WO2014041145A1 - Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce - Google Patents

Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce Download PDF

Info

Publication number
WO2014041145A1
WO2014041145A1 PCT/EP2013/069072 EP2013069072W WO2014041145A1 WO 2014041145 A1 WO2014041145 A1 WO 2014041145A1 EP 2013069072 W EP2013069072 W EP 2013069072W WO 2014041145 A1 WO2014041145 A1 WO 2014041145A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dry matrix
adjuvant
target
support
analysis method
Prior art date
Application number
PCT/EP2013/069072
Other languages
English (en)
Inventor
Nadine Coulon
Nicolas Ugolin
Caroline Falck
Emilie Lefevre
Sylvie Chevillard
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives filed Critical Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Priority to KR1020157009164A priority Critical patent/KR102165631B1/ko
Priority to JP2015531584A priority patent/JP6220878B2/ja
Priority to EP13762488.8A priority patent/EP2895845A1/fr
Priority to US14/428,101 priority patent/US9400252B2/en
Priority to CN201380054861.1A priority patent/CN104737001B/zh
Priority to CA2884867A priority patent/CA2884867C/fr
Publication of WO2014041145A1 publication Critical patent/WO2014041145A1/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/71—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited
    • G01N21/718—Laser microanalysis, i.e. with formation of sample plasma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/71—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited
    • G01N21/714—Sample nebulisers for flame burners or plasma burners
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/71—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited
    • G01N21/73—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited using plasma burners or torches
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4731—Casein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for quantitatively measuring biomolecular targets on a biochip. It applies in particular to the field of proteomics, and more particularly to the quantitative measurement of protein phosphorylation by laser-induced plasma optical emission spectroscopy technique.
  • phosphorylation of proteins is a cognitively important point of view in the field of modern biology, or diagnostics in the field of therapeutics. This function is indeed essential in many biological processes, such as epigenetic regulation, nutritional regulation, DNA repair, hormonal regulation, etc. No known simple and direct technique can identify a protein in a biological medium and evaluate its phosphorylation rate.
  • a known technique of analysis consists in analyzing protein extracts by capturing them on so-called “spot” sites (each spot being constituted by a plurality of identical probes) organized in a network on a medium commonly referred to as "bio- chip "or" micro-array "according to English terminology.
  • the targets sought in the protein extracts to be analyzed are identified by specific probes that may be antibodies, receptors or any other molecules associating specifically with a given protein or one of its modifications.
  • the carrier is called an "antibody biochip”.
  • a plurality of target biomolecules can thus be analyzed simultaneously or almost simultaneously by appropriate analysis techniques.
  • Various techniques make it possible to perform the actual analysis of the elements thus retained or “segregated” on an antibody biochip.
  • a known technique For the analysis of phosphorylation of nucleic acids on a biochip, a known technique consists in carrying out this analysis by a laser-induced plasma optical emission spectroscopy technique commonly known by the acronym "LIBS" corresponding to the English terminology " Laser-Induced Breakdown Spectroscopy.
  • LIBS laser-induced plasma optical emission spectroscopy
  • This technique involves ablating, by means of a laser beam, the segregated sample on the surface of the bio-chip and generating a plasma, this plasma being then analyzed by a spectroscopic method.
  • the emission spectrum of the desired chemical elements can be recorded, as well as the focus coordinates of the laser beam on the surface of the sample. Suitable calculation means can then make it possible to establish an elementary map of the surface of the sample.
  • a device and a method for quantitatively measuring the biomolecular targets present on a biological analysis support are for example described in the patent application published under the reference FR 292901 1.
  • An analysis device by LIBS is for example described in the patent application published under the reference FR 2964458.
  • a LIBS analysis of protein phosphorylation on a biochip poses several problems a priori.
  • a first problem is related to the presence of exogenous phosphorus, masking the desired signal.
  • a second problem is related to the fact that the supports usually used for the biological analyzes are not compatible with a LIBS analysis, the plasmas forming on this type of support being not analyzable under acceptable conditions.
  • a third problem is related to the fact that biological molecules such as proteins have a very small amount of phosphorus in their structure, which is difficult to detect by LIBS.
  • a fourth problem is related to the fact that the signal obtained does not vary in an easily modelable manner, for example in a linear manner, as a function of the desired quantity: in other words, the normalization of the signal for the quantification of a protein is problematic.
  • An object of the present invention is to overcome at least the aforementioned drawbacks, by proposing a method and a device for the quantitative analysis of biomolecular targets by a LIBS technique.
  • This invention implements an adequate support and a method for the formation of a readily analyzable plasma by spectrometry, the LIBS signal emitted by the plasma being proportional to the abundance of the desired quantity.
  • the subject of the invention is a method and a device for quantitative measurement. More specifically, the subject of the present invention is a method for the quantitative analysis by optical emission spectrometry of a plasma induced by a laser beam of at least one target included in a biochip, characterized in that it the use of an adjuvant allowing the formation of a dry matrix able to be ablated simultaneously with the said at least one target, the dry matrix being configured to improve the analytical properties of the plasma, the adjuvant having an emission spectrum whose lines have wavelengths distinct from the wavelengths of the spectral lines used for the quantitative analysis of said at least one target.
  • said at least one target can be segregated on the bio-chip by at least one probe so that a probe-target complex is formed between each probe and the corresponding target.
  • said use of an adjuvant can allow the formation of a dry matrix of amorphous structure.
  • said use of an adjuvant can allow the formation of a dry matrix of crystalline structure.
  • the dry matrix may be formed so that the probe-target complexes are disposed on the surface of a support, and are wholly or partially encompassed by a volume of said dry matrix.
  • the dry matrix and the probes can be fixed on a support.
  • the adjuvant molecules forming the dry matrix can be directly complexed to the probes.
  • the dry matrix adjuvant molecules can be attached to a support with the probes attached to the adjuvant molecules with the adjuvant molecules attached to the support.
  • a dry matrix layer may be formed by placing an adjuvant layer on the surface of the support, prior to the arrangement of the probes on the dry matrix surface thus formed on the surface of a support.
  • the dry matrix may be formed by a compound whose absorption wavelengths are close to the wavelength of the laser beam, such as the wavelength used for the laser is included in the absorption spectrum of the dry matrix.
  • the adjuvant may comprise a solution of water and an element of the group comprising the sugar, polysaccharide, disaccharide.
  • each probe may be labeled with an internal standardization standard.
  • each probe may be labeled by the graft normalization element.
  • the normalizing element may be formed of boron.
  • the present invention also relates to a device comprising a support comprising a plurality of sites, each site comprising a plurality of probes, the probes being grafted concomitantly with the molecules of an adjuvant for the formation of a dry matrix.
  • said support may comprise organic compounds, monolithic or organo-diamond compounds.
  • the present invention also relates to a solution for the implementation of a method according to any one of the embodiments described, characterized in that it comprises an adjuvant for the formation of a dry matrix.
  • the solution for implementing a method according to one of the embodiments described can to comprise a determined proportion of a standardization element of an optical signal of a plasma induced by a laser beam
  • Another advantage provided by the present invention is that it allows simple, rapid, quantitative and vector analysis of biomolecules, for example proteins, and the level of phosphorus in a mixture.
  • a quantitative analysis is performed on a biochip comprising a network of targets and / or probes organized into spots.
  • the spots of each probe are capable of recognizing and segregating a target bio-molecule present in the mixture to be analyzed.
  • an adjuvant be implemented to allow the formation of a dry matrix, the latter being intimately linked with the targets or with the probe-target complexes.
  • the term "intimately related” is understood to mean that the dry matrix supports, encompasses or surrounds target or target probe complexes, such that the laser ablation of the target or probe-target complex and the plasma produced by LIBS at a spot of the biochip network comprises, in addition to target biomolecules or target-probe complexes, adjuvant molecules and / or their decomposition elements.
  • a dry matrix is in the form of a solid compound of crystalline or amorphous form after drying of the bio-chip.
  • the dry matrix may be in the form of an adduct, that is to say a mixture of probes, targets and adjuvant molecules, a crystalline phase or amorphous mixed or encompassing targets and / or probes.
  • adduct that is to say a mixture of probes, targets and adjuvant molecules, a crystalline phase or amorphous mixed or encompassing targets and / or probes.
  • Different configurations of the dry matrix on the support of the bio-chip are described hereinafter by way of examples, with reference to FIGS. 2A to 2D. It should be observed that a method or a device according to the present invention can also be applied to a biochip comprising a plurality of targets deposited or segregated on a support, not necessarily associated with probes.
  • the adjuvant is in particular selected so as to be substantially non-phosphorus, and so that it does not denature the antigen-antibody binding. That is to say, on the one hand, that the emission spectra of the molecules the adjuvant and the matrix itself are distinct from the emission lines used to quantify the phosphorus and, if appropriate, to normalize the signal, and secondly that the adjuvant is compatible with the hybridization or complexation of the targets and / or target probe complexes.
  • the adjuvant used for the formation of the dry matrix may for example be soluble. Examples of suitable solutions are described below.
  • the dry matrix is furthermore chosen so as to have the further advantage of improving the analytical properties of the plasma produced by laser for the analysis by a spectroscopy technique.
