JP6220878B2 - バイオチップ上における生体分子ターゲットの定量ｌｉｂｓ計測のための方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、バイオチップ上における生体分子ターゲットの定量計測のためのプロセス及び装置に関する。本発明は、具体的には、プロテオミクスの分野に適用され、且つ、更に詳しくは、レーザー誘起プラズマに基づいた発光分光法の技法を介した蛋白質リン酸化の定量計測に適用される。

プロテオミクスの分野においては、細胞抽出物中に存在する蛋白質及びその個々の濃度の同定と、また、その活性を表すこれらの蛋白質の翻訳後修飾の同定と、に努力が傾注されている。これに関連して最も興味深い翻訳後修飾の１つがリン酸化であり、蛋白質リン酸化は、最近の生物学の分野における認識の観点において、或いは、治療の分野における診断の観点において、基礎をなすものである。この機能は、実際に、後成的調節、栄養的調節、ＤＮＡ修復、ホルモン調節などの多数の生物学的プロセスにおいて不可欠である。既知の単純且つ直接的な技法では、生物学的媒質中の蛋白質の同定とそのリン酸化の程度の評価は、不可能である。

１つの既知の分析法は、バイオチップ又はマイクロアレイと一般に呼称される支持部上においてアレイとして組織された「スポット」サイト（それぞれのスポットは、複数の同一プローブから構成されている）上に蛋白質抽出物を採取することにより、蛋白質抽出物を分析することを含む。分析対象である蛋白質抽出物中の対象となるターゲットが、特定のプローブによって同定され、これらのプローブは、所与の蛋白質又はその修飾のうちの１つと具体的に関連付けられた抗体、受容体、又はその他の任意の分子であってもよい。抗体の場合には、支持部は、「抗体バイオチップ」と呼称される。従って、適切な分析法を介して、同時に又は実質的に同時に、複数のターゲット生体分子が分析されてもよい。様々な技法によれば、このようにして抗体バイオチップ上において保持又は「分離」された要素の実際の分析を実行することができる。

バイオチップ上における核酸のリン酸化分析の場合に、１つの既知の技法は、レーザー誘起破壊分光法（ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）という用語に対応する略語であるＬＩＢＳによって呼称されるレーザー誘起プラズマに基づいた発光分光法の技法を介して、この分析を実行することを含む。この技法は、レーザービームにより、バイオチップの表面において、分離された試料を除去することと、プラズマを生成した後に、このプラズマを分光法を介して分析することとを含む。それぞれのレーザー照射ごとに、調査対象の化学要素の発光スペクトルを、試料の表面におけるレーザービームの合焦座標と共に、記録してもよい。この結果、適切な計算手段により、試料の表面の基礎的マップの確立が可能となろう。生物学的分析支持部上に存在している生体分子ターゲットの定量計測のための装置及びプロセスについては、例えば、参照文献（特許文献１）として公開された特許出願に記述されている。ＬＩＢＳ分析装置については、例えば、参照文献（特許文献２）として公開された特許出願に記述されている。

但し、バイオチップ上における蛋白質リン酸化のＬＩＢＳ分析は、原則的に、いくつかの問題点を有する。第１の問題点は、対象の信号を隠蔽する外因性リンの存在と関連している。第２の問題点は、生物学的分析のために通常使用されている支持部がＬＩＢＳ分析に適合していないという事実と関連しており、その理由は、このタイプの支持部上において形成されるプラズマが、受け入れ可能な条件下において分析不能であるからである。第３の問題点は、蛋白質などの生体分子は、非常にわずかな量のリンしか、その構造中に有しておらず、従って、ＬＩＢＳを介して検出するのが困難であるという事実と関連している。第４の問題点は、得られる信号が、対象の量の関数として、例えば、線形などのように、容易にモデル化可能な方式で変化しておらず、換言すれば、蛋白質の定量化のための信号の正規化に問題を有するという事実と関連している。

仏国特許出願公開第２９２９０１１号明細書 仏国特許出願公開第２９６４４５８号明細書

本発明の目的の１つは、ＬＩＢＳ法を介した生体分子ターゲットの定量分析のためのプロセス及び装置を提案することにより、少なくとも上述の欠点を克服することにある。本発明は、分光分析によって容易に分析可能なプラズマの形成を許容する適切な支持部及びプロセスを使用しており、プラズマによって放出されるＬＩＢＳ信号は、対象の量のアバンダンスに比例している。

この目的のために、本発明の主題の１つは、定量計測のためのプロセス及び装置である。更に詳しくは、本発明の主題の１つは、バイオチップ内に含まれる少なくとも１つのターゲットのレーザービームによって誘起されたプラズマの発光分光法による定量分析のためのプロセスであり、このプロセスは、前記少なくとも１つのターゲットと共に同時に除去されうるドライマトリックスの形成を許容するアジュバントの使用を伴っており、ドライマトリックスは、プラズマの分析特性を改善するように構成され、アジュバントは、そのスペクトル線が前記少なくとも１つのターゲットの定量分析のために使用されるスペクトル線の波長とは別個の波長を有する発光スペクトルを有することを特徴としている。

本発明の一実施形態においては、前記少なくとも１つのターゲットは、プローブ−ターゲット錯体がそれぞれのプローブとそれに対応するターゲットとの間に形成されるように、少なくとも１つのプローブを介してバイオチップ上において分離されてもよい。

