JP6236519B2 - 広いダイナミックレンジを有するアッセイ - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国特許出願第13/833,655号の継続出願である。該米国特許出願は参照によりこの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
i)第1の標識を含む第1の被検物結合性分子;
ii)第2の標識を含む第2の被検物結合性分子、ここで、第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きい、および
iii)固相支持体に結合した第3の被検物結合性分子、ここで、第3の被検物結合性分子は被検物と、第1の被検物結合性分子または第2の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、
を備えている。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子、第2の被検物結合性分子および/または第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、固相支持体が空間的に隔てられた2つ以上の電極を含むものである。一部の実施形態では、固相支持体が微粒子を含むものである。一部の実施形態では、第1の標識および第2の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の標識と第2の標識が異なっている。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約5倍から約100倍の範囲である、例えば約10倍から約100倍である。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約100倍である。一部の実施形態では、キットは、1ステップサンドイッチアッセイまたは2ステップサンドイッチアッセイのいずれかに使用され得る。
i)第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子;
ii)第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子、ここで、第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きい;および
iii)標識を含む第3の被検物結合性分子、ここで、第3の被検物結合性分子は被検物と、第1の被検物結合性分子または第2の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、を備えている。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子、第2の被検物結合性分子および/または第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、第3の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の固相支持体および第2の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の固相支持体が、第1の発色団を含む微粒子またはビーズであり、第2の固相支持体が、第2の発色団を含む微粒子またはビーズである。一部の実施形態では、第1の固相支持体および第2の固相支持体が形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である。一部の実施形態では、第1の固相支持体が第1の電極であり、第2の固相支持体が第2の電極であり、ここで第1の電極と第2の電極は空間的に隔てられている。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約5倍から約100倍の範囲である、例えば約10倍から約100倍である。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約100倍である。
i)第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子;
ii)第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子、ここで、第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きい;および
iii)標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、ここで、前記トレーサーは、第1の被検物結合性分子または第2の被検物結合性分子のいずれかとの結合に関して、前記被検物と、競合し得る、を備えている。一部の実施形態では、キットは、1種類以上が抗体またはこの断片である第1の被検物結合性分子および/または第2の被検物結合性分子を備えている。一部の実施形態では、標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の固相支持体および第2の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の固相支持体が、第1の発色団を含む微粒子またはビーズであり、第2の固相支持体が、第2の発色団を含む微粒子またはビーズである。一部の実施形態では、第1の固相支持体および第2の固相支持体が形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である。一部の実施形態では、第1の固相支持体が第1の電極であり、第2の固相支持体が第2の電極であり、ここで第1の電極と第2の電極は空間的に隔てられている。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約5倍から約100倍の範囲である、例えば約10倍から約100倍である。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約100倍である。
a)被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第1の標識を含む第1の被検物結合性分子、第2の標識を含む第2の被検物結合性分子および固相支持体に結合した第3の被検物結合性分子とを:
(i)第1の被検物結合性分子および第3の被検物結合性分子、ならびに
(ii)第2の被検物結合性分子および第3の被検物結合性分子、
を、結合させる条件下で接触させる工程、ここで、第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子は同時に当該被検物に結合しない;
b)被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度および被検物に結合している第2の被検物結合性分子の第2の標識のシグナル強度を測定する工程;ならびに
c)第1の標識と第2の標識のシグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