  • the dry matrix may be formed by a compound whose absorption wavelengths are close to the wavelength of the laser beam used, such that the wavelength used for the laser is included in the spectrum of the laser. absorption of the dry matrix.
  • FIG. 1 a flowchart illustrating a method of analysis, according to a exemplary embodiment of the present invention
  • FIG. 2 a diagram illustrating the general principle of a method of analysis on a biochip comprising probes / targets according to an exemplary embodiment of the present invention
  • FIGS. 3A, 3B, 3C and 3D diagrams schematically illustrating an analysis device according to different configurations, according to exemplary embodiments of the present invention
  • FIGS. 4A and 4B diagrams schematically illustrating an analysis device further comprising a normalization element, in configurations corresponding respectively to FIGS. 3A and 3C.
  • an analysis method may comprise a first step 101 for preparing the bio-chip.
  • the first step 101 can be followed by a second step 102 of analysis by LIBS, during which a plasma is formed in particular at the level of the target biomolecules to be analyzed by means of an ablation laser, according to techniques that are themselves known.
  • the preparation step 101 may comprise a first substep of depositing the biomolecules, i.e., single targets and / or probes on a support, followed by drying; a second sub-step may consist, after a possible saturation sub-step, segregating on the support a plurality of target biomolecules optionally by coupling them to corresponding y antibodies, forming a matrix of probes. Each target biomolecule is thus fixed on a probe recognizing it arranged on the support.
  • a dry matrix is also formed, according to a specificity of the present invention.
  • the dry matrix formed makes it possible to ensure better exploitability by optical emission spectrometry of the plasma produced by laser during the second step 102.
  • the dry matrix is formed so that it can be ablated simultaneously with a target or probe-probe complex. target.
  • a shot of the ablation laser targeting the target biomolecule of interest ensures the removal of a portion of the surrounding dry matrix.
  • the dry matrix may be arranged to completely or partially encompass the target biomolecule or probe-target complex.
  • the dry matrix may also be disposed below the target biomolecule or the probe-target complex, provided that the proximity of the dry matrix is sufficient for a laser shot for the target biomolecule or probe-target complex. also ablates part of the surrounding dry matrix.
  • Different possible configurations of the dry matrix with respect to a target biomolecule or probe-target complex, on a biochip support are described hereinafter with reference to FIGS. 3A to 3D.
  • the dry matrix is further configured to improve the analytical properties of the LIBS plasma. In addition, it must not denature probe-target recognition if necessary, and must not itself contain phosphorus.
  • the dry matrix can be amorphous or crystalline, and can be formed by means of an adjuvant.
  • the adjuvant may for example be a soluble adjuvant.
  • a solution for an analysis method according to one of the embodiments described, comprising a proportion of biomolecules to be analyzed may also comprise the adjuvant allowing the formation of the dry matrix.
  • the adjuvant can be introduced into at least one of the solutions used to hybridize the biochip with the target proteins or to flush the biochip after hybridization.
  • the adjuvant allows the formation of a dry matrix on the surface of the bio-chip especially at the different spots.
  • the adjuvant forming a dry matrix may be introduced during the step of depositing the probes on the support at the time of manufacture of the bio-chip: either by introduction into the deposition solution of probes, just after the deposition of the probes, by chemically grafting the adjuvant molecule directly onto the surface of the support used for fixing the probes.
  • sucrose molecules can be grafted onto the surface of the bio-chip activated by SOCI2 through their alcohol function.
  • the adjuvant molecules can first be grafted to the surface of the bio-chip support and then activated as needed depending on the nature of the adjuvant, and the probes can be grafted into spots. on the surface of the bio-chip through the adjuvant molecules.
  • At least one rinsing or hybridization solution may comprise a metal or halogen standardization element, emitting a signal LIBS distinct from that of phosphorus and proportional to the abundance of said metal element.
  • Said normalization element may in particular be chosen so that it is in the same spectral window as the emission line chosen for phosphorus analysis according to the equipment used.
  • the emission lines can be distinct in the sense of the spectrograph used, that is to say sufficiently remote for a given spectrograph, so that they can be distinguished.
  • the normalization element can be introduced into the adjuvant allowing the formation of the dry matrix.
  • the normalization element may for example be boron, taken alone, integrated in a molecule or trapped in a molecular cage or crypt, and reproducibly bound to the target.
  • the normalization element such as boron may be directly complexed with the antibody of the probe, or possibly with the target.
  • the support forming the bio-chip may be a free carbon support of phosphorus, comprising organic compounds, that is to say any combination of the elements Carbon, Hydrogen, Oxygen and Nitrogen.
  • the support forming the bio-chip may be monolithic (such as diamond), glassy, or organo-diamond, promoting the formation of a plasma exploitable in good conditions. It may be a support consisting of monolithic nanoparticles covered with probes deposited or grafted onto a vitreous or organic support.
  • the adjuvant introduced above is itself configured so as not to denature the probe-target bond, and not to contain phosphorus.
  • the adjuvant may for example be formed by polysaccharides, such as sucrose or any other polysaccharide not containing phosphorus.
  • the second step 102 above allows analysis by LIBS-type spectrometry, using appropriate devices, and may include process sub-steps in themselves known.
  • the second step 102 involves the implementation of analysis means by LIBS spectrometry, including in particular means for emitting an intense pulsed laser beam or "beam ablation means, means for moving the sample to be analyzed, means for detecting recording and calculation.
  • Figure 2 shows a diagram illustrating the general principle of an analysis method according to an embodiment of the present invention.
  • a plurality of target proteins 201 may be deposited in a plurality of spots on a support 200 of a biochip.
  • the support 200 further comprises a plurality of probes 21 1 capable of recognizing the target proteins 201.
  • An analysis method according to the present invention implements the use of an adjuvant 202, for example soluble, allowing the formation of a dry matrix 203, completely encompassing the probe-target complexes in the example illustrated by FIG. 2.
  • the biochip comprising a plurality of target proteins 201, as well as a plurality of probes 21 1 in the non-limiting illustrated example. of the present invention, can be subjected to an analysis by LIBS during the second step 102 mentioned above and described with reference to FIG.
  • FIGS. 3A to 3D show diagrams schematically illustrating an analysis device according to different exemplary embodiments of the present invention, corresponding to different configurations of the dry matrix and the support of the bio-chip.
  • each target biomolecule 201 attached to a probe 21 1 the recognizing disposed on the support 200 of the bio-chip may be encompassed by a volume of dry matrix 203 formed by a suitable adjuvant as described above.
  • the target probe-biomolecule pair 21 1, 201 may be completely encompassed by the dry matrix, as well as in the example illustrated by the figure, or only partially encompassed by it.
  • FIG. 3A According to an embodiment illustrated in FIG. 3A, corresponding to a first configuration of the target biomolecules, corresponding probes and of the dry matrix on the support of the bio-chip, each target biomolecule 201 attached to a probe 21 1 the recognizing disposed on the support 200 of the bio-chip, may be encompassed by a volume of dry matrix 203 formed by a suitable adjuvant as described above.
  • the target probe-biomolecule pair 21 1, 201 may be completely encompassed by the dry matrix, as well as in the example illustrated by the figure, or only partially encompassed by it.
  • FIG. 3A According to an embodiment
  • the support 200 of the bio-chip, on which the probes for forming the target probe-biomolecule pairs 21 1, 201, can be placed on its surface be saturated with the dry matrix 203.
  • an adjuvant layer may for example be placed on the surface of the support 200 of the bio-chip already populated with target probe-biomolecule couples 21 1, 201.
  • Such an embodiment may have an advantage in terms of simplicity of implementation, the entire surface of the support 200 of the bio-chip can be saturated with the dry matrix 203.
  • each probe-target biomolecule couple 21 1, 201 disposed on the support 200 of the bio-chip can be included in the dry matrix 203, the adjuvant forming the dry matrix 203 which can be directly complexed with the probe 21 1.
  • a dry matrix layer 203 may be formed by disposing or grafting an adjuvant layer, for example uniformly on the surface of the support 200 of the bioparticle. chip, in advance of the arrangement of the probes 21 1 grafted directly on the matrix.
  • the target biomolecule complexes or hybridizes to the corresponding probe directly on the dry matrix.
  • An alternative mode may consist of grafting the probes onto the support and then grafting onto the support the molecules of the matrix so as to surround the targets.
  • the fourth embodiment has a substantial advantage from an industrial point of view. Indeed, kits comprising a bio-chip on the support of which was formed the dry matrix layer 203 can be supplied, like conventional biochips. An operator can then normally have target probe-biomolecule pairs on the surface of such a biochip by proceeding in a usual manner.
  • the present invention also relates to a device or "kit" for pre-hybridization or hybridization of biochips such as at least one solution for the pre-hybridization, hybridization or rinsing of a bio-chip comprising an adjuvant allowing the formation of a dry matrix on the surface of the bio-chip.
  • the subject of the present invention is also a bio-chip, the support of which comprises on its surface a dry matrix layer 203.
  • the thickness of the dry matrix 203 formed above the target biomolecules may be on average not greater than 1 millimeter.
  • the plasma formed by the laser could indeed not contain traces of the target biomolecule in reasonable proportions for an analysis to be possible.
  • each probe 21 may advantageously comprise a normalization element forming an internal standard for normalizing the signal obtained by LIBS.
  • the normalization element may be formed by an element directly complexed with each probe 21 1, for example by a grafting technique. If the probe 211 is formed by an antibody, the antibody can thus be directly labeled by the graft normalization element.
  • the normalization element may for example be formed by an element such as boron.