本発明の一実施形態においては、前記アジュバントの使用により、非晶質構造のドライマトリックスの形成を許容してもよい。

本発明の一実施形態においては、前記アジュバントの使用により、結晶質構造のドライマトリックスの形成を許容してもよい。

本発明の一実施形態においては、ドライマトリックスは、プローブ−ターゲット錯体が、支持部の表面において入手可能であり、且つ、全体的に又は部分的に、前記ドライマトリックスの容積によって貪食（ｅｎｇｌｏｂｅ）されるように、形成されてもよい。

本発明の一実施形態においては、ドライマトリックス及びプローブは、支持部に固定されてもよい。

本発明の一実施形態においては、ドライマトリックスを形成するアジュバント分子は、プローブに対して直接的に錯体化されてもよい。

本発明の一実施形態においては、ドライマトリックスを形成するアジュバント分子は、プローブがアジュバント分子に固定され、アジュバント分子が支持部に固定された状態で、支持部に固定されてもよい。

本発明の一実施形態においては、支持部の表面上にアジュバントの層を配置することにより、ドライマトリックスの層が形成され、その後、このようにして支持部の表面に形成されたドライマトリックスの表面上にプローブを配置してもよい。

本発明の一実施形態においては、ドライマトリックスは、レーザーに使用されている波長がドライマトリックスの吸収スペクトルに含まれるように、その吸収波長がレーザービームの波長に近接している化合物によって形成されてもよい。

本発明の一実施形態においては、アジュバントは、水と、糖、多糖、及び二糖を有する群からの１つの要素と、の溶液を有してもよい。

本発明の一実施形態においては、それぞれのプローブは、内部標準を形成する正規化要素によってマーキングされてもよい。

本発明の一実施形態においては、それぞれのプローブは、グラフトにより、正規化要素によってマーキングされてもよい。

本発明の一実施形態においては、正規化要素は、ボロンによって形成されてもよい。

又、本発明の主題の１つは、複数のサイトを有する支持部を有する装置であり、それぞれのサイトは、複数のプローブを有し、プローブは、ドライマトリックスの形成を許容するアジュバントの分子に付随的にグラフトされている。

本発明の一実施形態においては、前記支持部は、有機化合物、モノリシック化合物、又はオルガノ−ダイアモンド化合物（ｏｒｇａｎｏ−ｄｉａｍｏｎｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を有してもよい。

又、本発明の主題の１つは、記述されている実施形態のうちのいずれか１つの実施形態に従ってプロセスを実行する溶液であり、この溶液は、ドライマトリックスの形成を許容するアジュバントを有することを特徴としている。

本発明の一実施形態においては、記述されている実施形態のうちの１つに従ってプロセスを実行する溶液は、レーザービームによって誘起されたプラズマの光学信号を正規化するための所与の割合の要素を有してもよい。

本発明によって提供される別の利点は、本発明によれば、例えば、蛋白質などの生体分子の、且つ、混合物中のリン含有量の、単純で、迅速で、定量的な、且つ、ベクトル的な分析が可能になるという点にある。

本発明によれば、定量分析は、ターゲット及び／又はスポットとして組織化されたプローブのアレイを有するバイオチップ上において実行される。それぞれのプローブのスポットは、分析対象の混合物中に存在するターゲット生体分子を認識及び分離する能力を有する。本発明の１つの特異性に従って、アジュバントを使用してドライマトリックスの形成を許容することが提案され、このマトリックスは、ターゲットと、或いは、プローブ−ターゲット錯体と、親密にリンクされている。「親密にリンクされる」という用語は、ここでは、ドライマトリックスが、バイオチップアレイのスポットにおけるターゲットの又はプローブ−ターゲット錯体のレーザー除去及びＬＩＢＳによって生成されるプラズマが、ターゲット生体分子又はターゲット−プローブ錯体に加えて、アジュバント分子及び／又はその分解要素を有するような方式で、ターゲット又はプローブ−ターゲット錯体を支持するか、貪食するか、又は取り囲むことを意味している。以下においては、ドライマトリックスは、バイオチップの乾燥後に、結晶質又は非晶質の形態の固体化合物の形態を有するものと見なされている。非限定的な例として、ドライマトリックスは、混合された結晶質又は非晶質相のアダクトの、即ち、プローブ、ターゲット、及びアジュバント分子の混合物の、形態を有してもよく、或いは、ターゲット及び／又はプローブを貪食していてもよい。バイオチップ支持部上のドライマトリックスの様々な構成については、例として、図２Ａ〜図２Ｄを参照して後述する。又、本発明によるプロセス又は装置は、必ずしもプローブと関連付けられてはいない支持部上において堆積又は分離された複数のターゲットを有するバイオチップに適用されてもよいことを認識されたい。

アジュバントは、具体的には、本質的にリン化されないように、且つ、抗原−抗体接合を変性させないように、選択されている。これは、第１に、アジュバント及びマトリックス自体を構成する分子の発光スペクトルが、リンを定量化するために、且つ、適宜、信号を正規化するために、使用される発光線とは異なっており、且つ、第２に、アジュバントは、ターゲット及び／又はプローブ−ターゲット錯体の交雑又は錯体化と整合性を有することを意味している。