を含むものである。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子、第2の被検物結合性分子および/または第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の標識および第2の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を試験試料と同じ反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を試験試料と、異なる反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第1の標識と第2の標識が異なっている。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約5倍から約100倍の範囲である。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約100倍である。さまざまな実施形態において、アッセイのダイナミックレンジが3桁以上、例えば4桁以上を含む。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子を、約100倍未満(例えば、約10倍から約100倍、約10倍から約50倍、約60倍から約100倍、約25倍、約50倍、約75倍)異なる所定のモル量で存在させる。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子がオリゴマー化または架橋されたものでない。一部の実施形態では、該方法が自動化または半自動化システムを用いて行われる。一部の実施形態では、アッセイが1ステップアッセイである。
d)較正試験において、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度と被検物に結合している第2の被検物結合性分子の第2の標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることによりフラグ値を設定する工程を含む。
フラグ値以上であるならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる;または
フラグ値未満ならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
フラグ値以下であるならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる;または
フラグ値を超えているならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
a)被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子、第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子および標識を含む第3の被検物結合性分子とを:
(i)当該第1の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第1の固相支持体に、第3の被検物結合性分子を;および
(ii)当該第2の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第2の固相支持体に、第3の被検物結合性分子を、
結合させる条件下で接触させる工程;
ここで、第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子は、同時に被検物に結合しない;
b)第1の固相支持体および第2の固相支持体に結合している第3の被検物結合性分子の標識からのシグナル強度を測定する工程;ならびに
c)第1の固相支持体および第2の固相支持体に結合している第3の被検物結合性分子の標識からのシグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
を含む。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子、第2の被検物結合性分子および/または第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、第3の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、第1の固相支持体および第2の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の標識および第2の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を試験試料と同じ反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第1の固相支持体が、第1の発色団を含む微粒子またはビーズであり、第2の固相支持体が、第2の発色団を含む微粒子またはビーズである。一部の実施形態では、第1の固相支持体および第2の固相支持体が形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である。一部の実施形態では、第1の固相支持体が第1の電極であり、第2の固相支持体が第2の電極であり、ここで第1の電極と第2の電極は空間的に隔てられている。一部の実施形態では、第1の電極および第2の電極が携帯型ポイントオブケアデバイスに収容されている。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を試験試料と、異なる反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約5倍から約100倍の範囲である、例えば約10倍から約100倍である。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約100倍である。一部の実施形態では、イムノアッセイのダイナミックレンジが3桁以上を含む。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子を、約100倍未満(例えば、約10倍から約100倍、約10倍から約50倍、約60倍から約100倍、約25倍、約50倍、約75倍)異なる所定のモル量で存在させる。一部の実施形態では、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子がオリゴマー化または架橋されたものでない。一部の実施形態では、該方法が自動化または半自動化システムを用いて行われる。
d)較正試験において、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度と、被検物と第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることによりフラグ値を設定する工程を含む。
フラグ値以上であるならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められ、または
フラグ値未満ならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
フラグ値以下であるならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる;または
フラグ値を超えているならば、被検物に結合している第1の被検物結合性分子の第1の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
