Ácido tartárico2,3-dihidroxibutanodioico (4TMS)

171 11 SCE 154001 1544,5 1313EC75 Ácido eritrónico (4TMS) Ácido eritrónico

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]172 11 1559,6 2011EC33 Ácido treónico (4TMS) Ácido treónico 173 11 SCE 149001 1488,2 1274EC17 Ácido málico (3TMS) Ácido málico 174 11 1488,2 1288EC44 Ácido málico (3TMS) Ácido málico 175 11 SCE 238002 1488,5 1313EC75 [724; glicerol (3TMS)]176 11 SCE 173002 2383,7 1313EC36 Metoxiamina fucosa (4TMS) Fucosa 177 11 1726,7 1135EC00 Metoxiamina treosa {BP} Treosa (3TMS) 178 11 1461,7 1135EC00 Metoxiamina treosa (3TMS) Treosa 179 11 1467,9 1344EC12 Metoxiamina eritrosa (3TMS) Eritrosa 180 11 1453,0 1344EC12 Metoxiamina eritrosa {BP} Eritrosa (3TMS) 181 11 SCE 129003 1293,1 1313EC75 Glicerol (3TMS) Glicerol 182 11 1302,8 2011EC21 Glicerol (3TMS) Glicerol 183 12 SCE 211004 2109,7 1313EC75 [662; metoxiamina ribosa-5fosfato {BP} (5TMS)]184 12 SCE 243001 2427,1 1274EC17 [931; mio-inositol-2-fosfato (7TMS)] 185 12 SCE 318001 3183,2 1160EC23 [748; D-sedoheptulosa-7fosfato (7TMS)] 186 12 SCE 239001 2386,9 1160EC23 [928; glucopiranosa-6-fosfato (6TMS)] 187 12 2383,0 2011EC24 Sorbitol-6-fosfato (7TMS) Sorbitol-6-fosfato 188 12 SCE 232002 2310,0 1191EC10 Metoxiamina fructosa-6-Fructosa-6-fosfato fosfato (6TMS)

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

189 12 SCE 268001 2679,2 1160EC23 [837; alfa-D-fructofuranosa1,6-bisfosfato (7TMS)]

190 12 2474,0 1344EC24 Mio-inositol-2-fosfato (7TMS) Mio-inositol-2fosfato

191 12 SCE 272002 2718,4 2011EC43 [824; D-sedoheptulosa-7fosfato (7TMS)]

192 12 2318,9 2011EC23 Metoxiamina fructosa-6-Fructosa-6-fosfato fosfato (6TMS)

193 12 SCE 256001 2564,4 2313EC75 [945; galactofuranosa-6fosfato (7TMS)]

194 12 SCE 235002 2347,2 1313EC43 Metoxiamina glucosa-6-Glucosa-6-fosfato fosfato {BP} (6TMS)

195 12 SCE 233002 2328,1 1313EC75 Metoxiamina glucosa-6-Glucosa-6-fosfato fosfato (6TMS)

196 12 2440,4 2011EC32 Ácido glucónico-6-fosfato Ácido glucónico-6(7TMS) fosfato

197 12 2350,9 2011EC22 Metoxiamina glucosa-6-Glucosa-6-fosfato fosfato {BP} (6TMS)

198 12 2348,0 1344EC17 Metoxiamina galactosa-6-Galactosa-6-fosfato fosfato {BP} (6TMS)

199 12 2330,5 2011EC22 Metoxiamina glucosa-6-Glucosa-6-fosfato fosfato (6TMS)

200 12 2311,4 1344EC17 Metoxiamina galactosa-6-Galactosa-6-fosfato fosfato (6TMS)

201 12 2331,8 1344EC18 Metoxiamina manosa-6-Manosa-6-fosfato fosfato {BP} (6TMS)

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

202 12 2313,9 1344EC18 Metoxiamina manosa-6-Manosa-6-fosfato fosfato (6TMS)

203 12 SCE 308001 3981,9 1160EC23 [808; adenosina-5monofosfato (5TMS)]

204 12 SCE 203004 2023,7 1274EC17 [680; glicerol-2-fosfato (4TMS)]

