JP6219956B2 - 血液脳関門シャトル - Google Patents

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Description

本発明は、血液脳関門上のレセプター（Ｒ／ＢＢＢ）と結合する血液脳関門シャトル及びそれを使用する方法に関する。
背景
例えば低い脳透過性を有する大型バイオ治療薬又は小分子薬などの神経障害薬の脳透過は、神経血管ユニット（ＮＶＵ）中の他の細胞成分と一緒に広範囲で不透過性の血液脳関門（ＢＢＢ）によって厳密に制限されている。この障壁を克服するための多くの戦略が試験されており、一つは、脳毛細血管内皮上に発現された内因性レセプターによって仲介されるトランスサイトーシス経路を利用することである。脳へのバイオ治療薬のレセプター介在性送達を可能にするために、モノクローナル抗体又はペプチドなどのリコンビナントタンパク質がこれらのレセプターに対して設計されている。しかし、脳内皮細胞（ＢＥＣ）内の誤ソーティング及びＢＥＣ中のあるオルガネラ（特にバイオ治療薬の分解に導くオルガネラ）内の蓄積度を最小化する一方で脳の取り込みを最大化するための戦略は、まだ探求されていない。
モノクローナル抗体及び他のバイオ治療薬は、中枢神経系（ＣＮＳ）における病態の処置に莫大な治療潜在性を有する。しかし、脳内へのそれらの経路は、ＢＢＢによって阻止される。以前の研究から、血流中に注射されたＩｇＧの非常のわずかなパーセンテージ（約０．１％）がＣＮＳ区画中に透過できることが明らかにされた（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)）。ＣＮＳ中の抗体が低濃度であるせいで、これにより確かに任意の薬理作用が制限される。
したがって、神経障害薬の送達システムがＢＢＢを通過して脳内に薬物を効率的にシャトルする必要がある。
概要
第一の局面では、本発明は、脳エフェクター本体、リンカー、及び血液脳関門レセプターに結合する一つの一価結合性本体を含む血液脳関門シャトルであって、リンカーが、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体にエフェクター本体を連結する血液脳関門シャトルを提供する。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドから成る群より選択される。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体は、血液脳関門レセプターのリガンド、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓＦａｂ、ＶＨＨ、好ましくはｓＦａｂから成る群より選択される分子を含む。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳レセプターは、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、低比重リポタンパク質レセプター関連タンパク質８、低比重リポタンパク質レセプター関連タンパク質１、及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子、好ましくはトランスフェリンレセプターから成る群より選択される。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体は、トランスフェリンレセプターに対する一つのｓｃＦａｂ、より詳細には配列番号１４、１５又は１６のアミノ酸配列内に含まれる、トランスフェリンレセプター中のエピトープを認識するｓｃＦａｂを含む。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、脳エフェクター本体は、神経障害薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞傷害性薬物、脳ターゲットに対する抗体、脳ターゲットに対するモノクローナル抗体、脳ターゲットに対するペプチドから成る群より選択される。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、脳ターゲットは、β−セクレターゼ１、Ａβ、上皮成長因子、上皮成長因子レセプター２、タウ、リン酸化タウ、アポリポタンパク質Ｅ４、αシヌクレイン、αシヌクレインのオリゴマー性フラグメント、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６、アミロイド前駆タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター、及びカスパーゼ６から成る群より選択される。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、脳エフェクター本体は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドから成る群より選択される。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳レセプターに結合する一価結合性本体は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドから成る群より選択され、該一価結合性本体は、リンカーによって脳エフェクター本体のＣ末端に連結されている。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、脳エフェクター本体は、脳ターゲットに対する完全長抗体、好ましくは完全長ＩｇＧを含む。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳関門シャトルは、脳エフェクター本体としての完全長ＩｇＧ抗体、リンカー、及び血液脳レセプターと結合する一価結合性本体としての一つのｓｃＦａｂを含み、ここでｓｃＦａｂは、リンカーによってＩｇＧ抗体の重鎖の一つのＦｃ部分のＣ末端に連結されている。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、エフェクター本体は、Ａβに対する完全長抗体である。