JP6223771B2 - 抗ｋｉｒ抗体、製剤、およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、特定のキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に対する新規の抗体と、これらおよび／または他の治療用抗ＫＩＲ抗体のための製剤、投与量、および投与スケジュールと、その製造および使用方法とに関する。

ＫＩＲは、ＮＫ細胞およびいくつかのＴ細胞を含むリンパ球の特定のサブセットに存在する多型１の膜貫通分子である。ＫＩＲは、ＭＨＣクラスＩ分子のα１および２ドメイン内の決定因子と相互作用をする。ＡＭＬの患者において、ハプロタイプ一致幹細胞移植（ＳＣＴ）は、ＫＩＲ−ＨＬＡクラスＩ不適正ＮＫ細胞の増殖および活性化を引き起こし、その結果、白血病の再発率を低下させ、移植片対宿主病を起こさず、そして生存率を著しく改善することができる（非特許文献１）。ハプロタイプ一致ＳＣＴの臨床効果のための分子基盤は、ＮＫ細胞媒介性の腫瘍の死滅が阻害性ＫＩＲ受容体によって調節されることである。これらのＮＫ細胞受容体は、その特異的ＨＬＡ−Ｂまたは−Ｃリガンドとの結合の際に、ＮＫ細胞媒介性の腫瘍の死滅を阻害する負のシグナルを伝達する。ＨＬＡ−Ｂおよび−Ｃ分子は集団内で非常に多形性であり、別個のＨＬＡアロタイプはＫＩＲ２ＤＬ１またはＫＩＲ２ＤＬ２／３のいずれかによって認識されるので、多くの場合ＫＩＲおよびＨＬＡが不適正である（すなわち、ドナーのＫＩＲがレシピエントのＨＬＡリガンドに結合しない）ドナーおよびレシピエントを見出すことが可能である。このような状況では、ＨＬＡリガンドと結合できないＫＩＲによる阻害性シグナルの伝達は起こらず、ＮＫ細胞の活性化が促進される。しかしながら、このＳＣＴプロトコルは、全ての患者が利用できるとは限らず、例えば高齢のＡＭＬ患者の大部分は利用することができない。

薬理学的アプローチによって同様のＮＫ媒介性の抗白血病活性を達成するために、阻害性ＫＩＲシグナル伝達を遮断することができるヒト化または完全ヒト抗ＫＩＲ抗体を使用することができる。有利な薬理学的特性を有し、例えば癌または感染症の治療において有用である抗ＫＩＲ抗体は、特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４に記載されている。しかしながら、このような抗体の臨床用途のためには、最適化された製剤および有効な投与計画が必要とされる。

国際公開第２００６００３１７９号パンフレット 国際公開第２００６０７２６２６号パンフレット 国際公開第２００５００３１７２号パンフレット 国際公開第２００５００３１６８号パンフレット

ルジェリ（Ｒｕｇｇｅｒｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２年、２９５、２０２９−３１頁

本明細書において記載される本発明は、癌および他の障害または疾患の治療において有用な生理学的効果を促進する際の使用に適した抗ＫＩＲ抗体のための製剤および投与計画に関する。

本発明は、投与したときにインビボでＮＫ細胞活性を調節する抗ＫＩＲ抗体の組成物を提供する。特定の投与計画で使用されると、これらの組成物はＮＫ細胞におけるＫＩＲ受容体の効率的な占有をもたらし、例えば、癌およびウィルス性疾患の治療において有用である。

また、抗ＫＩＲ抗体１−７Ｆ９のＳ２４１Ｐ変異形（国際公開第２００６００３１７９号パンフレットにおいて記載される）と、この変異形および／または１−７Ｆ９と共に使用することができる新規の医薬品製剤と、その製造方法と、癌およびウィルス性疾患の治療などにおいて生理学的効果を促進するためのこれらの組成物の使用方法とが提供される。

抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のＳ２４１Ｐ変異形をコードする変異重鎖のアミノ酸配列（配列番号１）を示しており、変異したプロリン残基は太字である。 抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のｐＨ溶解度試験の結果を示す。 種々の賦形剤に関連する沈殿分析の結果を示す。 タンパク質Ａを用い、ＰＢＳ緩衝液中に脱塩することによる抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）Ｓ２４１Ｐ変異体の精製からのクロマトグラムを示す。タンパク質Ａから溶出した材料（ピークスタート（保持（「Ｒ．」）容積−１４ｍＬ）およびピークエンド（Ｒ．容積−１２ｍＬ）で注釈が付けられている）は、脱塩カラムに注入する前にループ内に貯蔵した。脱塩の後に画分を収集し、Ａ２およびＡ３の注釈を付けた画分を貯蔵して、さらなる分析のために使用した。 ハイブリドーマ細胞において発現される抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）（Ａ）およびＣＨＯＫ１細胞において発現される抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）（Ｂ）の分析からの電気泳動図および積分表を示す。 上記と同様である。 野生型Ｂ６マウスおよび遺伝子導入ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスの抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）についての集団の薬物動態モデルの概略図を示しており、飽和性の末梢結合部位を含む。 Ｂ６マウスにおける平均実測値と比較した平均予測ＰＫプロファイルを示す。モデル予測は、Ｂ６／ＫＩＲ−ｔｇＩＩを組み合わせたＰＫモデルに基づく。 ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスについての平均実測値と比較した平均予測ＰＫプロファイルを示す。モデル予測は、Ｂ６／ＫＩＲ−ｔｇＩＩを組み合わせたＰＫモデルに基づく。 ＫＩＲ−ｔｇＩマウスにおける平均実測値と比較した平均予測ＰＫプロファイルを示す。 ヒトのＰＫ予測およびカニクイザルにおけるＰＫの推定に適用される２コンパートメント薬物動態モデルの概略図を示す。 ３７℃でＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスからのＮＫ細胞およびヒトＮＫ細胞に結合する抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のインビトロ滴定による平行濃度対占有率曲線を示す。ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスからの脾細胞およびヒトドナーからのＰＢＭＣまたはＮＫ細胞、ならびにＫＩＲ２ＤＬ１を発現するＹＴＳ細胞株を、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の濃度の増大と共にインキュベートし、次にフローサイトメトリーによって分析した。 ＡＭＬ患者の抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）血漿濃度を投与後の時間に対して示す。 ヒトにおける、投与の２時間後のＫＩＲ占有率と、１−７Ｆ９の血清濃度との間の関係を示す。定量限界（ＬＯＱ）より低い血漿濃度は、１／２ＬＯＱ（２．５ｎｇ／ｍｌ）でプロットした。実線は実際のデータに一致していないが、１価の飽和等温線（ｉｓｏｔｅｒｍ）と一致し、Ｋｄ＝４ｎｇ／ｍｌである（式１０）。 ヒトにおける、投与の２４時間後から６週間後までの時点のＫＩＲ占有率と、１−７Ｆ９の血清濃度との間の関係を示す。定量限界（ＬＯＱ）より低い値は、１／２ＬＯＱ（２．５ｎｇ／ｍｌ）でプロットした。実線は実際のデータに一致していないが、１価の飽和等温線（ｉｓｏｔｅｒｍ）と一致し、Ｋｄ＝２０ｎｇ／ｍｌである（式１０）。点線は、Ｋｄ＝９ｎｇ／ｍｌを示す（２４時間についての予測）。 抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）を投与した後の患者の血液中のＮＫ細胞およびＴ細胞におけるＣＤ１０７ａのレベルを示しており、ＣＤ１０７ａレベルは、投与の２４時間後にＮＫ細胞において増大した。

上記のように、本発明は、ＮＫ細胞の活性化に適した組成物、製剤、投与量、および投与計画、ならびに抗ＫＩＲ抗体の治療用途、そして癌またはウィルス性疾患の治療における使用のための説明書と共に１つまたは複数の抗ＫＩＲ抗体を含むキットを提供する。

１つの態様では、本発明は、表１に記載されるような典型的な用量−投与計画（または投与頻度）の組み合わせを特徴とする抗ＫＩＲ抗体の投与計画を提供する。

表１に記載される特定の値はおおよその値であると理解すべきである。例えば、表１のそれぞれの用量−投与計画に対して、より高い用量を同じ投与頻度で投与することによって、あるいは同じ用量をより高い投与頻度で投与することによって、効率的なＮＫ細胞の調節を達成することもできる。

提供される投与計画は、実施例に記載されるように、ＰＫ／ＰＤモデリングと、抗ＫＩＲ抗体１−７Ｆ９における臨床試験からのデータとの組み合わせにある程度基づく。理論に拘束されないが、表１の投与計画は、抗ＫＩＲ抗体をヒト患者に投与した後に血液中のＮＫ細胞において少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のように高いＫＩＲ占有レベルを達成することによって、効率的なＮＫ細胞の調節をもたらす。同様に高い占有レベルを得るために適切な特性を有する他の抗ＫＩＲ抗体も、本明細書において記載されるように本発明に従う投与計画において使用することができる。

ＫＩＲおよびＨＬＡ不適正のドナーおよびレシピエント間のハプロタイプ一致ＳＣＴの臨床設定では、移植後約３ヶ月までの間、患者の循環血中にドナー由来ＮＫ細胞を検出することが可能であるが、それでもやはり、ＮＫ細胞はそれよりもかなり長く（しかし、血液中におけるその同定を不可能にする量で）存続することが可能である。全ての個体はＮＫ細胞上にクローン的に分布した種々のＫＩＲのレパートリーを発現し、ハプロタイプ一致ＳＣＴ設定でも、ドナー由来のＮＫ細胞のサブセットだけがレシピエントのＨＬＡに結合することができない特定のＫＩＲを発現し得ることに注意すべきである。従って、ＮＫ細胞のサブセットにおいて少なくとも３ヶ月間、特定のＫＩＲのサブセットを介するシグナル伝達が完全に欠如すれば、著しい臨床的利益を達成するために十分である。

これらの前提に基づいて、中和抗ＫＩＲ抗体の治療的に有効な投与スケジュールは、少なくとも約３ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、十分に高い（例えば、完全またはほぼ完全な）ＫＩＲ受容体の遮断をもたらすものである。しかしながら、これまで、ヒト患者において十分に高い遮断が達成され得るかどうか、あるいはこのような遮断を達成するためにどんな用量の抗ＫＩＲ抗体が必要とされるかは知られていない。意外にも、本明細書に記載されるように、低用量の抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は、（ｉｉ）ＮＫ細胞媒介性のインビボの腫瘍細胞の死滅を検出可能な程度に活性化するため、そして（ｉ）患者においてほぼ完全な受容体の遮断を達成するために十分であった。全長ヒトまたはヒト化抗体は通常、血液中で長い半減期を有するが、数ヶ月間、完全またはほぼ完全なＫＩＲ占有を達成するために、いくつかの規定間隔で繰り返し投与することが必要である。ＰＫ／ＰＤモデリングおよびヒトの臨床データの組み合わせから、どんな投与計画が連続的なＫＩＲ遮断を達成できるかがここで明らかになった（表１および実施例１２を参照）。

別の態様では、本発明は、１−７Ｆ９、１−７Ｆ９（Ｓ２４１Ｐ）、または同様のＩｇＧ４抗体、特に同様の抗ＫＩＲ ＩｇＧ４抗体および／または交差反応性の抗ＫＩＲ抗体のために適切な製剤を提供する。本明細書において記載される製剤は、（ａ）低レベルの抗体分子の沈殿（適切な溶解度および低レベルの粒子形成）、（ｂ）許容レベルの抗体分子の安定性（単量体構造および二次構造要素の維持に関して）、そして（ｃ）低レベルの凝集形成を含む、有利な薬理学的特性に関連していることが確定されている。

抗ＫＩＲ抗体
本発明において有用な抗ＫＩＲ抗体は、通常はＫＩＲシグナル伝達を低下させることによって、ＮＫ細胞調節性（すなわち、ＮＫ細胞活性の調節において有効）である。これは、ＨＬＡリガンドのＫＩＲ分子への結合を遮断する抗体、または抗体の非競合的な拮抗メカニズムのいずれかによって達成することができる（国際公開第２００６０７２６２６号パンフレットを参照）。例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３などの、１つまたは複数の阻害性ＫＩＲのシグナル伝達を低下または遮断する抗ＫＩＲ抗体（本明細書では「中和抗ＫＩＲ抗体」と呼ばれる）の場合、高いＫＩＲ占有率はＮＫ細胞活性の増強をもたらす。また、適切な抗ＫＩＲ抗体は、単一特異性（すなわち、単一の型のＫＩＲ分子に結合する）であってもよいし、多選択性（すなわち、複数のＫＩＲ分子に結合する）であってもよい。少なくとも、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３の全てに結合する抗ＫＩＲ抗体は、本明細書では、「交差反応性抗体」と呼ばれる。本発明に従う用途に有用な典型的な抗体には、国際公開第２００６００３１７９号パンフレットおよび国際公開第２００６０７２６２６号パンフレットに記載される抗体が含まれる。例えば、中和および交差反応性の抗ＫＩＲ抗体１−７Ｆ９（「抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）」、「１−７Ｆ９」、および「抗ＫＩＲ」とも呼ばれる）は、阻害性ＫＩＲ２ＤＬ受容体、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３と、そのＨＬＡ−Ｃリガンドとの相互作用を遮断し、それによって、ＮＫ細胞の細胞障害活性を高める。実施例１３および１４に記載されるように、単一の低用量の１−７Ｆ９でさえ、ＡＭＬまたは多発性骨髄腫を患っている患者で行われた用量増大（ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）試験においてこれまで試験したほとんどの患者において腫瘍マーカーを低減することができた。抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の可変軽鎖および重鎖配列は、それぞれ配列番号２および配列番号３で示される。

しかしながら、本発明は、抗ＫＩＲ ＩｇＧ４抗体１−７Ｆ９の新規の変異形も提供する。提供される変異形は、１−７Ｆ９可変重鎖配列と、ＥＵインデックスに従う位置２２８に相当する残基２４１のセリンのプロリンへの変異とを含むＩｇＧ４重鎖を含む（カバット（Ｋａｂａｔ）ら、「免疫学的に重要なたんぱく質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、ＮＩＨ、メリーランド州ベテスダ、１９９１）。また、本明細書において提供される配列番号１に従う重鎖を含むＩｇＧ４アイソタイプの１−７Ｆ９変異形も提供される。配列番号１をコードするヌクレオチド配列は配列番号６で示され、その相補配列は配列番号７で示される。変異形は、さらに、配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含むことができる。この変異形は、１−７Ｆ９（Ｓ２４１Ｐ）とも呼ばれる。通常、抗体の変異形は、ＣＨＯ細胞または別の適切な細胞型において組換えで発現される。実施例において示されるように、変異は、変異抗体が、１−７Ｆ９によって結合されるＫＩＲ抗原に結合する能力を妨げない。従って、１−７Ｆ９（Ｓ２４１Ｐ）抗体は、一般に、国際公開第２００６００３１７９号パンフレットにおいて抗体１−７Ｆ９が使用されると記載されている方法のいずれかで使用することができる。

１−７Ｆ９（Ｓ２４１Ｐ）変異形をコードする変異重鎖の配列は図１に示される。変異体は、変異重鎖および野生型軽鎖のトランスフェクションにおいてＣＨＯ細胞で発現された。当然ながら、このような抗体分子は任意の適切な方法（その例は国際公開第２００６００３１７９号パンフレットに記載されている）で産生することができるので、これらの方法は単なる例である。

中和および／または交差反応性の抗ＫＩＲ抗体を産生、同定、および特徴付けする（例えば、親和性（Ｋｄ））ための様々な方法、ならびにこのような抗体の組換え発現のための方法、そして他の関連技術は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２００６００３１７９号パンフレット、国際公開第２００６０７２６２６号パンフレット、国際公開第２００５００３１７２号パンフレット、および国際公開第２００５００３１６８号パンフレットに記載されており、これらは全て参照によってその全体が本明細書に援用される。

医薬品製剤
１つの態様では、本発明は、薬学的に許容可能な抗体製剤を提供する。当然ながら、１−７Ｆ９ ＩｇＧ４抗ＫＩＲ抗体または上記の１−７Ｆ９変異形ＩｇＧ４分子（例えば、「１−Ｆ７９ｖ」、「１−７Ｆ９ Ｓ２４１Ｐ」、または「Ｓ２４１Ｐ変異形」などと呼ばれることもある）の製剤で例示されるが、このような製剤の特性は、同様のＩｇＧ４抗体、特に同様の抗ＫＩＲ ＩｇＧ４抗体および／または交差反応性の抗ＫＩＲ抗体を含む製剤に適用することができる。例えば、国際公開第２００６００３１７９号パンフレットに記載されるヒト抗ＫＩＲ抗体、ならびにＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、ＥＢ６、またはＧＬ１８３などのマウス抗ＫＩＲ抗体のヒト化ＩｇＧ４変異形（Ｓ２４１Ｐ変異の有無にかかわらず）はどれも、本発明に従う製剤において同様に使用することができる。

