JP6273280B2

JP6273280B2 - 粒子に実行される蛍光測定の間の試薬の経時変化を補償するための方法、および、該方法を実施する生物学的分析装置

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Publication number: JP6273280B2
Application number: JP2015527885A
Authority: JP
Inventors: ウランカー、アレキサンドラ; ネリン、フィリップ; アリシェ、ムスタファ; コエ、ジレス
Original assignee: Horiba ABX SAS
Current assignee: Horiba ABX SAS
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2018-01-31
Anticipated expiration: 2033-08-19
Also published as: CN104641219A; WO2014029743A1; CN104641219B; FR2994740A1; JP2015526729A; US9448175B2; FR2994740B1; EP2888572A1; US20150241352A1; EP2888572B1

Description

技術分野
本発明は、粒子（試薬で標識された細胞を含む）に対して実行される蛍光測定の期間中における、蛍光試薬の経時的な劣化（分解）を補償するための方法に関する。

本発明の分野は、より具体的には、ただし網羅的にではないが、生物学的分析装置の分野、および、特に、血液学的装置の分野である。

先行技術
細胞分析、および、とりわけ、血液細胞分析は、試料の予備的な化学処理を可能にする特定の試薬の使用を必要とする。特定の細胞群の希釈、染色または選択的な破壊（異なる溶解）等、様々な物理化学的作用が為される。

これらの試薬は、自動血液分析機またはフローサイトメーターといった分析機器での使用に好適な容器にパッケージされている。それぞれの試薬に、単一の化学的な機能を与えることが通常であるが、使用のコストまたは簡単さを考慮して、いくつかの機能を、１つの同じ試薬に与えるのが現在の傾向である。製品の製造者とユーザーの両方にとって、保守の簡単さもまた、望ましい目的である。

それでも、いくつかの同時の物理化学的機能を提供する単一の試薬を製造することを望む場合に、困難な事がある：試薬の様々な化学化合物が互いに反応し、その物理化学的機能が著しく元の製品と異なる副産物を生じ得る。この変化または劣化は、試料、とりわけ、血液の予備的な処理を変化させ得、正しくない分析結果として反映されるかもしれない。

試薬の変化または劣化はまた、例えば、温度または電磁放射線等、環境的要因に依存し得る。特に、試薬に使用される或る蛍光性化合物は、温度に依存する劣化のレートで、水相（水性相）において劣化する。これは、とりわけ、チアゾールオレンジ（ＴＯ）の場合であって、該チアゾールオレンジは、細胞成分のための染色剤として使用され、かつ、細胞内ＤＮＡまたはＲＮＡに付着することを意図されている蛍光性化合物である。

ＴＯ等、蛍光性化合物を有する試薬は、とりわけ、文献 FR 2821428において記載されている。それらは、例えば、文献 WO 2006/024716に記載されるように、血液学的システムにおいて使用され得る。試薬の蛍光性化合物の劣化は、蛍光レベルの低下につながり、蛍光レベルの低下は、分析される細胞の計数および分類にエラーを生じ得る。

分子状酸素の存在下での、ＴＯを含む複素環ポリメチンの分解（または光分解）が知られている。過酸化水素といった強力な酸化剤の存在もまた、識別された劣化生成物のうちの１つであるベンゾチアゾロンの形成を伴う、ＴＯの劣化につながる。しかしながら、ＴＯの劣化は光の存在しない状態下でも起こり、酸化防止剤の添加、または、分解した酸素をアルゴン等、不活性ガスで置き換えることによって、この劣化は遅くならない。血液学的試薬中のＴＯの劣化は、自然発生的な分子の加水分解から生じるように思われる。

こうした劣化を制限するか、少なくとも遅らせるために、特定の試薬が調剤されており、例えば、文献US 7638290に記載されている物がある。しかしながら、これは、経時での化合物の好ましい安定性を保証するのに十分ではない。

水性媒体中の変化または劣化の現象を防ぐかまたは抑制するために、蛍光性化合物は、例えば、文献 EP 2175340に記載されているように、有機溶媒中に、高濃度の形で貯蔵され得、測定時に希釈され得る。実際、アルコールまたはエチレングリコールといった有機溶媒中では、蛍光性化合物の変化または劣化は殆ど存在せず、それは、水性溶媒に関する本当の利点である。

しかしながら、この進め方は、他の欠点を持つ。実際には、分析機（アナライザー）内では、より多くの数の容器を用いることが必要であり、それはまた、分析的研究室または血液学的研究室において、生成物の数の管理のための費用が高くなることにもつながる。

さらに、化学的試薬が、実際、分析機内で、または、そばに配置された装置内で、使用前に水を加えて元に戻さなければならないとき、使用の複雑さも増し、それは、最終的には、粘性が常に同じではない２以上の液体の混合に着手することが必要となるからである。これが、生成物の均一性の問題を生じ得、該問題によって、試料の不十分な処理に至る恐れがある。ほぼ完全な効率を有するミキサーを使用しなければならず、それが、余分なコストと、故障のリスクの増大とにつながる。