205 12 SCE 181003 1813,0 1313EC75 Ácido glicérico-3-fosfato Ácido glicérico-3(4TMS) fosfato

206 12 1813,4 1344EC13 Ácido glicérico-3-fosfato Ácido glicérico-3(4TMS) fosfato

207 12 SCE 177002 1769,9 1313EC75 Glicerol-3-fosfato (4TMS) Glicerol-3-fosfato

208 12 1770,0 1344EC63 L-glicerol-3-fosfato (4TMS) L-glicerol-3-fosfato

209 12 1735,8 1344EC63 L-glicerol-2-fosfato (4TMS) L-glicerol-2-fosfato

210 12 1731,7 1344EC71 Metoxiamina DL-DL-gliceraldehido-3gliceraldehido-3-fosfato {BP} fosfato (3TMS)

211 12 1719,5 1344EC71 Metoxiamina DL-DL-gliceraldehido-3gliceraldehido-3-fosfato fosfato (3TMS)

212 12 1723,3 1344EC71 Metoxiamina DL-DL-gliceraldehido-3gliceraldehido-3-fosfato {BP} fosfato (3TMS)

213 12 1708,9 1344EC71 Metoxiamina DL-DL-gliceraldehido-3gliceraldehido-3-fosfato {BP} fosfato (3TMS)

214 12 SCE 232001 2311,4 1274EC17 Metoxiamina galactosa-6-Galactosa-6-fosfato fosfato (6TMS)

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

215 12 SCE 129001 1296,5 1191EC10 Ácido fosfórico (3TMS) Ácido fosfórico

216 12 1293,1 1164EK02 Ácido fosfórico (3TMS) Ácido fosfórico

217 13 SCE 265001 2651,1 1160EC15 [721; adenosina (4TMS)]

218 13 SCE 181004 1806,2 1313EC75 [549; ácido 2-ceto-Dglucónico (5TMS)]

219 13 SCE 188006 1877,4 1274EC17 Alfa-D-metilglucopiranósido Alfa-D(4TMS) metilglucopiranósido

220 13 SCE 138001 1381,0 1313EC75 Serina (3TMS) Serina (3TMS)

221 14 SCE 177003 1770,3 1274EC17 [No disponible]

222 14 SCE 179002 1794,4 1274EC17 [789; tiramina (3TMS)]

223 14 SCE 143003 1436,0 1313EC36 [619; 2-(3’,4’-bishidroxifenil)2-oxoetilamina (4TMS)]

224 14 SCE 128002 1281,5 1313EC36 Etanolamina [3TMS] Etanolamina

225 14 SCE 216002 2162,3 1313EC75 [648; etilamina (2TMS)]

226 14 SCE 154002 1538,2 1313EC36 [596; ácido N-acetilglutámico(2TMS)]

227 14 SCE 192003 1915,4 1274EC17 Lisina (4TMS) Lisina

228 14 1916,6 164EK04 L-lisina (4TMS) L-lisina

229 14 SCE 186002 1858,1 1313EC36 Lisina (3TMS) Lisina

230 14 SCE 200002 2002,2 1178EC16 [775; dopamina (4TMS)]

231 14 SCE 176006 1763,9 1313EC75 Ornitina (3TMS); Arginina Arginina forma Ornitina; arginina{BP} (3TMS) ornitina

232 14 2255,2 1344EC14 Espermidina (5TMS) Espermidina

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

233 14 2197,4 1344EC14 Espermidina (4TMS) {BP} Espermidina

234 14 SCE 182002 1819,8 1313EC75 Ornitina (4TMS); Arginina Arginina forma Ornitina; arginina{BP} (4TMS) ornitina

235 14 1820,5 1185EK04 Ornitina (4TMS) Ornitina, arginina

236 14 1412,9 164EK04 O-acetil-L-serina (2TMS) O-acetil-L-serina

237 14 2075,8 2011EC34 Dopamina (4TMS) Dopamina

238 14 1914,2 2011EC35 Tiramina (3TMS) Tiramina

239 14 SCE 206001 2064,0 1191EC10 [770; 3,4,6trishidroxifeniletiletanolamina(5TMS)

