JP6223207B2

JP6223207B2 - アトロジン−１抑制剤

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Publication number: JP6223207B2
Application number: JP2014013944A
Authority: JP
Inventors: 純嗣石川
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2014-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2017-11-01
Anticipated expiration: 2034-01-29
Also published as: JP2015140314A

Description

本発明は、アトロジン−１抑制剤およびそれを含有する筋萎縮予防または筋力低下予防・改善剤に関する。

高齢者は、加齢による筋萎縮や筋力の低下が認められ、筋肉損傷や骨折しやすくなるなどの傷害が発生しやすくなる。この治療・療養のための安静状態やギプス固定等の活動制限下におかれるとさらに筋力が低下してくる。
また一般に、高齢者に発生する筋肉の筋質量や筋力が減少する筋萎縮には、廃用性筋萎縮やサルコペニア等が挙げられる。筋萎縮が起こると、それに伴ってさらに筋機能の低下がみられるようになる。
高齢者は、筋力の低下から筋萎縮となり、筋萎縮からさらに上記のような悪循環に陥りやすく、最悪の場合には寝たきりになる。このため、生活機能を改善し、クオリティオブライフ（ＱＯＬ）を維持するためには、ある程度の強制的な運動により廃用性筋萎縮や筋機能の低下を抑制することができると言われている（非特許文献１：寝たきりゼロへの１０カ条の普及について、厚生省、平成３年）。

これまで、筋萎縮や筋機能の低下を防ぐ試みとしては、健常時に適度な運動の継続或いはリハビリテーションの理学療法等に限られており、より効果的な筋萎縮の抑制方法が望まれている。
すでに運動や理学療法のみならず、筋萎縮及びそれに伴う筋機能の低下、ひいては寝たきりを予防しうる成分の探索が行われている。
果実ポリフェノールによる筋萎縮抑制（特許文献１：特開２００１−８９３８７号公報）、リコピンによる筋蛋白分解抑制（特許文献２：特開２００４−５９５１８号公報）、スーパーオキシドジスムターゼによる筋肉の酸化ストレス軽減（特許文献３：特開２００６−６２９７６号公報）、カテキン類を有効成分とする筋機能低下抑制剤（特許文献４：特開２００８−１３４７３号公報）、ミオスタチンペプチドによるミオスタチン拮抗物質（特許文献５：特表２００８−５３０００４号公報）、トゲドコロ抽出物を有効成分とする筋力増強剤（特許文献６：ＷＯ２００８−１２３４１７号国際公開公報）、Ｌ−ロイシンを総必須アミノ酸中にモル比で３５〜６６％を含有させた骨格筋減少予防剤（特許文献７：特開２０１２−１３１８１９号公報）などが挙げられる。

一方、遺伝子的な研究もおこなわれており、筋萎縮原因遺伝子（アトロジン：ａｔｒｏｇｅｎｅｓ）が特定され廃用性筋萎縮の分子メカニズムが明らかにされてきた。とくにアトロジン−１と呼ばれる遺伝子の発現を抑制することで、廃用性筋萎縮を抑制できることが明らかになってきた（非特許文献２：生化学第８１巻第７号、６１４−６１８ページ、２００９年）。したがってアトロジン−１遺伝子の発現を抑制できれば、サルコペニアなどアトロジン−１遺伝子の発現活性化に伴って発生する筋萎縮を予防改善できるといわれている。

特開２００１−８９３８７号公報特開２００４−５９５１８号公報特開２００６−６２９７６号公報特開２００８−１３４７３号公報特表２００８−５３０００４号公報ＷＯ２００８−１２３４１７号国際公開公報特開２０１２−１３１８１９号公報

「寝たきりゼロへの１０か条」の普及について：平成３年３月７日老健第１８号（厚生省発表）雑誌「生化学」第８１巻第７号、６１４−６１８ページ、２００９年、日本生化学会発行