  • a normalization element 405 may be attached directly to a probe 21 1 disposed on the support 200, for example by a grafting technique.
  • the assembly formed by the probes 21 1, the targets 201 may be encompassed by the dry matrix 203, in a configuration corresponding to the first configuration described above with reference to Figure 3A.
  • a normalization element 405 can be attached directly to a probe 21 1 disposed on the support 200, for example by a grafting technique.
  • the adjuvant molecules forming the In such an example, the dry matrix 203 may be directly complexed with the probes 21 1, in a configuration corresponding to the third configuration described above with reference to FIG. 3C.
  • the spectral lines of the adjuvant have wavelengths distinct from the wavelengths of the spectral lines used for the quantitative analysis, including the spectral lines used for the normalization and the spectral lines used for the quantification of the target and / or its post-translational modifications.
  • the Applicant has qualified the analysis method by carrying out in particular an analysis of the phosphorylated protein, more specifically on an in vitro model reconstituted from a beta A2 casein protein in which solutions of known concentrations of qualified casein by an inductively coupled emission spectrometric analysis method, commonly referred to as "ICP-AES" corresponding to the English terminology "Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometry", are analyzed; and on the other hand in a biological model containing exogenous phosphorus for which the phosphorylation rate of a molecular target H2AX can be induced at will.
  • ICP-AES inductively coupled emission spectrometric analysis method
  • Example of target deposits on bio-chip protein chip without probe.
  • beta A2 casein The molecular weight of beta A2 casein is 23.983 kiloDalton.
  • This protein may, for example, be supplied in a freeze-dried form, and then purified for example by a method commonly known by the acronym "HPLC” corresponding to the English terminology "High Performance Liquid Chromatography” or high performance liquid chromatography, for example using a solution comprising water (H 2 0), trifluoroacetic acid (TFA) and methyl cyanide (or acetonitrile).
  • HPLC high Performance Liquid Chromatography
  • the concentration of the protein may for example be determined by means of a UV spectrophotometer.
  • an analysis of beta-casein phosphorylation can be carried out by a known alternative method and deemed reliable in order to provide reference measurements.
  • an ICP-AES type of analysis method this method being a reference method for the determination of the elemental composition of liquid compounds.
  • the Applicant has carried out the ICP-AES analysis of beta casein solutions with concentrations of 0, 4, 12 and 20 ⁇ (micromoles).
  • beta casein In order to determine the sensitivity of the LIBS spectrometry for the quantification of the phosphorylation of proteins, different amounts of beta casein are directly deposited on the Kapton-epoxy support, the Kapton-epoxy film being glued for example by means of a glue. cyanoacrylate on a microscopic glass (for example in the form of a 7.5-cm by 2.5 cm cover).
  • the beta casein solution thus obtained is diluted in series at concentrations of 0, 40, 85, 170, 257 and 350 ⁇ in a buffered solution at 0.1 M of tris at a pH of 7.5, this preparation being designated " preparation A "in a buffered solution comprising 0.1 M of tris at a pH of 7.5 and 1 mM of sucrose, designated” preparation B ", and in a buffered solution comprising 0.1 M of tris at a pH of 7, 5, 1 mM sucrose and 0.5 mM boron, designated "preparation C”.
  • preparations were separately deposited into five replicas on the Kapton-epoxy film and dried for 30 minutes at room temperature.
  • Lymphocytes can be isolated by gradient cell separation from heparinized human blood samples.
  • the cells are washed twice in phosphate buffered saline or "PBS", diluted to a concentration of 10 6 cells / ml in a cellular medium, for example a medium comprising 10% fetal calf serum or "FCS", 1 % penicillin-streptomycin, and immediately irradiated with a Cobalt 60 irradiator at a dose level of 2 Gray.min "1 to 0, 0.5, 2 and 4 Gray.After their irradiation, the cells are rapidly diluted in a medium cultured at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml and incubated for one hour at a temperature of 37 ° C. in an atmosphere comprising a concentration of 5% of carbon dioxide, before quantifying the level of phosphorylation of ⁇ 2 ⁇ .
  • PBS phosphate buffered saline
  • FCS 10% fetal calf serum
  • Anti- YH2AX ser139 antibody can be chosen for this purpose.
  • the dialyzed antibody is then deposited on a Kapton or Kapton-epoxy support, for example a support comprising a Kapton layer of 25 ⁇ , or a Kapton layer of 25 ⁇ coated with an epoxy layer of 25 ⁇ m. ⁇ .
  • the antibody is disposed on the Kapton-epoxy film layer.
  • a volume of 100 ⁇ l of anti-YH2AX ser139 is dialyzed in a buffered solution of pH 7.5 comprising 0.1 M tris, 1 mM sucrose, for four hours at a temperature of 4 ° C.
  • the concentration of the solution of anti-YH2AX ser139 is adjusted to 0.5 mg / ml in 1 mM boron in a buffered solution of 0.1 M tris, and a volume of 1 ⁇ of the solution is placed in each well of the matrix on the Kapton-epoxy film layer and is then dried for 30 minutes at room temperature.
  • the free epoxy functions of the medium are saturated with a 1 X super blocking buffer solution or "SBB" according to the acronym for the terminology English "Super Blocking Buffer” in a solution comprising tris, 1 mM sucrose and a concentration of 5% dextran for 30 minutes at room temperature slightly stirred.
  • the support can be washed three times in a tris buffered saline solution, or 1 X TBS solution, also comprising 1 mM sucrose and 0.1% polysorbate 20, this solution also being used for washing the matrix.
  • 1 X TBS solution also comprising 1 mM sucrose and 0.1% polysorbate 20, this solution also being used for washing the matrix.
  • Persistent binding of antibodies to the support can be analyzed by means of a fluorescent scanner, and the absence of phosphorus can be verified by LIBS.
  • the lymphocytes are pelleted by centrifugation for two minutes at a speed of 10,000 rpm, placed in a microwave oven at a power of 450 W for 15 seconds, and then put back into position. suspension in a buffered solution comprising 0.1 M tris, 1 mM sucrose at a protein concentration of 1 mg / ml.
  • the proteins are diluted to a concentration of 0.1 mg / ml in a buffer solution of 1 X SBB comprising 1 mM sucrose, and incubated for 12 hours at a temperature of 4 ° C.
  • the resulting antibody templates are washed in a saline buffered saline solution (1 X TBS) comprising 1 mM sucrose, and 0.1% polysorbate 20, and twice in a saline buffered saline solution (1 X TBS) comprising 1 mM sucrose for 15 minutes with stirring and then dried at room temperature.
  • an aliquot of irradiated lymphocytes at each dose is analyzed using a fluorescence activated cell sorter, or "FACS" according to the acronym for "Fluorescence Activated”.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the cells are washed cold in PBS before fixation and permeabilization in ethanol titrating at 70 ° for one hour at a temperature of 4 ° C.
  • the cells are then incubated at room temperature with an anti-YH2AX ser139 antibody solution in a PBS comprising 2% FCS.
  • the Kapton-epoxy supports where the proteins are fixed can then be analyzed by LIBS, for example by means of a laser microprobe, XY displacement means configured to move the support rapidly and accurately.
  • the wavelength of the ablation laser beam used is chosen close to the wavelengths of the compound forming the adduct: for the example described, a neodymium-doped yttrium-aluminum garnet laser, or laser Nd: YAG "of wavelength 266 nm and an energy of 4 mJ per pulse of 5 ns is used.
  • Two reflective mirrors can guide the laser beam to scan the surface of the support.
  • the laser beam can pass through a diaphragm and then be focused on the surface of the sample to be analyzed by a refractive microscope objective.
  • the position of the sample can be visualized and adjusted by the moving means from the images provided by a CCD camera disposed above the laser microprobe.
  • the samples can be positioned and fixed by means of fixing means, for example formed by screws, on the XY displacement means.
  • the displacement means can operate at a frequency of 10 Hertz, corresponding to the laser firing frequency in an external synchronization mode, with 30 ⁇ displacements between two consecutive laser shots.
  • an optical fiber may for example be arranged with an end as close as possible to the plasma, the optical fiber guiding the light coming from the plasma to an inlet slot of a plasma.
  • spectrometer equipped with an intensified CCD camera (or "ICCD" camera).
  • the spectral resolution may be 0.032 to 410 nm, for an input slot of 100 ⁇ .
  • the displacement means and the ICCD camera can for example be controlled by means of suitable control means, for example formed by a single microcomputer.
  • the pulsed laser and the ICCD camera can be controlled by control means controlling the entire analysis device.
  • a laser shot can be applied, and a spectral window, for example extending in the wavelength range from 248 nm to 258 nm, around the spectral line specific to phosphorus (253.563 nm) can be acquired, and digitized then stored in memory by appropriate means.
  • the control means can then force the displacement means to move the sample to a new position.
  • a tube can be fixed to a fixed part of the laser microprobe and can be used to form means for generating a gas flow, such as argon, close to the surface of the sample at which the plasma is generated.
  • a gas flow such as argon
  • IP253 The selected intensities of phosphor lines at 253.563 nm (“IP253”) are treated as net values by subtracting the spectral background intensity corresponding to the mean value of the intensities measured at 254.120 nm and 254.700 nm.
  • Target proteins can be quantified by summing all net values of IP253 lines.
  • the spectra of phosphorus and boron can be filtered with a reliability factor Cdb determined by means of the following relation:
  • C db [ ⁇ l B - N B ) - a N ) / ⁇ (1 B - N B ) + a N )] (1), where IB designates the intensity of the boron, N B and ⁇ denote respectively the mean value and standard deviation of background intensity around wavelengths 249.084 nm and 250.363 nm, calculated on all spectra.
  • Phosphorus values for the target protein can then be quantified from the spectra selected from the following relationship:
  • IB 24 I 9 and P253 denote the intensity values of the spectral lines of the boron and phosphorus respectively
  • nP253 and nB249 designate respectively the average intensity of the bottom around boron and phosphorus in a given spectrum, and corresponding to a scanning pixel of the medium surface by LIBS.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procédé d'analyse quantitative par spectrométrie d'émission optique d'un plasma induit par un faisceau laser d'au moins une cible (201) comprise dans une bio-puce caractérisé en ce qu'il met en œuvre l'utilisation d'un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203) apte à être ablatée simultanément à ladite au moins une cible (201), la matrice sèche étant configurée pour améliorer les propriétés analytiques du plasma, l'adjuvant (202) présentant un spectre d'émission dont les raies ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative de ladite au moins une cible (201).

