JP2016510128A - 広いダイナミックレンジを有するアッセイ - Google Patents

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Abstract

本明細書において「プロゾーン現象」または「フック効果」を回避するのに有用であり、厳密に測定可能な被検物濃度の範囲を拡大するアッセイおよびキットを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８３３，６５５号の継続出願である。該米国特許出願は参照によりこの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
本明細書においてアッセイのダイナミックレンジを拡大するためのキットおよび方法を提供する。
過去数十年間、アッセイは、蛍光、化学発光、または被検物に応答してシグナルを生成させる他の手段を用いて行われている。現在、多くのアッセイは、反応混合物の全容量において生成した光シグナルの強度の測定によって行われている。生成した光シグナルは光学的手段によって測定され得、この場合、生成する光シグナルは多数の分子によって放射されているものである。典型的な一実施形態では、このようなアッセイは、抗原を含んでいることが疑われる試料を、固相支持体、例えば微粒子に結合した第１の抗体を含む試薬と合わせ、反応混合物を形成することにより行われ得る。抗原が試料中に存在している場合、これは第１の抗体に特異的に結合する。標識と結合した第２の抗体を含むコンジュゲートを反応混合物に導入すると、これは、先に記載のように固相支持体に結合した第１の抗体に特異的に結合している抗原に特異的に結合する。かかるアッセイはサンドイッチアッセイまたはイムノメトリックアッセイと称される。この型のアッセイを図１に模式的に示す。次いで、未結合コンジュゲートを反応混合物から除去（典型的には洗浄工程を行うことにより）した後、標識に起因するシグナルが測定される。反応混合物の全容量で得られたシグナルを測定し、次いで較正曲線と比較し、試料中に存在する抗原の濃度が確定される。アッセイがコンジュゲート抗体を導入する前に未結合試料被検物を除去するための洗浄工程を含む場合、これは一般的に「２ステップアッセイ」とみなされる。アッセイでコンジュゲート抗体と被検物を、中間の洗浄工程なしで一緒に抗体コート微粒子に導入する場合、これは「１ステップ」アッセイとみなされる。「フック効果」または「プロゾーン現象」は、「１ステップアッセイ」形式において圧倒的に多量の抗原が存在する場合のアッセイにおける偽低値の現象である。これは、アッセイにおいて捕捉抗体および検出抗体が不充分であることによって引き起こされる。かかるフック効果によってアッセイのダイナミックレンジが制限される。
サンドイッチアッセイで広範な被検物濃度で検出が可能である；典型的には２から３桁までの被検物濃度にわたって厳密に測定が可能である。しかし、被検物の検出がより広く、例えば３桁を超えて拡大されることは稀である。
一態様において、キットを提供する。さまざまな実施形態において、キットは：
ｉ）第１の標識を含む第１の被検物結合性分子；
ｉｉ）第２の標識を含む第２の被検物結合性分子、ここで、第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きい、および
ｉｉｉ）固相支持体に結合した第３の被検物結合性分子、ここで、第３の被検物結合性分子は被検物と、第１の被検物結合性分子または第２の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、
を備えている。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子、第２の被検物結合性分子および／または第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、固相支持体が空間的に隔てられた２つ以上の電極を含むものである。一部の実施形態では、固相支持体が微粒子を含むものである。一部の実施形態では、第１の標識および第２の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の標識と第２の標識が異なっている。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約５倍から約１００倍の範囲である、例えば約１０倍から約１００倍である。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約１００倍である。一部の実施形態では、キットは、１ステップサンドイッチアッセイまたは２ステップサンドイッチアッセイのいずれかに使用され得る。
一部の実施形態では、キットは：
ｉ）第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子；
ｉｉ）第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子、ここで、第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きい；および
ｉｉｉ）標識を含む第３の被検物結合性分子、ここで、第３の被検物結合性分子は被検物と、第１の被検物結合性分子または第２の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、を備えている。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子、第２の被検物結合性分子および／または第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、第３の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の固相支持体および第２の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の固相支持体が、第１の発色団を含む微粒子またはビーズであり、第２の固相支持体が、第２の発色団を含む微粒子またはビーズである。一部の実施形態では、第１の固相支持体および第２の固相支持体が形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である。一部の実施形態では、第１の固相支持体が第１の電極であり、第２の固相支持体が第２の電極であり、ここで第１の電極と第２の電極は空間的に隔てられている。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約５倍から約１００倍の範囲である、例えば約１０倍から約１００倍である。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約１００倍である。
一部の実施形態では、例えば競合アッセイキットの場合、キットは：
ｉ）第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子；
ｉｉ）第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子、ここで、第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きい；および
ｉｉｉ）標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、ここで、前記トレーサーは、第１の被検物結合性分子または第２の被検物結合性分子のいずれかとの結合に関して、前記被検物と、競合し得る、を備えている。一部の実施形態では、キットは、１種類以上が抗体またはこの断片である第１の被検物結合性分子および／または第２の被検物結合性分子を備えている。一部の実施形態では、標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の固相支持体および第２の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の固相支持体が、第１の発色団を含む微粒子またはビーズであり、第２の固相支持体が、第２の発色団を含む微粒子またはビーズである。一部の実施形態では、第１の固相支持体および第２の固相支持体が形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である。一部の実施形態では、第１の固相支持体が第１の電極であり、第２の固相支持体が第２の電極であり、ここで第１の電極と第２の電極は空間的に隔てられている。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約５倍から約１００倍の範囲である、例えば約１０倍から約１００倍である。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約１００倍である。
別の態様において、アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法を提供する。さまざまな実施形態において、該方法は：
ａ）被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第１の標識を含む第１の被検物結合性分子、第２の標識を含む第２の被検物結合性分子および固相支持体に結合した第３の被検物結合性分子とを：
（ｉ）第１の被検物結合性分子および第３の被検物結合性分子、ならびに
（ｉｉ）第２の被検物結合性分子および第３の被検物結合性分子、
を、結合させる条件下で接触させる工程、ここで、第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子は同時に当該被検物に結合しない；
ｂ）被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度および被検物に結合している第２の被検物結合性分子の第２の標識のシグナル強度を測定する工程；ならびに
ｃ）第１の標識と第２の標識のシグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
を含むものである。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子、第２の被検物結合性分子および／または第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の標識および第２の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を試験試料と同じ反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を試験試料と、異なる反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第１の標識と第２の標識が異なっている。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約５倍から約１００倍の範囲である。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約１００倍である。さまざまな実施形態において、アッセイのダイナミックレンジが３桁以上、例えば４桁以上を含む。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子を、約１００倍未満（例えば、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５０倍、約６０倍から約１００倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍）異なる所定のモル量で存在させる。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子がオリゴマー化または架橋されたものでない。一部の実施形態では、該方法が自動化または半自動化システムを用いて行われる。一部の実施形態では、アッセイが１ステップアッセイである。
一部の実施形態では、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度および被検物に結合している第２の被検物結合性分子の第２の標識のシグナル強度を測定する工程ｂ）が所定の被検物濃度範囲での較正試験において行われ、該方法がさらに：
ｄ）較正試験において、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度と被検物に結合している第２の被検物結合性分子の第２の標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることによりフラグ値を設定する工程を含む。
一部の実施形態では、試験試料中の被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している第２の被検物結合性分子の第２の標識のシグナル強度の比が：
フラグ値以上であるならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる；または
フラグ値未満ならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
一部の実施形態では、試験試料中の被検物に結合している第２の被検物結合性分子の第２の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の比が：
フラグ値以下であるならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる；または
フラグ値を超えているならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
さらなる一態様において、アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は：
ａ）被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子、第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子および標識を含む第３の被検物結合性分子とを：
（ｉ）当該第１の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第１の固相支持体に、第３の被検物結合性分子を；および
（ｉｉ）当該第２の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第２の固相支持体に、第３の被検物結合性分子を、
結合させる条件下で接触させる工程；
ここで、第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子は、同時に被検物に結合しない；
ｂ）第１の固相支持体および第２の固相支持体に結合している第３の被検物結合性分子の標識からのシグナル強度を測定する工程；ならびに
ｃ）第１の固相支持体および第２の固相支持体に結合している第３の被検物結合性分子の標識からのシグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
を含む。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子、第２の被検物結合性分子および／または第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が抗体またはこの断片である。一部の実施形態では、第３の被検物結合性分子が標識と直接結合している。一部の実施形態では、第１の固相支持体および第２の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の標識および第２の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を試験試料と同じ反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第１の固相支持体が、第１の発色団を含む微粒子またはビーズであり、第２の固相支持体が、第２の発色団を含む微粒子またはビーズである。一部の実施形態では、第１の固相支持体および第２の固相支持体が形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である。一部の実施形態では、第１の固相支持体が第１の電極であり、第２の固相支持体が第２の電極であり、ここで第１の電極と第２の電極は空間的に隔てられている。一部の実施形態では、第１の電極および第２の電極が携帯型ポイントオブケアデバイスに収容されている。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を試験試料と、異なる反応混合物中で接触させる。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約５倍から約１００倍の範囲である、例えば約１０倍から約１００倍である。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約１００倍である。一部の実施形態では、イムノアッセイのダイナミックレンジが３桁以上を含む。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子を、約１００倍未満（例えば、約１０倍から約１００倍、約１０倍から約５０倍、約６０倍から約１００倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍）異なる所定のモル量で存在させる。一部の実施形態では、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子がオリゴマー化または架橋されたものでない。一部の実施形態では、該方法が自動化または半自動化システムを用いて行われる。
一部の実施形態では、前述のアッセイが１ステップアッセイである（即ち、この場合は洗浄工程がない。）。一部の実施形態では、前述のアッセイが２ステップアッセイである（即ち、この場合は洗浄工程がある。）。かかる２ステップアッセイは、場合により、試験試料、第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子および第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子に、標識を含む第３の被検物結合性分子を接触させる前に、前記第１または前記第２の固相支持体に結合していない被検物を洗浄により除去する以外は記載のとおりに行われ得る。洗浄は、当業者によく知られた手段によって行われ得る。
１ステップアッセイの一部の実施形態では、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度および被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度を測定する工程ｂ）が所定の被検物濃度範囲での較正試験において行われ、該方法がさらに：
ｄ）較正試験において、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度と、被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることによりフラグ値を設定する工程を含む。
１ステップアッセイの一部の実施形態では、試験試料中の被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している第２の被検物結合性分子の第２の標識のシグナル強度の比が：
フラグ値以上であるならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められ、または
フラグ値未満ならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
１ステップアッセイの一部の実施形態では、試験試料中の被検物に結合している第２の被検物結合性分子の第２の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の比が：
フラグ値以下であるならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる；または
フラグ値を超えているならば、被検物に結合している第１の被検物結合性分子の第１の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
２ステップアッセイの一部の実施形態では、該方法は、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度、および被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度を測定することが所定の被検物濃度範囲での較正試験において行われるさらなる工程ｂ）を含む。該方法はさらに、場合により、２つのシグナルプロット内の較正曲線として使用されるのに充分なセクションを選択する基準を設定する工程を含む。一部の実施形態では、該方法はさらに、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度の横ばい値（プラトー）またはこの付近にフラグ値を設定する工程を含む。該方法の一部の実施形態では、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度がフラグ値以上であるならば、被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる。
さらなる一態様では、競合アッセイ形式においてアッセイのダイナミックレンジを拡大する方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は場合により：
ａ）被検物を含んでいることが疑われる試験試料を、標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子、第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子と接触させること、ここで、第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子は、同時に被検物に結合しない；
ｂ）第１の固相支持体上の第１の被検物結合性分子および第２の固相支持体上の第２の被検物結合性分子に結合しているトレーサーからのシグナル強度を測定すること；ならびに
ｃ）第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性タンパク質に結合しているトレーサーのシグナル強度の横ばい値（プラトー）またはこの付近にフラグ値を設定すること
を含む。一部の実施形態では、第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性タンパク質に結合しているトレーサーのシグナル強度がフラグ値以下ならば、第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子に結合しているトレーサーのシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる。
図１は、サンドイッチアッセイの模式図を示す。 図２は、競合アッセイの模式図を示す。 図３は、フック効果の結果、得られた代表的な較正曲線を示し、「プラトー」と表示したラインまではフック効果はない。横座標：被検物濃度（例えば、ｎｇ／ｍＬなどの単位）。縦座標：シグナルの大きさ（例えば、発光量の計数などの単位）。 図４は、第１の被検物結合性分子を第１の型の固相支持体に結合させ、第２の被検物結合性分子を第２の型の固相支持体に結合させ、第３の被検物結合性分子を標識と結合させたアッセイの一実施形態の模式図を示す。 図５は、第１の被検物結合性分子を第１の標識と結合させ、第２の被検物結合性分子を第２の標識と結合させ、第３の被検物結合性分子が固相支持体に結合させたアッセイの一実施形態の模式図を示す。ＡＢＭ；被検物結合性分子。 図６Ａは、１ステップサンドイッチアッセイの一例を示す。例示的な高親和性抗体および低親和性抗体で独立して得られた実例としてのシグナルプロットを示す。各プロットは較正曲線の上昇部分と下降部分および最大強度ピークを有する。図６Ｂは、１ステップサンドイッチアッセイの一例を示す。低親和性抗体と高親和性抗体のシグナル比のプロットを示す。この２つのプロットを組み合わせて使用すると試験試料の濃度を求めることができる。 図７は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のモデル設計サンドイッチアッセイの一例を示す。図７ａは、高親和性抗体および低親和性抗体で独立して得られた実例としてのシグナルプロットを示す。図７ｂは、低親和性抗体と高親和性抗体のシグナル比のプロットを示す。この２つのプロットを組み合わせて使用すると試験試料の濃度を求めることができる。 図８Ａは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のサンドイッチアッセイの一例を示す。高親和性抗体および低親和性抗体で独立して得られた実例としてのシグナルプロットを示す。図８Ｂは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のサンドイッチアッセイの一例を示す。低親和性抗体と高親和性抗体のシグナル比のプロットを示す。この２つのプロットを組み合わせて使用すると試験試料の濃度を求めることができる。 図９は、本明細書に記載のとおりに行った２ステップアッセイの結果、得られた代表的な較正曲線を示す。シグナル１は、被検物に結合している標識された被検物結合性分子に由来しており、この被検物は、第１の固相支持体上にコートされた第１の被検物結合性分子にも結合している。シグナル２は、被検物に結合している標識された被検物結合性分子に由来しており、この被検物は、第２の固相支持体上にコートされた第２の被検物結合性分子にも結合している。括弧内の領域（左の較正曲線の上昇部分「Ａ」と右の較正曲線の上昇部分「Ｂ」）が試験試料の濃度値の決定に使用され得る。 図１０は、本明細書に記載のとおりに行った競合アッセイの結果、得られた代表的な較正曲線を示す。シグナル１は、第１の固相支持体上にコートされた第１の被検物結合性分子に結合しているトレーサーに由来している。シグナル２は、第２の固相支持体上にコートされた第２の被検物結合性分子に結合しているトレーサーに由来している。括弧内の領域（左の較正曲線の下降部分「Ａ」および右の較正曲線の下降部分「Ｂ」）が試験試料の濃度値の決定に使用され得る。
本開示により、一部において、例えばサンドイッチアッセイ（１ステップおよび２ステップサンドイッチアッセイを含む）におけるいわゆる「フック効果」または「プロゾーン現象」を解消または回避することにより、アッセイのダイナミックレンジを広げるためのアッセイおよび方法を見出し、設計することに関して記載している。
定義
以下の用語は本開示に関連するものである。