本発明の１つの目的は、試薬の経時変化（エージング）を測定するかまたは少なくとも評価するための方法を提案することである。

本発明の他の目的は、試薬の経時変化による、蛍光測定のエラーを補償するための方法を提案することである。

本発明の他の目的は、使用する試薬の貯蔵寿命を長くすることである。

本発明の他の目的は、適用可能な場合は輸送中を含めて、試薬がその寿命中に晒された温度を表すマ−カ−を提案することである。

発明の開示
これらの目的は、水相にて貯蔵される試薬の劣化を補償する方法によって達成され、前記試薬は、少なくとも１つの蛍光性化合物を有し、かつ、粒子の識別を可能にするものであり、当該方法は、前記試薬で標識された粒子に対する蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）の測定のステップを有し、その特徴は、当該方法が、さらに：
− 前記試薬の少なくとも１つの現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）を特定するように、前記蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）の前記測定の時点（タイムポイント）に近い時点ｔにおいて、少なくとも１つの波長における、前記試薬の溶液に対する吸光度測定を実行するステップを有し、
− 前記現在の１つの光学濃度または複数の光学濃度ＯＤ（ｔ）と、前記劣化のない試薬の少なくとも１つの初期の光学濃度ＯＤ（０）とを用いて、前記蛍光レベルの前記測定の補正を計算するステップを有することである。

実施形態によれば：
− 劣化のない試薬は、製造終了時のものであってよく；
− 吸光度測定は、蛍光性化合物の吸収ピークに対応する少なくとも１つの波長において実行されてよく；
− 粒子は、細胞といったものであってよく、または、細胞を有するものであってよい。

前記試薬は、とりわけ：
− 少なくとも１つのポリメチンタイプの蛍光性化合物を有してよく、
− チアゾールオレンジを有してよい。

実施形態によれば、本発明の方法は：
− 初期の光学濃度ＯＤ（０）と現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）との比率に対応する、比率Ｋ（ｔ）を計算するステップと、
− 前記測定の時点ｔの付近において、前記試薬で標識された粒子に対して測定された前記蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）に、前記比率Ｋ（ｔ）を乗じることによって、補正された蛍光レベルＦＬＵＯｃ（ｔ）を計算するステップとを有し得る。

本発明の方法は、さらに：
− （例えば、蛍光性化合物の吸収ピークに対応する）いくつかの波長λｉにおける、初期の光学濃度ＯＤｉ（０）と現在の光学濃度ＯＤｉ（ｔ）とを測定するステップと、
− 前記波長λｉにおける比率Ｋｉ（ｔ）を計算するステップと、
− 前記波長λｉにおける、補正された蛍光レベルＦＬＵＯｃｉ（ｔ）を計算するステップとを有し得る。

他の実施形態によれば、本発明の方法は、さらに：
− 基準の粒子における蛍光レベルの変化ΔＦＬＵＯと、前記試薬のその劣化による前記光学濃度の変化ΔＯＤとの関係を確立する劣化のモデルを、事前に決定するステップと、
− 現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）の測定から、および、初期の光学濃度ＯＤ（０）の測定から、および、前記劣化のモデルから、喪失した蛍光チャネルの数ＣＰ（ｔ）を計算するステップとを有し得る。

本発明の方法は、さらに：
− 蛍光レベルの変化ΔＦＬＵＯと、前記試薬の光学濃度の変化ΔＯＤとの比率に対応する劣化のモデルを、係数αの形態にて、事前に決定するステップと、
− 前記係数αを乗じられた、前記現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）と、前記初期の光学濃度ＯＤ（０）との差という形態で、喪失した蛍光チャネルの数ＣＰ（ｔ）を計算するステップと、
− 前記測定された蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）を統計的に表す基準蛍光値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞を決定するステップと、
− 前記基準蛍光値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞と、前記喪失した蛍光チャネルの数ＣＰ（ｔ）との差によって除された、前記基準蛍光値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞に対応する補正ゲインＧＣ（ｔ）を計算するステップと、
− 測定の時点ｔにおいて、前記試薬で標識された粒子で測定された前記蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）に、前記補正ゲインＧＣ（ｔ）を乗じることによって、補正された蛍光レベルＦＬＵＯｃ（ｔ）を計算するステップとを有し得る。