ドライマトリックスの形成のために使用されるアジュバントは、例えば、溶解可能であってもよい。適切な溶液の例については、後述する。又、ドライマトリックスは、更には、分光法の技法を介した分析のためにレーザーによって生成されるプラズマの分析特性を改善するという利点を有するように、選択されている。具体的には、ドライマトリックスは、レーザーに使用されている波長がドライマトリックスの吸収スペクトルに含まれるように、その吸収波長が、使用されているレーザービームの波長に近接している化合物によって形成されてもよい。

本発明のその他の特徴及び利点については、添付図面との関連において一例として付与されている以下の説明を参照することにより、明らかとなろう。

本発明の一実装例による分析プロセスを示すフローチャートである。 本発明の一実装例によるプローブ／ターゲットを有するバイオチップ上における分析プロセスの一般的な原理を示す図である。 本発明の実装例による様々な構成における分析装置を概略的に示す図である。 図３Ａ及び図３Ｃにそれぞれ対応する構成における正規化要素をも有する分析装置を概略的に示す図である。

図１を参照すれば、本発明の任意の非限定的な例による分析プロセスは、バイオチップを調製する第１ステップ１０１を有してもよい。第１ステップ１０１の後には、ＬＩＢＳを介した分析の第２ステップ１０２が続いてもよく、第２ステップ１０２においては、プラズマが、具体的には、それ自体が既知である技法に従って、除去レーザーにより、実質的に分析対象のターゲット生体分子上において形成される。

調製ステップ１０１は、生体分子を、即ち、ターゲット及び／又はプローブを、支持部上に堆積させ、これに続いて乾燥させることを含む第１サブステップを有してもよく、第２サブステップは、任意選択の飽和サブステップの後に、任意選択により、複数のターゲット生体分子をその対応する抗体に結合させ、これにより、プローブマトリックスを形成することにより、支持部上において複数のターゲット生体分子を分離することを含んでもよい。従って、それぞれのターゲット生体分子は、それぞれのターゲット生体分子を支持部上に配置された状態で認識するプローブに固定される。

又、第１ステップ１０１においては、本発明の特異性に従って、ドライマトリックスの形成も実行される。形成されたドライマトリックスにより、第２ステップ１０２においてレーザーによって生成されるプラズマの発光分光法による相対的に良好な利用可能性の保証が可能になる。ドライマトリックスは、ターゲットと共に又はプローブ−ターゲット錯体と共に同時に除去されうるように、形成される。従って、対象のターゲット生体分子に狙いを定めた除去レーザーの照射により、隣接するドライマトリックスの一部分の除去が保証される。これを目的として、ドライマトリックスは、ターゲット生体分子又はプローブ−ターゲット錯体を完全に又は部分的に貪食するように、構成されてもよい。又、ドライマトリックスの近接性が、ターゲット生体分子又はプローブ−ターゲット錯体用のレーザー照射が隣接するドライマトリックスの一部分を除去するために十分なものである場合には、ドライマトリックスは、ターゲット生体分子又はプローブ−ターゲット錯体の下方に構成されてもよい。バイオチップ支持部上における所与のターゲット生体分子又は所与のプローブ−ターゲット錯体との関係におけるドライマトリックスの様々な可能な構成については、図３Ａ〜図３Ｄを参照して後述する。

又、ドライマトリックスは、ＬＩＢＳプラズマの分析特性の改善を許容するようにも、構成される。更には、このマトリックスは、適宜、プローブ−ターゲットの認識を変性させるべきではなく、且つ、それ自体がリンを含むべきでもない。

ドライマトリックスは、非晶質又は結晶質であってもよく、且つ、アジュバントによって形成されてもよい。アジュバントは、例えば、溶解可能なアジュバントであってよい。

又、実際に、特定の一実施形態においては、ある割合の分析対象の生体分子を有する記述されている実施形態のうちの１つによる分析プロセス用の溶液は、ドライマトリックスの形成を許容するアジュバントを有してもよい。ある実施形態において、アジュバントは、バイオチップをターゲット蛋白質と交雑させるために又は交雑後のバイオチップのすすぎのために使用される溶液のうちの少なくとも１つに導入されてもよい。この実施形態においては、錯体化及び／又はすすぎの後に、アジュバントは、具体的には、様々なスポットにおいてバイオチップの表面におけるドライマトリックスの形成を許容している。

その他の実施形態においては、ドライマトリックスを形成するアジュバントは、プローブ堆積溶液への導入により、或いは、プローブの堆積直後に、アジュバント分子をプローブの固定のために使用される支持部の表面上に直接的に化学的にグラフトすることにより、バイオチップの製造の時点における支持部上へのプローブの堆積ステップにおいて導入されてもよい。例えば、スクロース分子が、そのアルコール機能によってＳＯＣｌ_２によって活性化された状態で、バイオチップの表面上にグラフトされてもよい。

別の実施形態においては、アジュバント分子は、まず、バイオチップ支持部の表面上にグラフトされてもよく、且つ、次いで、必要に応じて、アジュバントの特性に基づいて活性化されてもよく、且つ、プローブが、アジュバント分子により、バイオチップの表面上にスポットとしてグラフトされてもよい。