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、Ａβに対する抗体は、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を含む。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、Ａβに対する抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、エフェクター本体は、Ａβに対する完全長抗体であり、一価結合性本体は、トランスフェリンレセプターに対するｓｃＦａｂ、より詳細には配列番号１４、１５又は１６のアミノ酸配列内に含まれるトランスフェリンレセプター中のエピトープを認識するｓｃＦａｂである。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体の第１の重鎖は、第１の二量体化モジュールを含み、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体の第２の重鎖は、第２の二量体化モジュールを含み、これら２種の重鎖のヘテロ二量体化が可能になる。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体の第１の重鎖の第１の二量体化モジュールは、ノブズ−イントゥ−ホールズ戦略（knobs into holes strategy）によるノブを含み、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体の第２の重鎖の二量体化モジュールは、ホールを含む。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、エフェクター本体はリン酸化タウに対する完全長抗体であり、一価結合性本体はトランスフェリンレセプターに対する一つのｓｃＦａｂである。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、エフェクター本体はαシヌクレインに対する完全長抗体であり、一価結合性本体はトランスフェリンレセプターに対する一つのｓｃＦａｂである。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、リンカーは、ペプチドリンカー、好ましくは少なくとも２５アミノ酸長、より好ましくは３０〜５０アミノ酸長を有するアミノ酸配列であるペプチドであり、特に該リンカーは、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２又は（Ｇ４Ｓ）４である。
本発明の以下の三つの態様は、脳エフェクター本体が、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドであるが、但し、脳エフェクター本体は完全長抗体、特に完全長ＩｇＧではない血液脳関門シャトルに関する。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体は、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体及び血液脳関門レセプターに結合する一つのｓＦａｂを含み、その際、ｓＦａｂは、第２のリンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＣ末端に連結されている。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、血液脳関門シャトルは、脳エフェクター本体、リンカー、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇドメイン、第２のリンカー、及び血液脳関門レセプターに結合する一つのｓＦａｂを含み、その際、脳エフェクター本体は、第１のリンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＮ末端に連結されており、ｓＦａｂは、第２のリンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に連結されている。
血液脳関門シャトルの特定の一態様では、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体はＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ本体である。
そのうえ本発明は、本発明の血液脳関門シャトルをコードする単離された核酸、血液脳関門シャトルをコードする単離された核酸を含むホスト細胞、及び血液脳関門シャトルを含む薬学的製剤に関する。
本発明の血液脳関門シャトルは、医薬として使用することができ、特に、例えばアルツハイマー病などの神経障害の処置のために使用することができる。
本発明の血液脳関門シャトルは、血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するために使用することができる。
特定の一態様では、本発明の血液脳関門シャトルのＩｇＧ抗体の重鎖であって、そのＦｃ部のＣ末端で、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体としてのｓｃＦａｂに連結されている重鎖は、以下の構造を有する：
− ＩｇＧ重鎖、
− ＩｇＧの重鎖のＦｃ部分のＣ末端をｓｃＦａｂのＶＬドメインのＮ末端に連結しているリンカー、
− ｓｃＦａｂの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及びＣ−κ軽鎖ドメイン、
− ｓｃＦａｂのＣ−κ軽鎖ドメインのＣ末端をｓｃＦａｂのＶＨドメインのＮ末端に連結しているリンカー、
− ｓｃＦａｂ抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及びＩｇＧ ＣＨ３重鎖ドメイン。
第二の局面では、本発明は、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体、リンカー、及び血液脳関門レセプターに対する一つのｓＦａｂを含む、血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するための融合タンパク質であって、ｓＦａｂが、リンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＣ末端に連結されている融合タンパク質を提供する。