240 14 1737,0 1135EC00 Ácido 6-aminocaproico Ácido 6(3TMS) aminocaproico 241 14 1636,7 1135EC00 Ácido 5-aminovalérico Ácido 5(3TMS) aminovalérico 242 14 SCE 213003 2125,3 1313EC75 [832; dopamina (4TMS)]243 14 SCE 133001 1326,5 1274EC17 Glicina (3TMS) Glicina 244 14 1533,6 1344EC21 Ácido 4-aminobutírico (3TMS) Ácido 4aminobutírico 245 14 1440,4 1185EK03 Beta-alamina (3TMS) Beta-alanina 246 14 1326,9 1185EK07 Glicina (3TMS) Glicina 247 15 SCE 340002 3401,9 1274EC11 [805; 4,4-dimetilcolesta-8,24dien-ol (1TMS)] 248 15 SCE 334001 3337,9 1191EC10 [700; ergosta-5,7-dien-ol] 249 15 SCE 331001 3301,9 1274EC11 [674; ergosterol (1TMS)]

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

250 15 SCE 327001 3270,3 1313EC36 Ergosterol (1TMS) Ergosterol

251 15 SCE 338001 3380,0 1274EC11 Lanosta-8,24-dien-3-beta-ol Lanosta-8,24-dien(1TMS) 3-beta-ol

252 15 SCE 335001 3350,3 1274EC11 [692; ergosta-7,22-dien-3-ol (1TMS)]

253 15 3374,5 2014EC05 Estigmastan-3-ol (1TMS) Estigmastan-3-ol

254 15 SCE 349001 3487,5 1191EC08 [568; 2,3dihexadecanoilglicerol(1TMS)]

255 15 SCE 223003 2225,2 1313EC36 Ácido octadecanoico (1TMS) Ácidooctadecanoico 256 15 SCE 222001 2217,8 1274EC17 Ácido 9-(Z)-octadecanoico Ácido 9-(Z)(1TMS) octadecanoico 257 15 SCE 203002 2029,2 1274EC17 [910; ácido 9-(Z)octadecanoico (1TMS)]258 15 SCE 225002 2245,5 1313EC75 Ácido octadecanoico (1TMS) Ácidooctadecanoico 259 15 SCE 205001 2048,2 1313EC75 Ácido hexadecanoico (1TMS) Ácidohexadecanoico 260 15 SCE 185004 1850,9 1274EC11 [912; ácido tetradecanoico(1TMS)] 261 15 2834,5 1180EC12 Ácido tetracosanoico (1TMS) Ácidotetracosanoico 262 16 3296,6 1164EK03 Ácido 1-cafeolquínico {BP}263 16 2139,0 1164EK03 Ácido trans-cafeico (3TMS) Ácido trans-cafeico (3TMS)

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]264 16 1985,5 1164EK03 Ácido cis-cafeico (3TMS) Ácido cis-cafeico (3TMS) 265 16 2253,1 1164EK03 Ácido trans-sináptico (2TMS) Ácido transsináptico 266 16 2066,6 1164EK03 Ácido cis-sináptico (2TMS) Ácido cis-sináptico 267 16 2101,9 1164EK03 Ácido trans-ferúlico (2TMS) Ácido trans-ferúlico268 16 1947,0 2011EC48 Ácido trans-p-cumárico Ácido trans-p(2TMS) cumárico 269 16 1924,7 1164EK03 Ácido cis-ferúlico (2TMS) Ácido cis-ferúlico 270 16 1821,6 2011EC49 Ácido trans-o-cumárico Ácido trans-o(2TMS) cumárico 271 17 SCE 223001 2225,6 1178EC20 Triptófano (2TMS) Triptófano 272 17 2225,2 1179EK02 L-triptófano (2TMS) Triptófano 273 17 2226,4 1164EK04 L-triptófano (3TMS) Triptófano 274 17 1975,9 1344EC27 Ácido indol-3-acético (2TMS) Ácido indol-3acético 275 17 SCE 151003 1514,1 1313EC36 [729; éster metílico de N,Ndimetillisina] 276 17 1871,6 1164EK04 L-asparragina (4TMS) L-asparragina 277 17 SCE 174003 1739,1 1274EC11 [No disponible] 278 17 SCE 141003 1410,5 1313EC36 [700; 2-metil-1,2-propanodiol(2TMS)] 279 17 SCE 192006 1924,5 1313EC16 Histidina (3TMS) Histidina