有利には、少なくとも１つのすすぎ又は交雑溶液は、リンのものとは異なると共に前記金属要素のアバンダンスに比例したＬＩＢＳ信号を放出する金属性の又はハロゲン化された正規化要素を有してもよい。前記正規化要素は、具体的には、使用される装置に基づいてリンの分析のために選択された発光線と同一のスペクトルウィンドウ内に位置するように、選択されてもよい。好ましくは、発光線は、弁別されうるように、使用されるスペクトログラフの意味において異なっていてもよく、即ち、所与のスペクトログラフについて十分に離隔していてもよい。

一般に、正規化要素は、ドライマトリックスの形成を許容するアジュバントに導入されてもよい。

正規化要素は、例えば、ボロンであってもよく、分離された状態で採取されてもよく、分子に統合されるか又は分子ケージ又はクリプト内においてトラップされてもよく、且つ、ターゲットに対して再現可能な方式で接合されてもよい。

有利には、ボロンなどの正規化要素は、プローブ抗体に対して、或いは、任意選択により、ターゲットに対して、直接的に錯体化されてもよい。

ターゲット分子及び／又はプローブとの関係における正規化要素の構成の例については、図４Ａ及び図４Ｂを参照して後述する。

バイオチップを形成する支持部は、有機化合物を有するリンを含んでいない炭素に基づいた支持部であってもよく、即ち、炭素、水素、酸素、及び窒素元素の任意の組合せであってもよい。バイオチップを形成する支持部は、（ダイアモンドなどのように）モノリシックであるか、ガラス質であるか、或いは、オルガノ−ダイアモンドであり、これにより、良好な条件下における利用可能なプラズマの形成を促進してもよい。これは、ガラス質又は有機質の支持部上に堆積又はグラフトされたプローブによってカバーされたモノリシックなナノ粒子から構成された支持部であってもよい。

上述のドライマトリックスの形成を許容するアジュバントは、それ自体が、プローブ−ターゲット接合を変性させないように、且つ、リンを含まないように、構成されている。アジュバントは、例えば、スクロースやリンを含まない任意のその他の多糖などの多糖によって形成されてもよい。

上述の第２ステップ１０２は、適切な装置を使用したＬＩＢＳタイプの分光分析による分析を許容しており、且つ、それ自体が既知であるプロセスサブステップを有してもよい。第２ステップ１０２は、具体的には、少なくとも、強力なパルス化レーザービーム又は「除去ビーム」を放出する手段、分析対象の試料を運動させる手段、記録検出手段、及び計算手段を有するＬＩＢＳ分光分析を介した分析手段の使用を伴っている。

図２は、本発明の一実装例による分析プロセスの一般的な原理を示す図である。

本発明の一般的な原理によれば、本発明がターゲット蛋白質に適用される際には、複数のターゲット蛋白質２０１が、バイオチップの支持部２００上に複数のスポットとして堆積されてもよい。又、図２に示されている例においては、支持部２００は、ターゲット蛋白質２０１を認識する能力を有する複数のプローブ２１１をも有する。本発明による分析プロセスは、図２に示されている例においては、プローブ−ターゲット錯体を完全に貪食する、ドライマトリックス２０３の形成を許容する、例えば、溶解可能なアジュバントなどのアジュバント２０２の使用を伴っている。従って、図１を参照して先程述べた上述の第１ステップ１０１の後に、本発明の非限定的な図示の例における複数のターゲット蛋白質２０１及び複数のプローブ２１１を有するバイオチップには、上述の第２ステップ１０２において、図１を参照して説明したＬＩＢＳ分析が適用されてもよい。

図３Ａ〜図３Ｄは、ドライマトリックス及びバイオチップ支持部の様々な構成に対応する本発明の様々な実装例による分析装置を概略的に示す図である。

バイオチップ支持部上のターゲット生体分子、対応するプローブ、及びドライマトリックスの第１構成に対応する図３Ａに示されている一実施形態においては、バイオチップの支持部２００上に配置された状態でそれぞれのターゲット生体分子２０１を認識するプローブ２１１に固定されたそれぞれのターゲット生体分子２０１は、上述のように、適切なアジュバントによって形成されたドライマトリックス２０３の容積によって貪食されてもよい。プローブ−ターゲット生体分子の対２１１、２０１は、図示の例におけるように、ドライマトリックスによって完全に貪食されてもよく、或いは、ドライマトリックスにより、部分的にのみ貪食されてもよい。

第２構成に対応する図３Ｂに示されている一実施形態によれば、プローブ−ターゲット生体分子の対２１１、２０１を形成するためのプローブがその上部に配置されたバイオチップの支持部２００は、ドライマトリックス２０３により、その表面において飽和させられてもよい。第２構成によれば、例えば、プローブ−ターゲット生体分子の対２１１、２０１が既に存在しているバイオチップの支持部２００の表面上に、アジュバント層が配置されてもよい。このような一実施形態は、バイオチップの支持部２００の表面全体が、場合により、ドライマトリックス２０３によって飽和させられており、使用の容易性の観点において利点を有していよう。

第３構成に対応する図３Ｃに示されている一実施形態によれば、バイオチップの支持部２００上に配置されたそれぞれのプローブ−ターゲット生体分子の対２１１、２０１は、ドライマトリックス２０３を形成するアジュバントが、場合により、プローブ２１１に対して直接的に錯体化された状態で、ドライマトリックス２０３内において貪食されてもよい。