また本発明は、変異形１−７Ｆ９抗体を含むこのような製剤または他の組成物も提供する。このような組成物は、約１５％未満、例えば、約１０％未満（例えば、約５％以下、約４％以下、約３％以下、またはさらに約１％以下）のＩｇＧ４「半抗体」（単一の重鎖／軽鎖対を含む）を有することを特徴とし得る。このようなＩｇＧ４「半抗体」副産物は、分泌されるヒトＩｇＧ４に応じて、ヒンジ領域における重鎖間ジスルフィドブリッジの不均一性に起因して生じる（ＩｇＧ４「半抗体」、Ｓ２４１Ｐ変異、および関連の原理の説明については、アンガル（Ａｎｇａｌ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３０（１）：１０５−１０８頁、１９９３年を参照）。この効果は通常、変性非還元（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件下でのみ検出可能である。１−７Ｆ９変異形において、Ｓ２４１Ｐ変異は、このような半抗体産物の形成を低減することができる。半抗体の形成の著しい低減は標準的な技法によって観察した。

１つの態様では、本発明は、（ａ）約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体と、（ｂ）約１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約１６０〜２５０ｍＭのスクロースまたは約１００ｍＭのＮａＣｌと、（ｄ）約７のｐＨのポリソルベート８０と、を含む薬学的に許容可能で活性な製剤を提供する。抗体は、通常、中和抗ＫＩＲ抗体であり、交差反応性であってもよい。別の実施形態では、抗体は、配列番号３または配列番号１に従う重鎖配列を含む。別の実施形態では、抗体はさらに、配列番号２に従う軽鎖配列を含む。このような製剤中のＩｇＧ４抗体分子の濃度は、例えば、約１〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌなど）でよい。特定の実施形態では、リン酸ナトリウムは約２０から約５０ｍＭまで変わり、スクロースは約２２０から約２５０ｍＭまで変わり、そしてポリソルベートは、例えば、約０．００１％でよい。別の特定の実施形態では、リン酸ナトリウム濃度は約２０ｍＭであり、スクロース濃度は約２２０ｍＭである。

別の例示的な態様では、本発明は、（ａ）配列番号３に従う可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約５０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２５０ｍＭのスクロースと、（ｄ）約７のｐＨの約０．００１％のポリソルベート８０とを含む薬学的に許容可能で活性な製剤を提供する。１つの実施形態では、重鎖は配列番号１の配列を含む。

さらに別の実例となる態様では、本発明は、（ａ）配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約５０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２５０ｍＭのスクロースまたは約１００ｍＭの塩化ナトリウムと、（ｄ）約０．００１％のポリソルベート８０とを含む薬学的に許容可能で活性な製剤を提供し、ここで製剤は約７のｐＨを有する。特定の態様では、抗体はＳ２４１Ｐ変異を有する１−Ｆ７９である。

１つの例示的な態様では、本発明は、（ａ）配列番号３に従う可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約２０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２２０ｍＭのスクロースと、（ｄ）約７のｐＨの約０．００１％のポリソルベート８０とを含む薬学的に許容可能で活性な製剤を提供する。１つの実施形態では、重鎖は配列番号１の配列を含む。

さらに別の実例となる態様では、本発明は、（ａ）配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約２０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２２０ｍＭのスクロースまたは約１００ｍＭの塩化ナトリウムと、（ｄ）約０．００１％のポリソルベート８０とを含む薬学的に許容可能で活性な製剤を提供し、ここで製剤は約７のｐＨを有する。特定の態様では、抗体はＳ２４１Ｐ変異を有する１−Ｆ７９である。

別の例示的な態様では、本発明は、（ａ）製剤中の抗体の濃度が約１０ｍｇ／ｍＬであるような量の、配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含むＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約８．４ｍｇ／ｍＬのリン酸水素ナトリウム（七水和物）と、（ｃ）約２．６ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウムと、（ｄ）約８５ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｅ）約０．０１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む成分の混合物から調製される薬学的に許容可能で活性な製剤を提供し、ここで製剤は約７のｐＨを有する。１つの態様では、抗体は配列番号１に従う重鎖を含む。別の態様では、抗体は１−Ｆ７９である。

追加の態様では、本発明は、上記の特徴を有する濃縮製剤から、患者へ注射するために適切な製剤を調製するための方法を提供し、約５℃からの温度で貯蔵された濃縮製剤を提供することと、製剤の成分（ｂ）〜（ｄ）を含む製剤で濃縮製剤を希釈して、希釈（すぐに注射／注入できる）生成物を生じさせることと、場合により、投与前の約２４時間までの間、約５℃からの温度で希釈生成物を貯蔵することとを含む。

さらに別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約５〜２０ｍＭのリン酸ナトリウム（例えば、約５ｍＭのリン酸ナトリウム、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１５ｍＭのリン酸ナトリウム、または約２０ｍＭのリン酸ナトリウム）と、（ｃ）約１８０〜約２５０ｍＭのスクロース（例えば、約１８０〜２４０ｍＭ、例えば約１９０〜２３０ｍＭ、例えば約２００〜２２５ｍＭ、例えば約２２０ｍＭなど）と、（ｄ）約０．００１または約０．０１〜０．１％のポリソルベート８０（例えば、約０．０２〜０１．％、０．０３〜０．１％、０．０５〜０．０９％、０．０５〜０．０８％など）とを含む薬学的に許容可能で活性な製剤を提供し、ここで製剤は約７のｐＨを有する。１つの態様では、製剤は、約３５ｍＭ未満（例えば、約２５ｍＭ未満）のリン酸ナトリウムを含む。より低いリン酸ナトリウム濃度は、特に、製剤の長期間の凍結貯蔵が所望される場合に望ましいことがある。別の態様では、製剤は、約０．００５％よりも多いポリソルベート８０を含む。特定の例示的な態様では、このような製剤に含有される抗体は１−Ｆ７９である。別の特定の実例となる態様では、このような製剤中の抗体は、配列番号１からなる、または配列番号１から本質的になる重鎖を有する。さらに別の態様では、抗体は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３と交差反応をする、別の抗ＫＩＲ ＩｇＧ４抗体など、または別の抗ＫＩＲ抗体などの別のＩｇＧ４抗体である。１つの態様では、製剤は、等張性であると特徴付けることができる。

さらなる態様として、本発明は、前段落に従う製剤の特徴を有する濃縮製剤から、患者へ注射するために適切な製剤を調製するための方法を提供し、約５℃からの温度で貯蔵された濃縮製剤を提供することと、製剤の成分（ｂ）〜（ｄ）を含む製剤または滅菌等張生理食塩水のいずれかで濃縮製剤を希釈して、希釈（すぐに注射／注入できる）生成物を生じさせることと、場合により、投与前の約２４時間までの間、約５℃からの温度で希釈生成物を貯蔵することとを含む。例えば、方法は、約５ｇ／Ｌのリン酸水素ナトリウム（二水和物）、約３ｇ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム（一水和物）、約８５ｇのスクロース、約０．０１ｇのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を含む成分の混合から調製される希釈剤中に、このような製剤を希釈することを含むことができ、これは、水酸化ナトリウム／塩化水素でｐＨ調整され、注射のために滅菌水の添加により所望の容積に設定される。

別の態様では、本発明は、通常上記の製剤中ではスクロースである代わりに、浸透圧調節剤として塩化ナトリウムを含む製剤を提供する。一般的に、塩化ナトリウムの濃度は約２０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、より一般的には約５０ｍＭ〜約２００ｍＭであり、例えば約７５ｍＭ〜約１７５ｍＭ（例えば、約９０〜１６０ｍＭ、約１００〜１５０ｍＭ）であろう。１つの態様では、このような製剤は、約１００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。

さらに別の実施形態では、本発明は、通常リン酸ナトリウムの代わりに、トリス（塩基）緩衝液が製剤中に取り込まれた製剤を提供する。任意の適切な濃度のトリス（塩基）を使用することができる。約１０〜１００ｍＭの濃度、例えば約１５〜８０ｍＭ、２０〜７５ｍＭ、または１０〜６０ｍＭ、またはさらに詳しくは、例えば約２５ｍＭなどの濃度が一般的である。

本発明の態様のいずれかに従う製剤は、任意の適切な濃度の抗体を有することができる。一般的に、濃度は約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ）である。１つの例示的な態様では、製剤は比較的濃縮された抗体製剤として提供され、例えば、約１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、投与（通常は静脈内投与または直接非経口注射による）の前に希釈される製剤でよい。別の例示的な態様では、製剤は、例えば、製剤中の抗体の濃度が約０．０５ｍｇ／ｍＬまたは約０．１ｍｇ／ｍＬでありすぐに注入／注射できる製剤のように、比較的希薄な製剤として提供される。別の態様では、製剤は、約１ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有する。

本発明に従う製剤の単位用量の容器は、任意の適切な容積で提供することができる。通常、製剤は、例えば約３ｍＬ〜約１５ｍＬの容積のように、約１ｍＬ〜約２０ｍＬの容積で提供される。一般に、製剤は、約５ｍＬ〜約１０ｍＬ（そして多くの場合、５ｍＬまたは１０ｍＬのいずれか）の容積である。容器は任意の適切なタイプの容器であり得る。容器は、予備の容積を有してもよい（例えば、容器は、５ｍＬの製剤を含有する６ｍＬのバイアルでよい）。特定の治療計画では、単位用量容器の容積を全て使用できるわけではない。容積は通常、製剤を不必要に無駄にすることなく、患者に提供される投与量の典型的な範囲を包含する量を提供するように選択される。

許容可能に低レベルの抗体分子の沈殿は、本発明との関連では、ＮａＣｌ、ポロキサマー界面活性剤、ＥＤＴＡ、ＨＳＡ、ＨＰ−ｂｅｔａＣＤ、ポリソルベート８０、ならびに／またはポリソルベート８０およびＮａＣｌの組み合わせなどの他の一般的な医薬品賦形剤を含むが他の点では実質的に同一の製剤で得られるよりも、製剤中の沈殿が検出可能な程度に（そして、著しくなければ、好ましくは実質的に）少ないことを意味する。沈殿物の評価方法は当該技術分野において知られており、例えば、標準技法を用いる目視検査（本明細書において例示される）を含むことができる。このようなＩｇＧ４抗体および約１８０〜５００ｍＭ（例えば、約１８０〜２８０ｍＭ）のスクロースの製剤は、特に約７または約７．０のｐＨの他の典型的な賦形剤と比較して（６．０以下のｐＨと比較して、より少ない程度の７．４のｐＨと比較して）、１−Ｆ７９または１−Ｆ７９ｖなどの抗ＫＩＲ抗体に関連して著しく低いレベルの沈殿物を提供できることが決定された。さらに、スクロースは、このような製剤に有利な浸透圧を提供することができる。

許容レベルの抗体分子の安定性（単量体構造および二次構造要素の維持に関して）は、本発明との関連では、例えば、３または８．５のｐＨにおける分子の安定性と比較して、抗体分子の単量体構造および二次構造要素を維持するために、組成物のｐＨが７に十分に接近して維持されることを意味する。

許容可能に低いレベルの凝集／沈殿物の形成は、製剤が、表示される量／濃度のポリソルベート８０およびリン酸ナトリウム（スクロースに加えて）によって得られるレベルの凝集／沈殿を含有することを意味する。例えば、様々な温度（例えば、約−２０℃〜約４０℃、例えば約５℃（例えば、２〜８℃）〜約２０℃など）で長期間（例えば、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月まで、またはそれよりも長い）の組成物のＩＥＦ、ＧＰ ＨＰＬＣ、およびＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によって決定され得るように、このような製剤は優れた安定性および低レベルの凝集に関連し、ヒスチジンおよびトリス製剤よりも少ない沈殿物も示すことが決定された。

上記のように、本発明の態様のいずれかに従う製剤は、これらの特徴の２つまたは３つ全てでなくても少なくとも１つを含むのが望ましい。

上記のことから、製剤のｐＨは重要な因子であることが分かる。特定のｐＨ範囲の限られた変動量は許容することができる（製剤の所望の安定特性および計画される貯蔵時間および変量に依存して）。一般に、少なくとも約６、そして約８未満（さらに一般的には約７．７、７．６、または７．５未満）のｐＨが使用される（例えば、６〜７．４の範囲、例えば６〜７．２、例えば６〜７、６．２〜７、６．４〜７、６．５〜７、６．７〜７など）。７〜７．４の範囲のｐＨを有する製剤（例えば、約７のｐＨを有する製剤など）は、適切な、あるいは時には有利な特性を有することも示されている。

本明細書に記載される態様のいずれかに従う製剤の安定性は、高分子量不純物（例えば、製剤中の抗体分子の凝集（多量体）を示唆する不純物）がないことに基づいて特徴付けることもができる。１つの態様では、本発明に従う製剤は、約５℃における少なくとも１日間、例えば少なくとも約１週間、例えば少なくとも約２週間、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、あるいはさらに少なくとも約３ヶ月間の貯蔵中に、約１０％未満（約５％以下など）の高分子量（ＨＭＷ）不純物含量を有すると特徴付けることができる。

さらに、本明細書に記載される態様のいずれかに従う製剤は、ＮＫ細胞活性の増強を必要としている患者においてＮＫ細胞活性を増強する方法において、本明細書で提供される投与計画のいずれかで有利に適用することができる。

本発明の態様のいずれかに従う製剤は、任意の適切な容積で注射または注入することができる。一般に（例えば、５０〜１００ｋｇの患者の場合）、希釈した（例えば、等張性の滅菌生理食塩水または「プラセボ」製剤／希釈剤（すなわち、抗体または他の活性剤をいずれも含まない製剤）のいずれかによる）最終製剤、または無希釈の最終製剤の約０．３〜３０ｍＬの溶液は、投与プロトコルにおいて、通常１ｍＬ〜３０ｍＬのシリンジによって（例えば、シリンジポンプを用いて）約１時間にわたって注射される。以下の典型的な投与計画チャート（特定の実施形態において、抗ＫＩＲ抗体は、Ｓ２４１Ｐ変異の有無にかかわらず抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）である）によって例示されるように、容積は当然ながら所望の投与量と共に変わり得る。

用量および投与計画
１つの態様では、本発明は、ＮＫ細胞活性の増強を必要としている患者においてＮＫ細胞活性を増強する方法を提供し、抗ＫＩＲ抗体を含む組成物を、約０．０００３ｍｇ（抗体）／ｋｇ（患者の体重）〜約３ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ（約０．０１５〜約３ｍｇ／ｋｇなど）、例えば、約０．０７５ｍｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、および約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇのいずれか、あるいは約０．０００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０７５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約３ｍｇ／ｋｇのいずれか）の投与量で患者に投与することを含む。１つの実施形態では、組成物は、前のセクションのいずれかにおいて記載される抗体製剤である。１つの実施形態では、方法は、例えば１日あたり３回〜２ヶ月間に１回の範囲の投与頻度で、投与を少なくとも１回繰り返すことを含む。また、用量は、例えば、少なくとも３回、少なくとも６回、または少なくとも１０回投与されてもよい。１つの実施形態では、抗体は静脈内に投与される。別の実施形態では、ＮＫ細胞の表面における抗体の阻害性ＫＩＲへの結合は、ＮＫ細胞の細胞障害活性を増強する。さらに別の実施形態では、抗体は交差反応性の抗ＫＩＲ抗体である。例えば、抗体は、抗体１−７Ｆ９の可変重領域配列（配列番号３）および可変軽領域配列（配列番号２）を含むことができる。それに加えてまたはその代わりに、抗体は、配列番号１の配列を含む重鎖を含んでもよい。通常、必ずではないが、患者は、最初の用量の約２４時間後に血液中のＮＫ細胞において増大したＣＤ１０７ａレベルを有する。

投与量範囲は、本明細書に記載されるように、一例として交差反応性の中和抗ＫＩＲ抗体１−７Ｆ９を用いて、薬物動態学的および薬力学的な（ＰＫ／ＰＤ）モデリングによって得た。ヒトＰＫは、ヒトＩｇＧ分子の典型的なＰＫ、１−７Ｆ９のサル試験から得られる推定ＰＫ、ならびにマウスとサルの間の相対成長スケーリング（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｌｉｎｇ）を評価することによって予測した。また用量は、ヒト患者において必ずしも飽和（９５％＜）ではないが検出可能な飽和度（＞２０％）を提供するように選択した（静脈内投与される０．０００３ｍｇ／ｋｇは、例えば、最大値の５０％までの過渡的な飽和度をもたらし、約０．００６μｇ／ｍＬの最大血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）に関連すると予測される）。これらのパラメータ（例えば、少なくとも約２０％、例えば少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の受容体飽和度、および／または約０．００５〜０．０１μｇ／ｍＬのＣ_ｍａｘを有する）は、同様にまたはその代わりに、投与計画のための決定的な特徴として使用することができる。方法は、通常、このようなＮＫ細胞の増強および／または抗腫瘍活性について患者を評価することを含む（任意の適切な技法の使用により実施することができ、これらの技法のいくつかは当該技術分野において知られており、本明細書において記載されるように、例えば、ＫＩＲ占有レベル、ＣＤ１０７ａマーカーなどを含む）。製剤は、通常、例えば約１時間などの適切な時間をかけて、静脈内投与によって投与される。