a)被検物を含んでいることが疑われる試験試料を、標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子、第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子と接触させること、ここで、第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子は、同時に被検物に結合しない;
b)第1の固相支持体上の第1の被検物結合性分子および第2の固相支持体上の第2の被検物結合性分子に結合しているトレーサーからのシグナル強度を測定すること;ならびに
c)第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性タンパク質に結合しているトレーサーのシグナル強度の横ばい値(プラトー)またはこの付近にフラグ値を設定すること
を含む。一部の実施形態では、第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性タンパク質に結合しているトレーサーのシグナル強度がフラグ値以下ならば、第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子に結合しているトレーサーのシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる。
以下の用語は本開示に関連するものである。
SBP1+SBP2→SBP1−SBP2
Ab+Ag→Ab−Ag。
SBP1+SBP2←SBP1−SBP2
Ab+Ag←Ab−Ag。
A+B→AB
試験試料(患者の血清試料など)のアッセイのためのキットに含めることができるものをいう。一部の成分は、溶液状であってもよく、アッセイにおける使用のために再構成するために凍結乾燥させてもよい。
一般的に、本明細書に記載のアッセイおよび方法は、サンドイッチアッセイにおいて3種類の被検物結合性分子の使用(慣用的なサンドイッチアッセイでは2種類の被検物結合性分子を使用する。)を伴い、1ステップサンドイッチアッセイにおける「フック効果」を解消し、2ステップサンドイッチアッセイにおけるアッセイの線形ダイナミックレンジを拡大するものである。また、かかるアッセイおよび方法は、本明細書において新たに説明するように、競合アッセイ形式におけるダイナミックレンジを拡大するためにも使用され得る。3種類の被検物結合性分子のうち2種類は捕捉または検出のいずれかに使用され得るが、これらの結合親和性は、例えば本明細書においてさらに説明するように異なっていなければならず、第1および第2の被検物結合性分子は第3の被検物結合性分子に、独立して被検物を介して結合する。被検物結合性捕捉分子として使用する場合、一部の実施形態では、第1および第2の被検物結合性分子は、異なる型の微粒子または表面上の異なる位置(例えば、空間的に隔てられた2つの相違する電極)に結合され得る。被検物結合性検出分子として使用する場合、一部の実施形態では、第1および第2の被検物結合性分子は、識別可能な分光学的特性(例えば、寿命、スペクトル)を有する標識を有するものであり得る。どちらの場合も、第1および第2の被検物結合性分子から生成されるシグナルは空間的および/または分光学的特性に基づいて別々に測定され得る。また、第1および第2の被検物結合性分子から得られるシグナル比を、較正曲線上の正確なセクションを選択するための指標として使用してもよい。2ステップサンドイッチ形式および競合的形式では、異なる親和性を有する抗体を異なる固相支持体に結合させ、各固相支持体からのシグナルが独立して測定され得る。
試験試料を被検物(またはこの断片)についてアッセイするためのキットを本明細書において示す。さまざまな実施形態において、キットは、一緒に試験試料を目的の被検物についてアッセイするのに有用な第1、第2および/または第3の被検物結合性分子、ならびに試験試料を被検物についてアッセイするための使用説明書を備えている。さまざまな実施形態において、キットは:
i)第1の標識と結合した第1の被検物結合性分子および第2の標識を含む第2の被検物結合性分子(ここで、第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第1の標識および第2の標識は検出可能に識別可能である(例えば、検出可能に識別可能な波長の光を放射する。));ならびに固相支持体に結合した第3の被検物結合性分子(ここで、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を同時に被検物に結合させずに第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を独立して被検物に結合させ、これにより第3の被検物結合性分子に結合してアッセイサンドイッチを形成する。);または
ii)第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子および第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子(ここで、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子は被検物に対して異なる結合親和性を有し、第1の固相支持体と第2の固相支持体は識別することができる(例えば、空間的分離、色、形状、サイズなどにより);ならびに標識と結合した第3の被検物結合性分子(ここで、第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を同時に被検物に結合させずに第1の被検物結合性分子および第2の被検物結合性分子を独立して被検物に結合させ、これにより第3の被検物結合性分子に結合してアッセイサンドイッチを形成する。);または
iii)第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子および第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子(ここで、第1の被検物結合性分子と第2の被検物結合性分子は被検物に対して異なる結合親和性を有し、第1の固相支持体と第2の固相支持体は識別することができる(例えば、空間的分離、色、形状、サイズなどにより);ならびにレポーター基に結合した被検物もしくは被検物の断片で構成されたトレーサー(これは試験試料中の被検物と、第1および第2の被検物結合性分子に対する結合に関して競合する。)
を備えたものであり得る。
較正標準または対照、例えば、精製および場合により凍結乾燥させた被検物(またはこの断片)および/またはアッセイを実施するための少なくとも1つの容器(例えば、チューブ、マイクロタイタープレートもしくはストリップ、これらは既に1種類以上の被検物結合性分子でコートされたものであってもよい。)および/またはバッファー、例えばアッセイバッファーもしくは洗浄バッファー(これらのいずれか一方を濃縮液、検出可能な標識(例えば、酵素標識)のための基質溶液もしくは停止液として提供してもよい。)を備えたものであり得る。好ましくは、キットは、アッセイを行うために必要であるすべての構成要素、即ち、試薬、標準、バッファー、希釈剤などを備えたものである。また、使用説明書には、標準曲線の作成または被検物を定量する目的のための参照標準の作製のための使用説明書も包含され得る。