用語「フック効果」および「プロゾーン現象」は互換的に、試料中に存在している実際のレベルよりも有意に低い吸光度を示す被検物（例えば、抗原）の測定レベルをいう。これは、幾つかの要因によって引き起こされ得る。例えば、これは、被検物の濃度が被検物結合性捕捉分子ならびに被検物結合性検出分子の両方の利用可能なすべての部位を過飽和させるのに充分に高く、これによりサンドイッチ形成が妨げられることによってアッセイが飽和している場合に起こる。溶液中の飽和状態の被検物結合性検出分子は未結合のままであり、洗い流されて偽低値シグナルをもたらす。「フック」は、データを被検物（例えば、抗原）濃度に対するシグナルとしてプロットした場合、曲線において観察される。
例えば、典型的な二抗体単一工程である「サンドイッチ−型」イムノアッセイでは、捕捉抗体（これは、典型的には固相上に固定化された抗体である。）を、目的の被検物を含んでいることが疑われる試験試料と混合する。この混合物に、検出可能な標識を含む抗体（以下、本明細書において「コンジュゲート」と称する。）を添加する。このアッセイでは、捕捉抗体が試験試料中の被検物に結合して捕捉抗体−被検物複合体を形成する。次いで、コンジュゲートが捕捉抗体−被検物複合体に結合し（「サンドイッチ」）、コンジュゲートの標識が目的の被検物の測定値として当該技術分野で知られた常套的な手法を用いて検出される。大過剰の遊離被検物の存在下では、すべてのコンジュゲートが遊離被検物に直接結合し、捕捉抗体−被検物複合体との結合に利用可能なコンジュゲートが少なくなる。この結果、捕捉抗体−被検物複合体との結合に利用可能な遊離コンジュゲートが少なくなるため、捕捉抗体−被検物複合体に結合される標識の量が低減され、従って検出される被検物の量が少なくなる。図３は、フック効果の結果として得られた較正曲線の一例を示す。図３で明らかなように、逆説的に、被検物濃度の範囲の高濃度端側では、実際の被検物濃度が高いほど、測定濃度は低く現れる。これは、フック効果がない場合に得られる曲線とは対照的である。かかる較正曲線では低値まで低下するのではなく、プラトーのままになる。
従って、フック効果を伴う較正曲線はピークと２つの特徴的なセクション「上昇部分」および「下降部分」を有する。図３からわかるように、上昇部分は、較正曲線の高値へと増大しているセクションである。下降部分は、較正曲線の低値またはさらには負の値へと減少しているセクションである。上昇部分は凹形に上向きであり（正の曲率）、一方、下降部分は凹形に下向きである（負の曲率）。上昇部分と下降部分は変曲点で分かれており、変曲点では曲率がマイナスからプラスに変化する。フック効果および同じ型の較正曲線が１ステップサンドイッチアッセイでも観察され得る。
「アッセイ」は、多くの場合、物質の複雑な混合物を含む溶液中の物質の存在または濃度を調べる生化学的試験である。血清または尿などの生体液中の被検物は、多くの場合、アッセイ法を用いてアッセイされる。かかるアッセイは、被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）が高い特異性で１つまたは非常に限定的な一群の分子に結合する固有の能力に基づいたものである。被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）に結合する分子は被検物または抗原と称される。分離工程を必要とするアッセイは、しばしば分離アッセイまたは不均一系アッセイと称され、設計が容易であるため普及しているが、多くの場合、標識された試薬が結合した表面を注意深く洗浄することを含む多くの工程が必要とされる。一部のアッセイは分離工程なしで実施され得る。かかるアッセイは、多くの場合、単純に試薬と試料を混合し、物理的測定を行うことにより行われ得る。かかるアッセイは、均一系アッセイまたは頻度は低いが非分離アッセイと称される。
本明細書で用いる場合、表現「サンドイッチアッセイ」は、同時に（例えば、同じ工程または別々の工程で）同じ被検物に結合する２種類の被検物結合性分子を使用するアッセイを意味する。被検物結合性分子の一方は固相支持体に直接または間接的に結合させ、被検物をこの固相支持体（例えば、微粒子または電極など）に直接または間接的に結合させる。他方の被検物結合性分子は標識と直接または間接的に結合させ、被検物をこの標識と直接または間接的に結合させ、被検物を検出するためのシグナルを得る。例えば、被検物結合性分子の一方は、試料中の被検物（例えば、抗原）に特異的に結合させるための被検物結合性捕捉分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）であり得、この場合、被検物（例えば、抗原）は固相支持体（例えば、電極または微粒子など）に直接または間接的に結合され、他方の被検物結合性分子は、試料中の被検物（例えば、抗原）に特異的に結合させるための被検物結合性検出分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）であり得、この場合、被検物（例えば、抗原）は抗原を検出するための標識と直接または間接的に結合される。比較的量が多い被検物が試料中に存在する場合、生成されるシグナルは多い。比較的量が少ない被検物が試料中に存在する場合、生成されるシグナルは少ない。図１は、サンドイッチアッセイの代表例を示す模式図である。
本明細書で用いる場合、表現「競合アッセイ」は、未標識抗原と標識抗原が同じ抗体部位に対する結合に関して競合するアッセイをいう。または、抗体と標識抗体が同じ抗原部位に対する結合に関して競合する。前者の一例では、標識抗原と未標識抗原が使用される。固相支持体を、標識抗原または未標識抗原のいずれかに特異的に結合し得る抗体でコートする。固相支持体、標識抗原、および抗原を含んでいることが疑われる患者の試料を合わせる。もちろん、患者の試料中の抗原（あれば）は未標識である。標識抗原と未標識抗原は、固相支持体上の抗体部位に関して競合する。標識抗原のみがシグナルを生成し得るため、標識抗原が固相支持体上の抗体に結合した場合のみシグナルが生成され得る。患者の試料中の抗原の量は生成したシグナルの量に反比例する。この型のアッセイを図２に模式的に示す。
本明細書で用いる場合、用語「複合体」は、少なくとも２つの分子が互いに特異的に結合しているものを意味する。複合体の例としては、限定されないが、被検物が被検物結合性分子に結合しているもの、被検物が複数の被検物結合性分子に結合しているもの、例えば、被検物が２つの被検物結合性分子に結合しているもの、被検物結合性分子が複数の被検物に結合しているもの、例えば、被検物結合性分子が２つの被検物に結合しているものが挙げられる。
本明細書で用いる場合、表現「固相支持体」は、被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）が、該被検物結合性分子が液状媒体中の固相支持体から切断されて遊離し得ないように結合され得る任意の固相表面を意味する。固相支持体は該固相支持体が接触している液体から容易に分離され得る。さまざまな実施形態において、固相支持体は、例えばプラスチック、誘導体化プラスチック、磁性もしくは非磁性金属、ガラスまたはシリコンであり得る。固相支持体の代表例としては、限定されないが、電極、テストチューブ、ビーズ、微粒子、ナノ粒子、マイクロ−またはマルチ−ウェルプレートのウェル、ゲル、コロイド、生体細胞、シート、チップ、および当業者に知られた他の構成体が挙げられる。被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）が結合され得る対象物の一例は微粒子、例えば磁性微粒子などである。微粒子は、典型的には１０００ミクロン未満の平均直径を有するものである。微粒子は、分散している液体から容易に分離され得る。微粒子は水性媒体中に容易に分散されるものである。さらに、場合により固相支持体は、被検物結合性タンパク質の回収手段、即ち、被検物結合性分子を該表面から、アッセイを実施した条件とは相違する制御された条件下で放出または離脱させる手段をもたらすものである。例えば、被検物結合性分子は固相支持体に切断可能なリンカーによって結合され得る。
本明細書で用いる場合、表現「被検物結合性捕捉分子」は、被検物（例えば、抗原）を固相支持体に結合させる被検物結合性分子、例えば、抗体またはこの抗原反応性断片を意味し、該抗体が被検物を固相支持体に結合させるという結果を伴い、この場合、被検物は固相支持体に直接または介在部分を介して間接的のいずれかによって結合される。
本明細書で用いる場合、表現「被検物結合性検出分子」は、化学的または生物学的反応において検出可能なシグナルをもたらす部分、またはもたらすように作製されたものであり得る部分に結合した被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）を意味する。
用語「１ステップ」アッセイは、未結合試料被検物からの結合試料被検物の分離を含むまないアッセイをいう。
用語「２ステップ」アッセイは、未結合試料被検物からの結合試料被検物の分離を含むアッセイをいう。
「約」は、記載の値からのおよそ＋／−１０％の変動をいう。かかる変動は、この語が具体的に示されているかいないかにかかわらず、本明細書において示す任意の所与の値に常に包含されていることを理解されたい。
「被検物」は、本明細書においてさらに説明するように測定対象の化合物または組成物を意味し、これはリガンドであってもよく、これは、単エピトープ型または多エピトープ型、抗原性またはハプテン性、少なくとも１つの共通するエピトープ部位または受容体を共有する単一または複数の化合物である。実例の目的の被検物としては、限定されないが、例えば、一般的にはタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ならびにより具体的には例えば、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素または受容体が挙げられる。
「抗体（「ａｎｔｉｂｏｄｙ」および「ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二機能性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全または一部ヒト化）、動物の抗体（例えば限定されないが、トリ（例えば、アヒルもしくはガチョウ）、サメ、クジラ、および哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、リャマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジーなど）、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）、ならびに抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二重ドメイン抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）または三重可変ドメイン（ＴＶＤ）抗体（二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびこの作製方法は、Ｗｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（１１）：１２９０−１２９７（２００７）および国際公開第２００１／０５８９５６号パンフレットに記載されており、各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。）、ならびに上記の任意のものの機能的に活性なエピトープ結合断片をいう。用語「二機能性抗体」は、本明細書で用いる場合、ある抗原部位に対する特異性を有する第１のアームと、異なる抗原部位に対する特異性を有する第２のアームとを含む抗体をいう、即ち、二機能性抗体二重特異性を有するものである。
「抗体断片（「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ」および「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」）」は、インタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含む一部分をいう。この部分には、インタクトな抗体のＦｃ領域の重鎖定常ドメイン（即ち、抗体のアイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）は含まれない。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、軽鎖可変ドメインを１つだけ含む一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチド、重鎖可変領域を１つだけ含むを含む一本鎖ポリペプチド、および重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチドが挙げられる。
「結合定数」は本明細書において説明してとおりである。用語「会合速度定数」、「ｋｏｎ」または「ｋａ」は、本明細書において互換的に用いており、以下の式によって示されるような、特異的結合ペアの第１の構成員（ＳＢＰ１；例えば、被検物結合性分子、抗体（Ａｂ）もしくはこの被検物反応性断片）と特異的結合ペアの第２の構成員（ＳＢＰ２；例えば、被検物（例えば、抗原（Ａｇ））の結合速度を示す値、または特異的結合ペアの第１の構成員と特異的結合ペアの第２の構成員間の複合体形成の速度を示す値をいう：
ＳＢＰ１＋ＳＢＰ２→ＳＢＰ１−ＳＢＰ２
Ａｂ＋Ａｇ→Ａｂ−Ａｇ。
用語「解離速度定数」、「ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」は、本明細書において互換的に用いており、以下の式によって示されるような、ＳＢＰ１（例えば、被検物結合性分子、Ａｂもしくはこの被検物反応性断片）のＳＢＰ２（例えば、Ａｇ）からの解離速度を示す値またはＳＢＰ１−ＳＢＰ２複合体（例えば、Ａｂ−Ａｇ複合体）の経時的な遊離のＳＢＰ１（例えば、被検物結合性分子、Ａｂもしくはこの被検物反応性断片）とＳＢＰ２（例えば、Ａｇ）への分離を示す値をいう：
ＳＢＰ１＋ＳＢＰ２←ＳＢＰ１−ＳＢＰ２
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ。
会合速度定数および解離速度定数の測定方法は当該技術分野でよく知られている。蛍光系手法の使用により、高い感度および平衡状態の生理学的バッファー中での試料中での検査できる可能性がもたらされる。他の実験アプローチおよび機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（生体分子相互作用解析）アッセイを使用してもよい（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手可能な機器）。さらに、ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ））アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能）を使用してもよい。
用語「平衡解離定数」または「ＫＤ」は、本明細書において互換的に用いており、解離速度（ｋｏｆｆ）を会合速度（ｋｏｎ）で除算することにより得られる値をいう。会合速度、解離速度および平衡解離定数は、抗原に対する被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの被検物反応性断片）の結合親和性を表すために用いられる。これは以下の反応および式：
Ａ＋Ｂ→ＡＢ
Figure 2016510128
 によって示され得る。
考えられる限りにおいて、これらの結合定数のいずれか１つ、即ちｋａ、ｋｄまたはＫＤが「結合親和性」、即ち結合の傾向または強度を評価または比較するために使用され得る。しかしながら、一般的に本明細書で記載している場合は、結合親和性はＫＤをいう。
「ＣＤＲ」は、本明細書において、被検物結合性分子または抗体の可変配列内の「相補性決定領域」を示すために用いている。抗体には重鎖および軽鎖の可変領域の各々に３つのＣＤＲが存在し、これらは、各可変領域について「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表示される。用語「ＣＤＲセット」は、本明細書で用いる場合、抗原に結合する１つの可変領域に存在する３つのＣＤＲ群をいう。これらのＣＤＲの厳密な境界は、種々のシステムに応じて種々に確定されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））によって示されたシステムは、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基番号付けシステムを示すだけでなく、３つのＣＤＲを画定する正確な残基の境界も示す。このようなＣＤＲは「Ｋａｂａｔ ＣＤＲ」と称されることがあり得る。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者ら（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）；ならびにＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））により、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定の下位部分は、アミノ酸配列レベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド主鎖コンホメーションが採用されていることが見出された。このような下位部分は「Ｌ１」、「Ｌ２」および「Ｌ３」または「Ｈ１」、「Ｈ２」および「Ｈ３」と表示され、ここで、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域および重鎖領域を表す。このような領域は「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」と称されることがあり得、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを画定する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３−１３９（１９９５）およびＭａｃＣａｌｌｕｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２（５）：７３２−７４５（１９９６）により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、本明細書におけるシステムの１つに厳密に従うものではない場合があり得るがＫａｂａｔ ＣＤＲと重複している（が、特定の残基または残基群またはさらには全ＣＤＲが被検物（例えば、抗原）結合に有意に影響しないという予測または実験所見に鑑みて短かったり長かったりし得る。）。本明細書で使用される方法において、このようなシステムのいずれかに従って画定されるＣＤＲを使用してもよいが、一部の特定の実施形態ではＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって確定されるＣＤＲが使用される。
「成分／構成要素（「ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」、「ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」）」および「少なくとも１つの成分／構成要素」は、一般的に、捕捉抗体、検出抗体またはコンジュゲート抗体、較正標準、対照、感度測定パネル、容器、バッファー、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止液などの、本明細書に記載の方法および当該技術分野で知られた他の方法による
試験試料（患者の血清試料など）のアッセイのためのキットに含めることができるものをいう。一部の成分は、溶液状であってもよく、アッセイにおける使用のために再構成するために凍結乾燥させてもよい。
本明細書で用いる場合、用語「コンジュゲート」は、結合ペアの構成員と標識を含む存在体を意味する。
「対照」は、被検物を含んでいないこと（「陰性対照」）、または被検物を含んでいること（「陽性対照」）がわかっている組成物をいう。陽性対照は既知濃度の被検物を含むものであり得る。「対照」、「陽性対照」および「較正標準」は本明細書において互換的に用いている場合があり得、既知濃度の被検物を含む組成物をいう。「陽性対照」は、アッセイの性能特性を確立するために使用され得、試薬（例えば、被検物）の完全性の有用な指標である。
「エピトープ（「ｅｐｉｔｏｐｅ」、「ｅｐｉｔｏｐｅｓ」）」または「目的のエピトープ」は、特異的結合パートナー（例えば、被検物結合性分子、例えば、抗体またはこの断片）によって認識され、この相補性部位（１つまたは複数）に結合し得る任意の被検物上の部位（１つまたは複数）をいう。被検物と抗原結合性分子は特異的結合ペアの一部である。例えば、エピトープはポリペプチド、タンパク質、ハプテン、糖鎖抗原（例えば限定されないが、糖脂質、糖タンパク質もしくはリポ多糖）または多糖上に存在し得る。この特異的結合パートナーは、限定されないが、被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの被検物反応性断片）であり得る。
「フラグ値」は、試験試料中の被検物の濃度を求める際に、被検物に対して比較的高い結合親和性を有する被検物結合性分子からのシグナルを使用するか、被検物に対する結合親和性が比較的低いものと高いものの両方の被検物結合性分子からのシグナル比を使用するかを左右する閾値またはカットオフ値である。フラグ値は本明細書に記載のとおりにして決定される。また、フラグ値は本質的に単独で重要なアッセイ情報をもたらすことに留意することは重要である。例えば、フラグ値は１ステップアッセイにおいて、アッセイ測定値または結合曲線の一部分がフック効果のために偽低値になっていないかどうかを調べるために使用され得る。
本明細書で用いる場合、用語「強度」は、単位面積または単位容積あたりの電気、光、熱または音の強度の量または度合いを意味する。さまざまな実施形態において、用語「強度」は、単位時間あたり単位面積あたりに計測された光子の数をいう。例えば、単位面積あたり１０００個の光子は単一ピクセル内に５００個と記録され得、一方、単位面積あたり８０個の光子は単一ピクセル内に４０個と記録される。具体的な変換は、使用される検出システムに依存する。強度は計測された光子の数に比例する。
「標識」および「検出可能な標識」は、被検物結合性分子（例えば、抗体もしくはこの被検物反応性断片）または被検物に直接または間接的に結合されて被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの被検物反応性断片）と被検物間の反応を検出可能にする部分を意味し、このように標識された被検物結合性分子（例えば、抗体もしくはこの被検物反応性断片）または被検物は「検出可能に標識された」と称される。標識は、例えば視認可能な手段または機器による手段によって検出可能なシグナルをもたらすものであり得る。この態様において、標識は任意のシグナル生成部分であり得、場合によっては、本明細書においてレポーター基と称している。本明細書で用いる場合、標識（またはシグナル生成部分）は外部手段によって、例えば電磁放射線の測定によって検出可能な測定可能なシグナルをもたらすものであり、使用されるシステムに応じてシグナルのレベルは、標識が固相支持体、例えば電極、微粒子またはビーズの環境内に存在する範囲内で異なり得る。種々の標識としては、シグナル生成物質、例えば、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、発色団または色原体（例えば、紫外または可視領域の光を吸収する色素、りん光体、蛍光剤、フルオロフォア（例えば、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）；フィコビリン（フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン）；キサンテン誘導体（フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド）；シアニン誘導体（シアニン、Ｃｙ色素、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン）；ナフタレン誘導体（ダンシルおよびプロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体（ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール）；ピレン誘導体（カスケードブルー）；オキサジン誘導体（ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）；アクリジン誘導体（プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；アリールメチン誘導体（オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン）；テトラピロール誘導体（ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン））、発光団、化学発光化合物、放射性化合物など）が挙げられる。標識の代表例は、光を生成する部分を含むもの（例えば、アクリジニウム化合物）、および蛍光を生成する部分を含むもの（例えば、フルオレセイン）である。他の標識は本明細書に記載している。これに関して、該部分は、これ自体は検出可能なものでなくてもよいが、また別の部分と反応すると検出可能となり得る。例えば、酵素が、シグナルを生成させるため、またはシグナルを増幅させるため、または前述の両方のために使用され得る。別の例として、該部分は、いわゆるクエンチャーまたはクエンチャーが作用する存在体であってもよい。用語「検出可能に標識たされた」という用語は、かかる標識のこれらおよび他の手段を包含していることを意図する。
「患者」および「被検体」は本明細書において互換的に用いている場合があり得、動物、例えば、トリ（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラ、ならびに哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、リャマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス）ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、およびヒト）をいう。好ましくは、患者または被検体はヒト、例えば、被検物欠損または被検物の存在もしくは過剰を有することが疑われるヒト、これらを有すると診断されたヒト、またはこれらの予防的もしくは治療的処置を受けているヒトである。