本発明の融合タンパク質の特定の一態様では、本発明の融合タンパク質は、さらに、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＮ末端で脳エフェクター本体をＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＮ末端に連結するためのリンカーを含む。
本発明の融合タンパク質の特定の一態様では、脳エフェクター本体は、神経障害薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞傷害性薬物、脳ターゲットに対する抗体フラグメント又はペプチドから成る群より選択され、脳ターゲットに対する抗体フラグメント又はペプチドは、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、Ｆ（ａｂ’）２から成る群より選択される。
本発明の融合タンパク質の特定の一態様では、血液脳関門レセプターに対するｓＦａｂは、トランスフェリンレセプターに対するｓＦａｂ、好ましくは配列番号１４、１５、又は１６のアミノ酸配列内に含まれる、トランスフェリンレセプター中のエピトープを認識するｓｃＦａｂである。
本発明の融合タンパク質の特定の一態様では、リンカーは、ペプチドリンカー、特に少なくとも１５アミノ酸長、より詳細には２０〜５０アミノ酸長を有するアミノ酸配列であるペプチドであり、最も詳細には該リンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号１３）又は（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１７）を有する。
本発明の融合タンパク質の特定の態様では、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体はＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ本体である。
そのうえ、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸、及び本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むホスト細胞を提供する。
第三の局面では、本発明は、本発明の融合タンパク質と、リンカーによって本発明の融合タンパク質のＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＮ末端に連結されている脳エフェクター本体とを含むコンジュゲートを提供する。
本発明のコンジュゲートの特定の一態様では、脳エフェクター本体は神経栄養因子であり、その際、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＮ末端に神経栄養因子を連結しているリンカーはペプチドリンカーである。
そのうえ、本発明は、本発明のコンジュゲート及び薬学的担体を含む薬学的製剤、医薬としてのコンジュゲートの使用、特に神経変性障害、特にアルツハイマー病の処置のためのコンジュゲートの使用を提供する。
実施例に使用された異なる形式の血液脳関門シャトル（融合タンパク質）を示す図である。１Ａ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）。１Ｂ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）のＦｃ部に連結されたＴｆＲに対する単一Ｆａｂ（ｓＦａｂ）。１Ｃ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）のＦｃ部に連結されたＴｆＲに対する二重Ｆａｂ（ｄＦａｂ）。ｓｃＦａｂ構造は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端に融合されている。 実施例に使用された異なる形式の血液脳関門シャトル（融合タンパク質）を示す図である。１Ａ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）。１Ｂ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）のＦｃ部に連結されたＴｆＲに対する単一Ｆａｂ（ｓＦａｂ）。１Ｃ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）のＦｃ部に連結されたＴｆＲに対する二重Ｆａｂ（ｄＦａｂ）。ｓｃＦａｂ構造は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端に融合されている。 実施例に使用された異なる形式の血液脳関門シャトル（融合タンパク質）を示す図である。１Ａ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）。１Ｂ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）のＦｃ部に連結されたＴｆＲに対する単一Ｆａｂ（ｓＦａｂ）。１Ｃ：Ａβに対するＩｇＧ（ｍＡｂ３１）のＦｃ部に連結されたＴｆＲに対する二重Ｆａｂ（ｄＦａｂ）。ｓｃＦａｂ構造は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端に融合されている。 Ａβ構造に対する融合タンパク質の結合特性を示す図である。結合親和性は、Ｆａｂ構築物が保存されたＡβ結合特性を有することを示すＥＬＩＳＡ設定を用いて測定した。ＡβフィブリルへのｍＡｂ３１−８Ｄ３構築物の結合。８Ｄ３（白四角）は固定化Ａβフィブリルに結合しないものの、ｍＡｂ３１−８Ｄ３−ｄＦａｂ（黒四角）、ｍＡｂ３１−８Ｄ３−ｓＦａｂ（白三角）、及びｍＡｂ３１（黒三角）は類似の親和性で結合する。 トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）に対する構築物の結合特性を示す図である。結合親和性は、Ｆａｂ構築物だけがトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）と結合し、二価結合様式のせいで二重Ｆａｂ構築物の方がわずかに高い見かけの親和性を有することを示すＥＬＩＳＡ設定を用いて測定した。