別の態様では、本発明は、患者（被験者）においてＫＩＲ２ＤＬ１、−２および−３および／または２ＤＳ１および−２による阻害に関連する疾患、状態、または障害を治療する方法を提供し、表１に記載される用量−投与計画のいずれかに従って抗ＫＩＲ抗体を含む組成物を患者に投与して、疾患、状態、または障害を治療することを含む。１つの実施形態では、組成物は上記の組成物または製剤のいずれか１つである。「治療」という用語は、本明細書では、症候または病状の発生を防止する目的、もしくは既に発生したこのような症候または病状を緩和、回復、根絶（治癒）させる目的で、このような製剤の有効量を送達することを指す。従って、「治療」という用語は、予防的治療を含むことを意味する。しかしながら、本発明の治療計画および予防計画が本発明の別々の独立した態様であると考えることも可能であることは理解されるであろう。従って、この用語が使用される場合はいつも、このような別々の予防的および対症的／治癒的用途への支持も提供すると理解されるべきである。

例えば、本発明は、患者において癌またはウィルス性疾患治療する方法を提供し、血漿中のＮＫ細胞において少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％のＫＩＲ占有率を少なくとも約３ヶ月間達成する用量および投与頻度で、抗ＫＩＲ抗体を投与することを含む。別の実施形態では、用量は、約０．０００３〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．００３〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１５〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０７５〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０７５〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．３〜約３ｍｇ／ｋｇ、および約１〜約３ｍｇ／ｋｇの範囲である。典型的な用量は、約０．０００３、約０．００３、約０．０１５、約０．０７５、約０．３、約１、および約３ｍｇ／ｋｇである。投与頻度は、１日１回〜２ヶ月間に１回、１週間に約１回〜２ヶ月間に約１回、または１か月に約１回の範囲でよい。あるいは、投与頻度は、１日に約３回、約２回、および約１回、１週間に約５回、約４回、約３回、および約２回、そして２、４、および６週間に約１回から選択することができる。他の別の実施形態では、約０．０７５〜約０．３ｍｇ／ｋｇの用量が１週間に約２回〜１ヶ月に約１回投与され、約０．３〜約１ｍｇ／ｋｇの用量が１ヶ月に約１回〜約２回投与され、約１〜約３ｍｇ／ｋｇの用量が１ヶ月に約１回〜２ヶ月間に約１回投与される。また、用量および投与頻度は、表１のものとして選択することができる。用量は、例えば、少なくとも３回、少なくとも６回、またはそれ以上投与することができる。例えば、方法は、ＮＫ細胞において少なくとも約９５％のＫＩＲ占有率を少なくとも約６ヶ月間達成する用量および投与頻度で、抗ＫＩＲ抗体を投与することを含んでもよい。抗体は通常静脈内に投与されるが、他の適切な投与様式が知られており、例えば、国際公開第２００６００３１７９号パンフレットにも記載されている。抗体は、好ましくは、例えば抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）またはそのＳ２４１Ｐ変異形などの中和および／または交差反応性の抗ＫＩＲ抗体である。

１つの態様では、上記の方法によって治療される患者は、癌と診断された患者である。さらに特定の態様では、患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断された患者である。別の特定の態様では、患者は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と診断された患者である。さらに別の特定の態様では、患者は、多発性骨髄腫（ＭＭｙ）と診断された患者である。さらに別の例示的な態様では、患者は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）と診断された患者である。別の実例となる態様では、上記方法の実施によって治療される患者は、結腸直腸癌と診断された患者である。さらに別の態様では、方法の実施によって治療される患者は、腎臓癌と診断された患者である。さらに別の態様では、患者は、卵巣癌と診断された患者である。別の実施形態では、患者は、肺癌と診断された患者である。さらに別の実施形態では、患者は、乳癌と診断された患者である。更なる実施形態では、患者は、悪性メラノーマと診断された患者である。さらに別の特定の実施形態では、上記の方法によって治療される患者は、ウィルス感染（例えば、ＨＩＶまたはＣ型肝炎による感染）などの感染症と診断された患者である。

患者に対する治療法の効果は、患者から採取した血液、血漿、尿などの生物サンプルにおいてＮＫ細胞活性化マーカーまたは腫瘍マーカーのレベルを評価することによって追跡され得る。例えば、実施例に示されるように、ほとんどの患者は、１−７Ｆ９の最初の用量（非常に低い用量にもかかわらず）の投与の２４時間後に採取した血液サンプル中のＮＫ細胞において増大したＣＤ１０７ａレベルを有する。特に、ＣＤ１０７ａのこの増大は、Ｔ細胞では検出されないであろう。本明細書に記載される臨床試験のために選択され、治療をモニターするために有用な特定の腫瘍マーカーとしては、例えば、ＡＭＬ患者の血液および／または骨髄中のウィルムス腫瘍遺伝子１転写物、ならびに尿中のＭ−タンパク質のレベルが挙げられる。さらに、様々な他の癌に対する抗腫瘍活性におけるＮＫ細胞の役割に基づいて、結腸直腸癌のＣＥＡ、胚細胞腫瘍のＡＦＰおよびＨＣＧ、絨毛性腫瘍のＨＣＧ、卵巣癌のＣＡ−１２５、乳癌のＣＡ １５−３、ＣＡ ２７．２９、およびエストロゲン受容体、前立腺癌のＰＳＡ、慢性リンパ性白血病のＣＤ５＋／ＣＤ２３＋細胞、ならびに白血病およびリンパ腫の細胞遺伝学的マーカーを含む、他の腫瘍マーカーのレベルの減少が、抗ＫＩＲ治療の影響を受けやすい悪性腫瘍において予期される。それに加えてまたはその代わりに、悪性疾患の抗ＫＩＲ療法の効力は、無癌生存、全生存、および／または無再発生存のような標準エンドポイントによって評価することができる（ＡＭＬ患者の第ＩＩＩ相試験の説明について、例えば、ブリューネ（Ｂｒｕｎｅ）ら（Ｂｌｏｏｄ．２００６年、１０８：８８−９６頁）を参照）。

ＮＫ細胞活性の調節および／もしくは癌、ウィルス性疾患または他の適切な疾患の治療のために、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）またはそのＳ２４１Ｐ変異形が好ましい抗体であるが、本発明に従う方法および用量−投与計画において他の抗ＫＩＲ抗体が使用されてもよい。しかしながら、このような抗ＫＩＲ抗体は、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）と同様のＫｄ値、患者における同様のクリアランス、および同様の分布容積を有さなければならない。ここで、「同様の」とは、対応する抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）パラメータの約５０％以内、好ましくは約３０％以内を意味する。抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は、約４ｎｇ／ｍｌの高親和性Ｋｄ、０．０１５ｍｇ／ｋｇまでの用量の場合は約２０ｎｇ／ｍｌの低親和性Ｋｄ、約０．５ｍｌ／ｈ／ｋｇのクリアランス、そして約１１５ｍｌ／ｋｇの分布容積を有する（実施例１１を参照）。本発明の１つまたは複数の方法において有用な典型的な抗ＫＩＲ抗体は、以下の特性：（ａ）ＮＫ細胞における阻害性ＫＩＲのシグナル伝達の低減または遮断と、（ｂ）約２〜約６ｎｇ／ｍｌの高親和性Ｋｄと、（ｃ）約１０〜約３０ｎｇ／ｍｌの低親和性Ｋｄと、（ｄ）約０．２５〜約０．７５ｍｌ／ｈ／ｋｇのクリアランスと、（ｅ）約５０ｍｌ／ｋｇ〜約１７５ｍｌ／ｋｇの分布容積と、（ｆ）場合により、複数のＫＩＲ（例えば、少なくとも、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３の全て）との結合とを有する。

別の態様では、上記の方法のいずれかは、さらに、国際公開第２００６００３１７９号パンフレットに記載されるような第２の抗癌剤（免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生薬、アポトーシス剤、阻害性ＫＩＲに結合する二次抗体、抗感染症薬、標的剤、および補助化合物、例えば抗ＣＤ２０抗体など）の投与によって補完され得る。本発明の変異抗体は、このような第２の薬剤を有効な投与量で有する製品または「キット」において提供されてもよい。本発明はさらに、変異抗体をコードする単離核酸、適切な宿主細胞におけるこのような核酸の発現によって抗体を産生する（そして、適切な方法によりそれから抗体産物を回収する）方法、このような核酸を含む宿主細胞、このような核酸を含むベクターを提供する。

以下の典型的な実験方法およびデータは本発明の様々な態様をよりよく説明するために示されるが、いかなる場合も本発明の範囲を限定すると見なされてはならない。

実施例１ − １−Ｆ７９の安定性試験
ヒト抗体１−７Ｆ９の生物物理学的特性および安定性は、以下のように試験した。タンパク質の折りたたみ二次構造を円二色性（ＣＤ）によって試験し、オリゴマー化および凝集を動的光散乱（ＤＬＳ）によって試験した。５℃における２年間の貯蔵条件を模倣するために、タンパク質を振とうさせながら３７℃で１４日間のインキュベーションにさらした。

材料および方法
サンプル調製。（ａ）５０ｍＭのリン酸Ｎａ、０．００１％のポリソルベート８０（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｐ８０７４）、ｐＨ７．０、（ｂ）５０ｍＭのリン酸Ｎａ、０．００１％のポリソルベート８０、ｐＨ７．０、０．５ｍＭのスクロース、（ｃ）５０ｍＭのクエン酸塩、０．００１％のポリソルベート８０、ｐＨ３．０、およびｄ）５０ｍＭのトリス、０．００１％のポリソルベート８０、ｐＨ８．５中で、２ｍｇ／ｍｌの１−７Ｆ９を調製した。

円二色性（ＣＤ）。ＣＤ測定は、温度制御のためのペルチェ要素を備えたＣｈｉｒａｓｃａｎ円二色性分光計（アプライド・フォトフィジクス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ））において、２５℃で、２．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度により実施した。１−７Ｆ９サンプルは、０．１ｍｍの経路長を有する円筒形の石英セル中に入れた。バッファ走査を記録しおよび各サンプルスペクトルについて差し引いた。

動的光散乱（ＤＬＳ）。ＤＬＳは、Ｄｙｎａｐｒｏ ９９温度制御ＤＬＳ装置（プロテイン・ソリューション社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｎｃ．））を用いて、２５℃で、２．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度により実施した。データ分析は、この装置と共に提供されるＤｙｎａｍｉｃｓソフトウェアを用いて行った。

結果
１４日間のインキュベーションの後、ＤＬＳで評価されるように、ｐＨ７．０のサンプルの場合には分子サイズは変化しなかったが、ｐＨ３．０およびｐＨ８．５で処方したサンプルはいずれも１４日間の間に多量に凝集した。

ＣＤ測定は全てのベータ構造の特徴を示し、賦形剤としてポリソルベート８０だけを含有するサンプルについてはシグナルのわずかな低下があったが、加速された試験の間中、ｐＨ７．０で処方されたサンプルがその二次構造を保持することが判明した。スペクトルの全体的な形は変化しないので、これは、サンプルの少量の沈殿による可能性がある。スクロースを含有するサンプルは、時間が経過してもこのような低下は少しも示さなかった。ｐＨ３．０および８．５で処方したサンプルのＣＤ測定は、恐らくアンフォールディングまたは他のコンホメーション変化の結果として、時間が経過するとスペクトル特徴の激しい変化を示し、これは、非機能性の１−７Ｆ９タンパク質をもたらし得る。変化は即時に観察され、ｐＨ３．０で最も著しかった。

全体としては、賦形剤としてポリソルベート８０およびスクロースを用いるｐＨ７．０におけるストレス条件（３７℃で振とう）下で、１−７Ｆ９はその物理特性を保持し、安定であった。

実施例２ − 溶解度スクリーニング
抗ＫＩＲヒトＩｇＧ４抗体１−Ｆ７９を含有する製剤において、１μｌの液滴中で８８個の異なる条件を試験する微小製剤スクリーンを実施した。スクリーンの条件は、３〜１０の間のｐＨ範囲およびいくつかの既知の賦形剤の添加を含んだ。沈殿について全ての製剤を目視検査した（生成物の透明性、色、および粒子／繊維の存在の評価）。視覚的評価のために、２人にオペレータによって独立して、黒色および白色の背景で日光（通常）または一般的な実験室の照明に対して外観を査定した。ｐＨ溶解度試験からの結果は図２に与えられ、種々の賦形剤に関連する沈殿分析の結果は図３に示される。

この分析の結果は、ｐＨ６．０および７．４と比較してｐＨ７．０ではより少ない沈殿が生じ、ｐＨ５．０、３．０、および８．５ではさらにより少ない沈殿が生じたことを示す。図２で与えられるデータから、０．５Ｍのスクロース製剤は、検出可能な沈殿物を生じなかった（また、グリセロール製剤は、比較的低レベルの沈殿物に関連した）ことが分かる。

実施例３ − 製剤試験
４つの異なる温度で３ヶ月までの貯蔵期間にわたって表３のスケジュールに従って、１−Ｆ７９（１０ｍｇ／ｍＬ）の１２個の異なる製剤を、ｐＨ、外観、ＧＰ ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＩＥＦに基づいて分析した。試験した製剤は表４に示される。

使用した特定の方法は、簡潔に、以下の通りであった（外観試験は上記に記載される）。

標準化ＴＳＫ ＳＷＸＬ Ｇ３０００カラムを用いるＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムにおいて、ゲル浸透（ＧＰ）ＨＰＬＣを行った。移動相は、１．０ｍＬ／分の流速のｐＨ７．０の０．２Ｍのリン酸ナトリウムであった。サンプル注入容積は５０μＬであった。２５０μｇのタンパク質負荷を単一の決定を用いて分析した（％モノマー、％断片、および％断片は、各サンプルに対して決定した）。全てのサンプルは、最初は１．８％〜２．３％の間の凝集体レベルを有すると決定された。

ＳＤＳ ＰＡＧＥを実施して、生成物の均質性および純度を試験した。還元および非還元サンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥは、Ｎｏｖｅｘプレキャスト４％および２０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド勾配ゲルを用いて実施し、色素の先端がゲルの底の１ｃｍ以内に移動するまで、ゲルごとに１２５Ｖの限定条件で電気泳動させた。非還元条件の場合には４μｇおよび還元条件の場合には１０μｇのタンパク質負荷を用いた。クーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎ Ｂｌｕｅ）Ｒ２５０染色を用いて、室温でゲルを染色した。Ｎｏｖｅｘ ＭＫ１２分子量マーカーを各ゲルにおいてインキュベートして、６ｋＤａ〜２００ｋＤａのＭＷ範囲を包含した。還元条件の場合には、インキュベーションは、２−メルカプトエタノールを含有するｐＨ８．０のサンプル緩衝液を用いた。非還元条件の場合には、インキュベーションは、２−メルカプトエタノールを含まないｐＨ７．１のサンプル緩衝液を用いた。還元および非還元サンプルは、汚染を防止するために、別々に調製して別々のゲルで分析した。それぞれのエンドポイントで単一の試験を実施した。各サンプルのバンディングプロファイルは、非還元および還元サンプルについて視覚的に、そして還元サンプルの各バンドの相対的なパーセント純度を決定するためにレーザーデンシトメトリーによって分析した。

市販のアガロース等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３〜ｐＨ１０）を用いてＩＥＦを実施し、タンパク質の等電点電気泳動パターンおよび等電点範囲を決定した。各サンプル１０μｇを５μＬの容積でゲルのカソード端部に添加した。１５００ボルト時に焦点を合わせた後、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０染色でゲルを染色し、各サンプルの焦点パターンをＴ＝０のプロファイルと視覚的に比較して、タンパク質の変化アイソフォームにおける変化を同定した。各ゲルにおいて適切なｐＩマーカーをインキュベートし、製造業者によって供給されるｐＨ値に基づいて同定した。各サンプルを各時点で１回試験した。

１２個の製剤における平均の抗体タンパク質濃度は１０．６１ｍｇ／ｍＬであり、全てのサンプルは、この値の３％以内のタンパク質濃度を有した。

これらの試験に基づいて、これらの時点の微粒子に関して様々な製剤をスコア化し（０スコアは最良であり、１４スコアは最悪である）、分析の一環として実施した他のアッセイ（ＨＰＬＣ、ＩＥＦ、ＳＤＳ、および外観分析）については、安定性に関する３点スケール（０は最悪であり、１は「最有力候補」の特性を有する可能性のある製剤を示し、そして２は「最有力候補」の品質を有する製剤を示す）においてスコア化した。この試験から得られた結果は、表５および表６で提供される。