本発明の方法は、いくつかの波長における光学濃度の測定から、複数の劣化のモデルを決定することをさらに有し得る。

他の態様によれば、フローサイトメトリーによる細胞分析用の装置が提案され、当該装置は、試薬で標識された粒子に対する蛍光レベルの測定のための手段を有し、その特徴は、当該装置がさらに：
− 前記試薬の少なくとも１つの現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）を決定するために、前記蛍光レベルの前記測定の時点に近い時点で、前記試薬の溶液において、少なくとも１つの波長における吸光度測定を実行する手段を有し、
− 前記現在の光学濃度（単数）または光学濃度（複数）ＯＤ（ｔ）、および、前記劣化のない試薬の少なくとも１つの初期の光学濃度ＯＤ（０）を使って、前記蛍光レベルの測定の補正を計算することができる計算手段を有することである。

実施形態によれば、本発明の装置は、分光光度法による測定のためのセルを有し得る。

分光光度法による測定のためのセルは、様々な中心波長λｉにおける光学濃度の測定を可能にする光学フィルタリングシステムを備えた多色光源および光受容器を有し得る。

実施形態によれば、本発明の装置は、血液分析機をさらに有し得る。

このように、本発明の方法は或る数の利点を提供し、それは次のようなものである：
− 使用する試薬の貯蔵寿命を長くする、
− 研究室に調達される生成物の数および量を減らす、
− 簡略化された流体系を有し、かつ、分析機内に試薬ミキサーまたは調整器（コンディショナー）がない、よりコンパクトな分析システムをつくることが可能である、
− 分解のリスクを低減する、
− より魅力的なコスト価格および作動コスト。

図面および実施形態の説明
本発明の他の利点および特定の特徴は、決して限定することのない、詳細な実施の説明および実施形態、ならびに、以下の添付図面を読めば、明らかになるであろう。

図１は、チアゾールオレンジ（ＴＯ）の分子が分解して加水分解生成物になるのを図解している。図２は、ＴＯの吸収スペクトル（図２a）、および、加水分解生成物の吸収スペクトル（図２ｂおよび２ｃ）を図解している。図３は、試薬の製造後それぞれ７週間（図３ａ）および１６ヶ月（図３ｂ）の、ＴＯで得られた顆粒球における蛍光測定の進展を図解している。図４は、週単位での時間の関数として、ＴＯを有する試薬の吸光度を図解している。図５は、図３の試薬の日単位の経過時間（age）の関数として、好中球についての蛍光ピークの位置（強度について）を図解している。図６は、光学濃度の変化の関数として、蛍光レベルの変化の測定を示している。図７ａから７ｆは、本発明の方法で得られる測定結果を図解している。図８は、試薬の製造中に実行される一連の動作を図解している。図９は、生物学的分析または血液分析のための装置において実行される、一連の動作を図解している。

ここで、本発明の方法の実施形態を説明するが、これは、水溶液にて貯蔵される蛍光性化合物、チアゾールオレンジ（ＴＯ）を有する試薬に適用されるものであり、その使用については、例えば、文献 WO 2006/024716に記載されている。

この実施形態は、決して限定的ではなく、本発明は、勿論、例えば、いくつかの染色剤を有する他の試薬に適用され得る。

上記に説明したように、本発明は、試薬の貯蔵寿命を長くすることを可能にする。記載される実施形態において、蛍光性の強度を補正するためのモデルの使用は、試薬の使用期間を数か月延ばすことを可能にし、従って、この期間は、分析性能の劣化なく、６か月から９か月、または、１２ヶ月まででも延長され得る。従って、分析機において使用される試薬の使用期限は、それぐらい延びる。

図１に図解されるように、水性媒体中では、チアゾールオレンジ（ＴＯ）は不安定であり、徐々に劣化する。この劣化は、ＴＯ分子１がメチレン架橋のレベルで２つの加水分解生成物へと非可逆的分裂することから生じ、すなわち、一方は、ベンゾチアゾロン部分（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾロン）２であり、他方は、キノリン誘導体（１−メチル−４−メチレンキノリン）３である。

図２を参照すると、ＴＯは、およそ５００ｎｍの波長における可視光で、最大吸収１０を持つ（図２ａ）。ここで、図２ｂおよび２ｃに図解されるように、形成された２つの加水分解生成物１、２のどちらも、これらの波長では吸光度を示さない。

従って、本発明の有利な態様によれば、ＴＯの劣化は、およそ５００ｎｍの波長において、試薬の吸光度を測定することによって、正確に定量化され得る。

吸光度は、媒質の、それを通過する光を吸収する能力の測度と定義されることが、思い出されるであろう。それは、光学的濃度または消光とも呼ばれる。

温度が高い程、ＴＯの劣化は早く、それは、試薬の蛍光性の喪失を伴う。従って、２２℃で、５００ｎｍにおけるその吸光度によって定量化されるチアゾールオレンジの劣化は、６ヶ月後には約１０％に達し、３５℃では、同じ時間で４０％に達し得る。