ｍＴｆＲへのｍＡｂ３１−８Ｄ３構築物の結合。ｍＡｂ３１（黒三角）は固定化ｍＴｆＲに結合しないものの、ｍＡｂ３１−８Ｄ３−ｄＦａｂ（黒四角）は、８Ｄ３親抗体（白四角）に類似の親和性で結合する。一価構築物ｍＡｂ３１−８Ｄ３−ｓＦａｂ（白三角）は、中等度の結合親和性を示す。 抗Ａβモノクローナル抗体ｍＡｂ３１（図４Ａ）、単一Ｆａｂ ｍＡｂ３１（ｍＡｂ３１のＣ末端に融合された単一Ｆａｂ）（図４Ｂ）、及び二重Ｆａｂ ｍＡｂ３１（ｍＡｂ３１のＣ末端に融合された二重Ｆａｂ）（図４Ｃ）のプラーク装飾を示す図である。ＰＳ２ＡＰＰマウス（ｎ＝３／構築物）に構築物を単回静脈内用量１０mg/kgで注射し、それから投与後８時間脳潅流した。分析は、プラーク結合についての免疫組織化学検査及び共焦点顕微鏡法を含んだ。データは、単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物だけがＢＢＢを通過してプラークに結合できることを示している。この図に全動物からの脳の代表野１個を示す。 抗Ａβモノクローナル抗体ｍＡｂ３１（図４Ａ）、単一Ｆａｂ ｍＡｂ３１（ｍＡｂ３１のＣ末端に融合された単一Ｆａｂ）（図４Ｂ）、及び二重Ｆａｂ ｍＡｂ３１（ｍＡｂ３１のＣ末端に融合された二重Ｆａｂ）（図４Ｃ）のプラーク装飾を示す図である。ＰＳ２ＡＰＰマウス（ｎ＝３／構築物）に構築物を単回静脈内用量１０mg/kgで注射し、それから投与後８時間脳潅流した。分析は、プラーク結合についての免疫組織化学検査及び共焦点顕微鏡法を含んだ。データは、単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物だけがＢＢＢを通過してプラークに結合できることを示している。この図に全動物からの脳の代表野１個を示す。 抗Ａβモノクローナル抗体ｍＡｂ３１（図４Ａ）、単一Ｆａｂ ｍＡｂ３１（ｍＡｂ３１のＣ末端に融合された単一Ｆａｂ）（図４Ｂ）、及び二重Ｆａｂ ｍＡｂ３１（ｍＡｂ３１のＣ末端に融合された二重Ｆａｂ）（図４Ｃ）のプラーク装飾を示す図である。ＰＳ２ＡＰＰマウス（ｎ＝３／構築物）に構築物を単回静脈内用量１０mg/kgで注射し、それから投与後８時間脳潅流した。分析は、プラーク結合についての免疫組織化学検査及び共焦点顕微鏡法を含んだ。データは、単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物だけがＢＢＢを通過してプラークに結合できることを示している。この図に全動物からの脳の代表野１個を示す。 二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物の定量を示す図である。処置された動物合計３匹から異なる３領域でプラーク及び毛細血管の染色を定量した（各構築物あたり合計９野）。データは、二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物ではｍＡｂ３１に比べて毛細血管の場合だけが増加することを示している。プラーク（脳内）で二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１のレベル増加は検出されなかった。１０mg/kgを投与後８時間にｍａｂ３１（ＨＥＫ対照）に比べた二重Ｆａｂ−ｍａｂ３を定量。 単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物の定量を示す図である。処置された動物合計３匹から異なる３領域でプラーク及び毛細血管の染色を定量した（各構築物あたり合計９野）。データは、単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物ではｍＡｂ３１に比べてプラークで大きな増加があることを示している。蛍光シグナルの定量は、単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１がｍＡｂ３１構築物の５０倍超を示している。単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物ではｍＡｂ３１に比べて毛細血管にも一過性染色があり、ＢＢＢを通過したことを示している。１０mg/kgを投与後８時間及び２５mg/kgを投与後２４時間にｍａｂ３１（ＨＥＫ対照）に比べた単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１を定量。 異なる２用量の抗Ａβモノクローナル抗体ｍＡｂ３１及び非常に低用量の単一Ｆａｂ ｍＡｂ３１（ｍＡｂ３１のＣ末端に融合された単一Ｆａｂ）のプラーク装飾を示す図である。構築物をＰＳ２ＡＰＰマウス（ｎ＝３／構築物）に単回静脈内投与で注射し、それから投与後様々な時点で脳潅流した。分析は、プラーク結合についての免疫組織化学検査及び共焦点顕微鏡法を含んだ。データは、単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物だけがＢＢＢを通過してプラークに結合できることを示している。脳曝露は単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物について非常に迅速であり、プラーク装飾は、単回投与から少なくとも１週間にわたり持続可能である。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲの細胞表面発現の定量を示す図である。二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物によるトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）の細胞表面ダウンレギュレーション。ＴｆＲを発現している脳内皮細胞を、単一Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物（図８Ａ）又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物（図８Ｂ）のいずれかと共に２４時間インキュベーションした。二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１構築物だけが細胞表面に発現されたＴｆＲのレベルを低下させた。