「患者の試料」、「試料」、「試験試料」は本明細書において互換的に用いている。試料、例えば尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤の細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球または単球の試料が、患者から得て直接使用され得るか、または例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の失活、試薬の添加などによって前処理され、試料の特性が、本明細書に論考しているようななんらかの様式もしくは当該技術分野で知られた他の様式で改良され得る。本開示との関連において、試料は好ましくは血清または血漿であり、最も好ましくは血清である。
「前処理試薬」、例えば、溶解、沈殿および／または可溶化試薬は、本明細書に記載の診断アッセイにおいて用いる場合、試験試料中に存在する細胞（あれば）を溶解させるもの、および／または被検物（あれば）を可溶化させるものである。前処理は、本明細書においてさらに説明するように、すべての試料に必要であるとは限らない。とりわけ、被検物の可溶化は、試料中に存在する内在結合性タンパク質（あれば）からの被検物の放出を伴う。前処理試薬は均一系（分離工程を必要としない。）であっても不均一系（分離工程を必要とする。）であってもよい。不均一系前処理試薬を使用する際は、アッセイの次の工程に進む前に、沈殿した被検物結合性タンパク質（あれば）を試験試料から除去する。前処理試薬は、場合により：細胞の溶解および／または被検物の可溶化に適切な（ａ）１種類以上の溶媒と塩、（ｂ）１種類以上の溶媒、塩およびデタージェント、（ｃ）デタージェント、（ｄ）デタージェントと塩、または（ｅ）任意の試薬もしくは試薬の組合せを含むものであり得る。
本明細書に記載のアッセイおよびキットとの関連における「品質管理試薬」としては、限定されないが、較正標準、対照および感度測定パネルが挙げられる。「較正標準」または「標準」が、被検物、例えば抗体または被検物の濃度の内挿のための検量（標準）曲線を作成するために典型的に使用される（例えば、１種類以上、例えば複数）。または、ほぼ所定の陽性／陰性カットオフである単独の較正標準を使用してもよい。多数の較正標準（即ち、１種類以上の較正標準または種々の量の較正標準（１つもしくは複数））を合わせて「感度測定パネル」が構成されるように使用してもよい。
「特異的結合パートナー」は特異的結合ペアの構成員である。特異的結合ペアは、化学的または物理的手段によって互いに特異的に結合する２つの異なる分子で構成される。従って、被検物／被検物結合性分子および一般的なアッセイの抗原／抗体特異的結合ペアに加え、他の特異的結合ペアとしては、ビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）、糖鎖とレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクター分子と受容体分子、補因子と酵素、酵素と酵素インヒビターなどが挙げられ得る。さらに、特異的結合ペアとしては、オリジナルの特異的結合構成員の類似体である構成員、例えば、被検物−類似体が挙げられ得る。免疫反応性の特異的結合構成員としては、抗原、抗原断片、および抗体、例えばモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに複合体およびこの断片（単離されたもの、または組換作製したもののいずれであれ）が挙げられる。
特異的結合ペア（例えば、抗原（またはこの断片）と抗体（またはこの抗原反応性断片））の構成員間の相互作用との関連における「特異的な」および「特異性」は相互作用の選択的反応性をいう。語句「〜に特異的に結合する」および同様の語句は、特異的結合ペアの第１の構成員（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）が特異的結合ペアの第２の構成員（例えば、抗原）に結合するが、他の抗原（またはこの断片）には特異的に結合しない能力をいう。本開示との関連において、被検物に特異的に結合する抗体は被検物に特異的であるとみなす。
「トレーサー」は標識と結合した被検物または被検物の断片をいい、この場合、標識と結合した被検物は被検物と、被検物に特異的な被検物結合性分子上の部位に対して有効に競合し得る。
上記の専門用語は具体的な実施形態を説明する目的で示したものである。これらの専門用語は限定を意図するものではない。
１．序論
一般的に、本明細書に記載のアッセイおよび方法は、サンドイッチアッセイにおいて３種類の被検物結合性分子の使用（慣用的なサンドイッチアッセイでは２種類の被検物結合性分子を使用する。）を伴い、１ステップサンドイッチアッセイにおける「フック効果」を解消し、２ステップサンドイッチアッセイにおけるアッセイの線形ダイナミックレンジを拡大するものである。また、かかるアッセイおよび方法は、本明細書において新たに説明するように、競合アッセイ形式におけるダイナミックレンジを拡大するためにも使用され得る。３種類の被検物結合性分子のうち２種類は捕捉または検出のいずれかに使用され得るが、これらの結合親和性は、例えば本明細書においてさらに説明するように異なっていなければならず、第１および第２の被検物結合性分子は第３の被検物結合性分子に、独立して被検物を介して結合する。被検物結合性捕捉分子として使用する場合、一部の実施形態では、第１および第２の被検物結合性分子は、異なる型の微粒子または表面上の異なる位置（例えば、空間的に隔てられた２つの相違する電極）に結合され得る。被検物結合性検出分子として使用する場合、一部の実施形態では、第１および第２の被検物結合性分子は、識別可能な分光学的特性（例えば、寿命、スペクトル）を有する標識を有するものであり得る。どちらの場合も、第１および第２の被検物結合性分子から生成されるシグナルは空間的および／または分光学的特性に基づいて別々に測定され得る。また、第１および第２の被検物結合性分子から得られるシグナル比を、較正曲線上の正確なセクションを選択するための指標として使用してもよい。２ステップサンドイッチ形式および競合的形式では、異なる親和性を有する抗体を異なる固相支持体に結合させ、各固相支持体からのシグナルが独立して測定され得る。
１ステップサンドイッチアッセイ形式では、所与の較正標準セットについて、ある被検物濃度範囲において被検物結合性分子の結合強度を測定した２つの較正プロットを独立して得る。目的の被検物に対して比較的高い結合親和性の被検物結合性分子がＰｌｏｔｈｉｇｈを得るための捕捉剤または検出剤として使用される。目的の被検物に対して比較的低い結合親和性被検物結合性分子がＰｌｏｔｌｏｗを得るための捕捉剤または検出剤として使用される。フック効果のため、どちらのプロットも最大強度のピーク（典型的には変曲点に）、上昇部分および下降部分を有する。曲線のどのセクションを較正曲線として使用するかを判断するために所定のフラグ値が使用され得る。フラグ値は本明細書に記載のとおりにして決定される。Ｐｌｏｔｈｉｇｈは、低被検物濃度側で最大強度に達する。Ｐｌｏｔｈｉｇｈは「較正プロット」と称されることもあり得る。Ｐｌｏｔｌｏｗは、高被検物濃度側で最大強度に達する。ＰｌｏｔｈｉｇｈのピークにおけるＰｌｏｔｌｏｗ／Ｐｌｏｔｈｉｇｈの比の値をフラグ値と定める（例えば、図６ａ参照）。試験試料測定におけるシグナル強度ＳＬ／ＳＨ（低親和性分子からのシグナル／高親和性分子からのシグナル）の比が所定のフラグ値より小さいならば、較正曲線の上昇部分がアッセイの較正に使用される。シグナル強度ＳＬ／ＳＨの比がフラグ値より大きいならば、較正曲線の下降部分がアッセイの較正に使用される。
また、逆比を適用してもよい。逆に、フラグ値がＰｌｏｔｈｉｇｈのピークのＰｌｏｔｈｉｇｈをＰｌｏｔｌｏｗで除算することにより決定される方法の実施形態では、試験試料測定におけるシグナル強度ＳＨ／ＳＬ（高親和性分子からのシグナル／低親和性分子からのシグナル）の比がフラグ値より大きい場合、較正曲線の上昇部分がアッセイの較正に使用される。または、試験試料測定におけるシグナル強度ＳＨ／ＳＬの比がフラグ値以下である場合、較正曲線の下降部分がアッセイの較正に使用される。
２ステップアッセイでは、高親和性の被検物結合性分子および低親和性の被検物結合性分子はどちらも固相支持体に結合させなければならない（例えば、１回以上の洗浄工程を可能にするため）。２ステップサンドイッチアッセイ形式では、固相支持体に結合した比較的高い結合親和性の被検物結合性分子からのシグナルは、高被検物濃度側でプラトー状態になり、一方、固相支持体に結合した低親和性の被検物結合性分子からのシグナルは高い被検物濃度に対して線形に応答する。従って、比較的高い親和性の被検物結合性分子からのシグナルが低被検物濃度の測定に使用され得、これによりアッセイの感度が確保される；一方、比較的低い親和性の被検物結合性分子からのシグナルは高い被検物濃度の測定に使用され得る。フラグ値は、比較的高い親和性の被検物結合性分子からのプラトーシグナルであり得る。試験試料について、比較的高い親和性の被検物結合性分子からのシグナルがフラグ値以上であるならば、比較的低い親和性の被検物結合性分子でのシグナルプロットを使用する。比較的高い親和性の被検物結合性分子によりアッセイの感度が確保されるとともに、比較的低い親和性の被検物結合性分子によりアッセイのダイナミックレンジが拡大される。
これを図９に示す。この図からわかるように、親和性が高い方の被検物結合性分子での較正曲線が左側の曲線であり、親和性が低い方の被検物結合性分子での較正曲線が右側の曲線である。２つの曲線のこの関係を用いて、アッセイの較正に使用するためのシグナルプロットの適切なセクションを選択する基準が設定され得る。一部の実施形態では、フラグ値は、第１の固相支持体からのシグナル強度のプラトー値の近くに設定され得る。試験試料について、第１の固相支持体からのシグナルがフラグ値以上であるならば、第２の固相支持体でのシグナルプロットの上昇部分（右側の曲線，セクションＢ）を較正に使用する。このアプローチを使用するとアッセイのダイナミックレンジが拡大され得る。
競合アッセイ形式では、固相支持体に結合した比較的高い親和性の被検物結合性分子からのシグナルは高被検物濃度側では水平になり、一方、固相支持体に結合した比較的低い親和性の被検物結合性分子からのシグナルは高被検物濃度に対して逆に応答する。従って、比較的高い親和性の被検物結合性分子からのシグナルが低被検物濃度の測定に使用され得、これによりアッセイの感度が確保される；一方、比較的低い親和性の被検物結合性分子からのシグナルは高い被検物濃度の測定に使用され得る。フラグ値は、比較的高い親和性の被検物結合性分子からのプラトーシグナルであり得る。試験試料について、比較的高い親和性の被検物結合性分子からのシグナルがフラグ値以上であるならば、比較的低い親和性の被検物結合性分子でのシグナルプロットを使用する。比較的高い親和性の被検物結合性分子によりアッセイの感度が確保されるとともに、比較的低い親和性の被検物結合性分子によりアッセイのダイナミックレンジが拡大される。
これを図１０に示す。この図からわかるように、親和性が高い方の被検物結合性分子での較正曲線が左側の曲線であり、親和性が低い方の被検物結合性分子での較正曲線が右側の曲線である。２つの曲線のこの関係を用いて、アッセイの較正に使用するためのシグナルプロットの適切なセクションを選択する基準が設定され得る。一部の実施形態では、フラグ値は、第１の固相支持体からのシグナル強度の横ばい値の近くに設定され得る。試験試料について、第１の固相支持体からのシグナルがフラグ値以下であるならば、第２の固相支持体でのシグナルプロット（下降部分，右側の曲線，セクションＢ）を較正に使用する。このアプローチを使用するとアッセイのダイナミックレンジが拡大され得る。
２ステップ形式および競合アッセイ形式のどちらににおいても、異なる親和性および／または異なる濃度を有する２種類の被検物結合性分子を使用することにより、良好に離れたシグナルプロットを得ることが可能であり、従ってアッセイのダイナミックレンジが拡大されることに注目することは重要である。
２．キット
試験試料を被検物（またはこの断片）についてアッセイするためのキットを本明細書において示す。さまざまな実施形態において、キットは、一緒に試験試料を目的の被検物についてアッセイするのに有用な第１、第２および／または第３の被検物結合性分子、ならびに試験試料を被検物についてアッセイするための使用説明書を備えている。さまざまな実施形態において、キットは：
ｉ）第１の標識と結合した第１の被検物結合性分子および第２の標識を含む第２の被検物結合性分子（ここで、第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、第１の標識および第２の標識は検出可能に識別可能である（例えば、検出可能に識別可能な波長の光を放射する。））；ならびに固相支持体に結合した第３の被検物結合性分子（ここで、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を同時に被検物に結合させずに第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を独立して被検物に結合させ、これにより第３の被検物結合性分子に結合してアッセイサンドイッチを形成する。）；または
ｉｉ）第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子および第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子（ここで、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子は被検物に対して異なる結合親和性を有し、第１の固相支持体と第２の固相支持体は識別することができる（例えば、空間的分離、色、形状、サイズなどにより）；ならびに標識と結合した第３の被検物結合性分子（ここで、第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を同時に被検物に結合させずに第１の被検物結合性分子および第２の被検物結合性分子を独立して被検物に結合させ、これにより第３の被検物結合性分子に結合してアッセイサンドイッチを形成する。）；または
ｉｉｉ）第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子および第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子（ここで、第１の被検物結合性分子と第２の被検物結合性分子は被検物に対して異なる結合親和性を有し、第１の固相支持体と第２の固相支持体は識別することができる（例えば、空間的分離、色、形状、サイズなどにより）；ならびにレポーター基に結合した被検物もしくは被検物の断片で構成されたトレーサー（これは試験試料中の被検物と、第１および第２の被検物結合性分子に対する結合に関して競合する。）
を備えたものであり得る。
当業者には理解されるように、キットに関して以下に記載する構成要素はまた、本明細書に記載の方法にも有用である。従って、固相支持体および標識の以下の説明は本明細書に記載のキットおよび方法に等しく適用される。
さまざまな実施形態において、キットは、本明細書に記載のアッセイ、例えば微粒子アッセイまたはポイントオブケアデバイスにおける使用のためのアッセイによって試験試料を被検物（またはこの断片）についてアッセイするための使用説明書を備えたものであり得る。使用説明書は紙形態であってもよく、コンピュータ可読形態、例えばディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどであってもよい。択一的または付加的に、キットは、
較正標準または対照、例えば、精製および場合により凍結乾燥させた被検物（またはこの断片）および／またはアッセイを実施するための少なくとも１つの容器（例えば、チューブ、マイクロタイタープレートもしくはストリップ、これらは既に１種類以上の被検物結合性分子でコートされたものであってもよい。）および／またはバッファー、例えばアッセイバッファーもしくは洗浄バッファー（これらのいずれか一方を濃縮液、検出可能な標識（例えば、酵素標識）のための基質溶液もしくは停止液として提供してもよい。）を備えたものであり得る。好ましくは、キットは、アッセイを行うために必要であるすべての構成要素、即ち、試薬、標準、バッファー、希釈剤などを備えたものである。また、使用説明書には、標準曲線の作成または被検物を定量する目的のための参照標準の作製のための使用説明書も包含され得る。
適宜、または所望により、キットに固相支持体、例えば電極、微粒子、磁性粒子、ビーズ、テストチューブ、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、骨格分子、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップを含めてもよい。実例としての固相支持体としては、限定されないが例えば、電極、マイクロタイタープレートなどのプレートのウェル、テストチューブ、多孔質ゲル（例えば、シリカゲル、アガロース、デキストランもしくはゼラチン）、ポリマーフィルム（例えば、ポリアクリルアミド）、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズもしくは磁性ビーズ）、フィルター／膜（例えば、ニトロセルロースもしくはナイロン）ストリップ、微粒子（例えば、ラテックス粒子もしくは磁化性微粒子（例えば、酸化第二鉄もしくは酸化クロムのコアとホモ−もしくはヘテロ−ポリマーコートを有し、約１から１０ミクロンの半径を有する微粒子））が挙げられる。基材は、捕捉剤と結合するのに適切な表面親和性および検出剤の到達が可能であるのに充分な多孔度を有する適切な多孔質材料で構成されたものであり得る。微多孔質材料が一般的に好ましいが、水和状態のゼラチン質材料を使用してもよい。かかる多孔質基材は好ましくは、約０．０１から約０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚さを有するシートの形態である。孔径はかなりさまざまであり得るが、好ましくは、孔径は約０．０２５から約１５ミクロン、より好ましくは約０．１５から約１５ミクロンである。かかる基材の表面は、被検物結合性分子の基材との共有結合を引き起こす化学的工程によって活性化され得る。一般的には疎水性の力による吸着によって捕捉剤の基材との不可逆結合が得られる；または、化学的カップリング剤または他の手段が捕捉剤を基材に共有結合させるのに使用され得るが、かかる結合は捕捉剤が被検物に結合する能力に支障をきたさないものとする。
本明細書における使用に適切な支持体の一例は微粒子である。本明細書に記載の方法での使用に適切な微粒子としては、限定されないが磁性微粒子が挙げられる。微粒子のサイズは典型的には約０．１から約１００μｍの範囲である。市販の微粒子は多種多様な材料のもの、例えばセラミック、ガラス、ポリマーおよび金属で作製されたものが入手可能である。本明細書に記載の方法における使用に適切な磁性微粒子は、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡから市販されている。０．１から１００μｍという一般的に認識されている定義をナノ粒子のサイズの定義として補足するが、他にもサイズの他の定義様式が存在する。一般的な認識では、１００ｎｍより小さい微粒子はナノ粒子とみなされる。０．５μｍより大きい微粒子（あれば）および０．５ｍｍより小さいものはいずれも微粒子であるとみなす。一般に、本明細書に記載の方法での使用に適切な微粒子のサイズは、選択された画像システムによって２個の微粒子が解像され得るように充分に大きくなければならない。本明細書に記載の方法での使用に適切な微粒子の特性、例えば色などは選択事項である。当業者は、該方法の適切なバリエーションによって課される要件が満たされるように微粒子の特性を選択することができよう。
本明細書に記載のキットおよび方法での使用に適切な反応槽としては、マイクロ−ウェルプレートおよびポイントオブケアデバイスのリザーバが挙げられる。さまざまな実施形態において、反応槽は、被検物結合性捕捉分子−被検物−被検物結合性検出分子複合体の画像が作成され得るような特質のものであり得る。一実施形態では、反応槽は、電磁放射線、典型的には紫外および可視範囲のスペクトルに対して透過性のものである。反応槽の構成に適切な材質としては、ガラスおよびポリマー材料が挙げられる。一実施形態では、反応槽の材質は自己蛍光性でないものである。しかしながら、一般的に、反応槽の具体的な形態および形状は重要でない。
一部の実施形態では、第１および第２の被検物結合性分子または第３の被検物結合性分子を、ストレプトアビジンまたはビオチンで事前にコートした微粒子（例えば、Ｐｏｗｅｒ−Ｂｉｎｄ（商標）−ＳＡ−ＭＰストレプトアビジンコート微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用）または抗種特異的モノクローナル抗体で事前にコートした微粒子に結合させる。必要であれば、基材を、捕捉剤の種々の官能基との反応性が可能になるように誘導体化させてもよい。かかる誘導体化には特定のカップリング剤の使用が必要とされ、この例としては、限定されないが、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。所望により、１種類以上の捕捉剤（例えば、被検物結合性分子（例えば、抗体または抗原に活性なこの断片））（各々は被検物に特異的である。）を、固相支持体の異なる物理的位置またはアドレス指定可能な位置に結合させてもよい（例えば、バイオチップ構成体の場合など（例えば、米国特許第６，２２５，０４７号明細書、国際公開第９９／５１７７３号パンフレット；米国特許第６，３２９，２０９号明細書；国際公開第００／５６９３４号パンフレットおよび米国特許第５，２４２，８２８号明細書参照）。
さまざまな実施形態において、第１および第２の被検物結合性分子または第３の被検物結合性分子は検出可能な標識と直接または間接的に結合させる。実例としての標識としては、例えば、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光性標識などが挙げられる。当該技術分野で知られているような任意の適切な検出可能な標識が使用され得る。例えば、検出可能な標識は放射性標識（３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐなど）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、化学発光性標識（例えば、アクリジニウムエステル、チオエステルもしくはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど）、１種類以上の発色団、例えば、紫外もしくは可視領域の光を放射する１種類以上の色素、りん光体、蛍光剤、フルオロフォア（例えば、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）；フィコビリン（フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン）；キサンテン誘導体（フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド）；シアニン誘導体（シアニン、Ｃｙ色素、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン）；ナフタレン誘導体（ダンシルおよびプロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体（ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール）；ピレン誘導体（カスケードブルー）；オキサジン誘導体（ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）；アクリジン誘導体（プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；アリールメチン誘導体（オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン）；テトラピロール誘導体（ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン））、発光団、化学発光体、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛キャッピングセレン化カドミウム）、サーモメトリック標識またはイムノ−ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識の導入、標識手順および標識の検出は、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）ならびにＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）（これはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）によって発行されたハンドブックとカタログの合体版である。）において知得される。アクリジニウム化合物は均一系化学発光アッセイにおける検出可能な標識として使用され得る（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１（２００４）；およびＡｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）参照）。
さまざまな実施形態において、第１の標識または第２の標識はフィコビリン（例えば、フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン）である。Ｒ−フィコエリトリンまたはＰＥは被検物結合性分子または他の分子を標識するための蛍光系指標としてさまざまな用途に有用である。Ｒ−フィコエリトリンは約５６６ｎｍにおける吸収が強く、第２のピークは４９６および５４５ｎｍであり、５７５ｎｍにおける発光が強い。Ｒ−フィコエリトリンは、これまでに同定された蛍光色素の中で最も明るい。例えば、フィコエリトリンのウィキペディア（ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎのインターネット上の無料の百科事典）およびＲ−ＰＨＹＣＯＥＲＹＴＨＲＩＮ（ＰＢ３１），ＰｒｏＺｙｍｅ Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ（これらはどちらも参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。検出可能な標識が少なくとも１種類のアクリジニウム化合物である実施形態では、キットは、少なくとも１種類のアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１種類のアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルまたはこの任意の組合せを備えたものであり得る。検出可能な標識が少なくとも１種類のアクリジニウム化合物である場合、キットはまた、過酸化水素源、例えばバッファー、溶液および／または少なくとも１種類の塩基性溶液も備えたものであり得る。