第４構成に対応する図３Ｄに示されている一実施形態によれば、ドライマトリックス２０３の層は、例えば、マトリックス上に直接的にグラフトされたプローブ２１１を配置する前に、バイオチップの支持部２００の表面上に均一にアジュバントの層を配置又はグラフトすることにより、形成されてもよい。ターゲット生体分子は、ドライマトリックス上において、直接的に、それに対応するプローブに対して錯体化又は交雑する。一代替モードは、プローブを支持部上にグラフトすることと、次いで、ターゲットを取り囲むように支持部上にマトリックスの分子をグラフトすることとを含んでもよい。第４実施形態は、産業的な観点において、大きな利点を有する。具体的には、従来型のバイオチップと同様に、ドライマトリックス２０３の層を形成した支持部上のバイオチップを有するキットを供給してもよい。この結果、操作者は、通常、通常の方式で進捗することにより、プローブ−ターゲット生体分子の対をこのようなバイオチップの表面上に配置することができる。

又、本発明の主題の１つは、バイオチップの表面におけるドライマトリックスの形成を許容するアジュバントを有するバイオチップの予備交雑、交雑、又はすすぎ用の少なくとも１つの溶液などのバイオチップの予備交雑又は交雑用の装置又は「キット」である。

従って、本発明の主題の１つは、バイオチップであってその支持部が、相応して、ドライマトリックス２０３の層をその表面に有するバイオチップでもある。

検討対象の実施形態とは無関係に、ターゲット生体分子上に形成されるドライマトリックス２０３の厚さは、平均で、１ミリメートル以下であることが有利となりうる。厚さが大きい場合には、レーザーによって形成されるプラズマに、実際に、分析が可能となるための妥当な割合で、ターゲット生体分子のトレースが含まれなくなるであろう。

記述されている実施形態のそれぞれにおいて、それぞれのプローブ２１１は、有利には、ＬＩＢＳによって得られる信号の正規化を可能にする内部標準を形成する正規化要素を有してもよい。本発明の１つの特異性によれば、上述のように、正規化要素は、例えば、グラフト法を介して、それぞれのプローブ２１１に対して直接的に錯体化される要素によって形成されてもよい。従って、プローブ２１１が抗体によって形成されている場合には、抗体には、グラフトにより、正規化要素によってラベルが直接的に付与されてもよい。正規化要素は、例えば、ボロンなどの元素によって形成されてもよい。

以下、それぞれ、上述の構成３Ａ及び構成３Ｃに対応する図４Ａ及び図４Ｂを参照し、ターゲット分子及び／又はプローブとの関係における正規化要素の構成の例について説明する。

図４Ａを参照すれば、正規化要素４０５は、例えば、グラフト法を介して、支持部２００上に配置されたプローブ２１１に直接的に固定されてもよい。プローブ２１１及びターゲット２０１によって形成された組立体は、図３Ａを参照して上述した第１構成に対応する構成に従って、ドライマトリックス２０３により、貪食されてもよい。

図４Ｂを参照すれば、正規化要素４０５は、例えば、グラフト法を介して、支持部２００上に配置されたプローブ２１１に直接的に固定されてもよい。このような例においては、ドライマトリックス２０３を形成するアジュバント分子は、図３Ｃを参照して上述した第３構成に対応する構成に従って、プローブ２１１に対して直接的に錯体化されてもよい。

アジュバントのスペクトル線は、正規化のために使用されるスペクトル線並びにターゲット及び／又はその翻訳後修飾の定量化のために使用されるスペクトル線を有する定量分析に使用されるスペクトル線の波長とは異なる波長を有する。

本出願人によって実行された本発明の実施形態のうちの１つによるプロセスの２つの定量化について、以下、詳細に説明することとする。本出願人は、具体的には、リン酸化された蛋白質の分析を、より詳細には、誘導結合されたプラズマ−原子発光分光分析（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ−ａｔｏｍｉｃ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）に対応する略語であるＩＣＰ−ＡＥＳによって一般に呼称されている誘導結合型発光分光分析タイプの分析法によって認定されたカゼインの既知の濃度の溶液が分析されるＡ２β−カゼイン蛋白質から再構成された体外モデルに基づいて、且つ、更には、分子ターゲットＨ２ＡＸのリン酸化の程度が随意に誘起されうる外因性リンを含む生物学的モデルにおいて、実行することにより、分析プロセスの定量化を実施した。この分析と関連するプロセス及び装置については、その他のターゲット生体分子の、且つ、具体的には、任意のリン酸化された蛋白質の、分析に適用されうるプロセス及び装置の本発明の非限定的な実装例に従って、以下において、詳細に提示する。後述する例は、決して、本発明を限定するものではなく、且つ、アジュバントが、それぞれのプロセスステップにおいて導入され、且つ、ドライマトリックスが、図２Ａを参照して上述した実施形態に従ってターゲット生体分子を貪食するように、バイオチップ支持部上においてその内部に形成される特定のケースに対応していることを理解されたい。但し、図２Ｂ〜図２Ｄを参照して上述した様々な代替モードも、選好を伴うことなしに、適用されてもよく、且つ、類似の結果をもたらすことになろう。又、アジュバントを単一のプロセスステップにおいてのみ導入することもできる。