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

280 17 SCE 187004 1868,5 1274EC17 [826; éster metílico del ácido beta-[[(5-metil-2tienil)metilenoaminobencenoacético]

281 17 SCE 184002 1842,1 1313EC75 [693; ácido 2-furan-2hidroxiacético (2TMS)]282 17 SCE 176003 1755,7 1313EC75 [829; ácido orótico (3TMS)]283 17 SCE 136001 1364,2 1313EC11 Uracilo (2TMS) Uracilo 284 17 1419,2 1135EC00 Timina (2TMS) Timina 285 17 SCE 204003 2039,0 1313EC43 [607; putrescina (4TMS)]286 17 SCE 172005 1720,9 1313EC36 [No disponible] 287 17 SCE 150003 1495,6 1313EC36 [815; etil-3(2H)-tiofenona] 288 17 SCE 167001 1673,8 1191EC10 Homocisteína (3TMS) Homocisteína 289 17 SCE 141004 1414,0 1274EC17 [590; 1-acetil-2-tiohidantoína] 290 17 1940,4 1344EC27 Ácido indol-3-acético (1TMS) Ácido indol-3acético 291 17 SCE 157001 1565,1 1274EC17 Fenilalanina (1TMS) Fenilalanina 292 17 1565,2 1164EK04 L-fenilalanina (1TMS) L-fenilalanina 293 17 SCE 335002 3358,2 1191EC08 [693; ergost-7-en-ol (1TMS)] 294 17 SCE 182006 1824,3 191EC08 [570; hipoxantina (2TMS)]295 17 1908,3 1344EC04 Adenina (1TMS) Adenina 296 17 1879,6 1344EC04 Adenina (2TMS) Adenina 297 17 2911,5 1344EC10 Delta-tocoferol (1TMS) Delta-tocoferol

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]298 17 1843,5 201EC47 Ácido p-aminobenzoico Ácido p(2TMS) aminobenzoico 299 17 1628,2 1344EC22 Ácido antranílico (2TMS) Ácido antranílico 300 17 2233,1 1313EC75 Éster metílico del ácido n-Éster metílico del nonadecanoico ácido nnonadecanoico 301 17 1402,9 1344EC19 Ácido mevalónico-1-lactona Ácido mevalónico-1(1TMS) lactona 302 18 SCE 132002 1316,0 1313EC36 Isoleucina (2TMS) Isoleucina 303 18 1315,1 1164EK04 L-isoleucina (2TMS) L-isoleucina 304 18 1351,6 1344EC23 Norleucina (2TMS) Norleucina 305 18 SCE 129002 1291,0 1185EK01 Leucina (2TMS) Leucina 306 18 SCE 129002 1291,0 1185EK01 Leucina (2TMS) Duplicación Leucina 307 18 SCE 159001 1595,8 1274EC17 [639; prolina (2TMS)]308 18 1318,8 1185EK05 L-prolina (2TMS) L-prolina 309 18 SCE 163001 1625,9 1274EC17 Ácido glutámico (3TMS) Ácido glutámico 310 18 1627,1 1185EK12 Ácido L-glutámico (3TMS) Ácido L-glutámico 311 18 SCE 178001 1784,4 1313EC36 Glutamina (3TMS) Glutamina 312 18 1782,6 1185EK08 L-glutamina (3TMS) L-glutamina

313 18 SCE 153002 1529,0 1313EC75 Ácido piroglutámico (2TMS) Glutamina forma Ácido piroglutámicoácidopiroglutámico

314 18 1530,9 1185EK13 Ácido piroglutámico (2TMS) Ácido piroglutámico

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]315 18 1526,0 1185EK10 4-hidroxiprolina (3TMS) 4-hidroxiprolina 316 18 SCE 165002 1653,8 1191EC10 [548; leucina (2TBS)]317 18 SCE 171003 1708,2 1313EC36 [499; ácido 2-etil-3-hidroxi-3metilvalérico (2TMS)]

318 18 SCE 176005 1758,1 1313EC75 [636; 4R-acetamido-2,3-(Z)epoxi-4-(E)hidroxiciclohexano (1TMS)]