本開示により、試験試料中の被検物(またはこの断片)の存在、量または濃度を調べるための方法を提供する。当該技術分野で知られているような任意の適切なアッセイがこの方法に使用され得る。例としては、限定されないが、例えば、サンドイッチアッセイ(例えば、放射性同位体検出(ラジオイムノアッセイ(RIA)など)および酵素検出(酵素アッセイ(EIA)または酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)(例えば、Quantikine ELISAアッセイ,R&D Systems,Minneapolis,MN))、競合アッセイなどのアッセイが挙げられる。
i)図4に示すように、第1のサンドイッチ複合体は、第1の固相支持体に結合(「attached」または「bound」)している第1の被検物結合性分子(例えば、微粒子上にコートされた被検物結合性捕捉分子)−被検物−標識と結合した第3の被検物結合性分子(例えば、レポーター基を有する被検物結合性検出分子)によって形成される。第2のサンドイッチ複合体は、第2の固相支持体に結合(「attached」または「bound」)している第2の被検物結合性分子−被検物−標識と結合した第3の被検物結合性分子によって形成される。
本明細書に記載の概念、キットおよび方法は、任意のシステムまたは機器、例えば任意の手動、自動化または半自動化システムにおいて実行され得る。以下の適合例は単なる例示として含めている。
本明細書において提供するキットおよび方法は目的の任意の被検物を検出するのに有用である。実例としての目的の被検物としては、限定されないが、例えば、一般的にはタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ならびにより具体的には、例えば、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素または受容体が挙げられる。適宜、市販の被検物結合性分子(例えば、抗体またはこの抗原反応性断片)を本発明において記載のキットおよびアッセイに使用してもよく、被検物結合性分子(例えば、抗体またはこの抗原反応性断片)を当該技術分野で知られた方法を用いて作製してもよい。一般的に、本明細書に記載のキットおよび方法を用いて検出された被検物はサンドイッチアッセイによって検出され得る。
さまざまな実施形態において、競合アッセイに使用されるトレーサー被検物は、サンドイッチアッセイにおいて被検物結合性捕捉分子および被検物結合性検出分子と複合体を形成し得る目的の被検物またはこの断片もしくは模倣物である。適宜、タンパク質被検物は天然供給源から精製したものであってもよく、本明細書に記載のような当該技術分野で知られた組換え手段もしくは合成手段によって作製されたものであってもよい。非タンパク質被検物は、当業者に知られた化学的手段および合成手段(生合成手段を含む。)によって作製されたものであり得る。トレーサー被検物は標識と直接または間接的に結合され得る。
一般的に、本明細書に記載のキットおよびアッセイでは3種類の被検物結合性分子が使用され、ここで、3種類の被検物結合性分子のうち2種類が被検物および第3の被検物結合性分子との複合体形成に関して競合する。被検物および第3の被検物結合性分子との複合体形成に関して競合する被検物結合性分子は被検物に、例えば約3倍から約5倍、約5倍から約100倍、約5倍から約10倍、約5倍から約25倍、約25倍から約50倍、約50倍から約100倍異なる親和性で結合し、被検物に対する結合の親和性は約3倍、約5倍、約10倍、約25倍、約50倍、約100倍、またはこれ以上の倍数異なる。さまざまな実施形態において、被検物結合性分子のうち1種類または2種類を標識と直接または間接的に結合させる。さまざまな実施形態において、被検物結合性分子のうち1種類、2種類または3種類が抗体またはこの抗原反応性(即ち、被検物に結合する)断片である。
配列決定されたら、被検物に特異的に結合するポリペプチド、例えばモノクローナル抗体(またはこの断片)が当該技術分野で知られた方法、例えば排他的固相支持体合成、部分固相支持体合成、断片縮合および古典的な液相合成を用いて合成され得る。例えば、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1963)を参照のこと。固相支持体では、合成は、典型的にはペプチドのC末端からα−アミノ保護樹脂を用いて開始する。適切な出発物質は、例えば、必要とされるα−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂またはベンズヒドリルアミン樹脂に結合させることにより調製され得る。かかるクロロメチル化樹脂の一例は、商標名BIO−BEADS SX−1 by Bio Rad Laboratories(Richmond,CA)で販売されており、ヒドロキシメチル樹脂の調製はBodonszky et al.,Chem.Ind.(London)38:1597(1966)に記載されている。ベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂はPietta and Marshall,Chem.Comm.650(1970)に報告されており、Beckman Instruments,Inc.(Palo Alto,CA)から塩酸塩の形態で市販されている。自動ペプチド合成装置が市販されており、ペプチドを特注で作製する市販のサービスもある。
被検物(またはこの断片)に特異的に結合するポリペプチド、例えばモノクローナル抗体(またはこの断片)は、当該技術分野で知られた方法を用いて組換え生産することができる。例えば、抗体(またはこの断片)をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸を宿主細胞内で発現させ得、抗体が単離され得る。単離核酸は、被検物に対する抗体のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。単離核酸は、例えばオリゴヌクレオチド合成装置で合成され得る。当業者には、遺伝コードの縮重のため、1種類より多くのヌクレオチド配列に所与のアミノ酸配列がコードされ得ることが容易に認識されよう。これに関して、被検物に対する抗体のものと実質的に同一であるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列が使用され得るが、発現させたバリアント抗体は被検物に対する該抗体と競合するものであるものとする。所与の宿主細胞に好まれるコドンが好ましくは組換え生産に選択される。被検物に対する抗体のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を他のヌクレオチド配列と、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応(LCR)を用いて結合し、抗被検物抗体またはこの抗原反応性断片をコードするようにしてもよい。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的会合のための5’または3’突出端を含むものである。会合したら、抗被検物抗体またはこの抗原反応性断片をコードしているヌクレオチド配列は、ベクター内に挿入され、所与の宿主細胞内での発現に必要な制御配列に作動可能に連結され、(形質転換またはトランスフェクションなどによって)宿主細胞内に導入され得る。ヌクレオチド配列を、宿主細胞内でさらに操作(例えば、さらなる免疫グロブリンドメイン、例えば、さらなる定常領域をコードしている1種類以上のヌクレオチド配列に連結)し、および/または発現させてもよい。