バイオチップ上におけるターゲットの堆積例（プローブを含まない蛋白質チップ）
Ａ２β−カゼインの分子質量は、２３．９８３キロダルトンに等しい。この蛋白質は、例えば、凍結乾燥された形態で供給されてもよく、且つ、次いで、例えば、水（Ｈ_２Ｏ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びメチルシアニド（又は、アセトニトリル）を有する溶液を使用することにより、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に対応する略語であるＨＰＬＣによって一般に呼称されている方法を介して、純化されてもよい。蛋白質の濃度は、例えば、ＵＶ分光測光により、判定されてもよい。

ＬＩＢＳ分光分析による分析の有効性を評価するべく、基準計測値を提供するために、既知の且つ著名な信頼性の高い代替方法を介して、β−カゼインのリン酸化の分析を実行してもよい。この目的のために、ＩＣＰ−ＡＥＳタイプの分析法を利用することが可能であり、この方法は、液体化合物の基本組成を判定するための標準的な方法である。本出願人は、０、４、１２、及び２０μＭ（マイクロモル）の濃度を有するβ−カゼイン溶液のＩＣＰ−ＡＥＳ分析を実行した。

蛋白質リン酸化の定量化のためのＬＩＢＳ分光分析の感度を判定するべく、β−カゼインの様々な量が、Ｋａｐｔｏｎ−エポキシから製造された支持部上に直接的に堆積され、Ｋａｐｔｏｎ−エポキシ薄膜は、例えば、シアノアクリレート接着剤を使用することにより、（例えば、７．５×２．５ｃｍのスライドの形態の）鏡検ガラス上に接合される。

このようにして得られたβ−カゼイン溶液が、ｐＨ７．５の０．１Ｍのトリス緩衝溶液中において、０、４０、８５、１７０、２５７、及び３５０μＭの濃度に連続的に希釈され、この調製を「調製Ａ」と呼称し、ｐＨ７．５の０．１Ｍのトリス及び１ｍＭのスクロースを有する緩衝溶液中において、０、４０、８５、１７０、２５７、及び３５０μＭの濃度に連続的に希釈され、この調製を「調製Ｂ」と呼称し、且つ、ｐＨ７．５の０．１Ｍのトリス、１ｍＭのスクロース、及び０．５ｍＭのボロンを有する緩衝溶液中において、０、４０、８５、１７０、２５７、及び３５０μＭの濃度に連続的に希釈され、この調製を「調製Ｃ」と呼称する。これらの調製物のそれぞれは、Ｋａｐｔｏｎ−エポキシ薄膜上において５回の反復で個別に堆積され、且つ、室温において３０分間にわたって乾燥された。

抗体バイオチップの例
リンパ球が、ヘパリンが添加された人間の血液試料を開始物質とし、勾配細胞分離によって隔離されてもよい。これらの細胞は、リン酸塩によって緩衝された生理食塩水、即ち、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ）によって２回にわたって洗浄され、例えば、１０％のウシ胎児血清、即ち、ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシンを有する媒質などの培養媒質中において１０^６個の細胞／ｍｌの濃度に希釈され、且つ、即座に、０、０．５、２、及び４Ｇｒａｙにおいて２Ｇｒａｙ．ｍｉｎ^−１の被曝量レベルでコバルト−６０照射器によって照射される。照射の後に、細胞は、培養媒質中において５×１０^５個の細胞／ｍｌの濃度で迅速に希釈され、且つ、γＨ２ＡＸのリン酸化濃度の定量化の前に、５％の二酸化炭素の濃度を有する雰囲気中において３７℃の温度において１時間にわたって培養される。

ＬＩＢＳ分析を介したリン酸化の定量化に適したマトリックスを得るべく、抗体マトリックス自体がリンを有していないことが必要である。この目的のために、抗γＨ２ＡＸ^{ｓｅｒ１３９}抗体が選択されてもよい。次いで、透析済みの抗体が、例えば、Ｋａｐｔｏｎの２５μｍの層又はエポキシの２５μｍの層によってカバーされたＫａｐｔｏｎの２５μｍの層を有する支持部などのＫａｐｔｏｎ又はＫａｐｔｏｎ−エポキシから形成された支持部上に堆積される。

抗体は、Ｋａｐｔｏｎ−エポキシの薄膜層上に配置される。抗γＨ２ＡＸ^{ｓｅｒ１３９}の１００μｌの容積が、４℃の温度において４時間にわたって、０．１Ｍのトリス及び１ｍＭのスクロースを有するｐＨ７．５の緩衝溶液中において透析される。

透析の後に、抗γＨ２ＡＸ^{ｓｅｒ１３９}溶液の濃度は、０．１Ｍのトリス緩衝溶液中において、１ｍＭのボロン当たり０．５ｍｇ／ｍｌに調節され、且つ、１μｌの容積の溶液が、Ｋａｐｔｏｎ−エポキシの薄膜層上のマトリックスのそれぞれの井戸内に配置され、且つ、次いで、室温において３０分間にわたって乾燥される。Ｋａｐｔｏｎ−エポキシの薄膜層に対する蛋白質の非特異的接合を回避するべく、媒質のフリーエポキシ機能が、トリス、１ｍＭのスクロース、及び５％の濃度のデキストランを有する溶液中において、穏やかに撹拌された状態で、室温において３０分間にわたって、１×のスーパーブロッキング緩衝液により、即ち、ＳＢＢ（ｓｕｐｅｒ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）溶液により、飽和させられる。支持部が、１ｍＭのスクロース及び０．１％のポリソルベート２０をも有するトリスの生理食塩水緩衝溶液又は１×のＴＢＳタイプの溶液により、３回にわたって洗浄されてもよく、この溶液は、本発明によるプロセスにおいて抗体マトリックスを洗浄するためにも使用される。支持部に対する抗体の永続的な固定が、蛍光スキャナによって分析されてもよく、且つ、リンの不存在が、ＬＩＢＳによって確認されてもよい。