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。毛細血管及びプラークのｉｎ ｖｉｖｏ染色を検討する初期時点。ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ａ）及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ｂ）の両方が、注射の１５分後に脳血管系を装飾し、それらの分布に差はない。注射の８時間後にｓＦａｂ−ＭＡｂ３１は実質に到達し、アミロイドプラークを装飾する（矢印、図９Ｃ）が、一方、ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１は１５分の時点まで同様に脳血管系内に留まる（図９Ｄ）。ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１について、実質のアミロイドプラークは検出されない。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。毛細血管及びプラークのｉｎ ｖｉｖｏ染色を検討する初期時点。ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ａ）及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ｂ）の両方が、注射の１５分後に脳血管系を装飾し、それらの分布に差はない。注射の８時間後にｓＦａｂ−ＭＡｂ３１は実質に到達し、アミロイドプラークを装飾する（矢印、図９Ｃ）が、一方、ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１は１５分の時点まで同様に脳血管系内に留まる（図９Ｄ）。ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１について、実質のアミロイドプラークは検出されない。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。毛細血管及びプラークのｉｎ ｖｉｖｏ染色を検討する初期時点。ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ａ）及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ｂ）の両方が、注射の１５分後に脳血管系を装飾し、それらの分布に差はない。注射の８時間後にｓＦａｂ−ＭＡｂ３１は実質に到達し、アミロイドプラークを装飾する（矢印、図９Ｃ）が、一方、ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１は１５分の時点まで同様に脳血管系内に留まる（図９Ｄ）。ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１について、実質のアミロイドプラークは検出されない。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。毛細血管及びプラークのｉｎ ｖｉｖｏ染色を検討する初期時点。ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ａ）及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ｂ）の両方が、注射の１５分後に脳血管系を装飾し、それらの分布に差はない。注射の８時間後にｓＦａｂ−ＭＡｂ３１は実質に到達し、アミロイドプラークを装飾する（矢印、図９Ｃ）が、一方、ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１は１５分の時点まで同様に脳血管系内に留まる（図９Ｄ）。ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１について、実質のアミロイドプラークは検出されない。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。研究に使用された全ての構築物の完全性を検査するために、ＭＡｂ３１（図１０Ａ）、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図１０Ｂ）又はｄＦａｂ−ＭＡＢ３１（図１０Ｃ）を使用して１８ヶ月マウスのＡＰＰトランスジェニック脳の凍結切片の染色を行った。図１０Ｄに検査の結果を示す。結果は、３種の構築物全てがトランスジェニックマウスの脳内のアミロイドプラークを検出したことを示した。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。研究に使用された全ての構築物の完全性を検査するために、ＭＡｂ３１（図１０Ａ）、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図１０Ｂ）又はｄＦａｂ−ＭＡＢ３１（図１０Ｃ）を使用して１８ヶ月マウスのＡＰＰトランスジェニック脳の凍結切片の染色を行った。図１０Ｄに検査の結果を示す。結果は、３種の構築物全てがトランスジェニックマウスの脳内のアミロイドプラークを検出したことを示した。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。研究に使用された全ての構築物の完全性を検査するために、ＭＡｂ３１（図１０Ａ）、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図１０Ｂ）又はｄＦａｂ−ＭＡＢ３１（図１０Ｃ）を使用して１８ヶ月マウスのＡＰＰトランスジェニック脳の凍結切片の染色を行った。図１０Ｄに検査の結果を示す。結果は、３種の構築物全てがトランスジェニックマウスの脳内のアミロイドプラークを検出したことを示した。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１又は二重Ｆａｂ−ｍＡｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。研究に使用された全ての構築物の完全性を検査するために、ＭＡｂ３１（図１０Ａ）、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図１０Ｂ）又はｄＦａｂ−ＭＡＢ３１（図１０Ｃ）を使用して１８ヶ月マウスのＡＰＰトランスジェニック脳の凍結切片の染色を行った。