当業者は、本開示における使用のためのこのようなベクター、発現制御配列、最適化コドンおよび宿主の中からなんら必要以上に実験を行うことなく選択を行うことができるであろうと考えられる。例えば、ベクターの選択の際には宿主が検討されなければならず、これは、該ベクターがこの内部で複製できるものでなければならない、または染色体に組み込まれ得るものでなければならないためである。また、ベクターのコピー数、該コピー数の制御能および該ベクターにコードされた他のタンパク質(あれば)(抗生物質マーカーなど)の発現も検討すべきである。また、発現制御配列の選択の際もさまざまな要素が検討され得る。このような要素としては、限定されないが、配列の相対強度、制御可能性および抗被検物抗体をコードしているヌクレオチド配列との適合性(特に、潜在的二次構造に関して)が挙げられる。宿主は、選択したベクターとの適合性、コドン使用頻度、分泌特性、ポリペプチドを正確にフォールディングする能力、発酵または培養要件、タンパク質をグリコシル化する能力(またはこの欠如)およびヌクレオチド配列にコードされた生成物の精製のし易さなどを検討して選択すべきである。
被検物(またはこの断片)に特異的に結合する他の抗体(またはこの断片)は、当該技術分野で知られたさまざまな異なる手法を用いて作製され得る。例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、適切な被検体(例えば限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物)を、適切な免疫原を含む免疫原性調製物で免疫処置することにより生成させることができる。免疫原は、これを産生する細胞から親和性クロマトグラフィー、免疫沈降または当該技術分野でよく知られた他の手法を用いて富化/精製し、単離したものであり得る。または、免疫原は、化学合成を使用し、当該技術分野で知られた常套的な手法(例えば限定されないが、合成装置)を用いて調製したものであってもよい。被検体内で生成した抗体は次いで、該抗体が免疫原(またはこの断片)に結合するかどうかを調べるためにスクリーニングされ得る。
また、被検物に結合する抗体の抗原反応性断片も本明細書に記載のとおりに使用され得る。抗体断片はFab、Fab’、Fab’−SH断片、ジスルフィド結合Fv、単鎖Fv(scFv)、F(ab’)2断片などであり得る。抗体断片の作製のための種々の手法が当業者に知られている。例えば、かかる断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化によって得られ得るか(例えば、Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107−117(1992)およびBrennan et al.,Science 229:81(1985)参照)または組換え宿主細胞により直接生成させ得る。例えば、Fab’−SH断片を大腸菌から直接回収し、化学カップリングさせるとF(ab’)2断片が形成され得る(例えば、Carter et al.,Bio/Technology 10:163−167(1992)参照)。別の実施形態では、F(ab’)2は、F(ab’)2分子の会合を促進させるロイシンジッパーGCN4を用いて形成される。または、Fv、FabまたはF(ab’)2断片を組換え宿主細胞倍溶液から直接単離してもよい。単鎖可変領域断片(scFv)は、軽鎖および/または重鎖の可変領域を短鎖連結ペプチドまたは配列の使用によって連結することにより作製される(例えば、Bird et al.,Science 242:423−426(1998)参照)。一本鎖バリアントは組換えまたは合成のいずれかによって作製され得る。scFvの合成による作製では、自動化合成装置が使用され得る。scFvの組換え生産では、scFvをコードしているポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドが真核生物系(酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞など)または原核生物系(大腸菌など)のいずれかの適切な宿主細胞に導入され得る。目的のscFvをコードしているポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの常套的な操作によって作製され得る。得られたscFvは、当該技術分野で知られた標準的なタンパク質精製手法を用いて単離され得る。さらに、他の形態の一本鎖抗体、例えばダイアボディもまた本開示によって想定される。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であって、VHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されているが、同じ鎖上で2つのドメイン間の対合形成を可能にするには短すぎるリンカーが使用されており、これにより該ドメインが強制的に別の鎖の相補的なドメインと対合形成され、2つの抗原結合部位が作出されているものである(例えば、Holliger et al.,PNAS USA 90:6444−6448(1993);およびPoljak et al.,Structure 2:1121−1123(1994)参照)。
現在市販されているPSAアッセイのアッセイ範囲はおよそ0.1ng/mLから100ng/mLまでである(例えば、Abbott ARCHITECT(R)Total PSA Assay,Abbott Park,IL)。1ステップアッセイ形式ではPSAの高濃度側においてフック効果が観察され得る。本発明の実施例において、本発明者らは、PSAを検出するためのアッセイのダイナミックレンジを拡大するため、本明細書に記載のとおりに実施される1ステップアッセイ形式において0から400,000ng/mLまでの被検物濃度のシグナル応答をモデル設計した。
本明細書において、1ステップアッセイ形式で2種類の検出抗体を使用するサンドイッチアッセイの一例を示す。
Claims (72)
- アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、
a)被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第1の標識を含む第1の被検物結合性分子、第2の標識を含む第2の被検物結合性分子および固相支持体に結合した第3の被検物結合性分子とを:
当該被検物に、
(i)当該第1の被検物結合性分子および当該第3の被検物結合性分子、ならびに
(ii)当該第2の被検物結合性分子および当該第3の被検物結合性分子、
を、結合させる条件下で接触させる工程、ここで、当該第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子は、同時に当該被検物に結合しない;
b)被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度および被検物に結合している当該第2の被検物結合性分子の当該第2の標識のシグナル強度を測定する工程;ならびに