具体的な特定の結果は以下を含む。ＧＰ ＨＰＬＣデータは、試験における他の製剤と比較して、ｐＨ５．５の酢酸およびクエン酸緩衝液を含有する製剤では、時間が経つと約２５℃および約４０℃でモノマーレベルの著しい低下（例えば、凝集／多量体化を示す）および／または断片レベルの増大（例えば、タンパク質の分解を示す）があることを示した。また、ＳＤＳ ＰＡＧＥ結果は、より高い温度では特に、他の製剤と比較して高いレベルの断片化のために、少なくともクエン酸および酢酸製剤のほとんどがＩｇＧ４抗ＫＩＲ抗体の長期貯蔵のために不適切であり得ることを示した。より低いｐＨの製剤は、一般に、より高いレベルの断片化（タンパク質の分解）にも関連した。

また、凍結融解条件にさらされ得る製剤の能力は、この実験および他の実験の一環として評価した。一般に、製剤は適切な凍結融解特性を示したが、製剤の少なくともいくつかでは、氷点下条件における貯蔵は最適でないと考えられた。製剤Ｆ６は、凍結融解ストレスによって、氷点下温度における長期貯蔵のためには不適切であると見なされた。スクロースおよび／または塩化ナトリウムなどの適切な浸透圧調節剤を包含させることは、抗体製剤の氷点下条件における貯蔵および／または凍結融解のために重要であり得る。一般に、約５℃において製剤を液体として提供、貯蔵および取り扱うことが推奨される。凍結が必要とされる場合には、比較的少量のリン酸ナトリウム（包含される場合）が使用され、浸透圧調節剤の濃度／選択は適切に調整されるべきである。

全体として、この分析から得られた結果は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を含有するヒスチジン、トリス、およびリン酸系の製剤が様々な温度条件にわたって最良の特性を示すことを示唆する。表４に示されるように、ＩＥＦ、ＨＰＬＣ、およびＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によって最良であると見なされた製剤は、ヒスチジン、塩化ナトリウム、およびポリソルベート８０を含有した。しかしながら、これらの特定の製剤は沈殿物を含有し、粒子形成（特に、より高い温度における）の観点から不適切であると考えられた。残りのデータから、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）と、浸透圧調節剤として塩化ナトリウムまたはスクロースのいずれかと、を含有するｐＨ７のリン酸製剤は、最適な抗ＫＩＲ ＩｇＧ４製剤を提供し得ると決定された。

実施例４ − 野生型抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９および抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９ Ｓ２４１Ｐの組換えＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合の表面プラズモン共鳴試験
１−７Ｆ９ Ｓ２４１Ｐ変異形は、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ならびにプライマーＰ１：５’−ｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇ（配列番号４）およびＰ２：５’−ｃｔｃａｇｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｇｇｔｇｇｇｃａｔｇｇｇｇｇ（配列番号５）を用いて、部位特異的変異誘発の適用によって発生させた。変異は、配列決定によって確認した。

表面プラズモン共鳴試験は、「野生型」抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９および抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９ Ｓ２４１Ｐの固定化ＫＩＲ２ＤＬ３への結合を検証および比較するために、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（スウェーデン国ウプサラのビアコアＡＢ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ））において実施した。

組換えＫＩＲ２ＤＬ３の固定化は、製造業者（ビアコアＡＢ）によって記載されるように、標準的なアミンカップリングを用いて、ＣＭ５センサーチップ（ビアコアＡＢ）において行った。

ランニング緩衝液として、そして全ての希釈のために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のポリソルベート２０（ｖ／ｖ））を用いた。センサーチップの再生は、（１５ｕｌ、流量３０ｕｌ／分）１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．８の短いパルスによって実施した。

流速１０ｕｌ／分、２５℃で実験を実施した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアを用いてデータを分析した。

抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９ Ｓ２４１Ｐを発現したＣＨＯ細胞の６つの異なるバッチと、野生型抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９を発現した１つのハイブリドーマバッチとを試験した。全てのサンプルは、ＨＢＳ−ＥＰ中で１００ｎＭに希釈した。個々のサンプルに固定化ＫＩＲ２ＤＬ３上を３分間通過させた後、１０分間の解離段階を行った。

全てのサンプルは、固定化ＫＩＲ２ＤＬ３への結合を明示した。Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１結合モデルを用いて個々のサンプルのオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を決定した。全てのサンプルは、ほぼ同一のオフレートを明示した（表７）。

同一の結合パターンおよびオフレートに基づいて、これらのデータは、ＫＩＲ２ＤＬ３への結合に関して、野生型抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９と、抗ＫＩＲ１ ７Ｆ９ Ｓ２４１Ｐとの間に差異を示さない。

実施例５ − Ｓ２４１Ｐ １−Ｆ７９における半抗体形成の低減
１−Ｆ７９の重鎖配列中のＳ２４１Ｐ変異の導入によって半抗体の形成が低減されたかどうかを評価するために、以下の実験を実施した。

ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭＳｕＲｅタンパク質Ａカラムにおいて、組換え発現Ｓ２４１ １−Ｆ７９ ＩｇＧ４変異形を精製した。添加した後、１０カラム容積のＰＢＳ緩衝液で媒体カラムを洗浄し、１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液ｐＨ３．０を用いて溶出させ後、ＨｉｇｈＴｒａｐ^ＴＭ脱塩カラムを用いて、ＰＢＳ緩衝液への緩衝液交換を行った。全ての操作は、ＧＥヘルスケア・アマシャム・バイオサイエンシーズＡＢ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）からのＡｋｔａｘｐｒｅｓｓシステムによって制御した。

抗体の不均一性および半抗体の含量の推定は、フォルラー（Ｆｏｒｒｅｒ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３４．１（２００４年）：８１およびワシーリエワ（Ｖａｓｉｌｙｅｖａ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５．２１−２２（２００４年）：３８９０に記載される方法を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーによって分析した。ジスルフィド結合を安定にするためにＮ−エチルマレイミドを添加して、非還元条件下でサンプルを調製した。

発現した抗Ｋｉｒ１−７Ｆ９ Ｓ２４１Ｐ変異体は、タンパク質Ａを用いて精製し、ＰＢＳ緩衝液中に脱塩した（図４）。図４において、タンパク質Ａから溶出した材料は、ピークスタート（保持（「Ｒ．」）容積−１４ｍＬ）およびピークエンド（Ｒ．容積−１２ｍＬ）注釈が付けられており、脱塩カラムに注入する前にループ内に貯蔵した。脱塩の後に画分を収集し、Ａ２およびＡ３の注釈を付けた画分を貯蔵してさらなる分析のために使用した。

精製に続いて、上記のフォルラーおよびワシーリエワによって既に記載された方法を用いて、組成物中に存在する半抗体の量を分析した。半抗体の分析は、半抗体の形成がＳ２４１Ｐ変異によって抑制されることを明示した（図５および表８（以下）を参照）。図５は、ハイブリドーマ細胞において発現される抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）（左側）パネルおよびＣＨＯＫ１細胞において発現される抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）右側パネルの分析からの電気泳動図および積分表を示す。表８は、ＣＨＯＫ１細胞において発現される野生型（ＷＴ）１−Ｆ７９およびＳ２４１Ｐ抗ＫＩＲ（１−Ｆ７９）の両方について検出された半抗体の形成量を反映する。

これらの結果は、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）重鎖におけるＳｅｒ−２４１のプロリン置換が、著しく少ない「半抗体」副産物に関連する抗ＫＩＲ ＩｇＧ４抗体産物を生じることを明示する。

実施例６ − ＫＩＲ遺伝子導入マウスにおけるインビボ試験に基づいた抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のヒトＰＫ／ＰＤの予測
この実施例は、ヒトの用量試験において抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の開始用量の選択のための薬物動態学的（ＰＫ）／薬力学的（ＰＤ）に基づいた理論的根拠を説明しており、検出可能な飽和度（＞２０％）を生じるが、最大飽和時のヒトにおけるＫＩＲ受容体の完全な飽和度（＜９５％）を生じないであろう用量を予測する。

具体的には、野生型およびＫＩＲ遺伝子導入マウスにおける抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のＰＫ特性を捉えるために、ＰＫモデルを開発した。ＰＫモデルに基づいて、ＫＩＲ遺伝子導入マウスにおけるＫＩＲ占有率と血漿濃度との関係のためのＰＫ／ＰＤモデルを確立した。次に、ヒトにおける抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のＰＫプロファイルを予測およびシミュレートし、マウスＰＫ／ＰＤモデルを予測ヒトＰＫプロファイルと組み合わせることによってヒトにおけるＫＩＲ占有率のためのＰＫ／ＰＤモデルを考案した。

材料および方法
データソース。ＫＩＲ遺伝子導入マウスにおけるＰＫ／ＰＤモデルは、単一用量として静脈内投与された様々な用量レベルの抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）についてインビボのＫＩＲ受容体の飽和度と血漿濃度との関係が決定された試験からのデータに基づいた。０．０００４ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇの用量範囲を用いた。３の異なる系統のマウスを用いた。野生型Ｂ６（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスはＫＩＲ受容体を発現せず、２つのＫＩＲ遺伝子導入マウス系統において可能性のある標的媒介性のクリアランスの大きさを評価するための基準として使用した。ヒトで見られるパターンと同様にＮＫ細胞およびＴ細胞のサブセットにおいてヒトＫＩＲ２ＤＬ２受容体を発現するマウス系統は、ＫＩＲ遺伝子導入ＩＩ（ＫＩＲ−ｔｇＩＩ）と命名した。このモデルでは、ＫＩＲの発現レベルは、正常なヒトＮＫ細胞におけるＫＩＲよりもわずかに低い。標的媒介性のクリアランスのために利用可能なＫＩＲ受容体の総数の観点から、最悪の場合のモデルとして、ＫＩＲ遺伝子導入Ｉ（ＫＩＲ−ｔｇＩ）と命名したマウス系統を選択した。ＫＩＲ−ｔｇＩマウスはＫＩＲ受容体を激しく過剰発現し、ヒトで見られるパターンを反映することは期待されない。

単一の静脈内用量の抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）に続いて、マウスのグループ（ｎ＝３）を屠殺し、７日間にわたって種々の時点で、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によってＫＩＲ受容体の飽和度を決定するために血液および脾臓を収集した。各マウスに対して、屠殺の前の１つの時点、および飽和度を決定する時点で有効なＥＬＩＳＡ法を用いて抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の濃度を決定した。受容体の占有率は、遊離ＫＩＲを検出するための直接接合した抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）と、結合した抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）を測定するための抗ＩｇＧ４抗体との両方を用いて、ＦＡＣＳによって測定した。このようにして、注入されるｍＡｂの用量を増大させて（これは、結合抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の量の増大に相関する）、遊離ＫＩＲの消失を追跡することが可能であった。

モデリングにおいて、受容体の内部移行は無視し、ＮＫ細胞の表面に存在する受容体の飽和度だけを考慮に入れた。標識化ＮＫ細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の測定を用いて、受容体の占有率および他の特徴を評価した。ヒトＰＫパラメータの予測は、ＰＫ−ＰＤ試験からのマウスＰＫデータ、以前の試験からのサルＰＫデータ、および様々な文献源からのヒトＩｇＧ ＰＫパラメータに基づいた。

アッセイ。有効なＥＬＩＳＡに基づいたアッセイを用いてマウスおよびサルの血漿濃度を査定した。定量限界は、マウス血漿アッセイでは２．５ｎｇ／ｍｌ、そしてサル血漿アッセイでは０．５ｎｇ／ｍｌであった。

ＫＩＲ遺伝子導入マウスにおいて、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）による受容体の占有率は、遊離ＫＩＲを検出するための直接接合した抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）と、結合した抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）を測定するための抗ＩｇＧ４抗体との両方を用いて、ＦＡＣＳによって測定した。このようにして、注入される抗体の用量を増大させて（これは、結合抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の量の増大に相関する）、遊離ＫＩＲの消失を追跡することが可能であった。

ＫＩＲ受容体の％飽和度を計算するために、２つの測定からの合計の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を以下のように用いた。

ソフトウェア。最終データファイル作成のために以下のソフトウェアを使用した：
Ｓ−ｐｌｕｓ、バージョン６．１、米国ワシントン州シアトルのインサイトフル・コーポレーション（Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。

非直線性の混合効果（ｍｉｘｅｄ−ｅｆｆｅｃｔｓ）モデリングのために以下のソフトウェアを使用した：
Ｃｏｍｐａｑ Ｖｉｓｕａｌ Ｆｏｒｔｒａｎ、バージョン６．６ａ、米国カリフォルニア州パロアルトのヒューレット−パッカード・カンパニー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、
ＮＯＮＭＥＭ Ｖ，バージョン１．１、米国メリーランド州ハノーバーのＧｌｏｂｏＭａｘ、
Ｖｉｓｕａｌ−ＮＭ、バージョン５、仏国モンペリエのＲＤＰＰ。

ソフトウェアの設置／検証は以下の方法で実行した：
ＮＯＮＭＥＭの機能性は、現在の部門別手順（ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて検証した。
他のソフトウェアは、製造業者によって推奨されるように設置した。

データファイル
フォーマット作成手順。ＰＫおよびＰＤデータをエクセルファイルとして初めに作成した。続いて、Ｓ−ＰＬＵＳを用いて、ＮＯＮＭＥＭおよびＮＭ−ＴＲＡＮによる使用のためにＰＫおよびＰＤデータを結合および作成した。

ＰＫモデルの作成のために最終データファイルを用いた。個々のＰＫ推定値を有するＰＫモデルからの出力は、無関係のＢ６マウスデータを排除し、ヒトにおける各用量レベルの集団平均をシミュレートする目的のためにシミュレーション記録を追加した後、ＰＤモデルのために用いた。

欠側値およびＬＯＱよりも低い値の取扱い。ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスでは、３μｇグループの２匹のマウスについてのＦＡＣＳ分析は失敗し、データはデータファイルに見られなかった。ＰＫデータ：ＢＬＱ値を０に設定し、モデルの構築から排除したが、ＰＫモデルを用いて血漿濃度を予測するためにその時点はデータファイル内に保持した。

偶然の異常値の取扱い。ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスの０．１μｇグループにおける血漿濃度は偶然の異常値であると考え、ＰＫモデルのパラメータ推定中に除外した。予測される血漿濃度を有するグループはＰＫ−ＰＤモデル中に含めた。

モデルの開発に続いて、重み付き残差の数値が４未満でなければならないという判断基準に基づいて、４つの異常値を同定および除去した。

点検手順。マウスＰＫ／ＰＤモデルについては、全ての個体の％結合および体重ならびに３個体の血漿濃度に関して、ＮＯＮＭＥＭのために使用される最終データファイルを生データエクセルファイルに対して点検した。サルＰＫモデルについては、データファイル内の記録数を、生データにおける記録数に対して点検した。

モデルの開発
モデルにおいて示されるように、ＮＯＮＭＥＭの一次条件付き（ＦＯＣＥ）推定法は、ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮの有無に関係なく、モデルの開発のために使用した。中間モデル評価およびその間の識別は、目的関数値および標準グラフィック評価法に基づいた。

目的関数値に関して、この値の変化はχ^２分散される（入れ子モデルについて）と考えられ、モデルを拡張するための判断基準は、それに応じて定義および使用した。

構造モデルおよび誤差モデル。全ての動物のＰＫモデルに対して、個体間の変動性（ＩＩＶ）について指数関数的誤差モデルを調べた。ＰＫモデル（応答として濃度を用いる）のために、比例的および結合した誤差モデルを個体内の変動性について調べた。ＰＤモデル（応答として％結合を用いる）のためには、追加的誤差モデルを使用した。

シミュレートしたヒトＰＫプロファイルについては、個体内または個体間の変動性は考慮に入れなかった。

点検手順。最終モデル（すなわち、ＮＯＮＭＥＭ制御ストリーム）を十分に校正して正確さを保証した。

共変動分析。マウスにおけるＰＫモデルに対して、全てのＰＫパラメータの共変動として体重（ＢＷ）を調べた。

評価手順。最終モデルの評価は、標準グラフィック評価法によって実施した。

結果および考察
１）野生型Ｂ６のみに対して、２）Ｂ６およびＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスの組み合わせに対して、および３）ＫＩＲ−ｔｇＩマウスに対して、マウス系統における３つのＰＫモデルを開発した。

野生型Ｂ６の分析。野生型Ｂ６からのＰＫデータの分析から、高投与グループと低投与グループの間の差異を説明するために非直線性が必要とされることが分かった。選択モデルは、分布容積のみが非直線性であり、クリアランスはそうでないマーガー（Ｍａｇｅｒ）＆ジャスコ（Ｊｕｓｋｏ）の標的媒介性の薬物動態（ＴＭＤＤ）モデルの特別な場合（マーガーおよびジャスコ、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ ２００１年、２８（６）：５０７−５３２頁）を使用した（図６の概略図を参照）。あるいは、２コンパートメントのミカエリス・メンテンモデル（すなわち、飽和性クリアランスを有する）はＰＫプロファイルを説明し得る。従って、ＰＫデータにおいて観察される非直線性の基礎となる生理学的メカニズムに関して決定的であることが不可能になる。ＴＭＤＤモデルを用いることによって、マウスモデルにおけるクリアランスに対して妥当な推定値を得ることができ、これはミカエリス−メンテンモデルでは不可能であろう。従って、ＴＭＤＤモデルを最終モデルとして採用した。