図１０Ｄに検査の結果を示す。結果は、３種の構築物全てがトランスジェニックマウスの脳内のアミロイドプラークを検出したことを示した。 単一Ｆａｂ−ｍａｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。ｉｎ ｖｉｖｏ処置標本に関する高分解能共焦点顕微鏡法は、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１が脳毛細血管の管腔側を装飾せず、内皮細胞の管腔膜を通過して小胞様構造内及び内皮細胞サイトゾル内に含まれることを示している。図１１の矢印は、内皮細胞核の反管腔側のｓＦａｂ−ＭＡｂ３１構築物含有小胞を示す。これらのデータは、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１が脳内皮細胞に進入でき、かつまた血管系を通過して脳の実質間隙（parenchyma space）内のアミロイドプラークに到達できることを示唆している（図９Ａ及びＣと比較）。 二重Ｆａｂ−ｍａｂ３１で処置されたＴｆＲのｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を示す図である。ｉｎ ｖｉｖｏ処置標本に関する高分解能共焦点顕微鏡法は、ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１が脳毛細血管の管腔側を装飾せず、内皮細胞の管腔膜を通過して小胞様構造内及び内皮細胞サイトゾル内に含まれることを示している。図１２の矢印は、内皮細胞核の反管腔側のｄＦａｂ−ＭＡｂ３１構築物含有小胞を示す。これらのデータは、ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１が脳内皮細胞に進入することができるが、トラップされて血管系を通過することができず、したがって脳の実質間隙内のアミロイドプラークに到達しないことを示唆している（図９Ｂ及びＤと比較）。 ｉ．ｖ．投与後の脳曝露及びプラーク装飾を示す図である。図１３Ａ：ｍＡｂ３１、ｄＦａｂ、及びｓＦａｂ構築物を１０mg/kgでＰＳ２ＡＰＰトランスジェニック動物に静脈内注射し、動物を潅流し、注射の８時間後に屠殺した。ｍＡｂ３１に比べｄＦａｂについてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった。ｓＦａｂ構築物について、検出抗体からの５５５nmでの蛍光強度ベースで親ｍＡｂ３１の５５倍のプラーク装飾が検出された。注射の８時間後のｍＡｂ３１（図１３Ｂ）、ｄＦａｂ（図１３Ｃ）、及びｓＦａｂ（図１３Ｄ）に関連する代表的な免疫組織化学染色。ｄＦａｂは微小血管だけの染色を示し、一方でｓＦａｂはアミロイド−βプラークを広範囲に装飾する。図１３Ｅ：２mg/kg及び１０mg/kgのどちらのｍＡｂ３１よりも低用量のｓＦａｂ構築物（２．６６mg/kg）の方が脳内のプラークに迅速かつ顕著に到達することの実証。ｓＦａｂ構築物のターゲットとの会合（engagement）は、注射後少なくとも１週間持続可能である。免疫組織化学染色は、注射後７日に２mg/kgのｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び２．６６mg/kgのｓＦａｂ（図１３Ｇ）についてプラーク装飾を示す。 ｉ．ｖ．投与後の脳曝露及びプラーク装飾を示す図である。図１３Ａ：ｍＡｂ３１、ｄＦａｂ、及びｓＦａｂ構築物を１０mg/kgでＰＳ２ＡＰＰトランスジェニック動物に静脈内注射し、動物を潅流し、注射の８時間後に屠殺した。ｍＡｂ３１に比べｄＦａｂについてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった。ｓＦａｂ構築物について、検出抗体からの５５５nmでの蛍光強度ベースで親ｍＡｂ３１の５５倍のプラーク装飾が検出された。注射の８時間後のｍＡｂ３１（図１３Ｂ）、ｄＦａｂ（図１３Ｃ）、及びｓＦａｂ（図１３Ｄ）に関連する代表的な免疫組織化学染色。ｄＦａｂは微小血管だけの染色を示し、一方でｓＦａｂはアミロイド−βプラークを広範囲に装飾する。図１３Ｅ：２mg/kg及び１０mg/kgのどちらのｍＡｂ３１よりも低用量のｓＦａｂ構築物（２．６６mg/kg）の方が脳内のプラークに迅速かつ顕著に到達することの実証。ｓＦａｂ構築物のターゲットとの会合（engagement）は、注射後少なくとも１週間持続可能である。免疫組織化学染色は、注射後７日に２mg/kgのｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び２．６６mg/kgのｓＦａｂ（図１３Ｇ）についてプラーク装飾を示す。 ｉ．ｖ．投与後の脳曝露及びプラーク装飾を示す図である。図１３Ａ：ｍＡｂ３１、ｄＦａｂ、及びｓＦａｂ構築物を１０mg/kgでＰＳ２ＡＰＰトランスジェニック動物に静脈内注射し、動物を潅流し、注射の８時間後に屠殺した。ｍＡｂ３１に比べｄＦａｂについてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった。ｓＦａｂ構築物について、検出抗体からの５５５nmでの蛍光強度ベースで親ｍＡｂ３１の５５倍のプラーク装飾が検出された。注射の８時間後のｍＡｂ３１（図１３Ｂ）、ｄＦａｂ（図１３Ｃ）、及びｓＦａｂ（図１３Ｄ）に関連する代表的な免疫組織化学染色。ｄＦａｂは微小血管だけの染色を示し、一方でｓＦａｂはアミロイド−βプラークを広範囲に装飾する。図１３Ｅ：２mg/kg及び１０mg/kgのどちらのｍＡｂ３１よりも低用量のｓＦａｂ構築物（２．６６mg/kg）の方が脳内のプラークに迅速かつ顕著に到達することの実証。ｓＦａｂ構築物のターゲットとの会合（engagement）は、注射後少なくとも１週間持続可能である。免疫組織化学染色は、注射後７日に２mg/kgのｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び２．６６mg/kgのｓＦａｂ（図１３Ｇ）についてプラーク装飾を示す。 ｉ．ｖ．投与後の脳曝露及びプラーク装飾を示す図である。図１３Ａ：ｍＡｂ３１、ｄＦａｂ、及びｓＦａｂ構築物を１０mg/kgでＰＳ２ＡＰＰトランスジェニック動物に静脈内注射し、動物を潅流し、注射の８時間後に屠殺した。