c)当該第1の標識と当該第2の標識の当該シグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
を含み、
被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度および被検物に結合している当該第2の被検物結合性分子の当該第2の標識のシグナル強度を測定する工程b)が、所定の被検物濃度範囲での較正試験において行われ、さらに:
d)較正試験において、被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度と被検物に結合している当該第2の被検物結合性分子の当該第2の標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることにより、フラグ値を設定する工程
を含む、前記方法。 - 当該第1の被検物結合性分子、当該第2の被検物結合性分子および/または当該第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が抗体またはこの断片である、請求項1に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子が当該標識と直接結合している、請求項1または2に記載の方法。
- 当該固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の標識および当該第2の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子を、同じ反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子を、異なる反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の標識と当該第2の標識が同じである、請求項7に記載の方法。
- 当該第1の標識と当該第2の標識が異なっている、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が5倍から100倍の範囲である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも100倍である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- アッセイのダイナミックレンジが3桁以上を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子が、100倍未満までの異なる所定のモル量で存在する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子が、オリゴマー化または架橋されていない、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 試験試料中の被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している当該第2の被検物結合性分子の当該第2の標識のシグナル強度の比が:
フラグ値以上であるならば、被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる;または
フラグ値未満ならば、被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
請求項1に記載の方法。 - 試験試料中の被検物に結合している当該第2の被検物結合性分子の当該第2の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度の比が:
フラグ値以下であるならば、被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる;または
フラグ値を超えているならば、被検物に結合している当該第1の被検物結合性分子の当該第1の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
請求項1に記載の方法。 - 自動化または半自動化システムを用いて行われる、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- アッセイが1ステップアッセイである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1−18のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキットであって、
i)第1の標識を含む第1の被検物結合性分子;
ii)第2の標識を含む第2の被検物結合性分子、ここで、当該第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きい、および
iii)固相支持体に結合した第3の被検物結合性分子、ここで、当該第3の被検物結合性分子は当該被検物に、当該第1の被検物結合性分子または当該第2の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、
を備えており、
当該固相支持体が、空間的に隔てられた2つ以上の電極を含む、キット。 - 当該固相支持体が、携帯型ポイントオブケアデバイスに収容されている、請求項19に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子、当該第2の被検物結合性分子および/または当該第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が、抗体またはこの断片である、請求項19に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子が、当該標識と直接結合している、請求項19または20に記載のキット。
- 当該固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項22に記載のキット。
- 当該固相支持体が、微粒子を含む、請求項23に記載のキット。
- 当該第1の標識および当該第2の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項19から24のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の標識と当該第2の標識が異なっている、請求項19から25のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、5倍から100倍の範囲である、請求項19から26のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも100倍である、請求項19から26のいずれか一項に記載のキット。
- 1ステップサンドイッチアッセイに使用され得る、請求項19から28のいずれか一項に記載のキット。
- アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、
a)被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子、第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子および標識を含む第3の被検物結合性分子とを:
(i)当該第1の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第1の固相支持体に、当該第3の被検物結合性分子を;および
(ii)当該第2の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第2の固相支持体に、当該第3の被検物結合性分子を、
結合させる条件下で接触させる工程;
ここで、当該第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子は、同時に当該被検物に結合しない;
b)当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体に結合している当該第3の被検物結合性分子の当該標識からのシグナル強度を測定する工程;ならびに
c)当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体に結合している当該第3の被検物結合性分子の当該標識からのシグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
を含み、
被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度、および被検物と第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度を測定する工程b)が、所定の被検物濃度範囲での較正試験において行われ、さらに:
d)較正試験において、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度と、被検物と第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることによりフラグ値を設定する工程
を含む、前記方法。 - 当該第1の被検物結合性分子、当該第2の被検物結合性分子および/または当該第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が、抗体またはこの断片である、請求項30に記載の方法。
- 当該第3の被検物結合性分子が、当該標識と直接結合している、請求項30または31に記載の方法。
- 当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の標識および当該第2の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項30から33のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子を、同じ反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項30から34のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の固相支持体が、第1の発色団を含む微粒子またはビーズであり、当該第2の固相支持体が、第2の発色団を含む微粒子またはビーズである、請求項30から35のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体が、形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である、請求項30から36のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の固相支持体が第1の電極であり、当該第2の固相支持体が第2の電極であり、ここで、当該第1の電極と当該第2の電極が空間的に隔てられている、請求項30から35のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の電極および当該第2の電極が、携帯型ポイントオブケアデバイスに収容されている、請求項38に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子を、異なる反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項30から39のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、5倍から100倍の範囲である、請求項30から40のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも100倍である、請求項30から40のいずれか一項に記載の方法。
- イムノアッセイのダイナミックレンジが3桁以上を含む、請求項30から42のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子を、100倍未満までの異なる所定のモル量で存在する、請求項30から43のいずれか一項に記載の方法。
- 当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子が、オリゴマー化または架橋されていない、請求項30から44のいずれか一項に記載の方法。
- 被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度に対する被検物と第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の比が:
フラグ値以上であるならば、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められ、または
フラグ値未満ならば、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
請求項30に記載の方法。 - 被検物と第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度に対する被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の比が:
フラグ値以下であるならば、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる;または
フラグ値を超えているならば、被検物と第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
請求項30に記載の方法。 - 前記試験試料、当該第1の固相支持体に結合した前記第1の被検物結合性分子および当該第2の固相支持体に結合した前記第2の被検物結合性分子に、標識を含む前記第3の被検物結合性分子を接触させる前に、前記第1または前記第2の固相支持体に結合していない被検物を洗浄することにより除去する、請求項30から45のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、被検物に結合している第1の被検物結合性タンパク質の第1の標識のシグナル強度の横ばい値(プラトー)またはこの付近に、フラグ値を設定する工程を含む、請求項48に記載の方法。
- 試験試料中の被検物に結合している当該第1の被検物結合性タンパク質の当該第1の標識のシグナル強度がフラグ値以上ならば、被検物に結合している当該第2の被検物結合性分子の当該第2の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、請求項49に記載の方法。