抗原ターゲットの抽出を許容するべく、リンパ球が、１００００回転／分の速度で２分間にわたって遠心分離によってペレット化され、１５秒にわたって４５０Ｗの出力のマイクロ波オーブン内に配置され、且つ、次いで、１ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度において０．１Ｍのトリス及び１ｍＭのスクロースを有する緩衝溶液中において再懸濁される。

蛋白質−抗体結合の場合に、蛋白質は、１ｍＭのスクロースを有する１×のＳＢＢ緩衝溶液中において０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈され、且つ、４℃の温度において１２時間にわたって培養される。この結果得られる抗体マトリックスは、１ｍＭのスクロース及び０．１％のポリソルベート２０を有するトリスの生理食塩水緩衝溶液（１×のＴＢＳ）中において洗浄され、且つ、撹拌を伴って、１５分にわたって１ｍＭのスクロースを有するトリスの生理食塩水緩衝溶液（１×のＴＢＳ）中において、２回にわたって洗浄され、且つ、次いで、室温において乾燥される。

標準的な方法を介した分析と関連し、それぞれの被曝操作において照射されたリンパ球のアリコートは、蛍光起動型細胞ソーター、即ち、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）により、分析される。細胞は、４℃の温度における１時間にわたる７０°プルーフのエタノール中における固定及び透過処理の前に、ＰＢＳ緩衝液中において、加熱を伴うことなしに、洗浄される。次いで、細胞は、２％のＦＣＳを有するＰＢＳ中において、抗γＨ２ＡＸ^{ｓｅｒ１３９}抗体溶液により、室温において培養される。洗浄及び遠心分離の後に、ペレットが得られ、このペレットが、再度懸濁され、且つ、フルオレセインイソチオシアネートタイプの発蛍光団により、即ち、ＦＩＴＣにより、ラベルが付与された抗マウス二次抗体によって１時間にわたって培養される。次いで、細胞は、洗浄され、遠心分離され、且つ、ヨウ化プロピジウム及びリボヌクレアーゼを有するＰＢＳ中において再度懸濁される。フローサイトメーターを使用して少なくとも１０^４個の細胞を分析し、且つ、適切な分析ソフトウェアにより、それぞれの細胞の蛍光強度を判定した。次いで、分析された細胞の中央蛍光強度から、所与の照射された試料中におけるγＨ２ＡＸの量を判定することができた。

ＬＩＢＳを介したリン定量化のためのバイオチップの分析
次いで、蛋白質がその上部において固定されるＫａｐｔｏｎ−エポキシ支持部を、例えば、支持部を速度及び精度を伴って運動させるように構成されたＸＹ運動のための手段を伴って、レーザーマイクロプローブにより、ＬＩＢＳによって分析してもよい。使用される除去レーザービームの波長は、アダクトを形成する化合物の波長に近接するように選択されており、記述されている例の場合には、２６６ｎｍの波長及び４ｍＪ／５ｎｓパルスのエネルギーを有するネオジミウムがドーピングされたイットリウム−アルミニウムガーネットパルス化レーザーが、即ち、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーが、使用されている。２つの反射ミラーにより、支持部の表面を掃引するように、レーザービームをガイドすることができる。その光路の開始点において、レーザービームは、ダイアフラムを通過することが可能であり、且つ、次いで、屈折顕微鏡の対物レンズにより、分析対象の試料の表面上に合焦されうる。試料の位置が、レーザーマイクロプローブの上方に配置されたＣＣＤカメラによって提供される画像を使用し、視覚化されてもよく、且つ、運動手段によって調節されてもよい。試料は、位置決めされてもよく、且つ、例えば、ねじによって形成された固定手段を介して、ＸＹ運動手段上に固定されてもよい。運動手段は、２つの連続的なレーザー照射の間に３０μｍの運動を伴って、外部同期モードにおけるレーザー照射周波数に対応した１０ヘルツの周波数で動作することができる。

プラズマ分析の場合に、例えば、一端がプラズマに可能な限り近接するように、光ファイバを配置してもよく、光ファイバは、プラズマから生じた光をパルス化高感度ＣＣＤカメラ（又は、ＩＣＣＤカメラ）を装備した分光計の入射スリットまでガイドする。例えば、スペクトル分解能は、１００μｍの入射スリットの場合に、４１０ｎｍにおいて、０．０３２に等しくなりうる。例えば、運動手段及びＩＣＣＤカメラは、例えば、単一のマイクロコンピュータによって形成された適切な制御手段を介して制御されてもよい。

パルス化レーザー及びＩＣＣＤカメラは、分析装置全体を制御する制御手段を介して制御されてもよい。

レーザー照射が印加されてもよく、且つ、リンに固有のスペクトル線（２５３．５６３ｎｍ）の周辺の２４８ｎｍ〜２５８ｎｍの範囲の波長内に延在するスペクトルウィンドウが、得られてもよく、デジタル化されてもよく、且つ、次いで、適切な手段を介してメモリ内に保存されてもよい。次いで、制御手段は、新しい位置への試料の運動を運動手段に対して課すことができる。