図３を参照すると、文献 FR 2821428に記載される試薬が、文献 WO 2006/024716に記載されたようなフローサイトメーターにおいて使用されるとき、分子の劣化は、その光学特性の変化と、とりわけ、蛍光性の喪失とにつながり：
− 図３ａは、その製造日の後、７週間使用された試薬で、血液分析機を使って得られた測定値を示し、それをＷ７で参照する；
− 図３ｂは、その製造日の後、１６ヶ月使用された試薬で、同一の試料において得られた測定値を示し、それをＭ１６で参照する。

それぞれの場合において、下方のダイヤグラム（発生頻度（Occurrence））は、FR 2821428に記載されるように、試薬で標識された細胞において得られた蛍光測定のヒストグラム２１を示している。蛍光測定値（ＦＬＵＯ）は、照明および細胞（セル）の流れの方向に垂直な方向に実行された、直交蛍光（orthogonal fluorescence）の測度であり、それは、文献 WO 2006/024716におおいて、ＦＬ１で参照されている測定値に対応している。上方のダイヤグラムにおいて、それぞれの点は細胞を表す。点は、それぞれに、同じく照明および細胞の流れの方向に垂直な方向に同時に実行された、直交蛍光（ＦＬＵＯ）の測定値と、直交拡散（ＳＳＣ）の測定値とに対応する軸上に位置づけられている。

ＦＬＵＯ−ＳＳＣグラフにおける細胞の位置が、顆粒白血球（多核好中球および好酸球）、リンパ球、赤芽球、単球、幼若顆粒白血球、および、高含有量の核酸を有する細胞の識別を可能にする。こうした分類は、文献 WO 2006/024716に詳述されている。特に、散布図２０は、顆粒細胞に対応している。

試薬Ｍ１６では、顆粒白血球の蛍光レベルは、約２５６＝１２５８−９９２チャネル（または蛍光強度レベルＦＬＵＯ）だけ、低くなる。

この例では、蛍光の減衰は、３つの理由のため、やっかいである：
− 核酸（ＲＮＡ＋ＤＮＡ）の定量的測度であるチアゾールオレンジの蛍光レベルは、例えば、特許文献FR 2873813に記載されるように、成熟細胞と未熟細胞との区別を可能にする。未熟細胞は、病気の場合にのみ血液中に存在し、従って、それらの識別は、診断という点では重大である。細胞株についての安定化されていない蛍光レベルは、偽陰性の増加につながり得る；
− 図３の例では、生物学者は、顆粒細胞の蛍光レベルがチャネル９９２に現れ、チャネル１２４８には表れないことがわかる。このチアゾールの蛍光性は、好中球等、所与の成熟細胞について、およそ一定で現れなければならない（遺伝物質ＤＮＡ＋ＲＮＡは、成熟した正常細胞については一定である）；
− それは、細胞分類にエラーを生じ得る：本文では、赤芽球群は、過大評価されているが、これは、リンパ球の比率が、赤芽球のゾーンにおいて識別され、計数されているからである。

上述したように、ＴＯの劣化は、５００ｎｍで、試薬の吸光度に影響する。図４は、本文では週単位の時間（ＴＳ）の関数として、異なる温度について実行された吸光度測定（ＯＤ）を示し：
− 曲線３０は、４℃の温度に対応しており、
− 曲線３１は、２２℃の温度に対応しており、
− 曲線３２は、３５℃の温度に対応している。

従って、劣化の速度は、実に、試薬の貯蔵温度の関数である。さらに、ボトルが空いているか、閉まっているかという事実は、反応速度に影響せず、そのことが、この劣化が酸化現象から生ずるものではないことを裏付けている。

従って、図４によれば、光学濃度（ＯＤ）の測定から、時間および温度の複合効果によって生じた試薬の劣化のレベルを検出することが可能である。

それが温度および貯蔵の熱的状態のマーカーであることを強調することが、非常に重要であり：好適な貯蔵状態において、かつ、所与の時間において、生成物は、一定の限度を超えては劣化しないであろう。従って、生成物の製造日から使用日まで、貯蔵状態が配慮されているかどうか、帰納的に決定することが可能である。この悪化は、温度積分に従っており、悪化のメカニズムは、非可逆的である。吸収の測定は、その公称分子構造を喪失したチアゾールオレンジの割合を示す。

有利には、これに基づいて、蛍光補正のモデルを構築することが可能であることが発見された。

図５の曲線４１は、試薬の経過時間の関数として、顆粒白血球の蛍光性（ＦＬＵＯ）のモ−ダルピーク(modal peak)の位置（または強度）の進展を示している。クロス印は、試薬の製造日から７週間、６ヵ月、１２ヶ月および１６ヶ月の使用日にそれぞれ対応する。水平軸（ＴＪ）は、日数である。