- 自動化または半自動化システムを用いて行われる、請求項30から50のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項30−51のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキットであって、
i)第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子;
ii)第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子、ここで、当該第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きい;および
iii)標識を含む第3の被検物結合性分子、ここで、当該第3の被検物結合性分子は当該被検物に、当該第1の被検物結合性分子または当該第2の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、
を備えており、
当該第1の固相支持体が第1の電極を含み、および当該第2の固相支持体が第2の電極を含む、キット。 - 当該第1の被検物結合性分子、当該第2の被検物結合性分子および/または当該第3の被検物結合性分子のうちの1つ以上が抗体またはこの断片である、請求項52に記載のキット。
- 当該第3の被検物結合性分子が当該標識と直接結合している、請求項52または53に記載のキット。
- 当該標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項52から54のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項52から55のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体が、第1の発色団を含む微粒子またはビーズであり、当該第2の固相支持体が、第2の発色団を含む微粒子またはビーズである、請求項52から56のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体が、形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である、請求項52から56のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体が第1の電極であり、当該第2の固相支持体が第2の電極であり、ここで、当該第1の電極と当該第2の電極が空間的に隔てられている、請求項52から56のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、5倍から100倍の範囲である、請求項52から59のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも100倍である、請求項52から59のいずれか一項に記載のキット。
- 1ステップまたは2ステップのいずれかのサンドイッチアッセイのために使用され得る、請求項52から61のいずれか一項に記載のキット。
- アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、
a)被検物を含んでいることが疑われる試験試料を、標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子、第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子と接触させること、ここで、当該第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、当該第1の被検物結合性分子および当該第2の被検物結合性分子は、同時に当該被検物に結合しない;
b)当該第1の固相支持体上の当該第1の被検物結合性分子および当該第2の固相支持体上の当該第2の被検物結合性分子に結合しているトレーサーからのシグナル強度を測定すること;ならびに
c)当該第1の固相支持体に結合した当該第1の被検物結合性タンパク質に結合している当該トレーサーのシグナル強度の横ばい値(プラトー)またはこの付近にフラグ値を設定すること
を含み、
当該第1の固相支持体に結合した当該第1の被検物結合性タンパク質に結合している当該トレーサーのシグナル強度がフラグ値以下であるならば、当該第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性タンパク質に結合している当該トレーサーのシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる、前記方法。 - 請求項63に記載の方法において使用するためのキットであって、
i)第1の固相支持体に結合した第1の被検物結合性分子;
ii)第2の固相支持体に結合した第2の被検物結合性分子、ここで、当該第1の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第2の被検物結合性分子の結合親和性より大きい;および
iii)標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、ここで、前記トレーサーは、当該第1の被検物結合性分子または当該第2の被検物結合性分子のいずれかとの結合に関して、前記被検物と競合し得る、
を備えたキット。 - 当該第1の被検物結合性分子および/または当該第2の被検物結合性分子の1つ以上が、抗体またはこの断片である、請求項64に記載のキット。
- 標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項64または65に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項64から66のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体が、第1の発色団を含む微粒子またはビーズであり、当該第2の固相支持体が、第2の発色団を含む微粒子またはビーズである、請求項64から66のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体および当該第2の固相支持体が、形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である、請求項64から66のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の固相支持体が第1の電極であり、当該第2の固相支持体が第2の電極であり、ここで、当該第1の電極と当該第2の電極が空間的に隔てられている、請求項64から66のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、5倍から100倍の範囲である、請求項64から70のいずれか一項に記載のキット。
- 当該第1の被検物結合性分子と当該第2の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも100倍である、請求項64から70のいずれか一項に記載のキット。
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