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE QUANTITATIVE PAR LIBS DE CIBLES BIOMOLECULAIRES SUR BIO-PUCE
La présente invention concerne un procédé et un dispositif de mesure quantitative de cibles biomoléculaires sur une bio-puce. Elle s'applique notamment au domaine de la protéomique, et plus particulièrement à la mesure quantitative de la phosphorylation de protéines par une technique de spectroscopie d'émission optique sur plasma induit par laser.
Dans le domaine de la protéomique, on s'applique à identifier dans des extraits cellulaires, les protéines présentes et leurs concentrations respectives, ainsi qu'à identifier les modifications post-traductionnelles de ces protéines, représentatives de leur activité. Une des modifications post- traductionnelles présentant le plus grand intérêt dans ce contexte, est la phosphorylation : la phosphorylation des protéines est capitale d'un point de vue cognitif dans le domaine de la biologie moderne, ou des diagnostics dans le domaine de la thérapeutique. Cette fonction est en effet essentielle dans de nombreux processus biologiques, tels que la régulation épigénétique, la régulation nutritionnelle, la réparation d'ADN, la régulation hormonale, etc. Aucune technique simple et directe connue ne permet d'identifier une protéine dans un milieu biologique et d'évaluer son taux de phosphorylation.
Une technique connue d'analyse consiste à analyser des extraits protéiques en les capturant sur des sites dits « spots », (chaque spot étant constitué d'une pluralité de sondes identiques) organisés en réseau sur un support communément désigné par le terme « bio-puce » ou « micro-array » selon la terminologie anglaise. Les cibles recherchées dans les extraits protéiques à analyser sont identifiées par des sondes spécifiques pouvant être des anticorps, des récepteurs ou toutes autres molécules s'associant spécifiquement à une protéine donnée ou à une de ses modifications. Dans le cas des anticorps, le support est qualifié de « bio-puce à anticorps ». Une pluralité de biomolécules cibles peut ainsi être analysée de manière simultanée ou quasi-simultanée par des techniques d'analyse appropriées. Différentes techniques permettent de réaliser l'analyse proprement dite des éléments ainsi retenus ou « ségrégués » sur une bio-puce à anticorps.
Pour l'analyse de la phosphorylation des acides nucléiques sur biopuce, une technique connue consiste à réaliser cette analyse par une technique de spectroscopie d'émission optique sur plasma induit par laser communément désignée par l'acronyme « LIBS » correspondant à la terminologie anglaise « Laser-lnduced Breakdown Spectroscopy ». Cette technique consiste à ablater, au moyen d'un faisceau laser, l'échantillon ségrégué à la surface de la bio-puce et à générer un plasma, ce plasma étant alors analysé par une méthode spectroscopique. Pour chaque tir laser, le spectre d'émission des éléments chimiques recherchés peut être enregistré, ainsi que les coordonnées de focalisation du faisceau laser à la surface de l'échantillon. Des moyens de calcul appropriés peuvent alors permettre d'établir une cartographie élémentaire de la surface de l'échantillon. Un dispositif et un procédé de mesure quantitative des cibles biomoléculaires présentes sur un support d'analyse biologique sont par exemple décrits dans la demande de brevet publiée sous la référence FR 292901 1 . Un dispositif d'analyse par LIBS est par exemple décrit dans la demande de brevet publiée sous la référence FR 2964458.
Cependant une analyse par LIBS de la phosphorylation de protéines sur bio-puce pose plusieurs problèmes a priori. Un premier problème est lié à la présence de phosphore exogène, masquant le signal recherché. Un deuxième problème est lié au fait que les supports habituellement utilisés pour les analyses biologiques ne sont pas compatibles avec une analyse par LIBS, les plasmas se formant sur ce type de support n'étant pas analysables dans des conditions acceptables. Un troisième problème est lié au fait que les molécules biologiques telles que les protéines présentent une quantité très faible de phosphore dans leur structure, donc difficilement décelable par LIBS. Un quatrième problème est lié au fait que le signal obtenu ne varie pas de manière facilement modélisable, par exemple de manière linéaire, en fonction de la quantité recherchée : en d'autres termes, la normalisation du signal pour la quantification d'une protéine est problématique.
Un but de la présente invention est de pallier au moins les inconvénients précités, en proposant un procédé et un dispositif pour l'analyse quantitative des cibles biomoléculaires par une technique LIBS. Cette invention met en œuvre un support adéquat et un procédé permettant la formation d'un plasma facilement analysable par spectrométrie, le signal LIBS émis par le plasma étant proportionnel à l'abondance de la quantité recherchée.
A cet effet, l'invention a pour objet un procédé et un dispositif de mesure quantitative. Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé d'analyse quantitative par spectrométrie d'émission optique d'un plasma induit par un faisceau laser d'au moins une cible comprise dans une bio-puce caractérisé en ce qu'il met en œuvre l'utilisation d'un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche apte à être ablatée simultanément à ladite au moins une cible, la matrice sèche étant configurée pour améliorer les propriétés analytiques du plasma, l'adjuvant présentant un spectre d'émission dont les raies ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative de ladite au moins une cible.
Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite au moins une cible peut être ségréguée sur la bio-puce par au moins une sonde de sorte qu'un complexe sonde-cible est formé entre chaque sonde et la cible y correspondant.
Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite utilisation d'un adjuvant peut permettre la formation d'une matrice sèche de structure amorphe.
Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite utilisation d'un adjuvant peut permettre la formation d'une matrice sèche de structure cristalline.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice sèche peut être formée de manière à ce que les complexes sondes-cibles soient disposés à la surface d'un support, et soient totalement ou partiellement englobés par un volume de ladite matrice sèche.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice sèche et les sondes peuvent être fixées sur un support.
Dans un mode de réalisation de l'invention, les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche peuvent être directement complexées aux sondes. Dans un mode de réalisation de l'invention, les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche peuvent être fixées sur un support, les sondes étant fixées sur les molécules d'adjuvant, les molécules d'adjuvant étant fixées sur le support.
Dans un mode de réalisation de l'invention, une couche de matrice sèche peut être formée en disposant une couche d'adjuvant sur la surface du support, préalablement à la disposition des sondes sur la surface de matrice sèche ainsi formée en surface d'un support.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice sèche peut être formée par un composé dont les longueurs d'onde d'absorption sont proches de la longueur d'onde du faisceau laser, tel que la longueur d'onde utilisée pour le laser soit comprise dans le spectre d'absorption de la matrice sèche.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'adjuvant peut comprendre une solution d'eau et d'un élément du groupe comprenant le sucre, polysaccharide, disaccharide.
Dans un mode de réalisation de l'invention, chaque sonde peut être marquée par un élément de normalisation formant étalon interne.
Dans un mode de réalisation de l'invention, chaque sonde peut être marquée par l'élément de normalisation par greffage.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'élément de normalisation peut être formé par du bore.
La présente invention a également pour objet un dispositif comprenant un support comprenant une pluralité de sites, chaque site comprenant une pluralité de sondes, les sondes étant greffées de manière concomitante aux molécules d'un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche.
Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit support peut comprendre des composés organiques, des composés monolithiques ou organo-diamantés.
La présente invention a également pour objet une solution pour la mise en œuvre d'un procédé suivant l'un quelconque des modes de réalisation décrits, caractérisée en ce qu'elle comprend un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la solution pour la mise en œuvre d'un procédé suivant l'un des modes de réalisation décrits peut comprendre une proportion déterminée d'un élément de normalisation d'un signal optique d'un plasma induit par un faisceau laser
Un autre avantage procuré par la présente invention est qu'elle permet une analyse simple, rapide, quantitative et vectorielle de biomolécules, par exemple des protéines, et du taux de phosphore dans un mélange.
Selon la présente invention, une analyse quantitative est réalisée sur une bio-puce comprenant un réseau de cibles et/ou de sondes organisées en spots. Les spots de chaque sonde sont capables de reconnaître et de ségréguer une bio-molécule cible présente dans le mélange à analyser. Selon une spécificité de la présente invention, il est proposé qu'un adjuvant soit mis en œuvre pour permettre la formation d'une matrice sèche, cette dernière étant intimement liée avec les cibles ou avec les complexes sondes-cibles. Il est entendu ici par les termes « intimement lié », le fait que la matrice sèche supporte, englobe ou entoure les cibles ou les complexes sondes-cibles, de telle manière que l'ablation laser de la cible ou du complexe sonde-cible et le plasma produit par LIBS au niveau d'un spot du réseau de la bio-puce comprenne, en plus des biomolécules cibles ou des complexes cibles-sondes, des molécules d'adjuvant et/ou leurs éléments de décomposition. Pour la suite, il est considéré qu'une matrice sèche se présente sous la forme d'un composé solide de forme cristalline ou amorphe après séchage de la bio-puce. A titre d'exemple non limitatif, la matrice sèche peut se présenter sous la forme d'un adduit, c'est-à-dire d'un mélange des sondes, des cibles et de molécules d'adjuvant, d'une phase cristalline ou amorphe mélangée ou englobant les cibles et/ou les sondes. Différentes configurations de la matrice sèche sur le support de la bio-puce sont décrites ci-après à titre d'exemples, en référence aux figures 2A à 2D. Il est à observer qu'un procédé ou un dispositif selon la présente invention peut également s'appliquer à une bio-puce comprenant une pluralité de cibles déposées ou ségréguées sur un support, non nécessairement associées à des sondes.
L'adjuvant est notamment choisi de manière à être essentiellement non phosphoré, et de manière à ce qu'il ne dénature pas la liaison antigène- anticorps. C'est-à-dire d'une part que les spectres d'émission des molécules constituant l'adjuvant et la matrice elle-même sont distincts des raies d'émissions utilisées pour quantifier le phosphore et le cas échéant pour normaliser le signal, et d'autre part que l'adjuvant est compatible avec l'hybridation ou la complexation des cibles et/ou des complexes sondes- cibles.