一部の実施形態では、キットは、被検物結合性分子を標識するための試薬または被検物結合性分子（例えば、被検物結合性検出分子）を検出するための試薬および／または被検物もしくは被検物を検出するための試薬を標識するための試薬を含むものであり得る、または該方法が該試薬を使用するものであり得る。被検物結合性分子、較正標準および／または対照は別々の容器にて提供してもよく、適切なアッセイ形式、例えばマイクロタイタープレート内に事前に分注しておいてもよい。
場合により、キットに品質管理構成要素（例えば、感度測定パネル、較正標準および陽性対照）を含める。品質管理試薬の調製は当該技術分野でよく知られており、さまざまな免疫診断製剤品の添付文書に記載されている。感度測定パネルの構成員は、場合によりアッセイの性能特性を確立するために使用され、さらに場合によりアッセイキット試薬の完全性およびアッセイの標準化の有用な指標となる。
また、場合によりキットに診断アッセイを行うため、または品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬、例えばバッファー、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などを含めてもよい。また、他の構成要素、例えばバッファーならびに試験試料（例えば、前処理試薬）の単離および／または処理のための溶液をキットに含めてもよい。キットにさらに１種類以上の他の対照を含めてもよい。キットの構成要素の１つ以上を凍結乾燥させてもよく、この場合、キットはさらに、凍結乾燥構成要素の再構成に適切な試薬を備えたものであり得る。
キットの種々の構成要素は場合により、必要に応じて適切な容器、例えばマイクロタイタープレート内に提供される。キットにさらに、試料を保持または保存するための容器（例えば、尿試料用の容器またはカートリッジ）を含めてもよい。適切な場合はまた、キットに、場合により反応槽、混合槽、および試薬または試験試料の調製を容易にする他の構成要素を含めてもよい。また、キットに試験試料の採取を補助するための１種類以上の器具、例えばシリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーンなどを含めてもよい。
３．アッセイ形式
本開示により、試験試料中の被検物（またはこの断片）の存在、量または濃度を調べるための方法を提供する。当該技術分野で知られているような任意の適切なアッセイがこの方法に使用され得る。例としては、限定されないが、例えば、サンドイッチアッセイ（例えば、放射性同位体検出（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）など）および酵素検出（酵素アッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡアッセイ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、競合アッセイなどのアッセイが挙げられる。
尿、血液、血清および血漿ならびに他の体液を採取し、取り扱い、処理するための当該技術分野でよく知られた方法が本開示の実施において、例えば、本開示による被検物結合性分子が免疫診断用試薬として使用される場合、および／または被検物のアッセイのためのキットに使用される。試験試料は、被検物に加えてさらなる部分、目的の他の被検物、例えば、一般的にはタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなど、ならびにより具体的には、例えば抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素または受容体を、本明細書に記載の実例としての被検物および任意の他の目的の被検物とともに含むものであってもよい。例えば、試料は被検体から採取した全血試料であり得る。試験試料を、特に全血は本明細書に記載のアッセイの前に、例えば前処理試薬で処理することが必要な場合または所望される場合があり得る。前処理が必要でない場合（例えば、ほとんどの尿試料）であっても、前処理は、場合により単に便宜上（例えば、市販のプラットフォームでのレジメンの一部として）行われる場合があり得る。好ましくは、試験試料は血清である。
前処理試薬は、本明細書に記載のアッセイおよびキットでの使用に適切な任意の試薬であり得る。例えば、Ｓａｃｋｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．により、被検物を被検物結合性タンパク質から解離させるために試料のｐＨを５．５以下に下げることが開示されている（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３２１０４号明細書参照）。前処理は場合により：（ａ）１種類以上の溶媒（例えば、メタノールおよびエチレングリコール）および塩、（ｂ）１種類以上の溶媒、塩およびデタージェント、（ｃ）デタージェントまたは（ｄ）デタージェントおよび塩を含むものである。前処理試薬は当該技術分野で知られており、かかる前処理は、例えば、Ａｂｂｏｔｔ ＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）解析装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）でのアッセイで使用されるようにして、文献に記載のとおりに（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｂｂｏｔｔ ＴＤｘ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ ｉｎ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：１９６９−１９７３（１９９０）、およびＷａｌｌｅｍａｃｑ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ ＡｘＳＹＭ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＴＤｘ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＥＭＩＴ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａｓｓａｙｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４３２−４３５（１９９９）参照）および／または市販のとおりに使用され得る。さらに、前処理は、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号明細書、欧州特許出願公開第０４７１２９３号明細書、米国特許仮出願第６０／８７８，０１７号明細書（２００６年１２月２９日出願）および米国特許出願公開第２００８／００２０４０１号明細書（参照により、前処理に関するこの教示の全体が組み込まれる。）に記載のようにして行ってもよい。前処理試薬は不均一系薬剤であっても均一系薬剤であってもよい。
不均一系前処理試薬を使用する場合は、前処理試薬によって場合により試料中に存在する抗体が沈殿する。かかる前処理工程には、沈殿した抗体から、試料への前処理薬剤の添加によって形成された混合物の上清を分離することにより抗体（あれば）を除去することが含まれる。かかるアッセイでは、結合性タンパク質が全く存在しない混合物の上清がアッセイに使用され、直接、捕捉工程へと進められる。
均一系前処理試薬を使用する場合は、かかる分離工程はない。試験試料と前処理試薬の混合物全体を、被検物（またはこの断片）に特異的な標識被検物結合性分子、例えば、被検物に特異的に結合する標識抗体またはこの抗原反応性断片と接触させる。かかるアッセイに使用される前処理試薬は、典型的には前処理された試験試料混合物中で、第１の被検物結合性分子による捕捉の前または捕捉の際のいずれかにおいて希釈される。かかる希釈にもかかわらず、一定量の前処理試薬（例えば、５Ｍメタノールおよび／または０．６Ｍエチレングリコール）が依然として捕捉の際に試験試料混合物中に存在（または残存）する。
不均一系形式では、試験試料を被検体から採取した後、第１の混合物を調製する。この混合物は、被検物（またはこの断片）について評価する試験試料と１種類または２種類の被検物結合性分子（例えば、抗体または抗原に活性なこの断片）を含むものであり、このとき、試験試料に含まれた被検物結合性分子と被検物（あれば）は被検物結合性分子−被検物複合体を形成する。さまざまな実施形態において、被検物結合性分子は被検物に特異的に結合する第１および第２の抗体（またはこの断片）、例えば、本明細書に記載の抗体または他の市販の抗体であり得る。混合物を形成するために試験試料と被検物結合性分子を添加する順序は重要でない。さまざまな実施形態において、被検物結合性分子は固相支持体上に固定化される。アッセイにおいて（第１の被検物結合性分子および場合により第２の被検物結合性分子に対して）使用される固相支持体は、当該技術分野で知られた任意の固相支持体、例えば限定されないが、電極、磁性粒子、微粒子、ビーズ、テストチューブ、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、骨格分子、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップであり得る。
第１（および第２）の被検物結合性分子−被検物複合体を含む混合物を形成した後、未結合の被検物（あれば）を複合体から当該技術分野で知られた任意の手法を用いて除去する。例えば、未結合の被検物は、洗浄することにより除去され得る。しかしながら、望ましくは、被検物結合性分子を試験試料中に存在する被検物（あれば）に対して過剰に存在させ、試験試料中に存在するすべての被検物が被検物結合性分子によって結合されるようにする。
アッセイ形式の一例では、被検物を、１種類または２種類の被検物結合性検出分子および固相支持体に結合した１種類または２種類の被検物結合性捕捉分子と、複合体の混合物が形成されるように混合する。以下は、形成される択一的なサンドイッチ複合体の例である：
ｉ）図４に示すように、第１のサンドイッチ複合体は、第１の固相支持体に結合（「ａｔｔａｃｈｅｄ」または「ｂｏｕｎｄ」）している第１の被検物結合性分子（例えば、微粒子上にコートされた被検物結合性捕捉分子）−被検物−標識と結合した第３の被検物結合性分子（例えば、レポーター基を有する被検物結合性検出分子）によって形成される。第２のサンドイッチ複合体は、第２の固相支持体に結合（「ａｔｔａｃｈｅｄ」または「ｂｏｕｎｄ」）している第２の被検物結合性分子−被検物−標識と結合した第３の被検物結合性分子によって形成される。
ｉｉ）図５に示すように、第１のサンドイッチ複合体は、第１の標識と結合した第１の被検物結合性分子（例えば、レポーター基１を有する被検物結合性検出分子）−被検物−固相支持体に結合した第３の被検物結合性分子（例えば、微粒子上にコートされた被検物結合性捕捉分子）によって形成され、第２のサンドイッチ複合体は第２の標識と結合した第２の被検物結合性分子（例えば、レポーター基２を有する被検物結合性検出分子）−被検物−固相支持体に結合した第３の被検物結合性分子によって形成される。
一般的に、被検物（またはこの断片）について試験される（例えば、含んでいることが疑われる）試料は、少なくとも１種類の捕捉剤（例えば、被検物結合性分子（例えば、捕捉抗体またはこの抗原反応性断片））と少なくとも１種類の検出剤（例えば、被検物結合性検出分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片））に、同時またはいずれかの順序で逐次のいずれかで接触させ得る。例えば、試験試料をまず少なくとも１種類の捕捉剤と、次いで（逐次）少なくとも１種類の検出剤と接触させ得る。または、試験試料をまず少なくとも１種類の検出剤と、次いで（逐次）少なくとも１種類の捕捉剤と接触させ得る。また別の択一例では、試験試料を捕捉剤および検出剤と同時に接触させ得る。
１ステップサンドイッチアッセイ形式では、被検物（またはこの断片）を含んでいることが疑われる試料を１種類または２種類の型の被検物結合性捕捉分子および１種類または２種類の型の被検物結合性検出分子の両方と、多種類の捕捉剤／被検物／検出剤複合体の形成が可能であるインキュベーション条件下で接触させる。試料、捕捉剤および検出剤はすべて反応槽に逐次または同時にする。）。
２ステップアッセイ形式では、被検物（またはこの断片）を含んでいることが疑われる試料をまず、各々、異なる固相支持体に結合した２種類の型の被検物結合性捕捉分子と接触させる。捕捉剤／被検物複合体の形成後、試料中の未結合の被検物を、洗浄工程で反応槽から除去する。次いで、複合体を少なくとも１種類の検出剤と（捕捉剤／被検物／検出剤複合体の形成が可能な条件下で）接触させる。
競合アッセイ形式では、被検物（またはこの断片）を含んでいることが疑われる試料をまず、各々、異なる固相支持体に結合した２種類の型の被検物結合性捕捉分子と接触させる。捕捉剤／被検物複合体の形成後、レポーター基が結合している被検物（またはこの断片）で構成されたトレーサーを反応混合物に添加し、残留しているすべての被検物結合性分子と結合させる。また、トレーサー、試料および被検物結合性捕捉分子を一工程で混合してもよい。
これらの各形式において、場合により、試験試料を少なくとも１種類の捕捉剤と接触させる前に、捕捉剤／被検物複合体の分離を容易にするために少なくとも１種類の捕捉剤を基材に結合させてもよい。捕捉剤を結合させる基材は、捕捉剤／被検物複合体の試料からの分離を容易にする上記または本明細書に記載のような任意の適切な固相支持体であり得る。
インキュベーションは、約４．５から約１０．０のｐＨ、約２℃から約４５℃の温度、および少なくとも約１分間から約１８時間、好ましくは約１から約２４分間、最も好ましくは約４から約１８分間の時間で行われ得る。
捕捉剤／被検物複合体を１種類より多くの検出剤と接触させると、多種類の捕捉剤／被検物／検出剤複合体が形成される。捕捉剤の場合と同様、少なくとも１種類の検出剤を捕捉剤／被検物複合体と接触させる場合、捕捉剤／被検物／検出剤複合体（１種類または複数種）の形成のためには上記のもの同様の条件下でのインキュベーション時間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１種類の検出剤は検出可能な標識を含むものである。検出可能な標識は少なくとも１種類の検出剤に、捕捉剤／被検物／検出剤複合体（１種類または複数種）の形成の前に結合させても、該形成と同時に結合させても、該形成の後に結合させてもよい。当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識が使用され得る（上記の論考、例えば、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）ならびにＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）を参照されたい。）。
検出可能な標識は検出剤に直接またはカップリング剤を介してのいずれかで結合され得る。使用され得るカップリング剤の一例はＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，塩酸塩）であり、これはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている。使用され得る他のカップリング剤は当該技術分野で知られている。検出可能な標識を検出剤に結合させるための方法は当該技術分野で知られている。
捕捉剤／被検物／検出剤複合体（１種類または複数種）を、標識の定量の前に残りの試験試料から分離してもよいが、その必要はない。例えば、少なくとも１種類の捕捉剤をウェルまたはビーズなどの固相支持体に結合させている場合、分離は、（試験試料の）液を固相支持体との接触から解除することにより行われ得る。または、少なくとも１種類の捕捉剤を固相支持体に結合させている場合、これを同時に試験試料および少なくとも１種類の検出剤と接触させ、捕捉剤／被検物／検出剤複合体（１種類または複数種）を形成させた後、試験試料を固相支持体との接触から解除してもよい。アッセイが未結合試料被検物からの結合試料被検物の分離を含まない場合、これは「１ステップ」アッセイとみなされる。アッセイが未結合試料被検物からの結合試料被検物の分離を含む場合、これは一般的に「２ステップアッセイ」（またはどのようにして分離が行われるかによっては遅延型１ステップアッセイ）とみなされる。
捕捉剤／被検物／検出剤複合体（１種類または複数種）の形成後、複合体（１種類または複数種）中の標識の量が、当該技術分野で知られた手法を用いて定量される。生成したシグナル（例えば、色、光、放射能、反応性酸素種）が、当業者に知られた常套的な手法を用いて検出され得る。生成したシグナルの強度に基づいて、試料中の被検物の量が定量され得る。具体的には、試料中の被検物の量は生成したシグナル強度に比例する。存在する被検物の量は、生成したシグナルの量を被検物の標準曲線と比較することにより、または参照標準との比較により定量され得る。標準曲線は、質量分析、重量測定法および当該技術分野で知られた他の手法による既知濃度の被検物の連続希釈物または溶液を用いて作成され得る。
例えば、酵素標識が使用される場合、標識された複合体を、発色などの定量可能な反応をもたらす該標識の基質と反応させる。標識が放射性標識である場合、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識である場合、標識は、標識をある色（これは「励起波長」として知られる。）の光で刺激し、この刺激に応答した標識が発する別の色（これは「発光波長」として知られる。）で検出することにより定量される。標識が化学発光性標識である場合、標識は、発光を目視または照度計、ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどの使用のいずれかによって検出することにより定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、試験試料中の被検物の濃度を、既知濃度の被検物の連続希釈物を用いて作成しておいた較正曲線の使用によって求める。
さまざまな実施形態において、該方法では微粒子固相支持体を使用し、自動化または半自動化システムを用いて行われる。本明細書に記載の方法における使用に適切なイメージングシステムは、個々の微粒子が解像され得るように画像が取得できる任意のシステムであり得る。本明細書に記載の方法での使用に適切なイメージングデバイスとしては、限定されないが、光学顕微鏡、蛍光イメージングスキャナーなどが挙げられる。イメージングシステムのかかる使用は、例えばＵＳ２０１２０３０８９９７（該使用に関するこの教示は参照により組み込まれる。）に記載されている。本明細書に記載の方法での使用に適切な画像ファイルの種類としては、限定されないが、ＪＰＥＧ／ＪＦＩＦ、ＧＩＦ、ＢＭＰ、ＴＩＦＦおよびＦＩＴＳが挙げられる。画像ファイル形式は画像ファイル形式のウィキペディア（ハイパーテキスト・トランスファー・プロトコルによってアクセス可能なウェブサイトｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ｉｍａｇｅ＿ｆｉｌｅ＿ｆｏｒｍａｔｓの無料の百科事典）（参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されており、ＦＩＴＳは、ＦＩＴＳのウィキペディア（ハイパーテキスト・トランスファー・プロトコルによってアクセス可能なウェブサイトｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＦＩＴＳの無料の百科事典）（参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
画像取得の際の露光時間は重要でない。本明細書に記載の方法での使用に適切な露光時間は、画像の該当する詳細部を識別するのに充分な解像がもたらされる任意の露光時間であり得る。
対象領域の選択は重要である。適切なコンピュータプログラムの使用により、個々の微粒子の位置が、対比またはなんらかの択一的な基準によって決定される。微粒子または他の固相支持体と関連するピクセルを対象領域とみなしてもよい。試料中の被検物の有意義な濃度値を得るためには、典型的には少なくとも約１００個の微粒子、例えば少なくとも約２００個の微粒子を画像内に存在させる。本明細書に記載の方法における使用に適切な市販のコンピュータプログラムとしては、限定されないが、商標「ＳＬＩＤＥＢＯＯＫ」（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ；インターネット上のｓｌｉｄｅｂｏｏｋ．ｃｏｍ）および「ＭＥＴＡＭＯＲＰＨ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を有するプログラムまたはパブリックドメインのソフトウェア、例えばＩｍａｇｅＪ（インターネット上のｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）などが挙げられる。
該方法の一形態の実施では、市販の落射蛍光顕微鏡が使用され、複合体は、これを支持している透明な表面を介してイメージングされ得る。標準的な落射蛍光顕微鏡、共焦点またはＴＩＲＦ（全反射照明蛍光）顕微鏡が使用され得る。さまざまな実施形態においてＴＩＲＦ顕微鏡が使用され、これは、この型の顕微鏡がより良好なｚ軸平面の解像を有しており、これにより微粒子が配置された焦点面より上からのシグナルが排除され、これによりバックグラウンドシグナルが低減され得るためである。かかる顕微鏡の代表例は高解像度ＣＣＤカメラ（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｍｏｄｅｌ Ｃ４７４２−８０−１２ＡＧ；インターネット上のｌｅａｒｎ．ｈａｍａｍａｔｓｕ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と連動させた電動式倒立蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ「ＩＸ８１」；インターネット上のｏｌｙｍｐｕｓａｍｅｒｉｃａ．ｃｏｍ／）である。有用な他の同等の顕微鏡およびカメラが市販されている。
該方法のこの基本形態では、全容量の反応混合物からの光シグナルが使用される慣用的なアッセイより高い感度を得るために単色アプローチが使用され得る。このより高い感度は、一次関数のプロットが、慣用的なアッセイで較正曲線として使用される線形プロットのものと比べて低濃度において大きな傾きを有することによって明示され得る。
被検物結合性捕捉分子を有する微粒子、フルオロフォアに結合した被検物結合性検出分子、および被検物を含んでいることが疑われる試料を、アッセイが行われるのに適切な条件下で合わせる。アッセイを行った後、被検物結合性捕捉分子と結合している微粒子、被検物、およびフルオロフォアに結合した被検物結合性検出分子を含むコンジュゲートで構成された複合体からのものでない蛍光性の光シグナル（あれば）を排除する。次いで、残存している複合体を、コンジュゲートのフルオロフォアが発する蛍光に基づいてさらに定量する。この後者の工程により、微粒子の表面上の選択基準を満たさないセクション（あれば）が排除される。例えば標準偏差などの統計パラメータに基づいて、選択基準の典型的な例は、測定に使用される微粒子が実質的に均一なコーティングを有することであり、これにより、高度の非特異的結合に起因し得るコンジュゲートの過剰な凝集が本質的に排除される。一般に、選択基準は具体的なアッセイに応じてさまざまである。具体的なアッセイの当業者は該具体的なアッセイの有意義な選択基準を設定することができるはずである。最後に、強度を被検物の濃度が強度の関数として作成された較正曲線と比較するため、定量した粒子のピクセルあたりの強度の平均値を測定する。定量した粒子のピクセルあたりの強度の平均値は、ＣＣＤカメラ（これにより光の強度が測定され得る。）によって求めることができる。強度の測定値を、計数の単位で表示されるパラメータに変換する。各ピクセルは、該ピクセルにおいて測定された光の強度に対応する数値を有する。
別の実施形態では、反応混合物の白色光画像を得る。白色光画像は、各固相支持体、例えば微粒子の位置を確認するために使用される。白色光画像は、照光と検出の両方で全電磁スペクトルを使用することにより形成される。この工程は必要ではないが、微粒子から生じたものでないシグナルが排除されるため有用である。次いで蛍光画像を取得し、微粒子に結合された被検物結合性検出分子の位置と強度を調べる。蛍光画像には色、例えば赤、緑が使用される。ピクセルあたりの計数を計算し、ピクセルあたりの計数の平均と標準偏差を記録する。例えば前述の標準偏差の２倍より大きいか、または小さい計数を有するピクセルを解析から除外する。残りのピクセルのピクセルあたりの平均計測数を計算する。被検物結合性検出分子の標識から測定されたシグナルの量により被検物の濃度が求められる。
より高度な感度が得られる測定を行うためには、市販の落射蛍光顕微鏡が使用され、複合体は、これを支持している透明な表面を介してイメージングされ得る。かかる顕微鏡の代表例は、高解像度ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｍｏｄｅｌ Ｃ４７４２−８０−１２ＡＧ）（これは数多くの供給元から市販されている。）と連動させた電動式倒立蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ「ＩＸ８１」）である。
この高感度測定では、二色アプローチが、全容量の反応混合物からの光シグナルが使用される慣用的なアッセイおよび先に記載の単色アプローチによって行われる測定のどちらよりも高い感度を得るために使用される。このより高い感度は、一次関数のプロットが、慣用的なアッセイまたは単色アプローチが使用されるアッセイで較正曲線として使用される線形プロットのものと比べて低濃度において大きな傾きを有することによって明示される。本発明の方法を行うために、市販の機器類を、第１の標識によって同定される第１の３部構成複合体を検出するための第２の検出チャネルおよび第２の標識によって同定される第２の３部構成複合体を検出するための第２のチャネルを追加して適合させる。蛍光チャネルは、励起フィルターと発光フィルターを含む一組のフィルターで画定され、これにより、特定の波長を有する光が試料に達し、特定の波長を有するシグナルがＣＣＤカメラに達することが可能になる。例えば、フルオロフォアＰＥはＰＥチャネル内でのみ検出され得、任意の他の蛍光チャネル内では検出され得ない。同様に、フルオロフォアＣｙ５はＣｙ５チャネル内でのみ検出され得、任意の他の蛍光チャネル内では検出され得ない。第２の検出チャネルを含むように容易に適合させ得る代表的な自動化および半自動化システムとしては、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ、およびＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が挙げられる。