ｍＡｂ３１に比べｄＦａｂについてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった。ｓＦａｂ構築物について、検出抗体からの５５５nmでの蛍光強度ベースで親ｍＡｂ３１の５５倍のプラーク装飾が検出された。注射の８時間後のｍＡｂ３１（図１３Ｂ）、ｄＦａｂ（図１３Ｃ）、及びｓＦａｂ（図１３Ｄ）に関連する代表的な免疫組織化学染色。ｄＦａｂは微小血管だけの染色を示し、一方でｓＦａｂはアミロイド−βプラークを広範囲に装飾する。図１３Ｅ：２mg/kg及び１０mg/kgのどちらのｍＡｂ３１よりも低用量のｓＦａｂ構築物（２．６６mg/kg）の方が脳内のプラークに迅速かつ顕著に到達することの実証。ｓＦａｂ構築物のターゲットとの会合（engagement）は、注射後少なくとも１週間持続可能である。免疫組織化学染色は、注射後７日に２mg/kgのｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び２．６６mg/kgのｓＦａｂ（図１３Ｇ）についてプラーク装飾を示す。 ｉ．ｖ．投与後の脳曝露及びプラーク装飾を示す図である。図１３Ａ：ｍＡｂ３１、ｄＦａｂ、及びｓＦａｂ構築物を１０mg/kgでＰＳ２ＡＰＰトランスジェニック動物に静脈内注射し、動物を潅流し、注射の８時間後に屠殺した。ｍＡｂ３１に比べｄＦａｂについてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった。ｓＦａｂ構築物について、検出抗体からの５５５nmでの蛍光強度ベースで親ｍＡｂ３１の５５倍のプラーク装飾が検出された。注射の８時間後のｍＡｂ３１（図１３Ｂ）、ｄＦａｂ（図１３Ｃ）、及びｓＦａｂ（図１３Ｄ）に関連する代表的な免疫組織化学染色。ｄＦａｂは微小血管だけの染色を示し、一方でｓＦａｂはアミロイド−βプラークを広範囲に装飾する。図１３Ｅ：２mg/kg及び１０mg/kgのどちらのｍＡｂ３１よりも低用量のｓＦａｂ構築物（２．６６mg/kg）の方が脳内のプラークに迅速かつ顕著に到達することの実証。ｓＦａｂ構築物のターゲットとの会合（engagement）は、注射後少なくとも１週間持続可能である。免疫組織化学染色は、注射後７日に２mg/kgのｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び２．６６mg/kgのｓＦａｂ（図１３Ｇ）についてプラーク装飾を示す。 ｉ．ｖ．投与後の脳曝露及びプラーク装飾を示す図である。図１３Ａ：ｍＡｂ３１、ｄＦａｂ、及びｓＦａｂ構築物を１０mg/kgでＰＳ２ＡＰＰトランスジェニック動物に静脈内注射し、動物を潅流し、注射の８時間後に屠殺した。ｍＡｂ３１に比べｄＦａｂについてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった。ｓＦａｂ構築物について、検出抗体からの５５５nmでの蛍光強度ベースで親ｍＡｂ３１の５５倍のプラーク装飾が検出された。注射の８時間後のｍＡｂ３１（図１３Ｂ）、ｄＦａｂ（図１３Ｃ）、及びｓＦａｂ（図１３Ｄ）に関連する代表的な免疫組織化学染色。ｄＦａｂは微小血管だけの染色を示し、一方でｓＦａｂはアミロイド−βプラークを広範囲に装飾する。図１３Ｅ：２mg/kg及び１０mg/kgのどちらのｍＡｂ３１よりも低用量のｓＦａｂ構築物（２．６６mg/kg）の方が脳内のプラークに迅速かつ顕著に到達することの実証。ｓＦａｂ構築物のターゲットとの会合（engagement）は、注射後少なくとも１週間持続可能である。免疫組織化学染色は、注射後７日に２mg/kgのｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び２．６６mg/kgのｓＦａｂ（図１３Ｇ）についてプラーク装飾を示す。 ｉ．ｖ．投与後の脳曝露及びプラーク装飾を示す図である。図１３Ａ：ｍＡｂ３１、ｄＦａｂ、及びｓＦａｂ構築物を１０mg/kgでＰＳ２ＡＰＰトランスジェニック動物に静脈内注射し、動物を潅流し、注射の８時間後に屠殺した。ｍＡｂ３１に比べｄＦａｂについてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった。ｓＦａｂ構築物について、検出抗体からの５５５nmでの蛍光強度ベースで親ｍＡｂ３１の５５倍のプラーク装飾が検出された。注射の８時間後のｍＡｂ３１（図１３Ｂ）、ｄＦａｂ（図１３Ｃ）、及びｓＦａｂ（図１３Ｄ）に関連する代表的な免疫組織化学染色。ｄＦａｂは微小血管だけの染色を示し、一方でｓＦａｂはアミロイド−βプラークを広範囲に装飾する。図１３Ｅ：２mg/kg及び１０mg/kgのどちらのｍＡｂ３１よりも低用量のｓＦａｂ構築物（２．６６mg/kg）の方が脳内のプラークに迅速かつ顕著に到達することの実証。ｓＦａｂ構築物のターゲットとの会合（engagement）は、注射後少なくとも１週間持続可能である。免疫組織化学染色は、注射後７日に２mg/kgのｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び２．６６mg/kgのｓＦａｂ（図１３Ｇ）についてプラーク装飾を示す。 週１回のｉ．ｖ．注射１４回によって処置された担プラークＰＳ２ＡＰＰマウスにおける長期研究でのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す図である。それぞれ低用量ｍＡｂ３１、中用量ｍＡｂ３１、低用量ｓＦａｂ、及び中用量ｓＦａｂについて、研究の終了時に残留プラークに結合している投与後構築物のターゲットプラーク結合性を示す（図１４Ａ〜Ｄ）。皮質及び海馬についてプラークの免疫組織化学染色後の定量的形態計測解析を示す（図１４Ｅ）。研究の開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとして、４．５月齢で屠殺された未処置動物のプラーク負荷を示す。ビヒクル処置動物で見られた進行性のプラーク形成に比べて、中用量ｓＦａｂで処置後に有意なプラーク数の減少が明らかであり、プラーク形成の減少傾向は低用量ｓＦａｂであっても出現する。したがって、ｓＦａｂ構築物は、皮質及び海馬の両方でプラーク数を有意に減少させる。プラークサイズの分析から、プラーク数の減少が小さなプラークサイズで最も顕著であることが明らかとなった。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。 