L'adjuvant utilisé pour la formation de la matrice sèche peut par exemple être soluble. Des exemples de solutions appropriées sont décrits ci- après. La matrice sèche est en outre choisie de manière à présenter par ailleurs l'avantage d'améliorer les propriétés analytiques du plasma produit par laser pour l'analyse par une technique de spectroscopie. Notamment, la matrice sèche peut être formée par un composé dont les longueurs d'onde d'absorption sont proches de la longueur d'onde du faisceau laser utilisé, tel que la longueur d'onde utilisée pour le laser soit comprise dans le spectre d'absorption de la matrice sèche.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description, donnée à titre d'exemple, faite en regard des dessins annexés qui représentent : - la figure 1 , un ordinogramme illustrant un procédé d'analyse, selon un exemple de réalisation de la présente invention ;
la figure 2, un schéma illustrant le principe général d'un procédé d'analyse sur une bio-puce comprenant des sondes / cibles selon un exemple de réalisation de la présente invention ;
- les figures 3A, 3B, 3C et 3D, des schémas illustrant de manière synoptique un dispositif d'analyse suivant différentes configurations, selon des exemples de réalisation de la présente invention ;
les figures 4A et 4B, des schémas illustrant de manière synoptique un dispositif d'analyse comprenant en outre un élément de normalisation, suivant des configurations correspondant respectivement aux figures 3A et 3C.
En référence à la figure 1 , un procédé d'analyse selon un exemple non limitatif de la présente invention peut comprendre une première étape 101 de préparation de la bio-puce. La première étape 101 peut être suivie d'une seconde étape 102 d'analyse par LIBS, lors de laquelle un plasma est notamment formé sensiblement au niveau des biomolécules cibles à analyser, au moyen d'un laser d'ablation, selon des techniques en elles-mêmes connues.
L'étape de préparation 101 peut comprendre une première sous- étape consistant à déposer les biomolécules, c'est-à-dire des cibles seules et/ou des sondes sur un support, suivie d'un séchage ; une seconde sous- étape peut consister, après une éventuelle sous-étape de saturation, à ségréguer sur le support une pluralité de biomolécules cibles éventuellement en les couplant à des anticorps y correspondant, formant une matrice de sondes. Chaque biomolécule cible est ainsi fixée sur une sonde la reconnaissant disposée sur le support.
Lors de la première étape 101 , il est également procédé à la formation d'une matrice sèche, selon une spécificité de la présente invention. La matrice sèche formée permet d'assurer une meilleure exploitabilité par spectrométrie d'émission optique du plasma produit par laser lors de la seconde étape 102. La matrice sèche est formée de manière à pouvoir être ablatée simultanément à une cible ou à un complexe sonde- cible. Ainsi, un tir du laser d'ablation visant la biomolécule cible d'intérêt garantit l'ablation d'une partie de la matrice sèche avoisinante. A cette fin, la matrice sèche peut être disposée de manière à englober complètement ou partiellement la biomolécule cible ou le complexe sonde-cible. La matrice sèche peut également être disposée au-dessous de la biomolécule-cible ou du complexe sonde-cible, dès lors que la proximité de la matrice sèche est suffisante pour qu'un tir laser destiné à la biomolécule cible ou au complexe sonde-cible ablate également une partie de la matrice sèche avoisinante. Différentes configurations possibles de la matrice sèche par rapport à une biomolécule cible ou à un complexe sonde-cible donné, sur un support de bio-puce, sont décrites ci-après en référence aux figures 3A à 3D.
La matrice sèche est en outre configurée de manière à permettre une amélioration des propriétés analytiques du plasma LIBS. En outre, celle-ci ne doit pas dénaturer la reconnaissance sonde-cible le cas échéant, et ne doit pas en elle-même contenir du phosphore. La matrice sèche peut être amorphe ou cristalline, et peut être formée au moyen d'un adjuvant. L'adjuvant peut par exemple être un adjuvant soluble.
En pratique, dans un mode de réalisation particulier, une solution pour un procédé d'analyse selon l'un des modes de réalisation décrits, comprenant une proportion de biomolécules à analyser peut également comprendre l'adjuvant permettant la formation de la matrice sèche. Dans certains modes de réalisation l'adjuvant peut être introduit dans au moins une des solutions utilisées pour hybrider la bio-puce avec les protéines cibles ou pour rincer la bio-puce après hybridation. Dans ce mode de réalisation, après complexation et / ou rinçage, l'adjuvant permet la formation d'une matrice sèche à la surface de la bio-puce notamment au niveau des différents spots.
Dans d'autres modes de réalisation, l'adjuvant formant une matrice sèche peut être introduit lors de l'étape du dépôt des sondes sur le support au moment de la fabrication de la bio-puce : soit par introduction dans la solution de dépôt des sondes, soit juste après le dépôt des sondes, en greffant chimiquement la molécule d'adjuvant directement sur la surface du support utilisé pour la fixation des sondes. Par exemple des molécules de sucrose peuvent être greffées sur la surface de la bio-puce activées par du SOCI2 au travers de leur fonction alcool.
Dans un autre mode de réalisation, les molécules d'adjuvant peuvent d'abord être greffées à la surface du support de la bio-puce puis activées au besoin en fonction de la nature de l'adjuvant, et les sondes peuvent être greffées en spots sur la surface de la bio-puce au travers des molécules d'adjuvant.
Avantageusement, au moins une solution de rinçage ou d'hybridation peut comprendre un élément de normalisation métallique ou halogéné, émettant un signal LIBS distinct de celui du phosphore et proportionnel à l'abondance dudit élément métallique. Ledit élément de normalisation peut notamment être choisi de manière à ce qu'il soit dans une même fenêtre spectrale que la raie d'émission choisie pour l'analyse du phosphore en fonction de l'appareillage utilisé. De préférence, les raies d'émission peuvent être distinctes au sens du spectrographe utilisé, c'est-à-dire suffisamment éloignées pour un spectrographe donné, pour que celles-ci puissent être distinguées.
D'une manière générale l'élément de normalisation peut être introduit dans l'adjuvant permettant la formation de la matrice sèche.
L'élément de normalisation peut par exemple être le bore, pris isolément, intégré à une molécule ou emprisonné dans une cage moléculaire ou une crypte, et lié de manière reproductible à la cible.
Avantageusement, l'élément de normalisation tel que le bore, peut être directement complexé à l'anticorps de la sonde, ou éventuellement à la cible.
Des exemples de configurations de l'élément de normalisation par rapport à des molécules cibles et/ou des sondes sont décrits ci-après en référence aux figures 4A et 4B. Le support formant la bio-puce peut être un support carboné libre de phosphore, comprenant des composés organiques, c'est-à-dire une combinaison quelconque des éléments Carbone, Hydrogène, Oxygène et Azote. Le support formant la bio-puce peut être monolithique (tel que le diamant), vitreux, ou organo-diamanté, favorisant la formation d'un plasma exploitable dans de bonnes conditions. Il peut être un support constitué de nanoparticules monolithiques recouvert de sondes déposées ou greffées sur un support vitreux ou organique.
L'adjuvant introduit ci-dessus, permettant la formation de la matrice sèche, est lui-même configuré de manière à ne pas dénaturer la liaison sonde-cible, et à ne pas contenir de phosphore. L'adjuvant peut par exemple être formé par des polysaccharides, telles que le saccharose ou tout autre polysaccharide ne contenant pas de phosphore.
La seconde étape 102 précitée permet une analyse par spectrométrie de type LIBS, en mettant en œuvre des dispositifs appropriés, et peut comprendre des sous-étapes de procédé en elles-mêmes connues. La seconde étape 102 implique la mise en œuvre de moyens d'analyse par spectrométrie LIBS, comprenant notamment au moins des moyens d'émission d'un faisceau laser impulsionnel intense ou « faisceau d'ablation », des moyens de déplacement de l'échantillon à analyser, des moyens de détection d'enregistrement et de calcul.
La figure 2 présente un schéma illustrant le principe général d'un procédé d'analyse selon un exemple de réalisation de la présente invention.
Selon le principe général de la présente invention lorsque celle-ci s'applique à des protéines cibles, une pluralité de protéines cibles 201 peuvent être déposées en une pluralité de spots sur un support 200 d'une bio-puce. Dans l'exemple illustré par la figure 2, le support 200 comprend en outre une pluralité de sondes 21 1 aptes à reconnaître les protéines cibles 201 . Un procédé d'analyse selon la présente invention met en œuvre l'utilisation d'un adjuvant 202, par exemple soluble, permettant la formation d'une matrice sèche 203, englobant totalement les complexes sondes-cibles dans l'exemple illustré par la figure 2. Ainsi, à l'issue de la première étape 101 précitée, décrite précédemment en référence à la figure 1 , la biopuce comprenant une pluralité de protéines cibles 201 , ainsi qu'une pluralité de sondes 21 1 dans l'exemple illustré non limitatif de la présente invention, peut être soumise à une analyse par LIBS lors de la seconde étape 102 précitée et décrite en référence à la figure 1 .
Les figures 3A à 3D présentent des schémas illustrant de manière synoptique un dispositif d'analyse selon différents exemples de réalisation de la présente invention, correspondant à différentes configurations de la matrice sèche et du support de la bio-puce.
Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3A, correspondant à une première configuration des biomolécules-cibles, des sondes correspondantes et de la matrice sèche sur le support de la bio-puce, chaque biomolécule-cible 201 fixée à une sonde 21 1 la reconnaissant disposée sur le support 200 de la bio-puce, peut être englobée par un volume de matrice sèche 203 formée par un adjuvant approprié tel que décrit précédemment. Le couple sonde-biomolécule cible 21 1 , 201 peut être complètement englobé par la matrice sèche, ainsi que dans l'exemple illustré par la figure, ou bien seulement partiellement englobé par celle-ci. Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3B, correspondant à une deuxième configuration, le support 200 de la bio-puce, sur lequel sont disposées les sondes permettant de former les couples sondes- biomolécules cibles 21 1 , 201 , peut en sa surface être saturé par la matrice sèche 203. Selon la deuxième configuration, une couche d'adjuvant peut par exemple être disposée sur la surface du support 200 de la bio-puce déjà peuplé de couples sondes-biomolécules cibles 21 1 , 201 . Un tel mode de réalisation peut présenter un avantage en terme de simplicité de mise en œuvre, l'intégralité de la surface du support 200 de la bio-puce pouvant être saturée par la matrice sèche 203.
Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3C, correspondant à une troisième configuration, chaque couple sonde-biomolécule cible 21 1 , 201 disposé sur le support 200 de la bio-puce peut être englobé dans la matrice sèche 203, l'adjuvant formant la matrice sèche 203 pouvant être directement complexé à la sonde 21 1 .
Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3D, correspondant à une quatrième configuration, une couche de matrice sèche 203 peut être formée en disposant ou en greffant une couche d'adjuvant, par exemple uniformément sur la surface du support 200 de la bio-puce, au préalable de la disposition des sondes 21 1 greffées directement sur la matrice. La biomolécule cible se complexe ou s'hybride à la sonde y correspondant directement sur la matrice sèche. Un mode alternatif peut consister à greffer les sondes sur le support puis à greffer sur le support les molécules de la matrice de manière en entourer les cibles. Le quatrième mode de réalisation présente un avantage substantiel d'un point de vue industriel. En effet, des kits comprenant une bio-puce sur le support de laquelle a été formée la couche de matrice sèche 203 peuvent être approvisionnés, à l'instar de bio- puces conventionnelles. Un opérateur peut alors normalement disposer les couples sondes-biomolécules cibles en surface d'une telle bio-puce en procédant d'une manière usuelle.
La présente invention a également pour objet un dispositif ou « kit » de pré-hybridation ou d'hybridation de bio-puces tel que au moins une solution pour la pré-hybridation, l'hybridation ou le rinçage d'une bio-puce comprenant un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche à la surface de la bio-puce. Ainsi la présente invention a également pour objet une bio-puce dont le support comprend ainsi en sa surface une couche de matrice sèche 203.
Quel que soit le mode de réalisation considéré, il peut être avantageux que l'épaisseur de la matrice sèche 203 formée au-dessus des biomolécules cibles ne soit en moyenne pas supérieure à 1 millimètre. Pour des épaisseurs supérieures, le plasma formé par le laser pourrait en effet ne pas contenir de traces de la biomolécule cible dans des proportions raisonnables pour qu'une analyse soit possible.
Dans chacun des modes de réalisation décrits, chaque sonde 21 1 peut avantageusement comprendre un élément de normalisation formant un étalon interne permettant de normaliser signal obtenu par LIBS. Selon une spécificité de la présente invention, ainsi que cela est décrit précédemment, l'élément de normalisation peut être formé par un élément directement complexé à chaque sonde 21 1 , par exemple par une technique de greffage. Si la sonde 21 1 est formée par un anticorps, l'anticorps peut ainsi être directement marqué par l'élément de normalisation par greffage. L'élément de normalisation peut par exemple être formé par un élément tel que le bore.
Des exemples de configurations de l'élément de normalisation par rapport à des molécules cibles et/ou des sondes sont décrits ci-après en référence aux figures 4A et 4B, correspondant respectivement aux configurations 3A et 3C décrites précédemment.
En référence à la figure 4A, un élément de normalisation 405 peut être fixé directement à une sonde 21 1 disposée sur le support 200, par exemple par une technique de greffage. L'ensemble formé par les sondes 21 1 , les cibles 201 peut être englobé par la matrice sèche 203, selon une configuration correspondant à la première configuration décrite précédemment en référence à la figure 3A.
En référence à la figure 4B, un élément de normalisation 405 peut être fixé directement à une sonde 21 1 disposée sur le support 200, par exemple par une technique de greffage. Les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche 203 peuvent dans un tel exemple être directement complexées aux sondes 21 1 , selon une configuration correspondant à la troisième configuration décrite précédemment en référence à la figure 3C. Les raies spectrales de l'adjuvant ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative, comprenant les raies spectrales utilisées pour la normalisation et les raies spectrales utilisées pour la quantification de la cible et/ou de ses modifications post-traductionnelles.
Il est proposé ci-après de décrire en détails deux qualifications d'un procédé selon l'un des modes de réalisation de la présente invention, réalisée par la demanderesse. La demanderesse a procédé à des qualifications du procédé d'analyse en réalisant notamment une analyse de la protéine phosphorylée, plus précisément sur un modèle in vitro reconstitué à partir d'une protéine de caséine béta A2 dans lequel des solutions de concentrations connues de caséine qualifiée par une méthode d'analyse de type spectrométrie d'émission à couplage inductif , communément désignée par le sigle « ICP-AES » correspondant à la terminologie anglaise « Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometry », sont analysées ; et d'autre part dans un modèle biologique contenant du phosphore exogène pour lequel le taux de phosphorylation d'une cible moléculaire H2AX peut être induit à volonté. Le procédé et dispositifs associés à cette analyse sont présentés dans le détail ci-après, selon un exemple de réalisation non limitatif de la présente invention, des procédés et des dispositifs pouvant être appliqués à l'analyse d'autres biomolécules- cibles, et notamment de toutes protéines phosphorylées. Il est à observer que l'exemple décrit ci-après n'est aucunement limitatif de la présente invention, et correspond à un cas particulier dans lequel l'adjuvant est introduit lors de chaque étape de procédé, et que la matrice sèche y est formée sur le support de la bio-puce de manière à englober la biomolécule- cible selon le mode de réalisation décrit précédemment en référence à la figure 2A. Cependant, les différents modes alternatifs décrits ci-dessus en référence aux figures 2B à 2D pourraient également être indifféremment appliqués et conduire à des résultats analogues. Egalement, l'adjuvant pourrait n'être introduit que lors d'une unique étape de procédé.
Exemple de dépôts de cibles sur bio-puce (puce à protéines sans sonde).
La masse moléculaire de la caséine béta A2 est égale à 23,983 kiloDalton. Cette protéine peut par exemple être approvisionnée sous une forme lyophilisée, puis purifiée par exemple par une méthode communément désignée par l'acronyme « HPLC » correspondant à la terminologie anglaise « High Performance Liquid Chromatography » ou chromatographie liquide à haute performance, par exemple en utilisant une solution comprenant de l'eau (H20), de l'acide trifluoroacétique (TFA) et du cyanure de méthyle (ou acétonitrile). La concentration de la protéine peut par exemple être déterminée au moyen d'un spectrophotomètre UV.
Afin d'évaluer l'efficacité de l'analyse par spectrométrie LIBS, une analyse de la phosphorylation de la caséine béta peut être réalisée par une méthode alternative connue et réputée fiable afin de fournir des mesures de référence. A cette fin, il est possible de recourir à une méthode d'analyse de type ICP-AES, cette méthode étant une méthode de référence pour la détermination de la composition élémentaire de composés liquides. La demanderesse a procédé à l'analyse par ICP-AES de solutions de caséine béta avec des concentrations de 0, 4, 12 et 20 μΜ (micromoles).
Afin de déterminer la sensibilité de la spectrométrie LIBS pour la quantification de la phosphorylation de protéines, différentes quantités de caséine béta sont directement déposées sur le support en Kapton-époxy, la pellicule de Kapton-époxy étant par exemple collée au moyen d'une colle cyanoacrylate sur un verre de microscopie (par exemple se présentant sous la forme d'une lamelle de 7,5 par 2,5 cm).
La solution de caséine béta ainsi obtenue est diluée en série à des concentrations de 0, 40, 85, 170, 257 et 350 μιτι dans une solution tamponnée à 0,1 M de tris au pH de 7,5, cette préparation étant désignée « préparation A », dans une solution tamponnée comprenant 0,1 M de tris au pH de 7,5 et 1 mM de sucrose, désignée « préparation B », et dans une solution tamponnée comprenant 0,1 M de tris au pH de 7,5, 1 mM de sucrose et 0,5 mM de bore, désignée « préparation C ». Chacune de ces préparations a été déposée isolément en cinq répliques sur la pellicule de Kapton-époxy, et séchée pendant 30 minutes à température ambiante.
Exemple de bio-puce à anticorps
Des lymphocytes peuvent être isolés par séparation cellulaire par gradient, à partir d'échantillons sanguins humains héparinisés. Les cellules sont lavées à deux reprises dans un tampon phosphate salin ou « PBS », diluées à une concentration de 106 cellules/ml dans un médium cellulaire, par exemple un médium comprenant 10% de sérum de veau fœtal ou « FCS », 1 % de pénicilline-streptomycine, et immédiatement irradiées avec un irradiateur Cobalt 60 à un niveau de dose de 2 Gray.min"1 à 0, 0,5, 2 et 4 Gray. Après leur irradiation, les cellules sont rapidement diluées dans un milieu de culture à une concentration de 5.105 cellules/ml et incubées pendant une heure à une température de 37°C dans une atmosphère comprenant une concentration de 5% de dioxyde de carbone, avant quantification du niveau de phosphorylation du γΗ2ΑΧ.
Afin d'obtenir une matrice adaptée à la quantification de la phosphorylation par une analyse par LIBS, il est nécessaire que la matrice d'anticorps soit elle-même dénuée de phosphore. L'anticorps anti- YH2AXser139 peut être choisi à cette fin. L'anticorps dialysé est alors déposé sur un support formé de Kapton ou de Kapton-époxy, par exemple un support comprenant une couche de Kapton de 25 μιτι, ou une couche de Kapton de 25 μιτι recouverte d'une couche d'époxy de 25 μιτι.
L'anticorps est disposé sur la couche pelliculaire de Kapton-époxy. Un volume de 100 μΙ d'anti-YH2AXser139 est dialysé dans une solution tamponnée de pH 7,5 comprenant 0,1 M de tris, 1 mM de sucrose, pendant quatre heures à une température de 4°C.
Après la dialyse, la concentration de la solution d'anti-YH2AXser139 est ajustée à 0,5 mg/ml dans 1 mM de bore dans une solution tamponnée de 0,1 M de tris, et un volume de 1 μΙ de la solution est disposé dans chaque puits de la matrice sur la couche pelliculaire de Kapton-époxy, puis est séché pendant 30 minutes à température ambiante. Afin d'éviter des liaisons non- spécifiques de protéines à la couche pelliculaire de Kapton-époxy, les fonctions époxy libres du médium sont saturées par une solution tamponnée super bloquante 1 X ou « SBB » suivant le sigle désignant la terminologie anglaise « Super Blocking Buffer » dans une solution comprenant du tris, 1 mM de sucrose et une concentration de 5% de dextran pendant 30 minutes à température ambiante légèrement agitée. Le support peut être lavé à trois reprises dans une solution saline tamponnée au tris, ou solution de type 1 X TBS, comprenant également 1 mM de sucrose et 0,1 % de polysorbate 20, cette solution étant également utilisée pour le lavage de la matrice d'anticorps dans un procédé selon la présente invention. La fixation persistante d'anticorps sur le support peut être analysée au moyen d'un scanner fluorescent, et l'absence de phosphore peut être vérifiée par LIBS.