被検物結合性捕捉分子を有する微粒子、フルオロフォアに結合した被検物結合性検出分子、および被検物を含んでいることが疑われる試料を、アッセイが行われるのに適切な条件下で合わせる。アッセイを行った後、被検物結合性捕捉分子に結合している微粒子、被検物、および第１のフルオロフォアに結合した被検物結合性検出分子を含むコンジュゲートで構成された複合体からのものでない蛍光性の光シグナル（あれば）を排除する。次に、被検物結合性捕捉分子（第１のフルオロフォアと異なる第２のフルオロフォアを特徴とする。）の画像を得る。この画像では、被検物結合性捕捉分子で均一な様式でコートされていない微粒子（あれば）に対応するピクセル（あれば）が排除される。微粒子が一様にコートされていない場合、該部分のピクセルを除外する。次いで複合体を、コンジュゲートが発する蛍光に基づいてさらに定量する。この後者工程により、複合体上の選択基準を満たさないセクション（あれば）が除外される。選択基準の典型的な例は均一なコーティングであり、これにより、高度の非特異的結合に起因し得るコンジュゲートの過剰な凝集が本質的に排除される。先に記載のように、選択基準は具体的なアッセイに応じてさまざまである。最後に強度を、被検物の濃度を確立した較正曲線と比較するため、定量した粒子のピクセルあたりの強度の平均値を測定する。
別の実施形態では、試料の白色光画像を得る。白色光画像は、微粒子の位置を調べるために使用される。この工程は必要ではないが、各固相支持体、例えば微粒子の位置を確認することが望ましい場合があり得るため有用である。次いで第１の蛍光画像を取得し、微粒子に結合された被検物結合性捕捉分子の位置を調べる。第１の蛍光画像には色、例えば赤、緑が使用される。第２の蛍光画像を取得し、コンジュゲートの成分として存在している被検物結合性分子の位置を調べる。第２の蛍光画像にも色、例えば赤、緑が使用されるが、第２の蛍光画像の色は第１の蛍光画像の色と区別する。微粒子上の被検物結合性捕捉分子とコンジュゲート上の被検物結合性分子の両方に由来するピクセルをさらなる解析に選択する。ピクセルあたりの計数を計算し、ピクセルあたりの計数の平均と標準偏差を記録する。例えば計算された標準偏差の２倍より大きいか、または小さい計数を有するピクセルを解析から除外する。残りのピクセルのピクセルあたりの平均計測数を計算する。被検物結合性検出分子の標識から測定されたシグナルの量により被検物の濃度が求められる。
４．具体的な機器へのキットおよび方法の適合
本明細書に記載の概念、キットおよび方法は、任意のシステムまたは機器、例えば任意の手動、自動化または半自動化システムにおいて実行され得る。以下の適合例は単なる例示として含めている。
本明細書に記載のアッセイによって試験試料中の被検物の濃度を求めるキット（またはこの構成要素）ならびに方法は、さまざまな自動化および半自動化システム（例えば、固相支持体が電極または微粒子を含むもの）における使用のために適合させ得る。実例としての自動化および半自動化システムは、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号明細書および同第５，００６，３０９号明細書に記載されており、例えばＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）によってＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）として市販されている。
自動化または半自動化システムを非自動化システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比べたときの違いの一例としては、被検物結合性捕捉分子（１つまたは複数）（例えば、被検物結合性捕捉分子、例えば、抗体または抗原に活性なこの断片）を結合させる基材（これはサンドイッチ形成および被検物の反応性に影響を及ぼし得る。）、ならびに捕捉、検出および／または場合により洗浄工程（あれば）の長さおよびタイミングが挙げられる。ＥＬＩＳＡなどの非自動化形式では、試料および捕捉試薬との比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）が必要とされ得るが、自動化または半自動化され形式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）では比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ではおよそ１８分間）でよい。同様に、ＥＬＩＳＡなどの非自動化形式では、被検物結合性検出分子（１つまたは複数）（例えば、被検物結合性検出分子、例えば、抗体またはこの抗原に活性な断片）、例えばコンジュゲート試薬は比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）でインキュベートされ得るが、自動化または半自動化され形式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））では比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ではおよそ４分間）でよい。
Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームとしては、限定されないが、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号明細書（これは参照によりこの全体が明細書に組み込まれる。）参照）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ、ならびに他のプラットフォームが挙げられる。さらに、アッセイ、キットおよびキットの構成要素は他の形式でも、例えば、電気化学的または他の携帯型もしくはポイントオブケアアッセイシステムにおいて使用され得る。本開示は、例えば、サンドイッチアッセイを行う市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的アッセイシステムに適用可能である。免疫センサーならびにこの製造方法および単回使用試験デバイスにおける動作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号明細書、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号明細書、および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号明細書（これらの該センサーならびに方法に関するこの教示は参照によりこの全体が組み込まれる。）に記載されている。
特に、アッセイのＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへの適合に関して、以下の構成体が有用である。一対のアンペロメトリック金作用電極と銀−塩化銀参照電極を有する微細加工シリコンチップを製造する。一方の作用電極の上面において、高親和性被検物結合性捕捉分子（１つまたは複数）を固定化したポリスチレンビーズ（０．２ｍｍ直径）を、該電極上のパターン化ポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着させる。親和性が低い方の固定化被検物結合性捕捉分子（１つまたは複数）を第２の電極に接着させる。このチップをアッセイに適切な流体工学形式を有するＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジにする。カートリッジの試料収容チャンバの壁面の一部には、アルカリホスファターゼ（または他の標識）で標識された被検物結合性検出分子（１つまたは複数）を含む層が存在する。カートリッジの流体パウチ内には、ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬が存在する。
動作時は、被検物を含む試料を試験カートリッジの収容チャンバに添加し、このカートリッジをＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）リーダー内に挿入する。被検物結合性検出分子（１つまたは複数）（例えば、被検物結合性検出分子、例えば、抗体または抗原に活性なこの断片）が試料中に溶解したら、カートリッジ内のポンプエレメントが試料を、該チップを内包するコンジット内に押し込む。ここでは、被検物結合性捕捉分子（１つまたは複数）、被検物および標識された被検物結合性検出分子（１つまたは複数）間のサンドイッチの形成が促進されるように振動される。アッセイの最後から２番目の工程では、流体がパウチから押し出されてコンジット内に入り、試料がチップから洗い流され、廃棄物チャンバ内に入る。アッセイの最終工程では、アルカリホスファターゼ標識がｐ−アミノフェノールホスフェートと反応してリン酸基が切断され、遊離したｐ−アミノフェノールが作用電極において電気化学的に酸化されることが可能になる。測定された電流に基づき、リーダーにより、組み込まれたアルゴリズムおよび工場測定値の較正曲線によって試料中の被検物の量が計算され得る。
さらに、本明細書に記載の方法およびキットは、アッセイを行うための他の試薬および方法を必然的に包含することは言うまでもない。例えば、種々のバッファー、例えば、当該技術分野で知られているものおよび／または例えば、洗浄のため、コンジュゲート希釈剤として、および／または較正標準希釈剤として使用するために容易に調製もしくは最適化され得るものが包含される。例示的なコンジュゲート希釈剤はＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）コンジュゲート希釈剤であり、これは特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）に使用されており、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッカー、抗菌剤およびデタージェントを含むものである。例示的な較正標準希釈剤はＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）較正用ヒト試料希釈剤であり、これは特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）に使用されており、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッカーおよび抗菌剤を含有しているバッファーを含むものである。さらに、米国特許出願第６１／１４２，０４８号（２００８年１２月３１日出願）に記載のように、例えばＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジ形式において、シグナルまたは被検物結合性検出分子と関連する核酸配列をシグナル増幅因子として使用するとシグナル生成の改善が得られ得る。
一般的に、本発明のキットおよび方法での使用のため、自動化および半自動化システムを、第１の標識によって同定される第１の３部構成複合体を検出するための第１のチャネルと第２の標識によって同定される第２の３部構成複合体を検出するための第２のチャネルの２つの異なるチャネルを用いて試料が解析されるように適合させる。
一般的に、本発明のキットおよび方法は任意の目的に、例えば、数ある用途の中でも、患者を診断、予後診断またはこの治療的／予防的処置の有効性を評価するために使用され得る。
５．被検物
本明細書において提供するキットおよび方法は目的の任意の被検物を検出するのに有用である。実例としての目的の被検物としては、限定されないが、例えば、一般的にはタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ならびにより具体的には、例えば、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素または受容体が挙げられる。適宜、市販の被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）を本発明において記載のキットおよびアッセイに使用してもよく、被検物結合性分子（例えば、抗体またはこの抗原反応性断片）を当該技術分野で知られた方法を用いて作製してもよい。一般的に、本明細書に記載のキットおよび方法を用いて検出された被検物はサンドイッチアッセイによって検出され得る。
本発明のキットおよびアッセイ法を用いて検出される実例としての目的の被検物としては、限定されないが、例えば、サイトカイン、免疫抑制薬、心血管疾患抗原、癌抗原、感染性疾患抗原、薬理学的薬剤、ホルモン、血漿、血清および／または血液抗原、バイオマーカー（例えば、腎臓障害の）、ビタミンならびに自己免疫抗原が挙げられる。かかる被検物としては、限定されないが、例えば：サイトカイン、免疫抑制薬（例えば、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、テムシロリムス（ｔｅｍｓｏｒｏｌｉｍｕｓ）、ゾタロリムス、シクロスポリン、またはこれらの化合物いずれかの類似体）；心血管疾患抗原（例えば、トロポニンＩ、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、血清クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）、塩基性またはＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ガレクチン−３、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ミオグロビン、Ｄ−ダイマーフィブリン分解生成物（またはＦＤＰ）、高感度Ｃ−反応性タンパク質）；癌抗原（例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＣＡ １２５、ＣＡ １５−３、ＣＡ １９−９、ＣＡ １９−９ ＸＲ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチン１９、サイトケラチン断片２１−１（ＣＹＦＲＡ．２１−１）、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、プロガストリン放出ペプチド（ＰｒｏＧＲＰ）、有棘細胞癌抗原（ＳＣＣ−Ａｇ））；感染性疾患抗原（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩｇＧ、ＣＭＶ ＩｇＭ、ルベラＩｇＧ、ルベラＩｇＭ、トキソプラズマＩｇＧ、トキソプラズマＩｇＭ、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ＩｇＧ、ＨＡＶ ＩｇＭ、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）、ＨＢｃ ＩｇＭ、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、シャーガス、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、梅毒、ヒトＴ−リンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ））；薬理学的薬剤（例えば、アセトアミノフェン、アンフェタミン／メタンフェタミン、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、カンナビノイド、コカイン、麻薬、エタノール、メタドン、アヘン剤、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、プロポキシフェン、サリチラート、三環系抗鬱薬、アミカシン、カルバマゼピン、ジギトキシン、ジゴキシン、ゲンタマイシン、リチウム、フェノバルビタール、フェニトイン、キニジン、テオフィリン、トブラマイシン、バルプロ酸、バンコマイシン）；ホルモン（例えば、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、プロラクチン、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、テストステロン、コルチゾール、インスリン、ペプシノゲンＩ、ペプシノゲンＩＩ、Ｃ−ペプチド、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、甲状腺ホルモンＴ３、甲状腺ホルモンＴ４、甲状腺刺激ホルモン）、酵素（例えば、酸性ホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、クレアチンキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、αヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（αＨＢＤＨ）、リパーゼ；コリンエステラーゼ、セルロプラスミン）；血漿、血清および／または血液抗原（例えば、アルブミン、微量アルブミン、プレアルブミン、クレアチニン、シスタチンＣ、ビリルビン、リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ、補体Ｃ３、補体Ｃ４、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、κ軽鎖、λ軽鎖、β２ミクログロブリン、ヘモグロビン、ホモシステイン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ））；バイオマーカー（例えば、腎臓障害のもの、例えば、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ））；ビタミン（例えば、ビタミンＢ１２、葉酸、ビタミンＤ）；抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）抗体、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、α−１糖タンパク質、自己免疫抗原（例えば、リウマチ因子（ＲＦ）、抗サイログロブリン（抗Ｔｇ）、ならびに抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体（抗ＴＰＯ抗体））が挙げられる。
６．トレーサー被検物
さまざまな実施形態において、競合アッセイに使用されるトレーサー被検物は、サンドイッチアッセイにおいて被検物結合性捕捉分子および被検物結合性検出分子と複合体を形成し得る目的の被検物またはこの断片もしくは模倣物である。適宜、タンパク質被検物は天然供給源から精製したものであってもよく、本明細書に記載のような当該技術分野で知られた組換え手段もしくは合成手段によって作製されたものであってもよい。非タンパク質被検物は、当業者に知られた化学的手段および合成手段（生合成手段を含む。）によって作製されたものであり得る。トレーサー被検物は標識と直接または間接的に結合され得る。
標識は、本明細書に記載のような任意の検出可能な標識であり得る。実例としての標識としては、例えば、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光性標識などが挙げられる。当該技術分野で知られているような任意の適切な検出可能な標識が使用され得る。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐなど）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、化学発光性標識（例えば、アクリジニウムエステル、チオエステルもしくはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど）、１種類以上の発色団、例えば、紫外もしくは可視領域の光を放射する１種類以上の色素、りん光体、蛍光剤、フルオロフォア（例えば、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）；フィコビリン（フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン）；キサンテン誘導体（フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド）；シアニン誘導体（シアニン、Ｃｙ色素、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン）；ナフタレン誘導体（ダンシルおよびプロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体（ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール）；ピレン誘導体（カスケードブルー）；オキサジン誘導体（ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）；アクリジン誘導体（プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；アリールメチン誘導体（オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン）；テトラピロール誘導体（ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン））、発光団、化学発光体、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛キャッピングセレン化カドミウム）、サーモメトリック標識またはイムノ−ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。さまざまな実施形態において、トレーサー被検物はフィコビリン（例えば、フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン）で標識される。一部の実施形態では、トレーサー被検物はアクリジニウム化合物、例えば、アクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１種類のアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルまたはこの任意の組合せで標識される。
７．被検物結合性分子
一般的に、本明細書に記載のキットおよびアッセイでは３種類の被検物結合性分子が使用され、ここで、３種類の被検物結合性分子のうち２種類が被検物および第３の被検物結合性分子との複合体形成に関して競合する。被検物および第３の被検物結合性分子との複合体形成に関して競合する被検物結合性分子は被検物に、例えば約３倍から約５倍、約５倍から約１００倍、約５倍から約１０倍、約５倍から約２５倍、約２５倍から約５０倍、約５０倍から約１００倍異なる親和性で結合し、被検物に対する結合の親和性は約３倍、約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、約１００倍、またはこれ以上の倍数異なる。さまざまな実施形態において、被検物結合性分子のうち１種類または２種類を標識と直接または間接的に結合させる。さまざまな実施形態において、被検物結合性分子のうち１種類、２種類または３種類が抗体またはこの抗原反応性（即ち、被検物に結合する）断片である。
一部の実施形態では、被検物結合性分子のうち１種類、２種類または３種類が、抗体でない被検物結合性分子である。抗体と同様の様式で標的を標的化して結合する他の化合物が開発されている。このような「抗体模倣物」の一部のものでは、非免疫グロブリンタンパク質骨格が抗体の可変領域の代替タンパク質フレームワークとして使用される。
例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２６０，２０３号明細書）には、凝集しているが分子としては分離している抗体の軽鎖と重鎖の可変領域のものと同様の結合特異性を有する単一ポリペプチド鎖結合性分子が記載されている。この一本鎖結合性分子は、抗体の重鎖と軽鎖の両方の可変領域の抗原結合部位がペプチドリンカーによって連結された抗原結合部位を含むものであり、二ペプチド抗体と同様の構造にフォールディングされる。この一本鎖結合性分子は、慣用的な抗体と比べて例えばサイズが小さい、安定性が大きい、修飾が容易である、などの幾つかの利点を示す。
Ｋｕ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１４）：６５５２−６５５６（１９９５））には、シトクロムｂ５６２ベースの抗体の代替品が開示されている。Ｋｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）は、シトクロムｂ５６２のループのうち２つを無作為抽出し、ウシ血清アルブミンに対する結合に選択したライブラリーを作製した。個々の変異型は、抗ＢＳＡ抗体と同様にＢＳＡと選択的に結合することがわかった。
Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，８１８，４１８号明細書および同第７，１１５，３９６号明細書）には、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様タンパク質骨格と少なくとも１種類の可変ループを特長とする抗体模倣物が開示されている。アドネクチンとして知られるこのようなフィブロネクチン系抗体模倣物は、天然または改変抗体と多くの同じ特徴（例えば、任意の標的化被検物に対する高い親和性および特異性）を示す。新たな、または改善された結合性タンパク質を進化させるための任意の手法がこのような抗体模倣物に使用され得る。
このようなフィブロネクチン系抗体模倣物の構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の構造と類似している。従って、このような模倣物は、性質および親和性が天然抗体のものと類似した抗原結合特性を示す。さらに、このようなフィブロネクチン系抗体模倣物は、抗体および抗体断片と比べて特定の有益性を示す。例えば、このような抗体模倣物は、天然のフォールディング安定性のためにジスルフィド結合に依存せず、従って、通常は抗体が分解するであろう条件下で安定である。また、このようなフィブロネクチン系抗体模倣物の構造はＩｇＧ重鎖のものと類似しているため、インビボでの抗体の親和性成熟過程と同様のループの無作為抽出およびシャッフリングの方法がインビトロで使用され得る。
Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（５）：１８９８−１９０３（１９９９））には、リポカリン骨格ベースの抗体模倣物が開示されている（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｒ））。リポカリンは、タンパク質の末端に４つの超可変ループを有するβ−バレルで構成されている。Ｂｅｓｔｅ（１９９９）は、これらのループをランダム変異誘発に供し、例えばフルオレセインとの結合に選択した。３つのバリアントがフルオレセインとの特異的結合を示し、１つのバリアントは抗フルオレセイン抗体のものと同様の結合を示した。さらなる解析により、無作為抽出したすべての位置が可変であることが明らかになり、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｒ）を抗体の代替品として使用することは適切であろうことを示す。Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｒ）は小型の一本鎖ペプチド（典型的には１６０から１８０残基）であり、抗体と比べて生産コストが低い、保存安定性が高い、および免疫反応が少ない、などの幾つかの利点を示す。
Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，７７０，３８０号明細書）には、結合部位として使用される多数の可変ペプチドループが結合しているカリックスアレーンの剛直な非ペプチド有機骨格を有する合成の抗体模倣物が開示されている。ペプチドループはすべて、カリックスアレーンから幾何学的に互いに同じ側に突出している。この幾何学的コンホメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）のため、すべてのループが結合に利用可能であり、被検物に対する結合親和性が大きくなる。しかしながら、他の抗体模倣物と比較すると、カリックスアレーン系抗体模倣物は排他的にペプチドからなるものではなく、従って、プロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。骨格は純粋にペプチドからなるものでもＤＮＡからなるものでもＲＮＡからなるものでもなく、この抗体模倣物が極端な環境条件で比較的安定であり、長い寿命を有することを意味する。さらに、このカリックスアレーン系抗体模倣物は比較的小型であるため、免疫原性応答が生じにくい。
Ｍｕｒａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９（２）：２０９−２１６（２００３））には、抗体をより小さなペプチド模倣物に縮小する方法論が論考されており、これは、「抗体様結合性ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｍｅｔｉｃ）」（ＡＢｉＰ）と称され、同様に抗体の代替品として有用であり得る。
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：１５５６−１５６１（２００５））には、「アビマー」と称する多数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質が開示されている。ヒト細胞外受容体ドメインからインビトロエキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって開発されたアビマーは、種々の標的分子に対するこの親和性および特異性がいくぶん抗体と類似している結合性タンパク質の一類型である。得られたマルチドメインタンパク質は多数の独立した結合ドメインを含むものであり得、該結合ドメインは単一エピトープ結合性タンパク質と比べて改善された親和性（一部の場合ではサブナノモル濃度）および特異性を示し得る。アビマーの構築方法および使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第２００４−０１７５７５６号明細書、同第２００５−００４８５１２号明細書、同第２００５−００５３９７３号明細書、同第２００５−００８９９３２号明細書および同第２００５−０２２１３８４号明細書に開示されている。
たいてい、市販の抗体または被検物結合性分子は本発明のアッセイに使用することができる。さまざまな実施形態において、被検物結合性分子のうちの１種類、２種類または３種類は、例えば、既知の組換え手法および／またはモノクローナル抗体作製手法を用いて作製される。
モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた方法に従って作製および修飾（例えば、同類置換）され得る。修飾された抗体またはこの抗原反応性断片が被検物を検出する能力は、抗原結合特異性を評価するための当該技術分野で知られた任意の標準的な方法、例えば本明細書に記載および例示した方法などを用いて測定され得る。かかる方法としては、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ））、ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ））アッセイ、およびラジオイムノアッセイが挙げられる。好ましくは、修飾された抗体または抗原反応性断片は、対応する非修飾抗体と少なくとも同等に良好な、好ましくは（さらに望ましくは）より良好な被検物結合特性を示すものである。
ａ．合成による作製
配列決定されたら、被検物に特異的に結合するポリペプチド、例えばモノクローナル抗体（またはこの断片）が当該技術分野で知られた方法、例えば排他的固相支持体合成、部分固相支持体合成、断片縮合および古典的な液相合成を用いて合成され得る。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）を参照のこと。固相支持体では、合成は、典型的にはペプチドのＣ末端からα−アミノ保護樹脂を用いて開始する。適切な出発物質は、例えば、必要とされるα−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂またはベンズヒドリルアミン樹脂に結合させることにより調製され得る。かかるクロロメチル化樹脂の一例は、商標名ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ ＳＸ−１ ｂｙ Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で販売されており、ヒドロキシメチル樹脂の調製はＢｏｄｏｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ）３８：１５９７（１９６６）に記載されている。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂はＰｉｅｔｔａ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．６５０（１９７０）に報告されており、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から塩酸塩の形態で市販されている。自動ペプチド合成装置が市販されており、ペプチドを特注で作製する市販のサービスもある。
従って、ポリペプチドは、α−アミノ保護アミノ酸とクロロメチル化樹脂とのカップリングにより、例えば重炭酸セシウム触媒の補助を伴って、Ｇｉｓｉｎ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．５６：１４６７（１９７３）に記載の方法に従って調製され得る。最初のカップリング後、α−アミノ保護基は、選択した試薬、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または塩酸（ＨＣｌ）の有機溶媒中の溶液により室温にて除去する。
適切なα−アミノ保護基としては、ペプチドの段階的合成の技術分野で有用であることが知られているものが挙げられる。α−アミノ保護基の例は：アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチルおよびアセチル）、芳香族ウレタン型保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）および置換型Ｃｂｚ）、脂肪族ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニルおよびシクロヘキシルオキシカルボニル）、ならびにアルキル型保護基（例えば、ベンジルおよびトリフェニルメチル）である。ＢｏｃおよびＦｍｏｃは有用な保護基である。側鎖保護基はカップリング中はインタクトなままであり、アミノ末端保護基の脱保護中またはカップリング中は切れない。側鎖保護基は、最終ペプチドの合成が終了したら目的のペプチドを改変させない反応条件下で除去可能なものでなければならない。
α−アミノ保護基の除去後、残りの保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングさせる。一般的に、各保護アミノ酸は過剰で、適切なカルボキシル基活性化剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の例えば塩化メチレン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物の溶液とともに使用される。
所望のアミノ酸配列が完成したら、所望のペプチドを樹脂支持体から、ペプチドを樹脂から切り離すだけでなく、残存しているすべての側鎖保護基も切り離す試薬、例えばＴＦＡまたはフッ化水素（ＨＦ）での処理によってデカップリングさせる。クロロメチル化樹脂を使用すると、ＨＦ処理により遊離ペプチド酸の形成がもたらされる。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用すると、ＨＦ処理により直接、遊離ペプチドアミドがもたらされる。または、クロロメチル化樹脂を使用する場合、側鎖保護ペプチドを、ペプチド樹脂をアンモニアで処理することによってデカップリングすると所望の側鎖保護アミドが得られ得、またはアルキルアミンで処理することによってデカップリングすると側鎖保護されたアルキルアミドもしくはジアルキルアミドが得られ得る。次いで、側鎖保護部を通常の様式で、フッ化水素で処理することによって除去すると遊離のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドが得られる。
これらおよび他の固相支持体ペプチド合成手順は当該技術分野でよく知られている。かかる手順はまた、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４）にも記載されている。
ｂ．組換えによる作製
被検物（またはこの断片）に特異的に結合するポリペプチド、例えばモノクローナル抗体（またはこの断片）は、当該技術分野で知られた方法を用いて組換え生産することができる。例えば、抗体（またはこの断片）をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸を宿主細胞内で発現させ得、抗体が単離され得る。単離核酸は、被検物に対する抗体のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。単離核酸は、例えばオリゴヌクレオチド合成装置で合成され得る。当業者には、遺伝コードの縮重のため、１種類より多くのヌクレオチド配列に所与のアミノ酸配列がコードされ得ることが容易に認識されよう。これに関して、被検物に対する抗体のものと実質的に同一であるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列が使用され得るが、発現させたバリアント抗体は被検物に対する該抗体と競合するものであるものとする。所与の宿主細胞に好まれるコドンが好ましくは組換え生産に選択される。被検物に対する抗体のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を他のヌクレオチド配列と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）を用いて結合し、抗被検物抗体またはこの抗原反応性断片をコードするようにしてもよい。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的会合のための５’または３’突出端を含むものである。会合したら、抗被検物抗体またはこの抗原反応性断片をコードしているヌクレオチド配列は、ベクター内に挿入され、所与の宿主細胞内での発現に必要な制御配列に作動可能に連結され、（形質転換またはトランスフェクションなどによって）宿主細胞内に導入され得る。ヌクレオチド配列を、宿主細胞内でさらに操作（例えば、さらなる免疫グロブリンドメイン、例えば、さらなる定常領域をコードしている１種類以上のヌクレオチド配列に連結）し、および／または発現させてもよい。
すべてのベクターおよび発現制御配列が等しく良好に機能して目的のポリヌクレオチド配列を発現させ得る得るわけではなく、すべての宿主が同じ発現系で等しく良好に機能するわけではないが、
当業者は、本開示における使用のためのこのようなベクター、発現制御配列、最適化コドンおよび宿主の中からなんら必要以上に実験を行うことなく選択を行うことができるであろうと考えられる。例えば、ベクターの選択の際には宿主が検討されなければならず、これは、該ベクターがこの内部で複製できるものでなければならない、または染色体に組み込まれ得るものでなければならないためである。また、ベクターのコピー数、該コピー数の制御能および該ベクターにコードされた他のタンパク質（あれば）（抗生物質マーカーなど）の発現も検討すべきである。また、発現制御配列の選択の際もさまざまな要素が検討され得る。このような要素としては、限定されないが、配列の相対強度、制御可能性および抗被検物抗体をコードしているヌクレオチド配列との適合性（特に、潜在的二次構造に関して）が挙げられる。宿主は、選択したベクターとの適合性、コドン使用頻度、分泌特性、ポリペプチドを正確にフォールディングする能力、発酵または培養要件、タンパク質をグリコシル化する能力（またはこの欠如）およびヌクレオチド配列にコードされた生成物の精製のし易さなどを検討して選択すべきである。
組換えベクターは自律複製ベクター、即ち、染色体外存在体として存在し、この複製が染色体の複製と独立しているベクター（プラスミドなど）であってもよい。または、ベクターは、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体（１つまたは複数）と一緒に複製されるものであってもよい。
ベクターは、好ましくは、抗被検物抗体をコードしているポリヌクレオチド配列が該ポリヌクレオチド配列の転写に必要とされるさらなるセグメントに作動可能に連結された発現ベクターである。ベクターは、典型的にはプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するものである。本明細書に記載の宿主細胞での発現のための幾つかの適切な発現ベクターが市販されており、または文献に記載されている。真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、限定されないが、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。具体的なベクターとしては、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）＼Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）が挙げられる。酵母細胞における使用のための発現ベクターの例としては、限定されないが、２μプラスミドおよびこの誘導体、ＰＯＴ１ベクター（例えば、米国特許第４，９３１，３７３号明細書参照）、ｐＪＳＯ３７ベクター（Ｏｋｋｅｌｓ，Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２０２−２０７（１９９６）に記載）およびｐＰＩＣＺ Ａ、ＢまたはＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。昆虫細胞における使用のための発現ベクターの例としては、限定されないが、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：６８５−６９８（１９８６））、ならびにｐＢｌｕｅｂａｃ ４．５およびｐＭｅｌｂａｃ（どちらもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。）が挙げられる。
使用され得る他のベクターは、抗被検物抗体をコードしているヌクレオチド配列がコピー数で増幅されることを可能にするものである。かかる増幅可能なベクターは当該技術分野でよく知られている。このようなベクターとしては、限定されないが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）増幅（例えば、Ｋａｕｆｉｎａｎ，米国特許第４，４７０，４６１号明細書；およびＫａｕｆｉｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４−１３１９（１９８２）参照）ならびにグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号明細書および欧州特許出願公開第０３３８８４１号明細書参照）によって増幅され得るベクターが挙げられる。
組換えベクターにさらに、該ベクターが対象の宿主細胞内で複製されることを可能にするヌクレオチド配列を含めてもよい。哺乳動物宿主細胞における使用のためのかかる配列の一例はＳＶ４０複製起点である。ベクターが酵母細胞内で複製されることを可能にする適切な配列は酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１から３および複製起点である。
また、ベクターに選択可能マーカー、即ち、産物が宿主細胞の欠陥を補う遺伝子もしくはポリヌクレオチド、例えば、ＤＨＦＲをコードしている遺伝子もしくはスキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ ４０：１２５−１３０（１９８５）参照）、または薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子もしくはポリヌクレオチドを含めてもよい。糸状菌では、選択可能なマーカーとしては、限定されないがａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤおよびｓＣが挙げられる。
また、ベクター内に、抗被検物抗体の発現に必要または好都合な任意の成分である「制御配列」を存在させてもよい。各制御配列は天然であってもよく、抗被検物抗体をコードしているヌクレオチド配列とって外来であってもよい。かかる制御配列としては、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、制御配列は、抗被検物抗体をコードしているポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１種類のプロモーターを含むものである。
「作動可能に連結されている」とは、２つ以上のヌクレオチド配列が互いの配列の通常の機能が行われ得るような構成体に、酵素的ライゲーションまたは他の様式によって共有結合されていることを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダー配列をコードしているヌクレオチド配列はポリペプチドのヌクレオチド配列に、該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーはコード配列に、該配列の転写に影響を及ぼす場合、作動可能に連結されており；リボソーム結合部位はコード配列に、翻訳が促進されるように配置されている場合、作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結されている」とは、連結されているヌクレオチド配列同士が連続していること、分泌リーダー配列の場合は、連続しており、同じリーディングフレーム内に存在することを意味する。連結は簡便な制限部位でのライゲーションによって行われる。かかる部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが標準的な組換えＤＮＡ法とともに使用され得る。
多種多様な発現制御配列が本開示との関連において使用され得る。かかる有用な発現制御配列としては、前述の発現ベクターの構造遺伝子と関連している発現制御配列ならびに原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはこのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている任意の配列、ならびにこの種々の組合せが挙げられる。哺乳動物細胞における転写を指令するための適切な制御配列の例としては、ＳＶ４０の初期および後期プロモーターならびにアデノウイルス、例えば、アデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ショウジョウバエの最小限のヒートショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０またはアデノウイルスＥ１ｂ領域ポリアデニル化シグナルならびにコザックコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−５０（１９８７））が挙げられる。
哺乳動物細胞における発現を改善するため、合成イントロンを、抗体またはこの断片をコードしているポリヌクレオチド配列の５’非翻訳領域に挿入してもよい。合成イントロンの一例はプラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能）由来の合成イントロンである。
昆虫細胞における転写を指令するための適切な制御配列の例としては、限定されないが、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス３９Ｋのこの後の初期遺伝子プロモーター、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列が挙げられる。
酵母宿主細胞における使用のための適切な制御配列の例としては、酵母α−交配系のプロモーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターおよびＧＡＬ誘導性プロモーターが挙げられる。
糸状菌宿主細胞における使用のための適切な制御配列の例としては、ＡＤＨ３プロモーターおよびターミネーター、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼまたはアルカリプロテアーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）またはＡ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｓ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをコードしている遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター、およびＡＤＨ３ターミネーターが挙げられる。
目的の抗体をコードしているポリヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列もまた含むものであってもよく、含まないものであってもよい。シグナルペプチドは、抗被検物抗体がこれを発現させる細胞から分泌される場合に存在させる。かかるシグナルペプチドは、存在させる場合、該ポリペプチドの発現のために選択した細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、抗被検物モノクローナル抗体に同種または異種のものであってもよく、宿主細胞に同種または異種のものであってもよい、即ち、シグナルペプチドは宿主細胞で通常発現されるもの、または宿主細胞で通常発現されないものである。従って、シグナルペプチドは、例えば細菌に由来する原核生物系であってもよく、例えば哺乳動物、昆虫、糸状菌または酵母の細胞に由来する真核生物系であってもよい。
シグナルペプチドの有無は、例えば、抗被検物抗体の作製に使用される発現宿主細胞に依存する。糸状菌における使用のためには、シグナルペプチドは、簡便には、アスペルギルス属の種のアミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードしている遺伝子、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼもしくはプロテアーゼまたはフミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼをコードしている遺伝子に由来するものであり得る。昆虫細胞における使用のためには、シグナルペプチドは昆虫の遺伝子に由来するもの（例えば、国際公開第９０／０５７８３号パンフレット参照）、例えば、鱗翅類タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）脂質動員ホルモン前駆体（例えば、米国特許第５，０２３，３２８号明細書参照）、ミツバチのメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ｅｇｔ）（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４：３４９−３５７（１９９３）、またはヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２８４：２６２−２７２（１９９７））に由来するものであり得る。
哺乳動物細胞における使用のためのシグナルペプチドの具体例としては、マウスＩｇ κ軽鎖シグナルペプチド（Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９−１０４（１９９２））が挙げられる。酵母細胞における使用のための適切なシグナルペプチドとしては、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−因子シグナルペプチド（例えば、米国特許第４，８７０，００８号明細書参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（例えば、Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８９：６４３−６４６（１９８１）参照）、修飾カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（例えば、Ｖａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４８：８８７−８９７（１９８７）参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（例えば、国際公開第８７／０２６７０号パンフレット参照）、および酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（例えば、Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ６：１２７−１３７（１９９０）参照）が挙げられる。