示されているように、蛍光レベルは、時間の関数として単調に減少するが、ひと目で正確に減少の法則を決定するほど明らかには見えない。

従って、蛍光補正のためのモデルは、本発明の文脈において詳述されている。

第一の補正(correction、修正)モデル
第一の補正モデルによれば、試薬の劣化を補償する方法は、以下のステップを有する。

第一に、試薬の初期の光学濃度が測定され、その製造日に個別に取得され、従って、劣化はない。この値は、ＯＤ（０）と表される。この測定は、例えば、試薬の承認テスト中、または、その製造中に実行され得る。

分析機の使用中、現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）の測定は、所与の時点（タイムポイント）ｔで個別に取得された試薬について実行される。これらの測定は、好ましくは、ＦＬＵＯｍ（ｔ）と表される蛍光測定がなされるときの時点に近い時点ｔで、すなわち、同じ日または同じ週に実行される。それらは、例えば、血液分析機の保守サイクル中または日毎もしくは週毎の起動時に実行され得る。

補正を実行するために、以下の比率が計算される：
Ｋ（ｔ）＝ＯＤ（０）／ＯＤ（ｔ）。

この比率Ｋ（ｔ）が、劣化していない試薬の光学濃度ＯＤ（０）の公称値に対して、ＯＤ（ｔ）を比較することを可能にする。

比率Ｋ（ｔ）は、試薬の使用日ｔに測定された蛍光信号ＦＬＵＯｍ（ｔ）を補正する係数として使用される（１を上回る）係数となり、それが、補正された蛍光レベルの計算を可能にする
ＦＬＵＯｃ（ｔ）＝Ｋ（ｔ）×ＦＬＵＯｍ（ｔ）。

この第一の補正モデルの効果は、図５に図解されている：曲線４４上の点は、補正係数Ｋを乗じられた、曲線４１の顆粒細胞の蛍光ピークの測定値に対応している。

この演算によって、蛍光強度を２つの許容限度、上限４２および下限４３間で置き換えることが可能になり、そのため、アルゴリズムによって、この顆粒細胞群を正確に識別することが可能になることがわかる。

この第一の補正モデルは、起点からの光学濃度の変化と、同じく起点からの蛍光強度の変化との間の比率性の仮説に基づいている。それが、簡単であるという利点と、事前の、経時的な試薬の挙動の分析を全く必要としないという利点とを持つ。

当該方法は、異なる波長における吸収ピークを有し、かつ、任意で、異なる劣化特性を有する、いくつかの蛍光性化合物を有する試薬にまで一般化され得る。

この場合：
− いくつかの波長λｉ群において、初期の光学濃度ＯＤｉ（０）の測定と、現在の光学濃度ＯＤｉ（ｔ）の測定を実行することが可能であり、
− これらの波長における比率Ｋｉ（ｔ）＝ＯＤｉ（０）／ＯＤｉ（ｔ）を計算することが可能であり、
− 個別の補正を、異なる蛍光性化合物に対応する異なる蛍光測定ＦＬＵＯｃｉ（ｔ）＝Ｋｉ（ｔ）×ＦＬＵＯｍｉ（ｔ）に適用することが可能である。

第二の補正モデル
この補正モデルは、試薬の劣化のモデルの事前の特定に基づいている。この測定は、試薬の経時変化の間に実行される、基準の（参照の）細胞における吸光度ＯＤおよび蛍光レベルＦＬＵＯの実験的測定から開始して、実行され得る。

劣化のモデルによって、試薬の光学濃度の変化ΔＯＤの関数として蛍光レベルの変化ΔＦＬＵＯを表すことが可能になる：
ΔＦＬＵＯ＝ｆ(ΔＯＤ)。

一般に、劣化のモデルは、線形係数の形で表され得る：
α＝ΔＦＬＵＯ／ΔＯＤ。

次に、第一の補正モデルと同様に、試薬の初期の光学濃度が測定され、その製造日に個別に取得され、従って、劣化はない。この値は、ＯＤ（０）と表される。この測定は、例えば、試薬の承認テスト中、またはその製造中に実行され得る。

分析機の使用中、現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）の測定が、所与の時点ｔにおいて個別に取得された試薬について実行される。これらの測定は、好ましくは、ＦＬＵＯｍ（ｔ）と表される蛍光測定がなされるときの時点に近い時点ｔにおいて、即ち、同じ日または同じ週に、実行される。それらは、例えば、血液分析機の保守サイクルの間に、または、血液分析機の毎日または毎週の起動時に実行され得る。

喪失した蛍光チャネル（またはレベル）の数が計算される：
ＣＰ（ｔ）＝ｆ（ＯＤ（０）−ＯＤ（ｔ））、
または、線形係数の場合：
ＣＰ（ｔ）＝（ＯＤ（０）−ＯＤ（ｔ））×α。

次に、補正ゲインが計算できる：
ＧＣ（ｔ）＝＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞／（＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞−ＣＰ（ｔ））。

量＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞は、基準蛍光値であり、それは網羅的にではないが、測定の中央値もしくは平均値、または特定の細胞群に対応する値であり得る。

次に、補正ゲインＧＣ（ｔ）が、試薬の使用日ｔに測定された蛍光信号ＦＬＵＯｍ（ｔ）に適用され、それによって、補正された蛍光レベルが計算するのが可能になる：
ＦＬＵＯｃ（ｔ）＝ＧＣ（ｔ）×ＦＬＵＯｍ（ｔ）。

当該方法は、λｉからλｎまでの範囲の波長群について、ＯＤｉ（ｉは、１からｎまでの間である）と表されるいくつかの光学濃度の測定に一般化され得る。

次に、ｆｉ（ΔＯＤｉ）と表されるｎ関数が決定され得、異なる蛍光波長について、個別の補正を計算することを可能にする。これらの補正は：
ＣＰｉ（ｔ）＝ｆｉ（ＯＤｉ（０）−ＯＤｉ（ｔ））（式中、ｉは、１からｎまでの間である）の形態で書かれる。

非限定的な例として、２つの蛍光性化合物からなる試薬は、チアゾールオレンジおよび化合物Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２に基づき得、該化合物Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２は、高いＤＮＡ親和性を有する染色剤である。１つ以上の蛍光性化合物はまた、次の非網羅的なリストから選択され得る：
ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、Ｖｙｂｒａｎｔシリーズ、ＹＯＹＯ−１、ＳＹＴＯシリーズ、Ｈｏｅｃｈｓｔシリーズ、アクリジンオレンジ、または、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ１。

ここで、第二の補正モデルをチアゾールオレンジに適用する例として、より詳細に説明する。

光学濃度の測定は、分光光度測定チャンバ内で実行される。測定セルを、ＮＩＣＨＩＡ（登録商標）ＮＳＰ５９０Ｓタイプの発光ダイオードからの光線（青味を帯びた緑）が横切り、その中心発光波長は、ｉ＝３０ｍＡの強度について５０１ｎｍである。受容テストでは、ＯＳＲＡＭ（登録商標）ＢＰＷ２１フォトダイオードが使用され、これは、３５０ｎｍから８２０ｎｍまでの間での適用に好適であり、５５０ｎｍで０．３４Ａ／Ｗのスペクトル感度を有する。

正確な補正モデルを構築するために、それぞれ、３週間（Ｗ３）、５週間（Ｗ５）、１３週間（Ｗ１３）、３２週間（Ｗ３２）、５２週間（Ｗ５２）および７７週間（Ｗ７７）を経た試薬について、光学濃度の測定を実行した。

ＯＤ（０）と表される、ｔ＝０における光学濃度の値は、Ｗ３に対応する値であると考えられる。

初期の光学濃度ＯＤ（０）と、経時的に測定された光学濃度ＯＤ（ｔ）のそれぞれとの差ΔＯＤ（ｔ）が、ここから導出される。

結果をここに示す：

従って、補間モデルが構築され得、任意の時点においてΔＯＤを計算することが可能になる：
ΔＯＤ＝−２１０^−７ｔ^２＋０．００３ｔ−０．０１０４（ｔは日数である）

このモデルは、非常に良い相関係数（Ｒ^２＝０．９９１８）を示す。

さらに、３つの新鮮な血液試料に対して蛍光測定を実行した。それぞれの新鮮な血液試料について、好中球の蛍光強度の平均値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞を計算した。

好中球を選択した。その理由は、好中球が、測定の間に、殆ど分散なく、容易に識別可能な散布図を与えるからである（図３の散布図２０）。新鮮な血液試料についての蛍光強度の平均値が、３５°の温度で、（強度の）１１００チャネルに調整されなければならないことは知られている。

従って、試薬の経過時間の関数として、これらの新鮮な血液試料についての蛍光性の喪失（測定されたΔＦＬＵＯ）を評価することが可能である。結果は、以下の通りである：

光学濃度の変化ΔＯＤが、補間モデルを用いて計算される。

従って、図６を参照すると、蛍光レベルの変化と光学濃度の変化との相関が確立され、劣化のモデルの係数α＝ΔＦＬＵＯ／ΔＯＤが、ここから導出できる。

ここで、α＝３０００が得られる。

測定の補償が以下のように実行される。

それぞれの試薬について、光学濃度ＯＤ（０）は、その製造日にできるだけ近くで測定されなければならない。実験において、ＯＤ（０）＝０．２３８５。

次に、試薬のそれぞれの光学濃度ＯＤ（ｔ）の測定が、一連の試料の通過に先立って実行される。

喪失した蛍光チャネルの数が計算される：
ＣＰ（ｔ）＝（ＯＤ（０）−ＯＤ（ｔ））×３０００。

この喪失したチャネルの数は、好中球の蛍光強度の平均値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞における喪失に等しいと考えられる。