本発明の目的は、筋機能の低下や筋萎縮を抑制し、寝たきり予防に有用な医薬品又は飲食品を提供することにある。

そこで本発明者は、天然物由来の成分について検討を行ったところ、植物由来の天然成分であるグネチンＣに強いアトロジン−１遺伝子発現の抑制作用を見出した。

本発明は、次の構成からなる。
（１）グネチンＣを有効成分とするアトロジン−１遺伝子発現抑制剤。
（２）（１）に記載のアトロジン−１遺伝子発現抑制剤を含む筋萎縮抑制剤。
（３）（２）に記載の筋萎縮抑制剤を含む筋萎縮抑制のための飲食品。
（４）（２）に記載の筋萎縮抑制剤を含むサルコペニア予防・改善剤。

本発明により、アトロジン−１遺伝子発現の抑制剤が提供される。本発明のアトロジン−１遺伝子発現抑制剤はグネチンＣを有効成分としており、アトロジン−１の遺伝子発現を抑制することで最終的に廃用性筋萎縮あるいはサルコペニアの進行を抑制する。その結果筋肉筋機能の低下を抑える。したがって、寝たきり予防するための医薬または健康食品として利用できる。

グネチンＣが横紋筋由来の筋芽細胞において、アトロジン−１遺伝子の発現を抑制することを確認した、相対定量法（ΔΔＣｔ法）による測定結果を示すグラフである（マウスＡＣＴＢ遺伝子をレファレンス遺伝子とした場合の）。グネチンＣが横紋筋由来の筋芽細胞において、アトロジン−１遺伝子の発現を抑制することを確認した、相対定量法（ΔΔＣｔ法）による測定結果を示すグラフである（マウスＧＡＰＤ遺伝子をレファレンス遺伝子とした場合の）。

以下、本発明について詳述する。
本発明において、「筋萎縮」とは、筋細胞の減少や縮小により筋量が低下することをいい、長期間の安静臥床や骨折などによるギプス固定、あるいは微小重力暴露によるもの（廃用性筋萎縮という）、加齢に伴うもの（サルコペニアという。）が挙げられる。したがって筋萎縮の抑制とは、不活動や加齢に伴う筋量の低下を抑制することを意味する。
本発明は、グネチンＣを有効成分とするアトロジン−１の抑制剤である。アトロジン−１遺伝子が活性化すると骨格筋肉蛋白質の分解が促進され筋萎縮がすすむ。一方ＩＧＦ−１によって筋肉が肥大する際には、アトロジン−１遺伝子の発現が抑制され、筋肉が増強される。したがってグネチンＣは、筋萎縮やサルコペニアの予防・改善剤として利用できる。

本発明で用いるグネチンＣ（gnetin C）は、スチルベノイド（スチルベン誘導体）と呼ばれるポリフェノールのグループに分類される、レスベラトロールの一種である。体系名は、(2R,3R)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-3-(3,5-ジヒドロキシフェニル)-6-[(E)-4-ヒドロキシスチリル]-2,3-ジヒドロベンゾフラン-4-オールである。グネチンＣの構造式を下記化学式１に示す。

グネチンＣは、東南アジアに分布するグネモン（学名: Gnetum gnemon、別名 Melinjo 、メリンジョ）などのグネツム科植物の種子や実などに含まれスチルベン化合物である。また、ブドウのファイトアレキシンの一種として知られている。グネチンＣは、グネツムの種子（別名メリジョ）を各種抽出溶媒、好ましくはメタノール又はメタノールを用いてグネチンＣを抽出することができる。抽出されたグネチンＣは分取高速液体クロマトグラフィなどの分離精製手段によって分離、精製できる。
また本発明のグネチンＣは、有機化学的または微生物を用いて合成した高純度品を用いることができる。
抽出は、例えば、メリジョの種子にグネチンＣが多く含まれていることが知られているので、乾燥した後、抽出溶媒に一定期間浸漬するか、あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ、次いで濾過し、濃縮し、さらに上述の分取クロマトによって分取することができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。
上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、もしくはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。