Afin de permettre l'extraction de la cible antigénique, les lymphocytes sont culottés par centrifugation pendant deux minutes à une vitesse de 10000 tours/min, placés dans un four à micro-ondes sous une puissance de 450 W pendant 15 secondes, puis remis en suspension dans une solution tamponnée comprenant 0,1 M de tris, 1 mM de sucrose à une concentration en protéines de 1 mg/ml.
Pour le couplage protéine-anticorps, les protéines sont diluées à une concentration de 0,1 mg/ml dans une solution tamponnée de 1 X SBB comprenant 1 mM de sucrose, et incubées pendant 12 heures à une température de 4°C. Les matrices d'anticorps en résultant sont lavées dans une solution tamponnée saline de tris (1 X TBS) comprenant 1 mM de sucrose, et 0,1 % de polysorbate 20, et à deux reprises dans une solution tamponnée saline de tris (1 X TBS) comprenant 1 mM de sucrose pendant 15 minutes avec agitation, puis séchées à température ambiante.
Pour ce qui concerne l'analyse par une méthode de référence, une aliquote de lymphocytes irradiés à chaque dose est analysée au moyen d'un trieur de cellules activé par fluorescence, ou « FACS » suivant l'acronyme désignant la terminologie anglaise « Fluorescence Activated Cell Sorter ». Les cellules sont lavées à froid dans un PBS avant fixation et perméabilisation dans de l'éthanol titrant à 70° pendant une heure à une température de 4°C. Les cellules sont alors incubées à température ambiante avec une solution d'anticorps anti-YH2AXser139 dans un PBS comprenant 2% de FCS. Après lavage et centrifugation pour obtenir un culot qui est remis en suspension et incubé pendant une heure avec un anticorps secondaire anti-souris marqué par un fluorophore de type isothiocyanate de fluorescéine, ou « FITC ». Les cellules sont alors lavées, centrifugées et remises en suspension dans un PBS comprenant de l'iodide de propidium et de la ribonucléase. Au moins 104 cellules ont été analysées au moyen d'un cytomètre de flux et l'intensité de fluorescence de chaque cellule a été déterminée au moyen d'un logiciel d'analyse approprié. La quantité de γΗ2ΑΧ dans un échantillon irradié déterminée a alors pu être déterminée à partir de l'intensité de fluorescence médiane des cellules analysées. Analyse de biopuces pour la quantification du phosphore par
LIBS
Les supports de Kapton-époxy où sont fixées les protéines peuvent alors être analysés par LIBS, par exemple au moyen d'une microsonde laser, de moyens de déplacement XY configurés pour déplacer le support avec rapidité et précision. La longueur d'onde du faisceau laser d'ablation utilisé est choisie proche des longueurs d'onde du composé formant l'adduit : pour l'exemple décrit, un laser puisé à grenat d'yttrium-aluminium dopé au néodyme, ou laser « Nd :YAG » de longueur d'onde 266 nm et d'une énergie de 4 mJ par impulsion de 5 ns est utilisé. Deux miroirs réflectifs peuvent guider le faisceau laser pour balayer la surface du support. Au début de son parcours optique, le faisceau laser peut passer au travers d'un diaphragme puis être focalisé sur la surface de l'échantillon à analyser par un objectif de microscope réfractif. La position de l'échantillon peut être visualisée et ajustée par les moyens de déplacement à partir des images fournies par une caméra CCD disposée au-dessus de la microsonde laser. Les échantillons peuvent être positionnés et fixés au moyen de moyens de fixation par exemple formés par des vis, sur les moyens de déplacement XY. Les moyens de déplacement peuvent opérer à une fréquence de 10 Hertz, correspondant à la fréquence des tirs laser dans un mode de synchronisation externe, avec des déplacements de 30 μιτι entre deux tirs laser consécutifs.
Pour l'analyse du plasma, une fibre optique peut être par exemple disposée avec une extrémité au plus proche du plasma, la fibre optique guidant la lumière issue du plasma jusqu'à une fente d'entrée d'un spectromètre équipé d'une caméra CCD intensifiée (ou caméra « ICCD ») puisée. Par exemple, la résolution spectrale peut être égale à 0,032 à 410 nm, pour une fente d'entrée de 100 μιτι. Les moyens de déplacement et la caméra ICCD peuvent par exemple être contrôlés au moyen de moyens de contrôle adaptés, par exemple formés par un unique micro-ordinateur.
Le laser puisé et la caméra ICCD peuvent être contrôlés par des moyens de pilotage pilotant l'ensemble du dispositif d'analyse.
Un tir laser peut être appliqué, et une fenêtre spectrale, par exemple s'étendant dans la gamme de longueurs d'onde de 248 nm à 258 nm, autour de la ligne spectrale propre au phosphore (253,563 nm) peut être acquise, et numérisée puis stockée en mémoire par des moyens appropriés. Les moyens de pilotage peuvent alors imposer aux moyens de déplacement un déplacement de l'échantillon vers une nouvelle position.
Avantageusement, un tube peut être fixé à une partie fixe de la microsonde laser et permet de former des moyens de génération d'un flux de gaz, tel que l'argon, à proximité de la surface de l'échantillon au niveau de laquelle le plasma est généré. De la sorte, la magnitude de l'émission du plasma peut être augmentée, et les phénomènes d'auto-absorption réduits.
Les intensités choisies des raies de phosphore à 253,563 nm (« IP253 ») sont traitées comme des valeurs nettes en soustrayant l'intensité du fond spectral correspondant à la valeur moyenne des intensités mesurées à 254,120 nm et 254,700 nm. Les protéines cibles peuvent être quantifiées en sommant toutes les valeurs nettes des lignes IP253.
Les spectres du phosphore et du bore peuvent être filtrés avec un facteur de fiabilité Cdb déterminé au moyen de la relation suivante :
Cdb = [{{lB - NB)- aN )/{(lB - NB )+ aN)] (1 ), où IB désigne l'intensité du Bore, NB et Ν désignent respectivement la valeur moyenne et l'écart-type de l'intensité du fond autour des longueurs d'onde 249,084 nm et 250,363 nm, calculées sur tous les spectres.
Les valeurs du phosphore pour la protéine cible peuvent alors être quantifiées à partir des spectres sélectionnés à partir de la relation suivante :
ValueP =∑[{lP25 - nP253 )/(lB249 - nB249 )] (2), où IB249 et I P253 désignent les valeurs d'intensité des raies spectrales respectivement du bore et du phosphore, et nP253 et nB249 désignent respectivement l'intensité moyenne du fond autour du bore et du phosphore dans un spectre donné, et correspondant à un pixel de balayage de la surface de médium par LIBS.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé d'analyse quantitative par spectrométrie d'émission optique d'un plasma induit par un faisceau laser d'au moins une cible (201 ) comprise dans une bio-puce caractérisé en ce qu'il met en œuvre l'utilisation d'un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203) apte à être ablatée simultanément à ladite au moins une cible (201 ), la matrice sèche (203) étant configurée pour améliorer les propriétés analytiques du plasma, l'adjuvant (202) présentant un spectre d'émission dont les raies ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative de ladite au moins une cible (201 ).
2- Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite au moins une cible (201 ) est ségréguée sur la bio-puce par au moins une sonde (21 1 ) de sorte qu'un complexe sonde-cible est formé entre chaque sonde (21 1 ) et la cible (201 ) y correspondant.
3- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite utilisation d'un adjuvant (202) permet la formation d'une matrice sèche (203) de structure amorphe.
4- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite utilisation d'un adjuvant (202) permet la formation d'une matrice sèche (203) de structure cristalline.
5- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la matrice sèche (203) est formée de manière à ce que les complexes sondes-cibles sont disposés à la surface d'un support (200), et sont totalement ou partiellement englobés par un volume de ladite matrice sèche (203).
6- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la matrice sèche (203) et les sondes (21 1 ) sont fixées sur un support (200). 7- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche (203) sont directement complexées aux sondes (21 1 ).
8- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche (203) sont fixées sur un support (200), les sondes (21 1 ) étant fixées sur les molécules d'adjuvant, les molécules d'adjuvant étant fixées sur le support (200).
9- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'une couche de matrice sèche (203) est formée en disposant une couche d'adjuvant sur la surface du support (200), préalablement à la disposition des sondes (21 1 ) sur la surface de matrice sèche (203) ainsi formée en surface d'un support (200).
10- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice sèche (203) est formée par un composé dont les longueurs d'onde d'absorption sont proches de la longueur d'onde du faisceau laser, tel que la longueur d'onde utilisée pour le laser soit comprise dans le spectre d'absorption de la matrice sèche (203).
1 1 - Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'adjuvant (202) comprend une solution d'eau et d'un élément du groupe comprenant le sucre, polysaccharide, disaccharide.
12- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque sonde (21 1 ) est marquée par un élément de normalisation (405) formant étalon interne. 13- Procédé d'analyse selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que chaque sonde (21 1 ) est marquée par l'élément de normalisation (405) par greffage. 14- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 1 et 12, caractérisé en ce que l'élément de normalisation (405) est formé par du bore.
15- Dispositif comprenant un support (200) comprenant une pluralité de sites, chaque site comprenant une pluralité de sondes (21 1 ), les sondes (21 1 ) étant greffées de manière concomitante aux molécules d'un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203).
16- Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit support (200) comprend des composés organiques, des composés monolithiques ou organo-diamantés.
17- Solution pour la mise en œuvre d'un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203).
18- Solution selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion déterminée d'un élément de normalisation (405) d'un signal optique d'un plasma induit par un faisceau laser.
PCT/EP2013/069072 2012-09-13 2013-09-13 Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce WO2014041145A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020157009164A KR102165631B1 (ko) 2012-09-13 2013-09-13 바이오칩 상의 생체분자 타겟들의 정량적 libs 측정을 위한 방법 및 디바이스
JP2015531584A JP6220878B2 (ja) 2012-09-13 2013-09-13 バイオチップ上における生体分子ターゲットの定量ｌｉｂｓ計測のための方法及び装置
EP13762488.8A EP2895845A1 (fr) 2012-09-13 2013-09-13 Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce
US14/428,101 US9400252B2 (en) 2012-09-13 2013-09-13 Method and device for the quantitative LIBS measurement of bio-molecular targets on a biochip
CN201380054861.1A CN104737001B (zh) 2012-09-13 2013-09-13 用于生物芯片上生物分子靶的libs定量测量的方法
CA2884867A CA2884867C (fr) 2012-09-13 2013-09-13 Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1258608A FR2995403B1 (fr) 2012-09-13 2012-09-13 Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce
FR1258608 2012-09-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014041145A1 true WO2014041145A1 (fr) 2014-03-20