Ｂ６およびＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスの共同分析。野生型Ｂ６およびＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスの共同分析のために、ＴＭＤＤモデルは、データにおいて観察される非直線性を説明するために好ましいモデルであることが再度分かった。ＰＫが２つのマウス系統において異なると結論され得るかどうかを調べるために、２つの系統に対して同一のパラメータを有するか、あるいは２つの系統において異なるパラメータを有するデータを説明することを試みた。視覚的なモデルの適合性はこれらの２つの方法により事実上同一であったので、２つの系統のＰＫに差異は見られないと結論付けた。しかしながら、目的関数値（ＯＦＶ）の著しい差異が見られたことに注意されたい（ΔＯＦＶ＝２８．４）。

Ｂ６／ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスにおける最終モデルのための評価プロットは、利用可能なデータの量を考慮して、モデルの質が完全に容認できることを示した（図７および８）。より具体的には、個々のレベルおよび集団平均レベルの両方において観察される濃度と予測される濃度の一致は完全に容認できた。最終モデルのパラメータ推定値は、Ｂ６／ＫＩＲ−ｔｇＩＩおよびＫＩＲ−ｔｇＩマウスについてそれぞれ表１および表２に示される。

ＫＩＲ−ｔｇＩ遺伝子導入マウスの分析。ＫＩＲ−ｔｇＩ遺伝子導入マウスの薬物動態は、２つの他の系統とは著しく異なることが分かった。非直線性ははるかに大きく、データはＴＭＤＤモデルに適合しなかったが、飽和性排除のためのミカエリス−メンテンモデルは成功であった。平均予測ＰＫプロファイルは、図９のＫＩＲ−ＴＧＩ遺伝子導入マウスの平均実測値と比較される。

抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のためのヒトＰＫデータは利用できなかったが、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は完全にヒトＩｇＧ４であるので、抗体はヒトの内在性ＩｇＧ４と同様の薬物動態特性を示すことが予期された。標的媒介性のクリアランスの影響を受けにくいＩｇＧのＰＫプロファイルは、通常、図１０に示されるように２コンパートメントモデルによって説明されることが十分に容認された（ゲティ（Ｇｈｅｔｉｅ）およびウォード（Ｗａｒｄ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２００２年、２５：９７−９１１３頁を参照）。

抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のための最もありそうなヒトＰＫパラメータを予測するために、以下の３つのセクションに記載されるように３つの異なる方法を比較した。

（１）ヒトＩｇＧの典型的なパラメータ
内在性ＩｇＧおよびモノクローナル抗体のＰＫについての文献には大量の情報が存在する。文献調査を行って、ヒトのＩｇＧのための２コンパートメントモデルを定義するパラメータ（ＣＬ、Ｖ１、Ｖ２およびＱ）の典型的な値を同定した。ＰＫパラメータは、ヒトにおけるヒトＩｇＧの一般的なＰＫ特徴と一致しなければならない。初期中心容積はほぼ血漿量（すなわち、３リットル）であり、分布容積は中心容積と同様であるかあるいはわずかに大きく、平均末端半減期は２０〜２３日である（ゲティおよびウォード、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２００２年、２５：９７−９１１３頁、モレル（Ｍｏｒｅｌｌ）ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９７０年、４９：６７３−８０頁、ロスコス（Ｒｏｓｋｏｓ）ら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｒｅｓ ２００４年、６１：１０８−２０頁、ロボ（Ｌｏｂｏ）ら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００４年、９３：２６４５−６８頁）。

これらの一般的な特徴を、様々な文献源からの個々のヒトおよびヒト化抗体についての文献データと組み合わせた。一般に、実証された標的媒介性のクリアランスまたは内在性ＩｇＧと一致しないＰＫ特性を有するｍＡｂは排除されている。引用されるクリアランス値はＲＥＳシステムを介する一般的な用量依存性のクリアランスメカニズムを反映することが予想される。

予想通りに、ほとんどのｍＡｂは、血漿量（約４０ｍｌ／ｋｇ）に近似される中心容積を有し、末梢の分布容積はこれと同様であるかまたはわずかに大きい。続いてヒトＰＫのシミュレーションのために使用されるＰＫパラメータは、表１０に示されている。これらは、文献調査中に見られる一般的な特徴および特異的なパラメータの両方の反映として選択された。これらのパラメータを使用する末端半減期は２０日である。

最小データで支持されるパラメータは、コンパートメント間クリアランスＱであり、このために、標的媒介性のクリアランスの有無に関係なくヒト化およびヒト抗体からのデータを使用することが必要であった。中心容積および末梢容積間の移動のための微小定数が示される場合、Ｑは、Ｖ_１×ｋ_１２（コンパートメント１と２の間の移動のための速度定数）として計算した。１ｍｌ／ｈ／ｋｇのコンパートメント間クリアランスおよび４０ｍｌ／ｋｇの中心容積は、１〜３日の分布相と一致し、ｍＡｂに対して観察されることが多い。

ヒトにおいてＩｇＧ血漿の半減期を調節する重要なメカニズムの１つは、ヒトＦｃＲｎ（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）受容体への結合であり（ロボら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００４年９３：２６４５−６８）、そして、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は、内在性ＩｇＧ４抗体と同様のＦｃＲｎ受容体に対する親和性を有することが予想される。

最も知られているヒトまたはヒト化モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプを有する。抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）はＩｇＧ４であるが、内在性ＩｇＧサブクラスの比較によって査定されるように、ＰＫパラメータはＩｇＧ１および−２と同様であることが予想される（モレルら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９７０年、４９：６７３−８０頁）。従って、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は、ヒトにおいて、例えば、ＣＰ−６７５２０６、アダリムマブ、テフィバズマブ（ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、ペルツズマブおよびＡＢＸ−ＩＬ８に酷似したＰＫ特性を示すことが予測される。

サルＰＫパラメータに関して、以前のＮＣＡ試験は、カニクイザルにおける抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のＡＵＣが、調査範囲０．１〜１ｍｇ／ｋｇにおいて用量直線性であることを示した。

集団ＰＫモデルのために、２コンパートメントモデルは、静脈内投与の後の血漿濃度の二重指数関数的（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）な低下を適切に説明することが分かった。４つのパラメータのいずれかにおける個体間の変動は有意ではない（ｐ−レベル＜０．０１において）。これは恐らく高い個体内変動のためであり、実際の血漿濃度を時間に対してプロットすると明らかであった。モデルの残留誤差は許容可能であった（２９％）。

表１１に示されるように、ＮＣＡおよび集団ＰＫモデルは、一貫して、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のクリアランスが、サルにおいて他のヒト抗体について報告されたクリアランスと比較していくらか高い（２〜３倍）ことを示す。しかしながら、分布容積も２〜３倍高いので、末端半減期（ｔ１／２）は８〜１１日であった（これは、サルに投与されたヒト抗体についての予想に従う）（ハルパーン（Ｈａｌｐｅｒｎ）ら、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ ２００６年、９１（２）：５８６−５９９頁、ゴブル（Ｇｏｂｂｕｒｕ）ら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １９９８年、２８６（２）：９２５−９３０頁）。暴露は用量に比例することが観察され、クリアランスに重要な飽和メカニズムの表示は観察されなかった。

いくつかの例はサルＰＫパラメータを直接ヒトに転移可能であり得ると示しているが、例えばＦｃＲｎ親和性における種差はクリアランスの種差を生じ得るので、これは注意して行わなければならない（ロボら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００４年、９３：２６４５−６８頁）。

相対成長スケーリング。２つの種（すなわち、マウスおよびサル）（０．０２５および２．５ｋｇの体重）において集団ＰＫモデル（上記を参照）から得られた４つの構造ＰＫパラメータを用いて、ヒト（７０ｋｇ）に対する相対成長スケーリングを実施した。問題となっているＰＫパラメータを体重（ＢＷ）に対してプロットした。得られた直線は、以下の式のＡおよびＢを決定する（ロボら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００４年、９３：２６４５−６８頁、タブリージ（Ｔａｂｒｉｚｉ）ら、「乾癬およびメラノーマ患者における可溶性および膜結合型の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体の薬物動態および免疫原性プロファイル（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｆｏｒ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ）」Ｐｏｓｔｅｒ ｏｎ ＡＳＣＰＴ ２００４年）。
クリアランス＝Ａ^＊（体重）^Ｂ

４つ全てのパラメータ（ＣＬ、Ｖ１、Ｖ２、およびＱ）を同様の方法で計算した。分布容積のスケーリングのためには、マウスモデルからのＶ１およびＶ２のみを考慮した。ｍＡｂのヒトＰＫ（直線的であると考えられる）について、また非常に低濃度についてはあまり実証されていないので、例えば非特異的な結合に関連する第３の飽和性コンパートメントは無視した。

相対成長スケーリングを用いるｍＡｂのためのＰＫの種間外挿の例はほんの少ししか存在しない（タブリージら、上記、リヒター（Ｒｉｃｈｔｅｒ）ら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ １９９９年、２７：２１−５頁、リン（Ｌｉｎ）ら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １９９９年、２８８（１）：３７１−３７８頁）。一般に、このアプローチを用いるヒトＰＫの予測はうまくいくと思われるが、クリアランスの過剰予測が存在すると思われる（タブリージら、上記、リンら、上記）。ＡＢＸ−ＩＬ８の場合のように、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の相対成長スケーリングのために２種だけを使用したが、正式には、２点を結ぶ直線についての統計的根拠が乏しい。しかしながら、関係からの潜在的な異常値はパラメータの変動性を反映するのではなく、排除メカニズム、特にＦｃＲｎ受容体に対する親和性の種差を反映し得るので、より多くの種を含むことは必ずしも予測を改善しないであろう。マウスおよびカニクイザルＦｃＲｎのための抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の親和性は不明であり、従って、相対成長スケーリングは注意して使用されなければならない（ロボら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ２００４年、９３：２６４５−６８頁）。

結論として、ヒトＰＫの予測において、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は完全にヒトＩｇＧなので、抗体はヒトの内在性ＩｇＧと同様の薬物動態特性を示し得ることが予想される。相対成長スケーリングおよびサルのクリアランスに基づいて、ヒトのクリアランスは、０．４６〜０．６４ｍｌ／ｈ／ｋｇであると推定され、ヒトにおけるヒトＩｇＧのクリアランスの典型的な値（０．１２ｍｌ／ｈ／ｋｇ）と比較して高い。このアプローチは最低のクリアランス、従ってヒトにおける最高の潜在的暴露を推定したので、ヒトＰＫ−ＰＤモデルの開発のために文献の予測を用いた。

ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスにおけるＫＩＲ受容体の飽和のためのＰＫ／ＰＤモデル
ＰＤ応答データ（ＭＦＩ）の定義。このアプローチのための本質的な仮定は、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）データによって％結合の妥当な値を計算／定義できることである。スクリーニング時および測定時の両方で、対照動物および処置動物に対していくつかの異なるＭＦＩ測定を使用した。これらには：
対照動物に対するＭＦＩ
ＭＦＩ_{．ｆｒｅｅ．ｃｏｎｔｒｏｌ} ： 遊離受容体に関連するＭＦＩ（ＰＢＭＣ）、
ＭＦＩ_{．ｍａｘ．ｂｏｕｎｄ．ｃｏｎｔｒｏｌ} ： １−７Ｆ９と共にインキュベートすることによる、１−７Ｆ９に結合した受容体に関連する最大ＭＦＩ（ＰＢＭＣ）、
ＭＦＩ_{．ｆｒｅｅ．ｂａｃｋｇｒ} ： 遊離受容体を査定する場合の背景ＭＦＩ、
ＭＦＩ_{．ｂｏｕｎｄ．ｂａｃｋｇｒ} ： 結合受容体を査定する場合の背景ＭＦＩ、
スクリーニング時の処置動物に対するＭＦＩ
ＭＦＩ_{．ｆｒｅｅ．ｓｃｒｅｅｎ} ： 遊離受容体に関連するＭＦＩ（ＰＢＭＣ）（一部の動物についてだけ査定）
実験の時点における処置動物に対するＭＦＩ
ＭＦＩ_{．ｆｒｅｅ} ： 遊離受容体に関連するＭＦＩ（ＰＢＭＣ）
ＭＦＩ_{．ｂｏｕｎｄ} ： 結合受容体に関連するＭＦＩ（ＰＢＭＣ）
ＭＦＩ．_{ｂｏｕｎｄ．ｓｐｌｅｅｎ} ： 結合受容体に関連するＭＦＩ（脾臓からの細胞）（一部の動物についてだけ査定）
ＭＦＩ_{ｍａｘ．ｂｏｕｎｄ．ｓｐｌｅｅｎ} ： 結合受容体に関連するＭＦＩ（脾臓からの細胞）（一部の動物についてだけ査定）
が含まれる。

ＫＩＲ受容体の％飽和度の計算。対照、背景、および脾臓における最大結合を用いて、３つの正規化ＭＦＩ値を処置動物に対して計算することができる。

ＭＦＩが関連する受容体の数と共に直線的に増大するという仮定の下で、これらの正規化ＭＦＩ値を用いて、％結合および％遊離受容体を計算することができる。ＭＦＩ．ｆｒｅｅ．ｎｏｒｍおよびＭＦＩ．ｂｏｕｎｄ．ｎｏｒｍに対する個々のＭＦＩ値において高い変動性が見られた。この変動がＫＩＲ受容体の数における個体間の変動によるものであり、ＭＦＩ．ｆｒｅｅ．ｎｏｒｍおよびＭＦＩ．ｂｏｕｎｄ．ｎｏｒｍが両方ともＫＩＲ受容体の数に比例するという仮定の下で％結合は、

のように計算することができ、これはＰＫ／ＰＤモデルのために選択される方法であった。

一部の動物のために、追加的なサンプルを採取して、ＭＦＩ．ｍａｘ．ｂｏｕｎｄ．ｓｐｌｅｅｎおよびＭＦＩ．ｂｏｕｎｄ．ｓｐｌｅｅｎを評価し、動物をその最大レベルで使用して正規化することを可能した。これらの動物については、ＭＦＩ．ｂｏｕｎｄ．ｎｏｒｍ．ｏｗｎｃｏｎｔｒｏｌを使用して％結合受容体を計算することが可能であった。このアプローチは、１５分サンプルを除いて、良好な一致を提供することが分かった。抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は血液に到達するよりも後で脾臓に到達するので、この差異はＰＢＭＣと脾臓細胞との間の差異によるものであろうと考えられる。

％結合のモデリング。ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスにおける抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の血漿濃度と、パーセント受容体飽和度との間の関係を説明するためにＰＫ／ＰＤモデルを開発した。飽和度は全ての時点で血漿濃度と平衡にあるわけではなかったので、受容体におけるオンレートおよびオフレート（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）を血漿濃度Ｃｐの時間による変化と連結する動的な結合式を使用することが必要であった。結合受容体Ｂの総数を説明する式は：

であり、同等に、パーセント結合％Ｂを説明する式：

も見出した。

解離定数Ｋｄは、Ｋｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎによってモデルで得られるｋｏｎおよびｋｏｆｆの値から計算した。

それぞれの時点における血漿濃度に対するパーセント結合ＫＩＲ受容体のプロットを調べると、２４時間前の時点では、受容体を飽和させるためにその後の時点よりも少ない抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）が必要とされるようであった。見かけの親和性の低下の種々の経験的な実現は一貫した結果を明示した。

非常に低い用量（≦０．０００４ｍｇ／ｋｇ以下）の場合、モデル予測によって抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の血漿濃度はほぼ定量限界以下であると示されているので、これらは測定しなかった。モデルにおいて測定された％結合を包含するために、ＰＫ部分をより高い用量から外挿した。この外挿の結果として、最高の初期親和性Ｋｄ１の正確な値はいくらか不確かであり、引き続いて、最終モデルはＫｄ１〜０．００４μｇ／ｍｌを使用した。親和性の低下は２４〜４８時間後に見られ、後の時点ではＫｄ２〜０．１μｇ／ｍｌであり、血漿濃度は測定可能な範囲内であった。測定した飽和度とモデル化された飽和度との間の良好な一致は、最終アプローチによって得られるであろう。この最終モデルは、

で表すことができ、パラメータ値は表１３に与えられ、ｋ_ｏｆｆは一定に保持され、ｋ_ｏｎはｋ_ｏｎ＝ｋ_ｏｆｆ／Ｋｄで計算される。Ｔ５０は、Ｋｄの５０％の変化が生じたときである。

抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は２つの結合部位を有するので、観察される親和性の低下は、２価および１価の結合様式またはその混合物を示すと解釈されている。いくつかの実験的設定において、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の２つの異なるＫｄ値が観察された。インビボでの２価から１価への結合様式の変化についての可能性のある説明は、膜内の受容体の内部移行または他の再編成によるＫＩＲ受容体の表面密度の低減であり、個々の受容体間により大きいスペーシングをもたらし得る。抗体の両方の結合部位の同時関与の可能性は、表面密度および膜結合型標的抗原の近接に強く依存するので、これは強力な２価の結合を低減し得る（ラルソン（Ｌａｒｓｓｏｎ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２６、７３５−７３９頁）。