本発明のアトロジン−１抑制剤は医薬製剤としてヒトおよび動物に投与することができる他、各種飲食品、飼料（ペットフード等）に配合しても摂取させることができる。

医薬製剤は、経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。
剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。
これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。

本発明の医薬製剤において、有効成分であるグネチンＣの投与量は、その純度、その剤型、また患者の年令、体重、適応症状などによって異なるが、例えば経口投与の場合は、成人であれば１日１回〜数回投与され、１日あたり１回約１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは３ｍｇ〜２０ｍｇ／人程度投与するのがよい。

飲食品の形態としては、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、または、液体状等任意に成形することができる。これらには、食品中に含有することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜含有させることができる。

本発明の飲食品中に含まれる有効成分であるグネチンＣの含有量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができ、例えば、１〜１０質量％程度とすることができる。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。従ってこのような場合には、本発明の飲食品は、グネチンＣを含有し、筋萎縮により活動困難となる種々の疾患の予防または改善等に用いられるものである旨の表示を付した飲食品とすることができる。

以下、本発明を実施例、参考例に基づきさらに詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、配合量はすべて質量％で示す。

実施例
＜横紋筋筋芽細胞におけるアトロジン−１遺伝子の抑制試験＞
マウス横紋筋筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞株は筋タンパク質合成系や分解系の研究や筋分化の研究に用いられており、筋肉の遺伝子発現を観察する目的に適している。

１．試験試料
市販されているメリンジョから精製されたグネチンＣの高純度試薬（和光純薬工業社製）を試験試料とした。また比較対象のためレスベラトロール類に属する化合物とされている、赤ワイン由来のピセアタンノール（Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ）を用いた。
ピセアタンノールは下記構造式を有するグネチンＣに類似したスチルベノイド化合物でありレスベラトロール類に分類される。

２．細胞株及び培養
マウス横紋筋筋芽細胞株であるC2C12細胞をリアルタイムPCR（Polymerase Chain Reaction）検討用に用いた。C2C12細胞は、筋タンパク質合成系や分解系の研究や筋分化の研究に用いられている。一方、マウスの骨格筋で、筋萎縮に伴い、アトロジン−１遺伝子の発現増加が報告され、ラット骨格筋やヒトの骨格筋でも、老化に伴い、アトロジン−１遺伝子の増加が報告されている。C2C12細胞のmRNAの発現を指標として、アトロジン−１遺伝子の発現抑制を検討した。
C2C12細胞（DSファーマバイオメディカル株式会社）は、vial（＞１０^６個）で購入し、これをF₀世代と定義した。継代培養している間は、世代番号は変えないが、継代回数１０回以内の細胞を実験に供した（F₀細胞を凍結し、液体窒素液相中に保存し、この保存細胞を再融解して実験に用いる場合、この細胞をF₁世代とした）。C2C12細胞は、submaximal confluentに達したものを、１：２０の割合で継代培養（subculture）を行い、２４ｈｒ後に、約３０％confluentに達した細胞を用いた。C2C12細胞は、接着細胞であるため、細胞剥離には、acutase（Innovative CellTechnologies, Inc. 社San Diego、CA、USA）を用いた。細胞培養用培地としては、低グルコース（１，０００ mg/L、D-glucose）のDMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）を基本液体培地（５００mL、12320-032、20mM HEPES［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid］、110mM ピルビン酸ナトリウム含有、Life Technologies Japan社、八丁堀、東京）として選択し、10%HyClone（登録商標）ウシ胎仔血清（FBS［Fetal Bovine Serum］: Australian、Lot No.: 14301101、Thermo Scientific、Tauranga、New Zealand）及び抗菌−抗真菌剤（Antibiotic-Antimycotic、１０mg/L、Life Technologies Japan、八丁堀、東京[penicillin G; 100mg/mL、streptomycin sulfate; 100mg/mL、amphotericin B; 0.25mg/mL]）を添加した。０ｈｒに、食品由来成分として、最終濃度１０、３０mMのピセアタンノール（Lot No.: WEG2634、和光純薬工業株式会社、道修町、大阪）及び最終濃度１０、３０mMのgnetin C（Lot No. : TLG0417、和光純薬工業株式会社、道修町、大阪）を添加し、対照群の培養上清には、上記成分の溶媒であるエタノール（EtOH、９９．５v/v%、和光純薬工業株式会社、道修町、大阪）を成分添加時と同量（10mL）添加した。試験開始２４ｈｒ後及び４８時間後に培養上清を吸引除去し、mRNA回収サンプルとした。