Family

ID=47215604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2013/069072 WO2014041145A1 (fr) 2012-09-13 2013-09-13 Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9400252B2 (fr)
EP (1) EP2895845A1 (fr)
JP (1) JP6220878B2 (fr)
KR (1) KR102165631B1 (fr)
CN (1) CN104737001B (fr)
CA (1) CA2884867C (fr)
FR (1) FR2995403B1 (fr)
WO (1) WO2014041145A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016095139A (ja) * 2014-11-12 2016-05-26 株式会社島津製作所 試験体プレート作製方法とそれにより作製された試験体プレート及びそれが用いられる含有物質計測装置

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3191840B1 (fr) * 2014-09-12 2020-04-08 Purdue Research Foundation Marquage d'anticorps par un métal et détection à base de plasma
US11353403B2 (en) * 2018-11-30 2022-06-07 Genentech, Inc. Vial contents inspection and material identification method and apparatus
CN113092395A (zh) * 2021-03-31 2021-07-09 四川大学 一种基于咖啡环的细胞快速分类与定量方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656504A (en) * 1992-10-26 1997-08-12 Pharmacia Biosensor Ab Method of preventing undesired binding in solid phase assays
WO2003025547A1 (fr) * 2001-09-21 2003-03-27 Biomedlab Corporation Procede et dispositif permettant de balayer des analytes au moyen de resonance plasmonique de surface
WO2008156491A2 (fr) * 2006-09-29 2008-12-24 Zyomyx, Inc. Dispositifs et procédés pour l'analyse d'échantillons avec épuisement de la teneur en analyte
FR2929011A1 (fr) 2008-03-20 2009-09-25 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif de mesure quantitative a haute cadence de cibles biomoleculaires presentes sur ou dans un support d'analyse biologique.
US20110000791A1 (en) * 2009-07-02 2011-01-06 Amic Ab Capillary driven assay device and its manufacture
US20110171636A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Delaware State University Mono- and multi-element coded libs assays and methods
FR2964458A1 (fr) 2010-09-06 2012-03-09 Commissariat Energie Atomique Dispositif de cartographie et d'analyse a haute resolution d'elements dans des solides
US20120099103A1 (en) * 2009-07-10 2012-04-26 University Of Florida Research Foundation, Inc. Method and apparatus to laser ablation-laser induced breakdown spectroscopy

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3809504C1 (fr) * 1988-03-22 1989-09-21 Bruker - Franzen Analytik Gmbh, 2800 Bremen, De
US20060014212A1 (en) * 2002-05-10 2006-01-19 Epitome Biosystems, Inc. Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis
DE10229498A1 (de) * 2002-07-01 2004-01-22 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung der Plasmaemissionsspektrometrie
KR20060003373A (ko) * 2003-05-16 2006-01-10 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 트랜스크립션 칩
FR2906035B1 (fr) * 2006-09-15 2008-11-28 Commissariat Energie Atomique Procede de mesure quantitative de cibles biomoleculaires deposees sur une biopuce, et dispositif pour sa mise en oeuvre.
JP2008256440A (ja) * 2007-04-03 2008-10-23 Toshiba Corp 分析装置
JP2009288068A (ja) * 2008-05-29 2009-12-10 Toshiba Corp 分析方法およびその装置
CA2892490A1 (fr) * 2012-11-26 2014-05-30 Caris Science, Inc. Compositions de biomarqueur et procedes

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656504A (en) * 1992-10-26 1997-08-12 Pharmacia Biosensor Ab Method of preventing undesired binding in solid phase assays
WO2003025547A1 (fr) * 2001-09-21 2003-03-27 Biomedlab Corporation Procede et dispositif permettant de balayer des analytes au moyen de resonance plasmonique de surface
WO2008156491A2 (fr) * 2006-09-29 2008-12-24 Zyomyx, Inc. Dispositifs et procédés pour l'analyse d'échantillons avec épuisement de la teneur en analyte
FR2929011A1 (fr) 2008-03-20 2009-09-25 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif de mesure quantitative a haute cadence de cibles biomoleculaires presentes sur ou dans un support d'analyse biologique.
US20110171636A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Delaware State University Mono- and multi-element coded libs assays and methods
US20110000791A1 (en) * 2009-07-02 2011-01-06 Amic Ab Capillary driven assay device and its manufacture
US20120099103A1 (en) * 2009-07-10 2012-04-26 University Of Florida Research Foundation, Inc. Method and apparatus to laser ablation-laser induced breakdown spectroscopy
FR2964458A1 (fr) 2010-09-06 2012-03-09 Commissariat Energie Atomique Dispositif de cartographie et d'analyse a haute resolution d'elements dans des solides

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016095139A (ja) * 2014-11-12 2016-05-26 株式会社島津製作所 試験体プレート作製方法とそれにより作製された試験体プレート及びそれが用いられる含有物質計測装置

Also Published As

Publication number Publication date
CA2884867A1 (fr) 2014-03-20
US9400252B2 (en) 2016-07-26
CA2884867C (fr) 2021-06-01
EP2895845A1 (fr) 2015-07-22
JP6220878B2 (ja) 2017-10-25
FR2995403B1 (fr) 2014-09-12
CN104737001B (zh) 2017-11-10
CN104737001A (zh) 2015-06-24
KR20150052310A (ko) 2015-05-13
FR2995403A1 (fr) 2014-03-14
KR102165631B1 (ko) 2020-10-14
US20150233837A1 (en) 2015-08-20
JP2015534639A (ja) 2015-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11175227B2 (en) Optical system and assay chip for probing, detecting and analyzing molecules
US11287382B2 (en) Optical system and assay chip for probing, detecting and analyzing molecules
JP6550433B2 (ja) 多重化組織用のデジタル的に強化された顕微鏡
RU2542386C2 (ru) Димерная окклюдантная наноструктура, меченная молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, локализованной в межчастичном соединении, ее использование и способ ее получения
EP1846162B1 (fr) Dispositif d'analyses biologiques avec detecteur integre
US7656523B2 (en) Multiplexed raman detection with filter set
EP2265933A1 (fr) Procédé et dispositif de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires présentes sur ou dans un support d'analyse biologique
EP2895845A1 (fr) Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce
EP3704471B1 (fr) Appareil et procede de microscopie a fluorescence a super-resolution et de mesure de temps de vie de fluorescence
Lu et al. Electro‐Optical Detection of Single Molecules Based on Solid‐State Nanopores
EP1409999B1 (fr) Appareil de separation par electrophorese sur microcanaux et de detection par fluorescence induite par laser
KR102132624B1 (ko) 라만 분광 기판, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법
EP2488854B1 (fr) Procede et systeme d'imagerie par fonctionnalisation du substrat
Yang et al. Multi-wavelength excitation Raman spectrometers and microscopes for measurements of real-world samples
Kumar et al. A cost-effective identification of tobacco alkaloids using porous Si SERS substrates for forensic and bioanalytical applications
CA2388490A1 (fr) Procede et dispositif d'analyse d'acides nucleiques fixes sur un support
EP3336524A1 (fr) Microscopie raman sous angle supercritique (sar)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13762488

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015531584

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2884867

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14428101

Country of ref document: US

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013762488

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013762488

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20157009164

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A