任意の適切な宿主、例えば、細菌、真菌（酵母を含む。）、植物、昆虫、哺乳動物または他の適切な動物細胞もしくは細胞株ならびにトランスジェニック動物または植物が抗被検物抗体の作製に使用され得る。細菌の宿主細胞の例としては、限定されないが、グラム陽性菌、例えば、バチルス属菌株、例えば、Ｂ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）もしくはＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属もしくはストレプトマイセス属、またはグラム陰性菌、例えば、大腸菌株が挙げられる。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５（１９７９）参照）、コンピテント細胞の使用（例えば、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８１：８２３−８２９（１９６１）もしくはＤｕｂｎａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１（１９７１）参照）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１（１９８８）参照）、またはコンジュゲーション（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９：５７７１−５２７８（１９８７）参照）によって行われ得る。
適切な糸状菌宿主細胞の例としては、限定されないが、アスペルギルス属菌株、例えば、Ａ．オリーゼ（ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）もしくはＡ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム属またはトリコデルマ属が挙げられる。真菌細胞は、当業者に知られた手法を用いたプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生を伴う方法によって形質転換させ得る。アスペルギルス属宿主細胞形質転換のための適切な手順は欧州特許出願公開第２３８０２３号明細書および米国特許第５，６７９，５４３号明細書に記載されている。フザリウム属の種の形質転換のための適切な方法はＭａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６（１９８９）および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．編，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４：１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３（１９８３）；およびＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２０（１９７８）に記載の手順を用いて形質転換させ得る。
適切な酵母宿主細胞の例としては、サッカロミセス属菌株、例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スキゾサッカロミセス属、クリベロミセス属、ピキア属、例えば、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）もしくはＰ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ハンセヌラ属、例えば、Ｈ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）またはヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）が挙げられる。異種ポリヌクレオチドでの酵母細胞の形質転換方法およびこれによる異種ポリペプチドの作製方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ（Ｙｅａｓｔｍａｋｅｒ（商標）Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔの製品プロトコル）ならびにＲｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９９：１９３−１９８（１９９２）、Ｍａｎｉｖａｓａｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：４４１４−４４１５（１９９３）およびＧａｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２１：１５９−１６４（１９９４）に開示されている。
適切な昆虫宿主細胞の例としては、限定されないが、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｏｒａ）細胞株、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９もしくはＳｆ２１）またはトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）（例えば、米国特許第５，０７７，２１４号明細書参照）が挙げられる。昆虫細胞の形質転換および異種ポリペプチドの作製は当業者によく知られている。
適切な哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、サル（例えば、グリーンモンキー）細胞株（ＣＯＳ）、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＣＲＬ−１５７３）））、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞、および組織培養状態の植物細胞が挙げられる。好ましくは、哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞株およびＨＥＫ２９３細胞株である。別の宿主細胞はＢ３．２細胞株（例えば，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、または別のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）である。
外来ポリヌクレオチドを哺乳動物宿主細胞に導入するための方法としては、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、ウイルスベクターおよびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫに記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を用いたトランスフェクション法が挙げられる。このような方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９６）に記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えばＪｅｎｋｉｎｓ編，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（１９９９）およびＨａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｅ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）に開示されているような確立された方法に従って行われる。
作製方法において、細胞は抗被検物抗体の生成に適切な栄養培地中で、当該技術分野で知られた方法を用いて培養する。例えば、細胞は、振盪フラスコ培養、実験室内もしくは工業用発酵槽内で適切な培地中および抗ヒト被検物モノクローナル抗体の発現および／または単離が可能な条件下で行われる小規模または大規模発酵（例えば、連続式、バッチ式、フェッドバッチ式もしくは固相発酵）によって培養する。培養は、炭素源と窒素源および無機塩を含む適切な栄養培地中で、当該技術分野で知られた手順を用いて行う。適切な培地は市販の供給元から入手可能であるか、または公表された組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）に従って調製され得る。抗被検物抗体が栄養培地中に分泌される場合は、培地から直接回収され得る。抗被検物抗体が分泌されない場合は、細胞溶解物から回収され得る。
得られた抗被検物抗体は当該技術分野で知られた方法によって回収され得る。例えば、抗被検物抗体は、栄養培地から慣用的な手順によって、例えば限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーションまたは沈殿によって回収され得る。
抗被検物抗体は当該技術分野で知られたさまざまな手順によって、例えば限定されないが、クロマトグラフィー（例えば限定されないが、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動による手順（例えば限定されないが、分取用等電点電気泳動法）、溶解度の差（例えば限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出（例えば、Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ編，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）参照）によって精製され得る。
ｃ．免疫処置、ハイブリドーマまたは他の手段による抗体の作製
被検物（またはこの断片）に特異的に結合する他の抗体（またはこの断片）は、当該技術分野で知られたさまざまな異なる手法を用いて作製され得る。例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、適切な被検体（例えば限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を、適切な免疫原を含む免疫原性調製物で免疫処置することにより生成させることができる。免疫原は、これを産生する細胞から親和性クロマトグラフィー、免疫沈降または当該技術分野でよく知られた他の手法を用いて富化／精製し、単離したものであり得る。または、免疫原は、化学合成を使用し、当該技術分野で知られた常套的な手法（例えば限定されないが、合成装置）を用いて調製したものであってもよい。被検体内で生成した抗体は次いで、該抗体が免疫原（またはこの断片）に結合するかどうかを調べるためにスクリーニングされ得る。
免疫原（即ち、精製タンパク質、タンパク質を発現している腫瘍細胞もしくは組換え発現免疫原（またはこの断片もしくはバリアント（またはこの断片））の単位用量および免疫処置レジメンは、免疫処置対象の被検体、この免疫状態および被検体の体重に依存する。被検体における免疫応答を向上させるため、免疫原をアジュバント、例えば、フロイントの完全または不完全アジュバントとともに投与してもよい。
上記のような免疫原での被検体の免疫処置によりポリクローナル抗体応答が誘導される。免疫処置した被検体における抗体力価は経時的に、固定化抗原が使用されるＥＬＩＳＡなどの標準的な手法によってモニタリングされ得る。
他の抗体生成方法としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの使用（例えば、国際公開第９１／００９０６号パンフレット、同第９１／１０７４１号パンフレットおよび同第９２／０３９１８号パンフレット参照）が挙げられる。または、ヒトモノクローナル抗体は、抗原を、ヒト抗体産生細胞または組織（例えば、ヒト骨髄細胞、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、ヒト胎児リンパ節組織または造血幹細胞）を移植した免疫不全マウスに導入することにより作製され得る。かかる方法としては、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスでの抗体生成（例えば、国際公開第９３／０５７９６号パンフレット；米国特許第５，４１１，７４９号明細書；もしくはＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６３２−１６３９（１９８８）参照）またはＲａｇ−１／Ｒａｇ−２欠損マウスでの抗体生成が挙げられる。また、ヒト抗体−免疫不全マウスは市販もされている。例えば、Ｒａｇ−２欠損マウスはＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手可能である。
モノクローナル抗体は被検体を免疫原で免疫処置することにより生成させ得る。免疫処置後、適切な時点、例えば抗体力価が充分に高レベルになったら、抗体産生細胞が、免疫処置した動物から収集され、標準的な手法を用いてモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。例えば、抗体産生細胞を標準的な体細胞融合手順によって不死化細胞（ミエローマ細胞など）と融合させるとハイブリドーマ細胞が得られ得る。かかる手法は当該技術分野でよく知られており、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開発されたハイブリドーマ手法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５））、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３））、ならびにヒトモノクローナル抗体を作製するためのエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６（１９８５））が挙げられる。モノクローナル抗体用ハイブリドーマを作製するための技術は当業者によく知られている。
また、モノクローナル抗体は、抗体産生細胞、例えば脾細胞を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し、免疫原で免疫処置したトランスジェニックマウスから収集することによっても作製され得る。脾細胞は、ヒトミエローマ細胞との融合またはＥＢＶでの形質転換によって不死化され得る。このようなハイブリドーマは、当該技術分野で報告されているヒトＢ細胞−またはＥＢＶ−ハイブリドーマ手法を用いて作製され得る（例えば、Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願公開第０６１４９８４号明細書を参照のこと）。
免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマの培養上清を、例えば、固定化した免疫原（またはこの断片）に特異的に結合する抗体を選択するためのスクリーニングによってスクリーニングすること、または本明細書に記載の抗体を、該抗体が所望の特徴、即ち免疫原（またはこの断片）に対する結合能を有するかどうかを調べるために試験することにより検出される。所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンが、例えば限界希釈手順、例えばＷａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））に記載の手順によってサブクローニングされ、標準的な方法によって培養され得る。
本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおける試験で陽性であったモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞は栄養培地中で、ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を培養培地中に分泌し、これにより完全抗体が得られることが可能であるのに充分な条件下および時間で培養され得る。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養手法および培養培地は、一般的に当該技術分野で報告されている（例えば、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）を参照のこと）。次いで、抗体を含む馴化ハイブリドーマ培養上清が回収され得る。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、場合により、培養培地から慣用的な免疫グロブリン精製手順によって、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどによって単離され得る。
モノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築し、このライブラリーを免疫原またはこの断片を用いてスクリーニングすることにより改変したものであってもよい。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２を参照のこと）。同様に、酵母ディスプレイベクターも当該技術分野で知られており、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＹＤ１）。簡単には、抗体ライブラリーをスクリーニングし、免疫原またはこの断片に特異的に結合する抗体を発現するファージまたは酵母細胞を同定して単離する。好ましくは、ライブラリーの一次スクリーニングは固定化した免疫原またはこの断片を用いたスクリーニングを伴う。
スクリーニング後、ディスプレイファージまたは酵母を単離し、選択した抗体をコードしているポリヌクレオチドがディスプレイファージまたは酵母から（例えば、ファージまたは酵母のゲノムから）回収され、他の発現ベクター内に（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）細胞、例えばＥＢＹ１００細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で）よく知られた組換えＤＮＡ手法によってサブクローニングされ得る。ポリヌクレオチドを宿主細胞内でさらに操作（例えば、さらなる免疫グロブリンドメイン、例えばさらなる定常領域をコードしている核酸に連結）および／または発現させてもよい。
被検物に特異的に結合するモノクローナル抗体が上記の方法に従って得られたら、当該技術分野で知られた方法に従って配列決定され得る。次いで、抗体が上記の組換えＤＮＡ技術、化学合成または化学合成と組換えＤＮＡ技術の組合せを用いて作製され得る。
さらに、本開示の一部の態様では、市販の抗被検物抗体または文献に記載の抗被検物抗体の作製方法を使用することが可能な場合があり得る。または、抗被検物抗体は、文献に記載の方法を用いて作製することができる。
ｄ．抗体断片
また、被検物に結合する抗体の抗原反応性断片も本明細書に記載のとおりに使用され得る。抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片などであり得る。抗体断片の作製のための種々の手法が当業者に知られている。例えば、かかる断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化によって得られ得るか（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）参照）または組換え宿主細胞により直接生成させ得る。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学カップリングさせるとＦ（ａｂ’）２断片が形成され得る（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）参照）。別の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の会合を促進させるロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。または、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞倍溶液から直接単離してもよい。単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、軽鎖および／または重鎖の可変領域を短鎖連結ペプチドまたは配列の使用によって連結することにより作製される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９９８）参照）。一本鎖バリアントは組換えまたは合成のいずれかによって作製され得る。ｓｃＦｖの合成による作製では、自動化合成装置が使用され得る。ｓｃＦｖの組換え生産では、ｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドが真核生物系（酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞など）または原核生物系（大腸菌など）のいずれかの適切な宿主細胞に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの常套的な操作によって作製され得る。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で知られた標準的なタンパク質精製手法を用いて単離され得る。さらに、他の形態の一本鎖抗体、例えばダイアボディもまた本開示によって想定される。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であって、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されているが、同じ鎖上で２つのドメイン間の対合形成を可能にするには短すぎるリンカーが使用されており、これにより該ドメインが強制的に別の鎖の相補的なドメインと対合形成され、２つの抗原結合部位が作出されているものである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）；およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３（１９９４）参照）。
抗体およびこの抗原反応性断片はさまざまな用途を有する。一態様において、抗体（またはこの断片）は１種類以上の免疫診断用試薬として使用され得る。例えば、抗体は、試験試料中の被検物の存在を検出するための１種類以上の方法における１種類以上の免疫診断用試薬として使用され得る。より具体的には、抗体（またはこの抗原反応性断片）は、試験試料中の被検物の存在を検出するためのアッセイにおける捕捉抗体または検出抗体として使用され得る。
以下の実施例は本開示を例示するために示している。本実施例はなんら請求項に記載の発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１］
現在市販されているＰＳＡアッセイのアッセイ範囲はおよそ０．１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでである（例えば、Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）Ｔｏｔａｌ ＰＳＡ Ａｓｓａｙ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）。１ステップアッセイ形式ではＰＳＡの高濃度側においてフック効果が観察され得る。本発明の実施例において、本発明者らは、ＰＳＡを検出するためのアッセイのダイナミックレンジを拡大するため、本明細書に記載のとおりに実施される１ステップアッセイ形式において０から４００，０００ｎｇ／ｍＬまでの被検物濃度のシグナル応答をモデル設計した。
条件のモデル設計のため、抗体１はタイプ１の微粒子上に最終抗体濃度１０ｎＭでコートし、ＰＳＡに対する解離定数は０．５ｎＭであった。抗体２はタイプ２の微粒子上にコートし、最終抗体濃度は１０ｎＭとし、ＰＳＡに対する解離定数は５０ｎＭである。コンジュゲート抗体濃度は１０ｎＭであり、このＰＳＡに対する解離定数は０．５ｎＭであった。各微粒子タイプに結合しているコンジュゲート抗体の量を、まず微粒子に結合している被検物の量を、標準的な結合方程式を用いて計算することにより求めた。次いで、コンジュゲート抗体に結合することが可能な微粒子上の被検物の割合を計算した。表１に各タイプの微粒子上で検出された被検物の量を示す。
Figure 2016510128
表１は、試験試料中の代表的な被検物（ここでは、ＰＳＡ）の濃度を測定するためのダイナミックレンジの拡大を示す実例としてのデータを示す。２列目の値がＰＳＡ濃度の測定に使用され得る。アッセイのダイナミックレンジは０．０５ｎｇ／ｍＬから４０９，６００ｎｇ／ｍＬまでであるのに対して、現在市販されているＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ＰＳＡアッセイ範囲は０．１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでである。
表１および図７は、試験試料中の代表的な被検物（ここでは、ＰＳＡ）の濃度を測定するためのダイナミックレンジの拡大を示す実例としてのデータを示す。タイプ１の微粒子からのシグナルは４００ｎｇ／ｍＬの被検物濃度で最大強度に達し、高被検物濃度側で減少する。従って、各シグナル値は２つの被検物濃度に対応している。この強度プロットを較正曲線として使用する場合、試験試料の濃度を測定することは不可能である。しかしながら、タイプ２の微粒子とタイプ１の微粒子のシグナル比は被検物濃度の関数として単調に増大している。従って、これらの比のうちの１つがフラグまたは指標として使用され得る。例えば、タイプ１の微粒子から最大シグナルのときシグナル比は０．０６５である。従って、０．０６５のシグナル比がフラグ値となる。試験試料でシグナル比が０．０６５未満であるならば、タイプ１の微粒子のシグナルプロットの上昇部分を較正に使用し（図７において特定）；シグナル比が０．０６５より大きいならば、タイプ１の微粒子のシグナルプロットの下降部分を較正に使用する。このモデルにより、アッセイのダイナミックレンジが、これほど高くないにしても４０９，６００ｎｇ／ｍＬまで拡大され得ることが確認される。これは、高親和性抗体と低親和性抗体をアッセイに含め、較正曲線のどのセクションを較正に使用するかを選択するためのフラグ値としてシグナル比を使用することにより行われる。また、フラグ値を、タイプ１の曲線からの結果が試料中の高濃度のＰＳＡによって引き起こされるフック効果による偽低値であるかどうかを調べるために使用することもできる。
［実施例２］
本明細書において、１ステップアッセイ形式で２種類の検出抗体を使用するサンドイッチアッセイの一例を示す。
このアッセイは、脳性ナトリウム利尿ペプチド（環状ペプチド；ＢＮＰ）の濃度を、サンドイッチアッセイにおいてペプチドを検出し得る親和性成熟抗体（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ；例えば、米国特許第７，９３９，０６９号明細書（これに関するこの教示は参照により組み込まれる。）に記載のようにして作製される。）を用いて測定するために設計した。
アッセイは１ステップサンドイッチ形式で行う。捕捉抗体を５ミクロンのＰｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂ（Ｃｈｕｒｃｈ Ｓｔｒｅｔｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）粒子上にコートした。１つは高親和性、１つは低親和性の２種類の抗体を、それぞれＣｙ３およびＦＩＴＣ蛍光色素で標識した。高親和性抗体（Ａｂ１−Ｃｙ３）はＢＮＰに対して０．３ｎＭのＫＤを有する。低親和性抗体（Ａｂ２−ＦＩＴＣ）はＢＮＰに対して２０ｎＭより大きいＫＤを有する。