好中球の平均蛍光強度は、１１００である；セルのセットのための補正ゲインが、ここから導出される：
ＧＣ（ｔ）＝１１００／（１１００−ＣＰ（ｔ））。

図７は、補償の例を図解している。図７ａから７ｆまでにおいては、それぞれの点は、細胞を表している。点は、それぞれ、直交拡散（ＳＳＣ）の測定に横軸で対応し、直交蛍光（ＦＬＵＯ）の測定に縦軸で対応する各軸に従って位置づけられ、それらの測定は、同時に、かつ、照明の方向および細胞の流れの方向に垂直な方向に実行される。

図７ａ、７ｂおよび７ｃは、それぞれ、製造を離れて、９ヶ月経時した試薬（Ｍ９）、および、１３ヶ月経時した試薬（Ｍ１３）での、補償をしない測定を示す。蛍光レベルの変位が、明白にわかる。

図７ｄ、７ｅおよび７ｆは、それぞれ、製造を離れて、９ヶ月経時した試薬（Ｍ９）、および、１３ヶ月経時した試薬（Ｍ１３）での、上記に説明した補償をする測定を示す。補正された蛍光レベルは、効果的に、一定に留まっている。

本発明による補償の方法は、とりわけ、固定された閾値の使用が不可欠な（例えば、細胞（セル）が少なすぎる場合、または標識された個体群がない場合の）血液試料にとって非常に有用である。実際には、固定された閾値の使用は、蛍光性について極めて正確であることが必要であり、これは、蛍光性が、細胞の成熟度と、従って、あり得る病状の検出とを決定するためのベースだからである。従って、細胞の蛍光性に関する不安定性は、例えば、芽球細胞の非検出につながり得る。従って、こうした補償の方法は、偽陰性を避けるために不可欠である。

本発明の方法は、生物学的分析装置、または、血液分析機に、容易に統合できる。

その適用は、分光光度法（スペクトロフォトメトリー）による測定のためのセル（そのセル内で、１つの試薬または複数の試薬の光学濃度の測定が実行される）を有する装置を提供することによって、広範囲に自動化できる。

異なる波長における測定を行なうために、様々な中心波長λｉ（ｉは、１からｎまでの間である）における光学濃度の測定を可能にする光学フィルタリングシステムを備えた多色光源および光受容器を使用することが有利であり得る。

ここで、生物学的分析装置または血液分析機における、本発明の方法の適用例を示す。

図８を参照すると、第一に、試薬が生成され（ステップ５０）、次に、ボトルといったような容器にパッケージングされる（ステップ５２）。

上記に説明したように、本発明の方法は、試薬の初期の光学濃度ＯＤ（０）の測定のステップ５１をさらに有し、該ステップは、パッケージング５２の前またはパッケージング５２の間に実行される。

測定された初期の光学濃度ＯＤ（０）の値は、後で使用するために、例えば、容器に固定されたＲＦＩＤタグに記憶される。

図９を参照すると、第二に、試薬のボトルは、試薬を使う目的のために、生物学的分析装置または血液分析機に挿入される（ステップ６４）。次に、ＲＦＩＤタグが読み取られ（ステップ６５）、このボトルに入っている試薬の初期の光学濃度ＯＤ（０）の値は、装置に記憶される。

通常、生物学的分析装置または血液分析機での測定の実行には、例えば毎日実行される、予備的な初期化ステップ６０が必要とされる。この初期化ステップ６０は、測定を実行するための装置を準備するためのモニタリング、制御、すすぎといった、通常の動作を有する。

本発明によれば、次に、試薬の現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）を測定するステップ６１もまた、実行される。従って、新規の初期化ステップ６０の実行まで、または、試薬のボトルの交換６４が先に起こる場合は、試薬のボトルの交換６４まで、測定を補正するのに使用される、現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）の値が得られる。

試薬のボトルの交換６４の場合、新鮮な試薬の現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）の測定６１が、使用前に実行される。

次に、測定サイクルが、生体試料または血液試料に実行され得る。

これらの測定サイクルは：
− 蛍光信号測定ＦＬＵＯｍ（ｔ）の獲得６２を有し；
− 補正された値ＦＬＵＯｃ（ｔ）を得るための、試薬の劣化の効果の補正６３を有する。補正された値ＦＬＵＯｃ（ｔ）は、初期の光学濃度ＯＤ（０）と現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）との記憶された値を使って、上記に説明した補正モデルに従って計算される。

初期化ステップ６０の周期的反復のおかげで、現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）の測定６１が、蛍光測定ＦＬＵＯｍ（ｔ）が実行されるときの時点に十分近い時点で実行されたとみなすことができる。