マウスＰＫ／ＰＤモデルのヒトへの外挿。ＮＯＮＭＥＭでは、基本的には、入力のＰＤ構造を保持しながらＮＯＮＭＥＭ入力ファイル中のマウスＰＫパラメータを表１２に記載されるヒトＰＫパラメータと交換することによって、ヒトＰＫ／ＰＤモデルを実行した（表１３）。この様式を用いて、様々な用量および１３週までの時点をシミュレートした。

シミュレーションでは、構造パラメータの集団平均だけを考慮した。すなわち、ＰＫまたはＰＤパラメータの個体間または個体内の変動は包含しなかった。

ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウスおよびヒトからの様々な細胞型のインビトロの結合曲線は図１１に示される。これらの結果は、血漿濃度と飽和度の関係が、ヒトおよびＫＩＲ遺伝子導入マウスに対してインビボで同程度であることを支持する。従って、ヒトの血漿濃度の時間経過はマウスとは異なり得るが、ＰＫ／ＰＤモデルを使用して、ヒトの所与の血漿濃度に対して、そして投与後の所与の時点で飽和度を予想することができる。

親和性の同様のインビトロ−インビボの比較は、チンパンジーおよびヒトにおいて抗ＣＤ１１ａ ｍＡｂ ｈｕ１１２４を比較することによってうまく行われた（バウアー（Ｂａｕｅｒ）ら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍ １９９９年、２７：３９７−４２０頁）。

最終モデルの適用、最大飽和度の予測および飽和の持続時間。ヒトの抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）のための最終予測ＰＫ／ＰＤモデルを用いて、ヒトの抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の種々の用量について時間に対するパーセント受容体占有率のシミュレーションを実施し、最大ＫＩＲ占有率および占有の持続時間を低下させた（表１４）。潜在的な活性化を過小推定しないために、最大の潜在的活性化を予想するようにモデル推定値を選択した。すなわち、モデルは、１）ＰＫモデルから予測される最高の潜在的暴露、２）ＰＫと飽和度の間の高親和性の関係（低Ｋｄ）、および３）ＮＫ細胞の最大の潜在的活性化の尺度としてのパーセントＫＩＲ占有率に基づく。

ヒトにおいて測定可能であるが完全な飽和ではない抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の検出可能な血漿濃度を生じることが予測される用量は０．０００３ｍｇ／ｋｇであると特定し、ＦＨＤ試験における開始用量を提示した。

従って、シミュレーションモデルは、ヒトにける抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の用量、得られる血漿濃度プロファイルおよびＫＩＲ受容体占有率の関係を予想するように開発された。このモデルは、ヒトのＩｇＧのための典型的なＰＫモデルを、血漿濃度とＫＩＲ受容体占有率との関係のためのモデルと組み合わせることによって構築した。後者のモデルは、ＫＩＲ−ｔｇＩＩマウス試験からのデータを用いて開発した。

モデルの開発中、最大の潜在的な占有を予想することを目的として、慎重な原理を用いた。このモデルに基づいて、０．０００３ｍｇ／ｋｇの用量は検出可能（＞２０％）であるが完全ではない飽和度（＜９５％）を生じ得ることが予測された。用量は、Ｃｍａｘで約６０％までのＫＩＲ占有率をもたらすことが予期される。

実施例７ − 臨床ＡＭＬ試験
単一用量の増大試験は、導入および強化化学療法後の最初の完全寛解状態にあり、骨髄移植に不適格な高齢のＡＭＬ患者（６０歳よりも高齢）において行われる。標準３＋３設計が適用され、全計７つの用量レベルが探索されることが予定され、用量は０．０００３ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与に続いて、ＫＩＲ占有がもはや検出可能でなくなるまで、患者は安全性、ＰＫおよびＫＩＲ占有についてモニターされる。

延長試験も行われる。用量増大試験が完了し、まだ完全寛解状態にあるＡＭＬ患者は延長試験に参加することができ、患者は月１回ベースで６回まで投与され得る。患者は前回の試験で受けた用量と同じ用量が投与される。

患者、材料および方法
両方の試験において、その最初の完全寛解（ＣＲ）状態にあり、移植に不適格な高齢のＡＭＬ患者（６０歳よりも高齢）は、試験に適格であった。用量増量試験におけるスクリーニングにおいて、化学療法の最後の用量からの時間は、少なくとも３０日であり、１２０日を超えない。他の適格性の判断基準としては、ＮＫ細胞におけるＫＩＲ２ＤＬ１および２／３の発現、ＥＣＯＧ状態０〜２、および前回の治療からの全ての毒性からの回復があった（しかし、これらに限定されなかった）。延長試験につては、許容可能な安全性プロファイルと共に用量増大試験が完了することが追加の適格性判断基準であった。

試験設計
用量増大試験は、多施設オープンラベルの単一用量−増大の安全性および耐容性試験である。７つの用量レベルが探索されることが予定され、０．０００３ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇである。一般的な（３＋３）設計がこの試験のために選択される。それぞれの患者は１つの用量に割り当てられ、患者ＮＫ細胞において検出可能なＫＩＲ占有が存在しなくなるまで、安全性、薬物動態、および薬力学についてモニターされる。安全性、ＰＫおよびＫＩＲ占有率は進行中に分析される。各用量グループから投与後の最初の４週間の間に得られるデータは、通常、用量増大の決定の基礎を成す。

延長試験は、繰り返し投与、多施設、オープンラベル、安全性および耐容性として設計される。個々の患者に与えられる用量は、単一用量試験で投与される患者と同じである。患者は４週間の間隔で６回の投与を受けることができる。すなわち、６回の投与サイクルは最大６ヶ月の期間を有する。各投与サイクルは、投与来診および安全性モニター来診からなる。最後の投与の後、患者ＮＫ細胞において検出可能なＫＩＲ占有が存在しなくなるまで、患者は安全性についてモニターされる。この安全性追跡期間の持続はおそらく投与される用量に依存し、最後の投与の最大２４週間後であることが予期される。

抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）投与に対する安全性（すなわち、観察される毒性）は、米国国立癌研究所の有害事象の共通用語規準（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ、ＣＴＣＡＥ）バージョン３．０を用いて査定される。薬物動態学的なエンドポイント、ＫＩＲ占有、ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化のマーカー、ＷＴ−１腫瘍マーカー、無進行生存および全生存も評価される。

結果
報告される有害事象（ＡＥ）および実験室パラメータに基づいて、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）は、これまで試験した用量（０．０００３ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ）において十分に耐容性であった。試験で報告されるＳＡＥはこれまで全て試験薬物に関係ないまたは関係しそうにないとみなされている。投与後に生じる重症度グレード１の軽度の皮膚反応（背側の紅斑、そう痒および皮膚発疹）は、３人の患者において報告されている。これらの反応は重篤でなく、おそらく試験薬物に関係すると評価され、患者はほとんど数日以内に回復した。

実施例８ − 臨床的な多発性骨髄腫試験
用量増大試験は、再発性または難治性の多発性骨髄腫（ＭＭｙ）患者においても行われ、患者は、月１回ベースで４回投与され得る。（すなわち、約４週間の投与間隔）。適格な患者は１８歳以上である。

標準３＋３設計が適用され、全計７つの用量レベルが探索されることが予定され、用量は、０．０００３ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ（０．０００３ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲である。投与に続いて、ＫＩＲ占有がもはや検出可能でなくなるまで、患者は安全性、ＰＫおよびＫＩＲ占有についてモニターされる。

実施例９ − 患者における薬物動態
方法
抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の血漿濃度は、以下に簡単に説明されるようにＥＬＩＳＡによって決定される。

プレートをＫＩＲ２ＤＬ３コーティング液（１００μｌ／ウェル）で被覆し、約＋４℃で一晩インキュベートする。次に、自動プレート洗浄機を用いて、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する（４００μｌ／ウェル）。遮断緩衝液を添加し（２００μｌ／ウェル）、室温で約２時間、プレートをプレートシェーカー上でインキュベートする。この後、もう一度プレートを洗浄緩衝液（４００μｌ／ウェル）で３回洗浄する。

標準物、品質対照およびサンプルをプレートに添加してから（１００μｌ／ウェル）、室温で約２時間、プレートシェーカー上でインキュベーションを行う。マウス抗ヒトＩｇＧ４：ペルオキシダーゼ作用液（１００μｌ／ウェル）を添加する前に、プレートをさらに３回洗浄する（上記のように）。次に、室温で約２時間、プレートをプレートシェーカー上でもう一度インキュベートし、その後もう一度洗浄する。

ＴＭＢをプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、次に、室温で約３０分間、プレートシェーカー上でインキュベートする。停止溶液（５０μｌ／ウェル）の添加により酵素反応を終結する。４５０ｎｍ（基準フィルタ６５０ｎｍ）で吸光度を読み取る。

この試験の定量の下限は５．０００ｎｇ／ｍＬであり、この試験の定量の上限は１１０．０ｎｇ／ｍＬである。

結果
これまで、用量増大試験において９人のＡＭＬ患者に、０．０００３、０．００３および０．０１５ｍｇ／ｋｇの３つの用量レベルの抗ＫＩＲ ｍＡｂが静脈内投与されたが、４人のＭＭｙ患者には、０．０００３ｍｇ／ｋｇの抗ＫＩＲが投与された。ＡＭＬ患者において今まで得られた血漿データから、３つの最低用量の間の暴露において用量の直線的な増大があると思われる（図１２）。ＭＭｙ患者において観察される濃度は、ＡＭＬ患者のものと十分に適合する。０．０１５ｍｇ／ｋｇの用量の後、測定可能な抗ＫＩＲの血漿濃度は、用量投与の後４週間まで検出された。これまで記録された最高の血漿暴露は、０．０１５ｍｇ／ｋｇの用量の後、約４００ｎｇ／ｍＬに近づいた。

実施例１０ − ＫＩＲ占有率アッセイ
このアッセイでは、受容体の占有は、４色蛍光分析によってヒト全血サンプルにおいて評価される。簡単に、遊離および結合ＫＩＲ２Ｄ受容体レベルは、ＥＤＴＡ抗凝固剤処置された末梢血中のＴおよびＮＫリンパ球において査定される。遊離部位アッセイは、ＫＩＲ２Ｄ分子に結合するＰＥ接合１−７Ｆ９で染色することによって、非結合ＫＩＲ２Ｄを査定し得る。結合部位アッセイは、ＫＩＲ２Ｄ受容体に結合した１−７Ｆ９を認識するＰＥ接合マウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体で染色することによって、１−７Ｆ９により占有されたＫＩＲ２Ｄ受容体を査定し得る。遊離および結合アッセイは、１−７Ｆ９−ＰＥまたは抗ｈＩｇＧ４−ＰＥについてパーセント陽性染色および蛍光強度［ＭＥＳＦ］の両方の評価を可能にし得る。以下の２つのアッセイにおいて以下の接合抗体の組み合わせが使用される：
遊離部位アッセイ：ＣＤ３／１−７Ｆ９／ＣＤ４５／ＣＤ５６
結合アッセイ：ＣＤ３／□ｈＩｇＧ４／ＣＤ４５／ＣＤ５６

サンプルは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒにおいて、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析される。Ｔ細胞はＣＤ４５＋ＣＤ３＋リンパ球と定義され、ＮＫ細胞はＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞と定義される。

実施例１１ − ＰＫ／ＰＤモデルのヒトへの翻訳
１−７Ｆ９による３つの進行中の臨床試験（実施例７および８を参照）からのデータを使用して、実施例６に記載される前臨床ＰＫ／ＰＤモデルを、実施例９および１０に記載されるように得られた薬物動態学的なＫＩＲ占有率のデータを用いて検証および更新した。

実施例７および８に記載されるように、患者は０．０００３、０．００３または０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で受けた。患者の一部は、４週間の間隔で同じ用量レベルの繰り返しの投与を受けたが、これらの低用量では占有率に対する影響は投与イベント間での持ち越しはほとんどないか限られているので、以下の計算のためにこれらの用量は非依存性の単一用量として処理された。

占有率の計算
ＫＩＲ占有率の計算のために、各患者は彼／彼女自身の対照としての役割を果たすので、前臨床ＰＫ／ＰＤモデルで使用される複雑な式の使用は必要でなかった。同様に、検証によってこのアッセイはより頑強であることが示されたので、遊離ＫＩＲ受容体の数を査定するアッセイだけを使用した。ＮＫ細胞の等価可溶性蛍光色素の分子（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ、ＭＥＳＦ）値（ＭＥＳＦ）で表される標準化蛍光を計算のために使用した：

０よりも低い占有率の値は定義により０に設定した。アッセイにおける日々の変動を説明するために、有意なＫＩＲ占有率のためのカットオフを３０％に設定した。

データ分析
試験からのＰＫおよびＰＤデータに探索的分析を行い、１−７Ｆ９の血漿濃度に対してＫＩＲ占有率をプロットして、データの傾向を観察した。説明のために、簡単な１価の結合等温線（ｉｓｏｔｅｒｍ）をこれらのプロット上に重ね合わせた。前臨床モデルから、親和性（Ｋｄ）は特定の時間枠内で一定であると仮定することが妥当であると分かり、従って、それぞれの時間枠のＫＩＲ占有率は、式１０：

を用いて計算した。

またこれは、結合が血漿濃度と瞬間的な平衡状態にあると仮定され得ることも暗示した。前臨床ＰＫ／ＰＤモデルから、これは妥当な仮定であることが分かった。

さらに、前臨床ＰＫ／ＰＤモデルによって予測されるＰＫおよびＰＤパラメータのいくつかを、進行中の臨床試験の間中、実際の観察と比較した。

集団ＰＫ
集団モデリングのために利用可能なＰＫデータを用いて、ヒトにおける１−７Ｆ９のための予備的なＰＫモデルを作成したが、ＰＫ／ＰＤの関係は探索的分析に基づいた。

ソフトウェア。最終データファイル作成のために以下のソフトウェアを使用した：
Ｓ−ｐｌｕｓ、バージョン６．１、米国ワシントン州シアトルのインサイトフル・コーポレーション。

非直線性の混合効果モデリングのために以下のソフトウェアを使用した：
Ｃｏｍｐａｑ Ｖｉｓｕａｌ Ｆｏｒｔｒａｎ、バージョン６．６ａ、米国カリフォルニア州パロアルトのヒューレット−パッカード・カンパニー、
ＮＯＮＭＥＭ Ｖ，バージョン１．１、米国メリーランド州ハノーバーのＧｌｏｂｏＭａｘ、
Ｖｉｓｕａｌ−ＮＭ、バージョン５、仏国モンペリエのＲＤＰＰ。

ソフトウェアの設置／検証は以下の方法で実行した：
ＮＯＮＭＥＭの機能性は、現在の部門別手順（ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて検証した。
他のソフトウェアは、製造業者によって推奨されるように設置した。

モデルの開発：モデル開発のために、相互作用を有するＮＯＮＭＥＭの一次条件付き（ＦＯＣＥ）推定法を使用した。中間モデルの評価およびその間の識別は、目的関数値および標準グラフィック評価法に基づいた。

目的関数値に関して、この値の変化はχ^２分散される（入れ子モデルについて）と考えられ、モデルを拡張するための判断基準は、それに応じて定義および使用した。

ＬＯＱよりも低い値の取扱い：
ＬＯＱよりも低い値はモデリングから排除したが、その時点は予測値を得るためにデータファイル内に保持した。

構造モデルおよび誤差モデル。比例的および結合した誤差モデルを個体内の変動性について調べた。

点検手順。最終モデル（すなわち、ＮＯＮＭＥＭ制御ストリーム）を十分に校正して正確さを保証した。

共変動分析。患者の数が少ないために共変動分析は実施しなかった。

評価手順。最終モデルの評価は、標準グラフィック評価法によって実施した。

構造モデル：標準１および２コンパートメントモデルを調べた。さらに、飽和性のクリアランスおよび／または分布を含むモデルを試験した。

結果
前臨床ＰＫ／ＰＤモデルの予測値。静脈内投与の後すぐ（１０分）に、一般的なヒトＩｇＧパラメータ（表１５参照）を用いてＰＫモデルで１−７Ｆ９の血漿濃度を正確に予測した。最大血漿濃度は主として中心容積の大きさに関係し、これは、ヒトについてはかなり十分に確定されているので、このパラメータは最も確かに予測されるものであり得ることが予期される。後の時点での予測については、動力学的プロセス（クリアランス、分布）が作用しているので、観察されるようにあまり確かな予測は期待できない（以下を参照）。

同様に、最大占有率（投与の２時間後）をモデルによって十分に予測した（表１６）。ほぼ同じ時点での血漿濃度およびＫＩＲ占有率がいずれも十分に予測されれば、前臨床ＰＫ／ＰＤモデルに含まれる高い初期親和性は、ヒトにおける投与後の早期の時点でＫＩＲ占有率を予測するために実際に適切であると結論付けることができる。