２５０ｎＭから２ｐＭまでの範囲の濃度の１００μＬの被検物を逐次、５μＬの１００ｎＭ Ａｂ１−Ｃｙ３、２μＬの０．１％微粒子および１０μＬの４００ｎＭ Ａｂ２−ＦＩＴＣと混合した。１時間のインキュベーション後、微粒子を洗浄し、顕微鏡でイメージングした。Ａｂ１−Ｃｙ３によって検出された被検物をＣｙ３チャネル内で測定し、Ａｂ２−ＦＩＴＣによって検出された被検物をＦＩＴＣチャネル内で測定した。
図８ａは、Ｃｙ３およびＦＩＴＣチャネル内で独立して測定した２ｐＭから２５０ｎＭまでのペプチドのシグナルプロットを示す。両方のチャネルでのデータを使用してフック効果を観察した。図８ｂは、ペプチド濃度の関数としてのＦＩＴＣチャネルとＣｙ３チャネルの比のプロットを示す；比は被検物濃度とともに単調に増大している。最大Ｃｙ３シグナルにおいてシグナル比は０．０７であり、これがフラグ値として使用される。試験シグナルのシグナル比が０．０７より高いならば、図８ａの特定される領域の較正プロットが濃度測定のために使用される。
本明細書において言及した特許、特許出願公開公報、雑誌の論文、教本および他の刊行物はすべて、本開示が関連する技術分野の技術水準を示すものである。
共同所有の係属中の出願である米国特許非仮出願第１３／８３３，３６５号明細書（発明の名称「内部較正を伴うアッセイ」，２０１３年３月１５日出願）は参照により、単独の内部較正標準を有するアッセイのためのキットおよび方法に関するこの教示の全体が明示的に組み込まれる。
かかる刊行物はすべて、参照により、個々の各刊行物があたかも具体的に個々に示されて参照により組み込まれているのと同程度に本明細書に組み込まれる。
本明細書において実例として示した本発明は、具体的に本明細書に開示していない要素（１つもしくは複数）または限定（１つもしくは複数）（あれば）なしでも適切に実施される場合があり得る。従って、例えば、本明細書の各場合における用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。同様に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈にそうでないことを明示していない限り、複数の指示対象物を包含している。従って、例えば、「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ（方法）」に対する言及は、この型の本明細書に記載の、および／または本開示を読むと当業者に自明になる１つ以上の方法および／または工程を包含している。
使用した用語および表現は、説明用語として用いており、限定用語として用いているのではない。これに関して、ある用語が「定義」で定義されており、［発明を実施するための形態］において別段に定義、説明または論考されている場合、かかる定義、説明および論考はすべて、かかる用語に帰属していることを意図する。また、かかる用語および表現の使用において、図示および説明した任意の等価な特長またはこの一部分を排除する意図はない。さらに、小見出し、例えば「定義」を［発明を実施するための形態］において使用しているが、かかる使用は、単に参照し易くしたものであり、なんら、あるセクションでなされた開示をこのセクションのみに限定することを意図するものではない；そうではなく、ある小見出しでなされた開示はいずれも、他の１つ１つの小見出しでの開示を構成していることを意図する。
請求項に記載の発明の範囲内で種々の修正が可能であることは認識されよう。従って、本発明を好ましい実施形態およびオプションの特長との関連において具体的に開示したが、当業者により本明細書に開示した概念の修正および変形がなされ得ることを理解されたい。かかる修正および変形は添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含まれるとみなす。

Claims (75)

  1. ｉ）第１の標識を含む第１の被検物結合性分子；
    ｉｉ）第２の標識を含む第２の被検物結合性分子、ここで、当該第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きい、および
    ｉｉｉ）固相支持体に結合した第３の被検物結合性分子、ここで、当該第３の被検物結合性分子は当該被検物に、当該第１の被検物結合性分子または当該第２の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、
    を備えたキット。
  2. 当該第１の被検物結合性分子、当該第２の被検物結合性分子および／または当該第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が、抗体またはこの断片である、請求項１に記載のキット。
  3. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子が、当該標識と直接結合している、請求項１から２のいずれか一項に記載のキット。
  4. 当該固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項３に記載のキット。
  5. 当該固相支持体が、空間的に隔てられた２つ以上の電極を含む、請求項４に記載のキット。
  6. 当該固相支持体が、微粒子を含む、請求項４に記載のキット。
  7. 当該第１の標識および当該第２の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のキット。
  8. 当該第１の標識と当該第２の標識が異なっている、請求項１から７のいずれか一項に記載のキット。
  9. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、約５倍から約１００倍の範囲である、請求項１から８のいずれか一項に記載のキット。
  10. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも約１００倍である、請求項１から８のいずれか一項に記載のキット。
  11. １ステップサンドイッチアッセイに使用され得る、請求項１から１０のいずれか一項に記載のキット。
  12. アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、
    ａ）被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第１の標識を含む第１の被検物結合性分子、第２の標識を含む第２の被検物結合性分子および固相支持体に結合した第３の被検物結合性分子とを：
    当該被検物に、
    （ｉ）当該第１の被検物結合性分子および当該第３の被検物結合性分子、ならびに
    （ｉｉ）当該第２の被検物結合性分子および当該第３の被検物結合性分子、
    を、結合させる条件下で接触させる工程、ここで、当該第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子は、同時に当該被検物に結合しない；
    ｂ）被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度および被検物に結合している当該第２の被検物結合性分子の当該第２の標識のシグナル強度を測定する工程；ならびに
    ｃ）当該第１の標識と当該第２の標識の当該シグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
    を含む、前記方法。
  13. 当該第１の被検物結合性分子、当該第２の被検物結合性分子および／または当該第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が抗体またはこの断片である、請求項１２に記載の方法。
  14. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子が当該標識と直接結合している、請求項１２から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 当該固相支持体が、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 当該第１の標識および当該第２の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子を、同じ反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子を、異なる反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 当該第１の標識と当該第２の標識が同じである、請求項１８に記載の方法。
  20. 当該第１の標識と当該第２の標識が異なっている、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が約５倍から約１００倍の範囲である、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が少なくとも約１００倍である、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. アッセイのダイナミックレンジが３桁以上を含む、請求項１２から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子が、約１００倍未満までの異なる所定のモル量で存在する、請求項１２から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子が、オリゴマー化または架橋されていない、請求項１２から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度および被検物に結合している当該第２の被検物結合性分子の当該第２の標識のシグナル強度を測定する工程ｂ）が、所定の被検物濃度範囲での較正試験において行われ、さらに：
    ｄ）較正試験において、被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度と被検物に結合している当該第２の被検物結合性分子の当該第２の標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることにより、フラグ値を設定する工程
    を含む、請求項１２から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 試験試料中の被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している当該第２の被検物結合性分子の当該第２の標識のシグナル強度の比が：
    フラグ値以上であるならば、被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる；または
    フラグ値未満ならば、被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
    請求項２６に記載の方法。
  28. 試験試料中の被検物に結合している当該第２の被検物結合性分子の当該第２の標識のシグナル強度に対する被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度の比が：
    フラグ値以下であるならば、被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる；または
    フラグ値を超えているならば、被検物に結合している当該第１の被検物結合性分子の当該第１の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
    請求項２６に記載の方法。
  29. 自動化または半自動化システムを用いて行われる、請求項１２から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. アッセイが１ステップアッセイである、請求項１２から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. ｉ）第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子；
    ｉｉ）第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子、ここで、当該第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きい；および
    ｉｉｉ）標識を含む第３の被検物結合性分子、ここで、当該第３の被検物結合性分子は当該被検物に、当該第１の被検物結合性分子または当該第２の被検物結合性分子のいずれかと同時に結合し得る、
    を備えたキット。
  32. 当該第１の被検物結合性分子、当該第２の被検物結合性分子および／または当該第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が抗体またはこの断片である、請求項３１に記載のキット。
  33. 当該第３の被検物結合性分子が当該標識と直接結合している、請求項３１から３２のいずれか一項に記載のキット。
  34. 当該標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のキット。
  35. 当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項３１から３４のいずれか一項に記載のキット。
  36. 当該第１の固相支持体が、第１の発色団を含む微粒子またはビーズであり、当該第２の固相支持体が、第２の発色団を含む微粒子またはビーズである、請求項３１から３５のいずれか一項に記載のキット。
  37. 当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体が、形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である、請求項３１から３５のいずれか一項に記載のキット。
  38. 当該第１の固相支持体が第１の電極であり、当該第２の固相支持体が第２の電極であり、ここで、当該第１の電極と当該第２の電極が空間的に隔てられている、請求項３１から３５のいずれか一項に記載のキット。
  39. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、約５倍から約１００倍の範囲である、請求項３１から３８のいずれか一項に記載のキット。
  40. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも約１００倍である、請求項３１から３８のいずれか一項に記載のキット。
  41. １ステップまたは２ステップのいずれかのサンドイッチアッセイのために使用され得る、請求項３１から４０のいずれか一項に記載のキット。
  42. アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、
    ａ）被検物を含んでいることが疑われる試験試料と、第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子、第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子および標識を含む第３の被検物結合性分子とを：
    （ｉ）当該第１の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第１の固相支持体に、当該第３の被検物結合性分子を；および
    （ｉｉ）当該第２の被検物結合性分子に結合している被検物を介して、当該第２の固相支持体に、当該第３の被検物結合性分子を、
    結合させる条件下で接触させる工程；
    ここで、当該第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子は、同時に当該被検物に結合しない；
    ｂ）当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体に結合している当該第３の被検物結合性分子の当該標識からのシグナル強度を測定する工程；ならびに
    ｃ）当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体に結合している当該第３の被検物結合性分子の当該標識からのシグナル強度を比較することにより被検物の濃度を求める工程
    を含む、前記方法。
  43. 当該第１の被検物結合性分子、当該第２の被検物結合性分子および／または当該第３の被検物結合性分子のうちの１つ以上が、抗体またはこの断片である、請求項４２に記載の方法。
  44. 当該第３の被検物結合性分子が、当該標識と直接結合している、請求項４２から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 当該第１の標識および当該第２の標識の一方または両方が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子を、同じ反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 当該第１の固相支持体が、第１の発色団を含む微粒子またはビーズであり、当該第２の固相支持体が、第２の発色団を含む微粒子またはビーズである、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体が、形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である、請求項４２から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 当該第１の固相支持体が第１の電極であり、当該第２の固相支持体が第２の電極であり、ここで、当該第１の電極と当該第２の電極が空間的に隔てられている、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
  51. 当該第１の電極および当該第２の電極が、携帯型ポイントオブケアデバイスに収容されている、請求項５０に記載の方法。
  52. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子を、異なる反応混合物中で試験試料と接触させる、請求項４２から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、約５倍から約１００倍の範囲である、請求項４２から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも約１００倍である、請求項４２から５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. イムノアッセイのダイナミックレンジが３桁以上を含む、請求項４２から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子を、約１００倍未満までの異なる所定のモル量で存在する、請求項４２から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子が、オリゴマー化または架橋されていない、請求項４２から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度、および被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度を測定する工程ｂ）が、所定の被検物濃度範囲での較正試験において行われ、さらに：
    ｄ）較正試験において、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識の最大シグナル強度をもたらす被検物濃度またはこの付近の濃度における、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度と、被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の比またはこの比の逆を求めることによりフラグ値を設定する工程
    を含む、請求項４２から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度に対する被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の比が：
    フラグ値以上であるならば、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められ、または
    フラグ値未満ならば、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
    請求項５８に記載の方法。
  60. 被検物と第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度に対する被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の比が：
    フラグ値以下であるならば、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる；または
    フラグ値を超えているならば、被検物と第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子とに結合している当該標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、
    請求項５８に記載の方法。
  61. 前記試験試料、当該第１の固相支持体に結合した前記第１の被検物結合性分子および当該第２の固相支持体に結合した前記第２の被検物結合性分子に、標識を含む前記第３の被検物結合性分子を接触させる前に、前記第１または前記第２の固相支持体に結合していない被検物を洗浄することにより除去する、請求項４２から５７のいずれか一項に記載の方法。
  62. さらに、被検物に結合している第１の被検物結合性タンパク質の第１の標識のシグナル強度の横ばい値（プラトー）またはこの付近に、フラグ値を設定する工程を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 試験試料中の被検物に結合している当該第１の被検物結合性タンパク質の当該第１の標識のシグナル強度がフラグ値以上ならば、被検物に結合している当該第２の被検物結合性分子の当該第２の標識のシグナル強度の較正曲線の上昇部分を用いて被検物濃度が求められる、請求項６２に記載の方法。
  64. 自動化または半自動化システムを用いて行われる、請求項４２から６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. ｉ）第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子；
    ｉｉ）第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子、ここで、当該第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きい；および
    ｉｉｉ）標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、ここで、前記トレーサーは、当該第１の被検物結合性分子または当該第２の被検物結合性分子のいずれかとの結合に関して、前記被検物と競合し得る、
    を備えたキット。
  66. 当該第１の被検物結合性分子および／または当該第２の被検物結合性分子の１つ以上が、抗体またはこの断片である、請求項６５に記載のキット。
  67. 標識が、酵素、発色団およびフルオロフォアからなる群より選択される、請求項６５から６６のいずれか一項に記載のキット。
  68. 当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体が独立して、粒子、微粒子、ビーズ、電極およびマルチウェルプレートからなる群より選択される、請求項６５から６７のいずれか一項に記載のキット。
  69. 当該第１の固相支持体が、第１の発色団を含む微粒子またはビーズであり、当該第２の固相支持体が、第２の発色団を含む微粒子またはビーズである、請求項６５から６７のいずれか一項に記載のキット。
  70. 当該第１の固相支持体および当該第２の固相支持体が、形状またはサイズのいずれかが異なる微粒子である、請求項６５から６７のいずれか一項に記載のキット。
  71. 当該第１の固相支持体が第１の電極であり、当該第２の固相支持体が第２の電極であり、ここで、当該第１の電極と当該第２の電極が空間的に隔てられている、請求項６５から６７のいずれか一項に記載のキット。
  72. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、約５倍から約１００倍の範囲である、請求項６５から７１のいずれか一項に記載のキット。
  73. 当該第１の被検物結合性分子と当該第２の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性の差が、少なくとも約１００倍である、請求項６５から７１のいずれか一項に記載のキット。
  74. アッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、
    ａ）被検物を含んでいることが疑われる試験試料を、標識が結合した前記被検物またはこの断片を含むトレーサー、第１の固相支持体に結合した第１の被検物結合性分子、第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性分子と接触させること、ここで、当該第１の被検物結合性分子の被検物に対する結合親和性は当該第２の被検物結合性分子の結合親和性より大きく、当該第１の被検物結合性分子および当該第２の被検物結合性分子は、同時に当該被検物に結合しない；
    ｂ）当該第１の固相支持体上の当該第１の被検物結合性分子および当該第２の固相支持体上の当該第２の被検物結合性分子に結合しているトレーサーからのシグナル強度を測定すること；ならびに
    ｃ）当該第１の固相支持体に結合した当該第１の被検物結合性タンパク質に結合している当該トレーサーのシグナル強度の横ばい値（プラトー）またはこの付近にフラグ値を設定すること
    を含む、前記方法。
  75. 当該第１の固相支持体に結合した当該第１の被検物結合性タンパク質に結合している当該トレーサーのシグナル強度がフラグ値以下であるならば、当該第２の固相支持体に結合した第２の被検物結合性タンパク質に結合している当該トレーサーのシグナル強度の較正曲線の下降部分を用いて被検物濃度が求められる、請求項７４に記載の方法。
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