３．アトロジン−１遺伝子発現抑制の測定
回収した細胞（10×10⁶個／サンプル）は、DPBS（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline、(-)CaCl₂(-)MgCl₂、Life Technologies Japan、八丁堀、東京）にて洗浄後、High Pure RNA Isolation Kit（Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）を用いて、total RNAをC2C12細胞より抽出した。次に、Transcriptor Universal cDNA Master（（４mL; Reverse Tanscriptase、１ mL; Transcriptor Reaction Buffer containing random hexamer primers、１mL; Template RNA、１４mL; PCR grade water：final volume ２０mL／tube）Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）を用いて、逆転写反応を行い、cDNAを作製した。このcDNA ２mLを使用し、LightCycler（登録商標） 480（Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）を用いて、final volume ２０mLの系で、リアルタイムＰＣＲを行った（Forward primer; ０．４mL、Reverse primer; ０．４mL、Probe ０．４mL、PCR grade water; ６．８mL、４８０ Master Mix; １０mL：final volume ２０mL／well）。なお、target primerは、Life Technologies Japan社にて合成したものを用い、reference primer及び、他の試薬（Probe、PCR grade water、４８０ Master Mix）は、Roche Diagonisitics社のものを用いた。

４．解析方法
データ処理は、LightCycler（登録商標） 480システム内の解析用ソフトウエアを用いた。プローブ法によりPCR反応を行ったため、ターゲット遺伝発現量は、リファレンス遺伝子発現量との比較による相対定量法：ΔΔCt法により算出した。リファレンス遺伝子には、マウスACTB（b-actin）及びマウスGAPD（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を使用した。
ターゲット遺伝子である、マウスアトロジン−１のプライマーシークエンスは、以下の通りである。
mアトロジン−1 forward：5’-AGTGAGGACCGGCTACTGTG-3’
mアトロジン−1 reverse：5’-GATCAAACGCTTGCGAATCT-3’

５．結果
測定、解析結果を図１、図２に示す。
１０μＭ、３０μＭのピセアタンノールは横紋筋筋芽細胞のアトロジン−１遺伝子の発現を抑制しなかったが、グネチンＣはアトロジン−１遺伝子の発現を抑制した。またピセアタンオールはアトロジン−１遺伝子の発現を促進させた。
アトロジン−１遺伝子の発現抑制はグネチンＣに特有な作用であるといえる。
以上の結果から、グネチンＣはアトロジン−１遺伝子の発現によって引き起こされる筋萎縮を抑制できることが判明した。

以下に示す表１〜表６の処方でサプリメント錠、ソフトカプセル剤、グミ、清涼飲料水、錠菓、キャンディを常法に従って製造できる。

Claims

グネチンＣを有効成分とするアトロジン−１遺伝子発現抑制剤。
請求項１に記載のアトロジン−１遺伝子発現抑制剤を含む筋萎縮抑制剤。
請求項２に記載の筋萎縮抑制剤を含む筋萎縮抑制のための飲食品。
請求項２に記載の筋萎縮抑制剤を含むサルコペニア予防・改善剤。