ヒトにおける初期ＫＩＲ親和性は、多くのデータポイントの１−７Ｆ９血漿濃度がＬＯＱよりも低かったので、データから近似されるだけであろう。しかしながら、占有率データは、図１３（投与の２時間後のＫＩＲ占有率を１−７Ｆ９の血漿濃度に対して示す）に見られるように、初期親和性が４ｎｇ／ｍｌの予測される値に近いことを示した。前臨床ＰＫ／ＰＤモデルは、親和性は時間と共に減少し得ると予測した。これまでわずかなデータポイントにしか基づいていないが、投与の２４時間後から６週間後までに得られる占有率データについて、このような傾向は実際に観察された（図１４）。２０ｎｇ／ｍｌのＫｄとの一時的な適合がプロット上に重ね合わせられた。前臨床モデルは、プロットにも示されるように、２４時間におけるＫｄを９ｎｇ／ｍｌであると予測した。

投与後の最初の数日、ＫＩＲ受容体の不飽和化の時間経過は、前臨床ＰＫ／ＰＤモデルによって十分に記載された。その後の時点における中程度の逸脱は恐らく、血漿濃度が、ヒトＰＫを予測するために使用される一般的なＩｇＧＰＫパラメータから予期されるよりもいくらか速く低下するためであった。それでもやはり、最大占有率については、基礎を成す血漿濃度はモデルによって十分に予測された。

集団ＰＫモデル。モノクローナル抗体について予期されるように、血漿濃度の時間経過は二重指数関数パターンに従った。従って、２コンパートメントモデルは、１コンパートメントモデルよりも良く、データへのより良い適合を与えた。

分布相において用量比例性でない傾向が見られ、より低い用量は高用量よりも急速に分配された。この更新モデルのためのＰＫパラメータは表１７に示される。

これまで得られたデータから、クリアランスは、前臨床ＰＫ／ＰＤモデルで使用した０．１２ｍｌ／ｈ／ｋｇのヒトＩｇＧの一般的なものよりも高い（約４倍）ようであった。理論に拘束されないが、この矛盾は、膜結合型標的に結合する抗体の場合に観察されることが多いように１−７Ｆ９が標的媒介性の処分を受けることを示唆し、１−７Ｆ９のクリアランスがより高い用量で飽和性であり得ることを暗示し、従ってより長い末端半減期をもたらし得る。分布容積についても同じ考察が適用され、これは予測されるよりもわずかに高くなるであろう。しかしながら、上記の探索的分析によっても示されるように、中心分布容積の大きさはかなり十分に予測される（０．０４７対０．０４ｌ／ｋｇ）。

結論
全体として、前臨床ＰＫ／ＰＤモデルによって予測される特徴は、これまで得られた臨床データにおいても観察された。最大占有率および最大１−７Ｆ９血漿濃度は十分に予測された。モデルによっても予測されたように、親和性は時間と共に変化し得る。

実施例１２ − 更新ＰＫ／ＰＤモデルに基づいた投与計画
前の実施例で記載したように得られたＰＫパラメータを適用して、臨床試験で使用される抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）用量レベルの最適な投与頻度を決定した。

１−７Ｆ９を用いる臨床治療における投与頻度は、飽和に必要とされる定常状態の血漿濃度と、１−７Ｆ９のクリアランスおよび分布容積とに依存する。

最大占有率は、初めは高親和性（予備的な結果は約４ｎｇ／ｍｌを示す）によって支配されるが、その後飽和を維持するために必要とされる血漿濃度はより高い（予備的な結果は約２０ｎｇ／ｍｌを示唆する）。

９５％よりも高い占有率を得るために必要とされる濃度（本明細書ではＳａｔＣｏｎｃと呼ばれる）は、結合のためのＫｄよりも約２０倍高い（式１０を参照）。投与間隔を決定するために、血漿濃度は、９５％よりも高いＫＩＲ占有率を維持するために間欠期においていつもＳａｔＣｏｎｃよりも高くなければならないと仮定した。

投与間隔の計算は式１１に基づいた（ガブリエルソン（Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ）Ｊ ＆ ウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）Ｄ、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ．第３版、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ ２０００年）。

式中、Ｖ_ｄは定常状態の分布容積であり（表１７のＶ１＋Ｖ２）、Ｄは用量であり、Ｃｌ＝クリアランスであり、ｔａｕ＝投与間隔である。再編成によって、ｔａｕは、

であることが分かる。

ｔａｕは、表１７からのＰＫパラメータおよびＳａｔＣｏｎｃ＝４００ｎｇ／ｍｌを用いて、０．０１５ｍｇ／ｋｇよりも高い用量について決定した。より低い用量に対しては、式１２は、投与の２４時間後に現れるより低いＫｄに基づいているので使用できなかった。代わりに、投与間隔は、データの外挿およびスタッガリングによって、繰り返し投与されて（そうであってもなくてもよい）親和性がその初期の高親和性に保持され得ると仮定して近似した。結果は表１８および１９に示される。

計算は、用量直線性のＰＫパラメータの仮定に基づいた。あるいは、観察された非直線性を含む（集団）ＰＫ／ＰＤモデルからのシミュレーションを用いて、ＫＩＲ飽和血漿レベルを与える用量が代わりに見出されてもよい。

実施例１３ − ヒト癌患者におけるＮＫ細胞の抗ＫＩＲ媒介性の活性化
ＮＫおよびＴ細胞に媒介される腫瘍細胞の死滅において、細胞溶解性顆粒の膜の内側を覆うリソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１またはＣＤ１０７ａ）は、ＮＫおよびＴ細胞表面上に露出される（ベッツ（Ｂｅｔｔｓ）ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ ２００３年、２８１：６５−７８頁）。臨床試験において、ＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａの発現の査定は、ＮＫ細胞に媒介される腫瘍細胞の死滅の可能で信頼できるマーカーであると示された（コッホ（Ｋｏｃｈ）ら、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２００６年、２４４：９８６−９２頁）。

ＡＭＬ患者の抗ＫＩＲ治療を調べる進行中の臨床試験では、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａを査定した。血液サンプルを採取し、赤血球を溶解し、末梢血細胞を洗浄し、続いて、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ５６、およびＣＤ１０７ａに対する抗体で染色した。データは、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを有するＢＤ ＦＡＣＳｃａｎｔｏにおいて獲得した。

結果は、ＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａのクリアアップ−調節を示したが、Ｔ細胞では示さなかった。単一の抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）用量（０．０００３、０．００３および０．０１５ｍｇ／ｋｇ）で治療した８人の患者のうち合計６人において、投与の２４時間後にＮＫ細胞においてＣＤ１０７ａレベルを増大させた（図１５）。

さらに、多サイクルの抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）（上記と同じ用量、最大６回までの繰り返しの用量で与えられる）で治療したＡＭＬ患者において、繰り返しの投与の後に、ＣＤ１０７ａレベルの増大が観察された。腫瘍細胞による患者ＮＫ細胞のエキソビボ刺激によって、ＣＤ１０７ａのレベルの増大は、腫瘍細胞の死滅の増大と一致する。多発性骨髄腫の患者において、抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の投与の際のＣＤ１０７ａの上方制御は、５人の患者の中の合計４人で観察された。

ＣＤ１０７ａに加えて、ＭＩＰ−１β（マクロファージ炎症性タンパク質−１β）も、ＮＫ細胞活性化の頑強なマーカー、ならびにＮＫ細胞媒介性の抗腫瘍効果の強力なＮＫ細胞化学誘引物質および刺激物質であることが示されている（ハンナ（Ｈａｎｎａ）ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４年、１７３：６５４７−６３頁、ルオ（Ｌｕｏ）ら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４年、１：１９９−２０４頁）。１−７Ｆ９の投与時、ＭＩＰ−１βの血清レベルの増大は、ＡＭＬおよび多発性骨髄腫における試験を受けた１２人の患者の中の合計１１人で観察された。

まとめると、これらの結果は、癌患者の抗ＫＩＲ治療が、急速にそして反復して、ＮＫ細胞活性化および腫瘍細胞の死滅を可能にすることを明示した。

実施例１４ − 抗ＫＩＲ媒介性の腫瘍マーカーの低減
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において、微小残存病変の検出は、リスク層別化および再発の早期発見のために重要性が高まっている。ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ−１）転写物は、骨髄性白血病の９０％よりも多くで過剰発現されることが示されている。ＷＴ−１は腫瘍量と十分に相関し、ＡＭＬにおける治療に対する応答をモニターする分子のための価値のある手段であることが証明されている。さらに、ＷＴ−１レベルの増大は、臨床的な再発に先行する（キローニ（Ｃｉｌｌｏｎｉ）ら、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００４年、１１２：７９−８頁）。

ＡＭＬ患者の抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）治療を調べる進行中の臨床試験において、骨髄および血液サンプルにおいてＷＴ−１レベルを測定した。ＷＴ−１レベルは、製造業者の指示に従ってＩｐｓｏｇｅｎからのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ＰＱＰＰ−０１）によって査定した。抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の投与の際、骨髄または血液のいずれかのＷＴ−１レベルの低下は、６人の患者のうち合計４人において観察された。

多発性骨髄腫は、骨髄中の悪性血漿細胞のモノクローナル増殖を特徴とする悪性のＢ細胞障害である。疾患の特徴は、血清および／または尿中の高レベルのモノクローナル（Ｍ）免疫グロブリン（Ｍタンパク質）である。臨床試験において、治療に対する応答を有するマーカーとしてＭタンパク質を日常的にモニターすることは、標準的な臨床業務である（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２００７年、４８：４６−５５頁）。

多発性骨髄腫患者の抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）治療を調べる進行中の臨床試験において、尿Ｍタンパク質は、製造業者の指示に従ってＨｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのゲル電気泳動アッセイ（３３９８）によって査定した。抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）の投与の際、尿Ｍタンパク質の低下は、４人の評価可能患者のうち合計２人において観察された。

まとめると、これらの結果は、癌患者の抗ＫＩＲ（１−７Ｆ９）治療が、抗腫瘍応答を誘発できることを明示した。

実施例１５ − 製剤試験
この実施例では、６ヶ月の安定性の設定において５つの異なる１−７Ｆ９製剤を試験した。

材料および方法
１−Ｆ７９の５つの異なる製剤（１０ｍｇ／ｍＬの１−７Ｆ９、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１６０〜２４０ｍＭのスクロース、０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、ｐＨ７．０）は、表２０のスケジュールに従って、３つの異なる温度において６ヶ月までの貯蔵期間にわたって、ｐＨ、概観、ＧＰ ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＩＥＦに基づいて分析した。製剤についての詳細は表２１に提供される。

Ｗａｔｅｒｓ ２６９５システムにおいてゲル浸透ＧＰ ＨＰＬＣを実行し、移動相が１．０ｍＬ／分の流速のｐＨ７．０の０．１Ｍのリン酸ナトリウムであることを除いて、本質的に実施例３に記載されるとおりに分析を実施した。Ｃｈｉｒａｓｃａｎ ＣＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）において円二色性を行った。

結果
結果は、表２２Ａ〜Ｃ、２３Ａ〜Ｃ、２４Ａ〜Ｃ、および２５Ａ〜Ｃに示される。

６ヶ月後、５つの異なる製剤間で実質的な差異は観察できず、これらは全て抗体医薬品に適した高品質であることが示され、ｐＨ、概観、ＧＰ−ＨＰＬＣ、生物活性によって分析されたときに、実質的な差異は示さなかった。円二色性によっても差異は検出できなかった。さらに、この実験で試験したポリソルベート８０の濃度（０．０１０〜０．０５０％は、以前の設定よりも１０〜５０倍高いにもかかわらず、試験パラメータに対する実際のポリソルベート濃度の実際の影響は検出できなかった。しかしながら、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２０ｍＭのスクロース、０．００１％のポリソルベート８０（ｐＨ７．０）を含む製剤は、優れた安定特性に加えて、低リン酸含量および正しい容量オスモル濃度の両方を有することの利点を有した。

本明細書で引用される刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は参照によってその全体が本明細書に援用され、本明細書中のどこか他のところで成された特定の文書の援用が離れて提供されることに関係なく、あたかも各参考文献が参照によって援用されると個々にそして明確に示され、その全体が本明細書で説明されたかのように同じ程度まで援用される（法律で許される最大範囲まで）。

「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の指示語の使用は、本発明を説明するという状況では、本明細書において他で指示されない限り、または文脈により明らかに否定されない限りは、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。

他で規定されない限り、本明細書において提供される全ての正確な値は、対応する概略値を代表する（例えば、特定の因子または測定に関して提供される全ての正確な典型的な値は、必要に応じて「約」によって修飾される対応する概略測定値も提供すると考えることができる）。さらに、どの群の値における「約」という用語の使用も、他で指示されない限りは、このような群のそれぞれの値に対する支持を提供する（本明細書中のこのような使用法における矛盾にかかわらず）ことが意図される（例えば、約１、２、または３という語句は、「約１」、「約２」、および「約３」に対する支持を提供すると解釈されるべきである。）。

本明細書における値の範囲の列挙は、単に、本明細書において他で指示されない限りは、その範囲の下端点と同じ桁および同じレベルの有意性（すなわち、全て同様の有効数字）内にある範囲の中に含まれる別々の各値を個々に指す簡単な方法としての機能を果たすことだけが意図され、別々の各値は、あたかも本明細書に個々に列挙されたかのように本明細書に援用される。従って、例えば、本明細書における１〜１００の範囲は、１〜１００の間の（および１、１０を含む）それぞれの整数（すなわち、１、２、３、４、．．．９８、９９、および１００）に対する支持を提供し、０．１〜１の範囲は、これらの端点の間および端点を含む、０．１と同じ桁およびレベルの優位性の各値（すなわち、０．１、０．２、０．３、．．．０．９、１．０）に対する支持を提供する。

１つまたは複数の要素に関して「含む」、「有する」、「包含する」、または「含有する」などの用語を用いて本発明の任意の態様または実施形態を本明細書中で説明することは、他で規定されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限りは、その特定の１つまたは複数の要素「からなる」、「から本質的になる」、または「実質的に含む」本発明の同様の態様または実施形態に対する支持を提供することが意図される（例えば、本明細書において特定の要素を含むと説明される組成物は、他で規定されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限りは、その要素からなる組成物も説明すると理解されるべきである）。

本明細書において提供されるいずれかおよび全ての例、または例となる言葉（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ（など）」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することだけが意図され、他で主張されない限りは、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言葉は、特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されてはならない。

本発明は、適用法令によって認められるように、本明細書に包含される特許請求の範囲および／または態様において列挙される主題の全ての変更および等価物を含む。

本発明の例示的な実施形態
本明細書に記載される本発明をより良く説明するために、ここで本発明の例示的な実施形態および特徴の非限定的なリストが提供される。これらの実施形態は、本明細書で提供される発明を実施するための形態においてより詳しく説明されており、本発明の追加的な実施形態、特徴、および利点はそれから明らかであろう。

以下の実施形態は、ＮＫ細胞活性の調節を必要としている患者においてＮＫ細胞活性を調節するための組成物に関する。
１． ＮＫ細胞活性の調節を必要としている患者においてＮＫ細胞活性を調節する方法であって、少なくとも１つのヒト阻害性ＫＩＲに結合する抗体を、約０．０００３〜約３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で患者に投与することを含む方法。
２． 用量が約０．０７５〜約３ｍｇ／ｋｇの範囲である、実施形態１の方法。
３． 用量が、約０．０００３、約０．００３、約０．０１５、約０．０７５、約０．３、約１、および約３ｍｇ／ｋｇから選択される、実施形態２の方法。
４． 投与を少なくとも１回繰り返すことを含む、実施形態１の方法。
５． １日３回〜２ヶ月間に１回の範囲の投与頻度で投与が繰り返される、実施形態１の方法。
６． 用量が少なくとも３回投与される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
７． 用量が少なくとも６回投与される、実施形態１４の方法。
８． 抗体が静脈内に投与される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
９． ＮＫ細胞の表面における阻害性ＫＩＲへの抗体の結合が、ＮＫ細胞の細胞障害活性を増強する、先行する実施形態のいずれかの方法。
１０． 抗体が交差反応性の抗ＫＩＲ抗体である、先行する実施形態のいずれかの方法。
１１． 抗体が、
（ａ）約２〜約６ｎｇ／ｍｌの高親和性Ｋｄ、
（ｂ）約１０〜約３０ｎｇ／ｍｌの低親和性Ｋｄ、
（ｃ）約０．２５〜約０．７５ｍｌ／ｈ／ｋｇのクリアランス、および
（ｄ）約５０ｍｌ／ｋｇ〜約１７５ｍｌ／ｋｇの分布容積
のうちの１つまたは複数の特性を有する、先行する実施形態のいずれかの方法。
１２． 抗体が（ａ）〜（ｄ）の特性を全て有する、実施形態１１の方法。
１３． 抗体が、抗体１−７Ｆ９の可変重（配列番号３）領域配列および可変軽（配列番号２）領域配列を含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
１４． 抗体が、配列番号１の配列を含む重鎖を含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
１５． 最初の用量の２４時間後に患者から採取した血液サンプル中のＮＫ細胞において、患者が増大したＣＤ１０７ａレベルを有する、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
１６． 血液サンプル中のＴ細胞において増大したＣＤ１０７ａレベルを有さない、先行する請求項のいずれかの方法。
１７． ＮＫ細胞における少なくとも約５０％のＫＩＲ占有率をもたらす、先行する実施形態のいずれかの方法。
１８． 少なくとも約９０％のＮＫ細胞におけるＫＩＲ占有率をもたらす、先行する実施形態のいずれかの方法。