勿論、本発明は、説明したばかりの実施例に限定されず、本発明の範囲内にとどまりつつも、これらの実施例に多くの調整がされ得る。

Claims

水相にて貯蔵された試薬の劣化を補償する方法であって、前記試薬は、少なくとも１つの蛍光性化合物を有し、かつ、粒子の識別を可能にするものであり、当該方法は、前記試薬で標識された粒子に対する蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）の測定（６２）のステップを有し、その特徴は、当該方法が、さらに：
− 前記試薬の少なくとも１つの現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）を特定するように、前記蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）の前記測定の時点に近い時点ｔにおいて、少なくとも１つの波長における、前記試薬の溶液に対する吸光度測定（６１）を実行するステップを有し、
− 前記現在の１つの光学濃度または複数の光学濃度ＯＤ（ｔ）と、劣化のない前記試薬の少なくとも１つの初期の光学濃度ＯＤ（０）とを用いて、前記蛍光レベルの前記測定の補正（６３）を計算するステップを有することである、
前記方法。
前記試薬が、ポリメチンタイプの蛍光性化合物を少なくとも１つ有する、請求項１に記載の方法。
前記試薬が、チアゾールオレンジを有する、請求項１または２に記載の方法。
さらに、
− 初期の光学濃度ＯＤ（０）と現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）との比率に対応する、比率Ｋ（ｔ）を計算するステップと、
− 前記測定の時点ｔの付近において、前記試薬で標識された粒子に対して測定された前記蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）に、前記比率Ｋ（ｔ）を乗じることによって、補正された蛍光レベルＦＬＵＯｃ（ｔ）を計算するステップとを
有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
さらに、
− いくつかの波長λｉにおける、初期の光学濃度ＯＤｉ（０）と現在の光学濃度ＯＤｉ（ｔ）とを測定するステップと、
− 前記波長λｉにおける比率Ｋｉ（ｔ）を計算するステップと、
− 前記波長λｉにおける、補正された蛍光レベルＦＬＵＯｃｉ（ｔ）を計算するステップとを、
有する、請求項４に記載の方法。
さらに、
− 基準の粒子における蛍光レベルの変化ΔＦＬＵＯと、前記試薬のその劣化による前記光学濃度の変化ΔＯＤとの関係を確立する劣化のモデルを、事前に決定するステップと、
− 現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）の測定から、および、初期の光学濃度ＯＤ（０）の測定から、および、前記劣化のモデルから、喪失した蛍光チャネルの数ＣＰ（ｔ）を計算するステップとを、
有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
さらに、
− 蛍光レベルの変化ΔＦＬＵＯと、前記試薬の光学濃度の変化ΔＯＤとの比率に対応する劣化のモデルを、係数αの形態にて、事前に決定するステップと、
− 前記係数αを乗じられた、前記現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）と、前記初期の光学濃度ＯＤ（０）との差という形態で、喪失した蛍光チャネルの数ＣＰ（ｔ）を計算するステップと、
− 前記測定された蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）を統計的に表す基準蛍光値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞を特定するステップと、
− 前記基準蛍光値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞と、前記喪失した蛍光チャネルの数ＣＰ（ｔ）との差によって除された、前記基準蛍光値＜ＦＬＵＯ（ｔ）＞に対応する補正ゲインＧＣ（ｔ）を計算するステップと、
− 測定の時点ｔにおいて、前記試薬で標識された粒子で測定された前記蛍光レベルＦＬＵＯｍ（ｔ）に、前記補正ゲインＧＣ（ｔ）を乗じることによって、補正された蛍光レベルＦＬＵＯｃ（ｔ）を計算するステップとを、
有する、請求項６に記載の方法。
いくつかの波長における光学濃度の測定から、複数の劣化のモデルを決定することをさらに有する、請求項６および７のいずれか一項に記載の方法。
フローサイトメトリーによる細胞分析用の装置であって、当該装置は、試薬にて標識された粒子に対する蛍光レベルの測定のための手段を有し、
その特徴は、当該装置がさらに：
− 前記試薬の少なくとも１つの現在の光学濃度ＯＤ（ｔ）を決定するために、前記蛍光レベルの前記測定の時点に近い時点で、前記試薬の溶液において、少なくとも１つの波長における吸光度測定を実行する手段を有し、
− 前記現在の１つの光学濃度または複数の光学濃度ＯＤ（ｔ）、および、劣化のない前記試薬の少なくとも１つの初期の光学濃度ＯＤ（０）を使って、前記蛍光レベルの前記測定の補正を計算することができる計算手段を有することである、
前記細胞分析用の装置。
分光光度法による測定のためのセルを有する、請求項９に記載の細胞分析用の装置。
前記分光光度法による測定のためのセルが、様々な中心波長λｉにおける、前記光学濃度の測定を可能にする光学フィルタリングシステムを備えた、多色光源および光受容器を有する、請求項１０に記載細胞分析のための装置。
血液分析機をさらに有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の装置。