319 18 2135,1 1344EC07 Guanina (4TMS) Guanina 320 18 2086,8 1344EC29 Metoxiamina de ácido Ácido prefénico

prefénico (3TMS) 321 18 1630,2 1313EC00 Trietanolamina (3TMS) Trietanolamina 322 18 2127,8 2011EC19 L(+)-cistationina (2TMS) L(+)-cistationina 323 18 1140,2 1185EK07 Glicina (2TMS) Glicina 324 18 1456,9 1164EK04 L-homoserina (3TMS) Homoserina 325 18 SCE 140001 1403,1 1274EC17 Treonina (3TMS) Treonina 326 18 1402,5 1164EK04 L-treonina (3TMS) L-treonina 327 18 SCE 146001 1459,3 1313EC36 Homoserina (3TMS) Homoserina 328 18 2206,1 1164EK04 L(+)-cistationina (4TMS) L(+)-cistationina 329 18 1674,4 1164EK04 DL-homocisteína (3TMS) DL-homocisteína 330 18 2174,2 2011EC19 L(+)-cistationina {BP} (4TMS) L(+)-cistationina 331 18 1523,1 1164EK04 L-metionina (2TMS) L-metionina 332 18 SCE 156002 1560,7 1191EC08 Cisteína (3TMS) Cisteína 333 18 1560,6 1164EK04 L-cisteína (3TMS) L-cisteína

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]334 18 SCE 194002 1938,9 1274EC17 Tirosina (3TMS) Tirosina 335 18 1939,9 1185EK11 L-tirosina (3TMS) L-tirosina 336 18 SCE 164001 1640,8 1313EC36 Fenilalanina (2TMS) Fenilalanina 337 18 1641,7 1164EK04 L-fenilalanina (2TMS) L-fenilalanina 338 18 1441,4 1344EC30 S-metilcisteína (2TMS) S-metilcisteína 339 18 1380,3 1164EK04 L-serina (3TMS) L-serina 340 18 SCE 138002 1378,1 1313EC75 Alanina (3TMS) Alanina 341 18 1379,5 1185EK02 L-alanina (3TMS) L-alanina 342 18 SCE 168001 1682,1 1160EC15 Asparragina (3TMS) Asparragina 343 18 1681,2 1164EK04 L-asparragina (3TMS) L-asparragina 344 18 1510,5 1164EK04 N-acetil-L-serina (2TMS) N-acetil-L-serina 345 18 SCE 152002 1520,6 1313EC75 Ácido aspártico (3TMS) Ácido aspártico 346 18 1519,2 1185EK09 Ácido L-aspártico (3TMS) Ácido L-aspártico 347 18 1334,7 1344EC21 Ácido 4-aminobutírico (2TMS) Ácido 4aminobutírico 348 18 SCE 162001 1623,5 1313EC36 [882; ornitina (3TMS)]349 18 SCE 147002 1474,4 1191EC10 [No disponible]

350 18 SCE 147003 1467,9 178EC16 [709; 2,5diaminovalerolactama(2TMS)]

351 18 1260,4 2011EC44 Norvalina (2TMS) Norvalina 352 18 SCE 122001 1220,2 1274EC17 Valina (2TMS) Valina

(continuación)

ORDEN GRUPO FUENTE EM-ID RI EXPERIMENTO DERIVADO [MEJOR COMENTARIO METABOLITOCOINCIDENCIA, NOMBRE]

353 18 1221,9 1185EK06 L-valina (2TMS) L-valina

354 18 SCE 144007 1450,0 1313EC75 [690; N,N-Di-(2-hidroxietil)metanamina (2TMS)]

355 18 SCE 132001 1317,6 1313EC75 Treonina (2TMS) Treonina

356 18 1318,9 1164EK04 L-treonina (2TMS) L-treonina

357 18 SCE 144003 1440,3 1274EC17 [678; N,N-Di-(2-hidroxietil)metanamina (2TMS)]

358 18 SCE 142001 1419,8 1313EC75 Alanina {BP} (3TMS)