以下の実施形態は、患者の癌の治療方法および関連事項に関する。
１． 血液中のＮＫ細胞において少なくとも約３ヶ月間少なくとも約９５％のＫＩＲ占有率を達成する用量および投与頻度で抗ＫＩＲ抗体を投与することを含む、患者の癌の治療方法。
２． 用量が、約０．００３〜約３ｍｇ／ｋｇの範囲である、実施形態１の方法。
３． 用量が、約０．０７５〜約３ｍｇ／ｋｇの範囲である、実施形態１の方法。
４． 用量が、約０．０００３、約０．００３、約０．０１５、約０．０７５、約０．３、約１、および約３ｍｇ／ｋｇから選択される、実施形態２の方法。
５． 投与頻度が、１日１回〜２ヶ月間に１回の範囲である、実施形態１の方法。
６． 投与頻度が、１週間に約１回〜２ヶ月間に約１回の範囲である、実施形態５の方法。
７． 投与頻度が、１ヶ月に約１回である、実施形態６の方法。
８． 投与頻度が、１日に約３回、約２回、および約１回、１週間に約５回、約４回、約３回、および約２回、ならびに２、４、および６週間に約１回から選択される、実施形態５の方法。
９． 約０．０７５〜約０．３ｍｇ／ｋｇの用量が、１週間に約２回〜１ヶ月に約１回投与される、実施形態１の方法。
１０． 約０．３〜約１ｍｇ／ｋｇの用量が、１ヶ月に約１回〜約２回投与される、実施形態１の方法。
１１． 約１〜約３ｍｇ／ｋｇの用量が、１ヶ月に約１回〜２ヶ月間に約１回投与される、実施形態１の方法。
１２． 投与頻度が、１ヶ月に約１回である、実施形態１０および１１のいずれかの方法。
１３． 用量および投与頻度が、以下の組み合わせのいずれか１つから選択される、実施形態１の方法。

１４． 用量が少なくとも３回投与される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
１５． 用量が少なくとも６回投与される、実施形態１４の方法。
１６． 血液中のＮＫ細胞において少なくとも約６ヶ月間少なくとも約９５％のＫＩＲ占有率を達成する用量および投与頻度で抗ＫＩＲ抗体を投与することを含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
１７． 癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭｙ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、結腸直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、または悪性メラノーマである、先行する実施形態のいずれかの方法。
１８． 抗体が静脈内に投与される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
１９． ＮＫ細胞の表面における阻害性ＫＩＲへの抗体の結合が、ＮＫ細胞の細胞障害活性を増強する、先行する実施形態のいずれかの方法。
２０． 抗体が交差反応性の抗ＫＩＲ抗体である、先行する実施形態のいずれかの方法。
２１． 抗体が、
（ａ）約２〜約６ｎｇ／ｍｌの高親和性Ｋｄ、
（ｂ）約１０〜約３０ｎｇ／ｍｌの低親和性Ｋｄ、
（ｃ）約０．２５〜約０．７５ｍｌ／ｈ／ｋｇのクリアランス、および
（ｄ）約５０ｍｌ／ｋｇ〜約１７５ｍｌ／ｋｇの分布容積
のうちの１つまたは複数の特性を有する、先行する実施形態のいずれかの方法。
２２． 抗体が（ａ）〜（ｄ）の特性を全て有する実施形態２１の方法。
２３． 抗体が、抗体１−７Ｆ９の可変重（配列番号３）領域配列および可変軽（配列番号２）領域配列を含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
２４． 抗体が、配列番号１の配列を含む重鎖を含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
２５． 最初の用量の約２４時間後に患者から採取した血液サンプル中のＮＫ細胞において、患者が増大したＣＤ１０７ａレベルを有する、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
２６． 血液サンプル中のＴ細胞において増大したＣＤ１０７ａレベルを有さない、先行する請求項のいずれかの方法。
２７． 患者がＡＭＬを患っており、１回または複数回の抗ＫＩＲ抗体の用量の後に、血液および／または骨髄中のウィルムス腫瘍遺伝子１転写物のレベルが低下される、先行する実施形態のいずれかの方法。
２８． 患者がＭＭｙを患っており、１回または複数回の抗ＫＩＲ抗体の用量の後に、尿中のＭタンパク質のレベルが低下される、先行する実施形態のいずれかの方法。

以下の実施形態は、本発明に従う典型的な製品（例えば、キット）を説明する。
１． （ａ）抗ＫＩＲ抗体を含む容器と、
（ｂ）患者の癌を治療するための説明書を含む添付文書と、
を含む製品であって、説明書には、約０．００３〜約３ｍｇ／ｋｇの抗ＫＩＲ抗体の用量が１日に約１回〜２ヶ月間に約１回の頻度で患者に投与されることが示されている製品。
２． 用量が約０．０７５〜約０．３ｍｇ／ｋｇであり、投与頻度が１週間に約２回〜１ヶ月に約１回である、実施形態１の製品。
３． 用量が約０．３〜約１ｍｇ／ｋｇであり、投与頻度が１ヶ月に約１〜約２回である、実施形態１の製品。
４． 用量が約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇであり、投与頻度が１ヶ月に約１回〜２ヶ月間に約１回である、実施形態１の製品。
５． 投与頻度が１ヶ月に約１回である、実施形態３０および３１のいずれかの製品。
６． 用量および投与頻度が、以下の組み合わせのいずれか１つから選択される、実施形態１の製品。

７． 第２の薬剤を含む容器をさらに含み、添付文書が第２の薬剤で患者を治療するための説明書をさらに含む、実施形態１の製品。
８． 第２の薬剤が、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生薬、アポトーシス剤、阻害性ＫＩＲに結合する二次抗体、抗感染症薬、標的剤、および抗ＣＤ２０抗体である、実施形態７の製品。

本発明の以下の実施形態は、抗ＫＩＲ抗体の医薬品製剤に関する。
１． （ａ）約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体と、（ｂ）約１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約１６０〜２５０ｍＭのスクロースまたは約１００ｍＭのＮａＣｌと、（ｄ）約７のｐＨのポリソルベート８０と、を含む、薬学的に許容可能で活性な製剤。
２． 抗体が、中和抗ＫＩＲ抗体である、実施形態１の製剤。
３． 抗体が、交差反応性の抗ＫＩＲ抗体である、実施形態２の製剤。
４． 抗体が、配列番号３に従う重鎖配列を含む、実施形態３の製剤。
５． 抗体が、配列番号２に従う軽鎖配列を含む、実施形態４の製剤。
６． 重鎖配列が配列番号１を含む、実施形態５の製剤。
７． ＩｇＧ４抗体分子の濃度が約１〜１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態１〜３のいずれかの製剤。
８． ＩｇＧ４抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態７の製剤。
９． 約２０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２２０〜２５０ｍＭのスクロース、および約０．００１％のポリソルベート８０を含む、実施形態１〜８のいずれかの製剤。
１０． 約２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約２２０ｍＭのスクロースを含む、実施形態９の製剤。
１１． （ａ）配列番号１に従う重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約５０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２５０ｍＭのスクロースと、（ｄ）約７のｐＨの約０．００１％のポリソルベート８０とを含む、薬学的に許容可能で活性な製剤。
１２． （ａ）配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約５０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２５０ｍＭのスクロースまたは約１００ｍＭの塩化ナトリウムと、（ｄ）約０．００１％のポリソルベート８０を含み、約７のｐＨを有する薬学的に許容可能で活性な製剤。
１３． （ａ）配列番号１に従う重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約２０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２２０ｍＭのスクロースと、（ｄ）約７のｐＨの約０．００１％のポリソルベート８０とを含む、薬学的に許容可能で活性な製剤。
１４． （ａ）配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約２０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約２２０ｍＭのスクロースまたは約１００ｍＭの塩化ナトリウムと、（ｄ）約０．００１％のポリソルベート８０とを含み、約７のｐＨを有する薬学的に許容可能で活性な製剤。
１５． 抗体が１−Ｆ７９である、実施形態１〜１４のいずれかの製剤。
１６． 製剤中の抗体の濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬである実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の製剤。
１７． 製剤中の抗体の濃度が、約０．０５ｍｇ／ｍＬである、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の製剤。
１８． （ａ）製剤中の抗体の濃度が約１０ｍｇ／ｍＬであるような量の、配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含むＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約８．４ｍｇ／ｍＬのリン酸水素ナトリウム（七水和物）と、（ｃ）約２．６ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウムと、（ｄ）約８５ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｅ）約０．０１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む成分の混合物から調製され、約７のｐＨを有する薬学的に許容可能で活性な製剤。
１９． 抗体が、配列番号１に従う重鎖を含む実施形態１８の製剤。
２０． 抗体が１−Ｆ７９である、実施形態１９の製剤。
２１． 製剤が、約５℃における約１ヶ月までの貯蔵中に約１０％未満の不純物含量を有する、実施形態１〜２０のいずれか１つの製剤。
２２． 製剤が、約５℃における約３ヶ月までの貯蔵中に、約５％未満の高分子量タンパク質不純物含量を有する、実施形態２１の製剤。
２３． （ａ）配列番号３に従う重鎖可変領域を含む重鎖および配列番号２に従う軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４抗体分子と、（ｂ）約５〜２０ｍＭのリン酸ナトリウムと、（ｃ）約１８０〜約２５０ｍＭのスクロースと、（ｄ）約０．００１〜０．１％のポリソルベート８０とを含み、約７のｐＨを有する薬学的に許容可能で活性な製剤。
２４． 製剤が、約２００ｍＭのスクロースを含む、実施形態２１に従う製剤。
２５． 製剤が、約５℃における約１ヶ月までの貯蔵中に、約１０％未満の不純物含量を有する、実施形態２３または実施形態２４の製剤。
２６． 製剤が、約５℃における約３ヶ月までの貯蔵中に、約５％未満の高分子量タンパク質不純物含量を有する、実施形態２３〜２５のいずれか１つの製剤。
２７． 製剤が等張性である、実施形態２３〜２６のいずれか１つの製剤。
２８． 製剤中の抗体の濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬである、実施形態２３〜２７のいずれか１つの製剤。
２９． 製剤中の抗体の濃度が、約０．０５ｍｇ／ｍＬである、実施形態２３〜７７のいずれか１つの製剤。
３０． 製剤中の抗体の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬである、実施形態２３〜２７のいずれか１つの製剤。
３１． 製剤中の抗体の濃度が、約１ｍｇ／ｍＬである、実施形態２３〜２７のいずれか１つの製剤。
３２． 静脈内注射によるヒト投与のための薬学的に許容可能な製剤の調製方法であって、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の濃縮製剤を約５℃からの温度で貯蔵することと、実施形態１の成分（ｂ）〜（ｄ）（しかし、抗体が欠けている）を含む溶液中に濃縮製剤を希釈して、すぐに投与できる（希釈）生成物を生じさせることと、すぐに投与できる生成物を、投与前の約２４時間までの間、約５℃からの温度で貯蔵することとを含む方法。
３３． 濃縮生成物が約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有し、希釈生成物が約０．０５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有する、実施形態３２の方法。
３４． 静脈内注射によるヒト投与のための薬学的に許容可能な製剤の調製方法であって、実施形態２１〜３１のいずれか１つに記載の濃縮製剤を約５℃からの温度で貯蔵することと、濃縮製剤を滅菌等張生理食塩水中に希釈して、すぐに投与できる（希釈）生成物を生じさせることと、すぐに投与できる生成物を、投与前の約２４時間までの間、約５℃からの温度で貯蔵することとを含む方法。
３５． 濃縮生成物が約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有し、希釈生成物が約０．０５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有する、実施形態３４の方法。
３６． 約３ｍＬ〜約３０ｍＬの容積の、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の製剤を含む貯蔵容器を含む医薬品。
３７． 容器が、約５ｍＬまたは約１０ｍＬの製剤を含む、実施形態３６の医薬品。
３８． 約３ｍＬ〜約３０ｍＬの容積の、実施形態２３〜３１のいずれか１つに記載の製剤を含む貯蔵容器を含む医薬品。
３９． 容器が、約５ｍＬまたは約１０ｍＬの製剤を含む、実施形態３８の医薬品。
４０． ＮＫ細胞活性の増強を必要としている患者においてＮＫ細胞活性を増強する方法であって、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の製剤を、約０．０００３ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）〜約３ｍｇ／ｋｇの抗体投与量で患者に投与することを含む方法。
４１． 投与量が、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇである、実施形態４０の方法。
４２． 患者が、癌と診断された患者である、実施形態４０または実施形態４１の方法。
４３． 患者が、急性骨髄性白血病と診断された患者である、実施形態４２の方法。
４４． 患者が、慢性骨髄性白血病と診断された患者である、実施形態４２の方法。
４５． 患者が、多発性骨髄腫と診断された患者である、実施形態４２の方法。
４６． 患者が、非ホジキンリンパ腫と診断された患者である、実施形態４２の方法。
４７． 患者が、結腸直腸癌と診断された患者である、実施形態４２の方法。
４８． 患者が、腎臓癌と診断された患者である、実施形態４２の方法。
４９． 患者が、卵巣癌と診断された患者である、実施形態４２の方法。
５０． 患者が、肺癌と診断された患者である、実施形態４２の方法。
５１． 患者が、乳癌と診断された患者である、実施形態４２の方法。
５２． 患者が、悪性メラノーマと診断された患者である、実施形態４２の方法。
５３． 患者が、感染症と診断された患者である、実施形態４０または４１の方法。
５４． 方法が、約０．０００３ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇの１回または複数回の追加の投与量を、前回の投与の少なくとも約６時間後に患者に投与することを含む、実施形態４０〜５３のいずれか１つの方法。
５５． 薬剤の調製における、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の製剤の使用。
５６． 癌または感染症の治療のための薬剤を調製するための、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の製剤の使用。
５７． 癌の治療のための薬剤として、約０．０００３ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇの抗体投与量を提供する量における、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の製剤の使用。
５８． 癌または感染症の治療において使用するための実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の製剤。
５９． 癌の治療において使用するための実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の製剤。

Claims (24)

1. 以下を含む、単離された抗ＫＩＲ抗体：
   （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域内の３つのＣＤＲ；
   （ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域内の３つのＣＤＲ；および
   （ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖内の定常領域。
2. 配列番号３に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
3. ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１または２に記載の抗体。
4. ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
5. 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸。
7. 請求項６に記載の核酸を含むベクター。
8. 請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
9. 適切な宿主細胞において請求項６に記載の核酸を発現させることを含む、抗ＫＩＲ抗体を生産する方法。
10. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗ＫＩＲ抗体を含む医薬組成物。
11. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体を含む、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭｙ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療に用いるための、医薬組成物。
12. １ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの用量が１ヶ月に１回〜２ヶ月に１回投与されるものである、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 用量および投与頻度が（ａ）１ｍｇ／ｋｇを１ヶ月に１回および（ｂ）３ｍｇ／ｋｇを２ヶ月に１〜２回から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
14. 該用量が少なくとも３回投与されるものである、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
15. 血液中のＮＫ細胞において少なくとも６ヶ月の間少なくとも９５％のＫＩＲ占有率を達成する用量および投与頻度で投与されるものである、請求項１２〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。
16. 最初の用量の２４時間後に採取した血液サンプル中のＮＫ細胞において、患者が投与前のＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａレベルと比較して増大したＣＤ１０７ａレベルを有する、請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
17. 該投与される抗ＫＩＲ抗体が前記ＫＩＲに対して２ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌの高親和性Ｋｄを有するものである、請求項１２〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
18. 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭｙ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体の使用。
19. 該抗体が、１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、１ヶ月に１回〜２ヶ月に１回の投与頻度で投与されるものである、請求項１８に記載の使用。
20. 用量および投与頻度が（ａ）１ｍｇ／ｋｇを１ヶ月に１回および（ｂ）３ｍｇ／ｋｇを２ヶ月に１〜２回から選択される、請求項１９に記載の使用。
21. 該用量が少なくとも３回投与されるものである、請求項１９または２０に記載の使用。
22. 血液中のＮＫ細胞において少なくとも６ヶ月の間少なくとも９５％のＫＩＲ占有率を達成する用量および投与頻度で投与されるものである、請求項１９〜２１のいずれかに記載の使用。
23. 最初の用量の２４時間後に採取した血液サンプル中のＮＫ細胞において、患者が投与前のＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａレベルと比較して増大したＣＤ１０７ａレベルを有する、請求項２０〜２２のいずれかに記載の使用。
24. 該投与される抗ＫＩＲ抗体が前記ＫＩＲに対して２ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌの高親和性Ｋｄを有するものである、請求項１９〜２３のいずれかに記載の使用。

Images