有利には、チューブが、レーザーマイクロプローブの固定部分に固定されてもよく、且つ、これにより、プラズマがその上部において生成される試料の表面に近接した状態で、アルゴンなどのガスの流れを生成する手段の形成が可能となりうる。この結果、プラズマ発光の大きさが増大し、且つ、自己吸収現象が低減されうる。

２５４．１２０ｎｍ及び２５４．７００ｎｍにおいて計測された強度の平均値に対応するスペクトルバックグラウンド強度を減算することにより、２５３．５６３ｎｍにおけるリンの線（ＩＰ２５３）の選択された強度が鋭い値として処理される。ＩＰ２５３線の鋭い値のすべてを合計することにより、ターゲット蛋白質を定量化してもよい。

リン及びボロンのスペクトルは、次の関係によって判定される信頼性係数Ｃｄｂによってフィルタリングされてもよい。
Ｃ_ｄｂ＝［（（Ｉ_Ｂ−Ｎ_Ｂ）−σ_Ｎ）／（（Ｉ_Ｂ−Ｎ_Ｂ）＋σ_Ｎ）］ （１）
この場合に、Ｉ_Ｂは、ボロンの強度を表記しており、Ｎ_Ｂ及びσ_Ｎは、それぞれ、すべてのスペクトルに基づいて算出された２４９．０８４ｎｍ及び２５０．３６３ｎｍの波長の周りのベース強度の平均値及び標準偏差を表記している。

次いで、ターゲット蛋白質のリンの値が、次の関係を使用することにより、選択されたスペクトルから定量化されてもよい。

ここで、ＩＢ_２４９及びＩＰ_２５３は、それぞれ、ボロン及びリンのスペクトル線の強度値を表記しており、且つ、ｎＰ２５３及びｎＢ２４９は、それぞれ、所与のスペクトル内のボロンとリンの周りのバックグラウンドの平均強度を表記しており、且つ、ＬＩＢＳによる媒質表面の掃引ピクセルに対応している。

Claims (14)

1. バイオチップに含まれた少なくとも１つのターゲット（２０１）のレーザービームによって誘起されたプラズマの発光分光法による定量分析のためのプロセスにおいて、
   前記プロセスは、前記少なくとも１つのターゲット（２０１）と共に同時に除去されうるドライマトリックス（２０３）の形成を許容するアジュバント（２０２）の使用を伴っており、前記ドライマトリックス（２０３）は、プラズマの分析特性を改善するように構成され、前記アジュバント（２０２）は、発光スペクトルであってそのスペクトル線が前記少なくとも１つのターゲット（２０１）の前記定量分析のために使用されるスペクトル線の波長とは別個の波長を有する発光スペクトルを有することを特徴とするプロセス。
2. 前記少なくとも１つのターゲット（２０１）は、プローブ−ターゲット錯体がそれぞれのプローブ（２１１）とそれに対応する前記ターゲット（２０１）との間に形成されるように、少なくとも１つのプローブ（２１１）により、前記バイオチップ上において分離されていることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
3. 前記アジュバント（２０２）の使用は、非晶質構造のドライマトリックス（２０３）の形成を許容することを特徴とする請求項１又は２に記載の分析プロセス。
4. 前記アジュバント（２０２）の使用は、結晶質構造のドライマトリックス（２０３）の形成を許容することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析プロセス。
5. 前記ドライマトリックス（２０３）は、前記プローブ−ターゲット錯体が、支持部（２００）の表面において配置され、且つ、全体的に又は部分的に、前記ドライマトリックス（２０３）の容積によって貪食されるように、形成されることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の分析プロセス。
6. 前記ドライマトリックス（２０３）及び前記プローブ（２１１）は、支持部（２００）に固定されることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の分析プロセス。
7. 前記ドライマトリックス（２０３）を形成するアジュバント分子は、前記プローブ（２１１）に対して直接的に錯体化されることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の分析プロセス。
8. 前記ドライマトリックス（２０３）を形成する前記アジュバント分子は、前記プローブ（２１１）が前記アジュバント分子に固定され、前記アジュバント分子が支持部（２００）に固定された状態で、前記支持部（２００）に固定されることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の分析プロセス。
9. 前記支持部（２００）の前記表面上にアジュバントの層を配置することにより、ドライマトリックス（２０３）の層が形成され、その後、このようにして支持部（２００）の前記表面に形成されたドライマトリックス（２０３）の表面上に前記プローブ（２１１）を配置することを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の分析プロセス。
10. 前記ドライマトリックス（２０３）は、前記レーザービームに使用されている波長が前記ドライマトリックス（２０３）の吸収スペクトルに含まれるように、化合物であってその吸収波長が前記レーザービームの波長に近接している化合物によって形成されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析プロセス。
11. 前記アジュバント（２０２）は、水と、糖、多糖、及び二糖を有する群からの要素と、の溶液を有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分析プロセス。
12. それぞれのプローブ（２１１）は、内部標準を形成する正規化要素（４０５）によってラベルが付与されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分析プロセス。
13. それぞれのプローブ（２１１）は、グラフトにより、前記正規化要素（４０５）によってラベルが付与されることを特徴とする請求項１１に記載の分析プロセス。
14. 前記正規化要素（４０５）は、ボロンから形成されることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の分析プロセス。

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