359 18 SCE 128001 1282,1 1274EC17 Serina (2TMS) Serina

360 18 1280,9 1164EK04 L-serina (2TMS) L-serina

361 18 1102,5 1185EK02 L-alanina (2TMS) L-alanina

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para analizar los metabolitos de una muestra biológica que comprende determinar cuantitativamente al menos 50 metabolitos en dicha muestra en un modo que dicha determinación cuantitativa resuelva diferencias de masas isotópicas dentro de un metabolito,

   estando caracterizado dicho procedimiento porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se ha mantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de tal forma que los metabolitos en dicha célula estén saturados con el isótopo con el que dicho compuesto metabolizable está marcado en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica está incrementado a al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos el 50 % de los metabolitos de la muestra biológica a analizarse contienen la marca isotópica.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente, antes de la determinación cuantitativa de los metabolitos, combinar la muestra biológica (es decir, la primera muestra biológica) con una segunda muestra biológica en la que los metabolitos no están marcados isotópicamente o están marcados isotópicamente de forma diferente a partir de la primera muestra biológica; y determinar en dichas muestras biológicas la cantidad relativa de metabolitos que son diferentes por su marca isotópica.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la primera y la segunda muestras biológicas corresponden a diferentes estados fenotípicos y/o genotípicos de las células comprendidas en las muestras o de las que se derivan las muestras.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que los diferentes estados fenotípicos y/o genotípicos son diferentes fases de desarrollo, entornos, suministros alimentarios, unidades taxonómicas, genomas de tipo silvestre y genomas mutantes o transgénicos, estados infectados y no infectados, estados morbosos y sanos o fases diferentes de una patogenicidad.

6. 6.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que el isótopo es 13C, 15N, 18O o 2H.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el compuesto metabolizable marcado isotópicamente es U-13C-glucosa, 2H2O, H218O, U-13C-ácido acético, 13C-carbonato o 13C-ácido carbónico.

8. 8.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra biológica comprende células de levadura o células vegetales.

9. 9.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente fraccionar

   o purificar la muestra biológica de tal forma que la muestra contenga un subconjunto de los metabolitos contenidos en la célula de la que la muestra se deriva.

10. 10.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los metabolitos se determinan cuantitativamente por espectrometría de masas.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la espectrometría de masas es MALDI-TOF.

12. 12.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que los metabolitos están cromatográficamente separados antes de la determinación cuantitativa.

13. 13.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende adicionalmente la etapa de introducir estándares externos para uno o más de los metabolitos determinados cuantitativamente.

14. 14.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende adicionalmente la etapa de identificar uno o más de los metabolitos que se determinan cuantitativamente.

15. 15.

    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dichos metabolitos se identifican por fragmentación secundaria.

16. 16.

    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la identificación de dichos metabolitos comprende ionización de impacto electrónico, tecnología de EM-EM y/o análisis después de la declinación de la fuente de iones moleculares o fragmentos.

17. 17.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha célula se ha mantenido en condiciones que permiten adicionalmente la captación de un compuesto metabolizable no marcado isotópicamente y dicho compuesto y/o dichos productos metabólicos del mismo se determinan cuantitativamente.

18. 18.

    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la cantidad determinada para el compuesto metabolizable no marcado isotópicamente y/o para dichos productos metabólicos del mismo se compara con la cantidad obtenida llevando a cabo dicho procedimiento en la misma medida, pero sin la captación de dicho compuesto metabolizable no marcado.

    5 19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que, además de los metabolitos, una o más proteínas y/o tránscritos en dicha(s) muestra(s) se determina(n) y se analiza(n) cuantitativamente.

19. 20.

    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dichos metabolitos y proteínas y/o tránscritos se determinan cada uno a partir de la misma muestra biológica.

20. 21.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicho análisis implica

    10 adicionalmente evaluación estadística y análisis de correlación adecuados de los datos obtenidos y opcionalmente, análisis de redes.
21. 22. Uso de un compuesto marcado isotópicamente que se puede metabolizar por una célula, para marcar al menos 50 metabolitos en dicha célula en una manera saturante en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica se incrementa a al menos el 80 % del total de todos los isótopos del

    15 elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas.

    Figura 1

    Figura 4B

    Figura 4F

    273 Figura 4G

    274 Figura H

    Figura 4j

    Figura 6 Figura 7