週１回のｉ．ｖ．注射１４回によって処置された担プラークＰＳ２ＡＰＰマウスにおける長期研究でのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す図である。それぞれ低用量ｍＡｂ３１、中用量ｍＡｂ３１、低用量ｓＦａｂ、及び中用量ｓＦａｂについて、研究の終了時に残留プラークに結合している投与後構築物のターゲットプラーク結合性を示す（図１４Ａ〜Ｄ）。皮質及び海馬についてプラークの免疫組織化学染色後の定量的形態計測解析を示す（図１４Ｅ）。研究の開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとして、４．５月齢で屠殺された未処置動物のプラーク負荷を示す。ビヒクル処置動物で見られた進行性のプラーク形成に比べて、中用量ｓＦａｂで処置後に有意なプラーク数の減少が明らかであり、プラーク形成の減少傾向は低用量ｓＦａｂであっても出現する。したがって、ｓＦａｂ構築物は、皮質及び海馬の両方でプラーク数を有意に減少させる。プラークサイズの分析から、プラーク数の減少が小さなプラークサイズで最も顕著であることが明らかとなった。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。 週１回のｉ．ｖ．注射１４回によって処置された担プラークＰＳ２ＡＰＰマウスにおける長期研究でのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す図である。それぞれ低用量ｍＡｂ３１、中用量ｍＡｂ３１、低用量ｓＦａｂ、及び中用量ｓＦａｂについて、研究の終了時に残留プラークに結合している投与後構築物のターゲットプラーク結合性を示す（図１４Ａ〜Ｄ）。皮質及び海馬についてプラークの免疫組織化学染色後の定量的形態計測解析を示す（図１４Ｅ）。研究の開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとして、４．５月齢で屠殺された未処置動物のプラーク負荷を示す。ビヒクル処置動物で見られた進行性のプラーク形成に比べて、中用量ｓＦａｂで処置後に有意なプラーク数の減少が明らかであり、プラーク形成の減少傾向は低用量ｓＦａｂであっても出現する。したがって、ｓＦａｂ構築物は、皮質及び海馬の両方でプラーク数を有意に減少させる。プラークサイズの分析から、プラーク数の減少が小さなプラークサイズで最も顕著であることが明らかとなった。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。 週１回のｉ．ｖ．注射１４回によって処置された担プラークＰＳ２ＡＰＰマウスにおける長期研究でのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す図である。それぞれ低用量ｍＡｂ３１、中用量ｍＡｂ３１、低用量ｓＦａｂ、及び中用量ｓＦａｂについて、研究の終了時に残留プラークに結合している投与後構築物のターゲットプラーク結合性を示す（図１４Ａ〜Ｄ）。皮質及び海馬についてプラークの免疫組織化学染色後の定量的形態計測解析を示す（図１４Ｅ）。研究の開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとして、４．５月齢で屠殺された未処置動物のプラーク負荷を示す。ビヒクル処置動物で見られた進行性のプラーク形成に比べて、中用量ｓＦａｂで処置後に有意なプラーク数の減少が明らかであり、プラーク形成の減少傾向は低用量ｓＦａｂであっても出現する。したがって、ｓＦａｂ構築物は、皮質及び海馬の両方でプラーク数を有意に減少させる。プラークサイズの分析から、プラーク数の減少が小さなプラークサイズで最も顕著であることが明らかとなった。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。 週１回のｉ．ｖ．注射１４回によって処置された担プラークＰＳ２ＡＰＰマウスにおける長期研究でのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す図である。それぞれ低用量ｍＡｂ３１、中用量ｍＡｂ３１、低用量ｓＦａｂ、及び中用量ｓＦａｂについて、研究の終了時に残留プラークに結合している投与後構築物のターゲットプラーク結合性を示す（図１４Ａ〜Ｄ）。皮質及び海馬についてプラークの免疫組織化学染色後の定量的形態計測解析を示す（図１４Ｅ）。研究の開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとして、４．５月齢で屠殺された未処置動物のプラーク負荷を示す。ビヒクル処置動物で見られた進行性のプラーク形成に比べて、中用量ｓＦａｂで処置後に有意なプラーク数の減少が明らかであり、プラーク形成の減少傾向は低用量ｓＦａｂであっても出現する。したがって、ｓＦａｂ構築物は、皮質及び海馬の両方でプラーク数を有意に減少させる。プラークサイズの分析から、プラーク数の減少が小さなプラークサイズで最も顕著であることが明らかとなった。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。 ＦｃのＣ末端に融合されたＴｆＲ ｓｃＦａｂフラグメントと多量体を形成した抗体がＡＤＣＣを誘導しないことを示す図である。ＢＡ／Ｆ３マウス赤白血病細胞のＮＫ９２介在性殺滅を、ＬＤＨの放出を定量することによって測定した。「従来型の」「Ｎ末端をＦｃに」配向でＴｆＲ結合性Ｆａｂ部分を有する多量体性構築物だけが顕著なＡＤＣＣを誘導し、一方で逆配向の脳シャトル構築物は非誘導性（silent）である。 トランスフェリンレセプターに対するｓｃＦａｂ ８Ｄ３が、マウストランスフェリンレセプターの細胞外ドメイン中の３種の異なるペプチドに結合することを示す図である。アミノ酸３個が重複する１５残基長ペプチドへの抗体８Ｄ３の結合は、固定化ｍＴｆＲペプチドを保持するCelluSpotスライド上でインキュベーションされた抗体の化学ルミネセンス検出によって明らかにした。囲み内：８Ｄ３によって結合されたペプチド３７３、３７４、及び３７６番（配列番号１５、１６、及び１７）。
発明の態様の詳細な説明
定義
「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、脳毛細血管内皮形質膜内のタイトジャンクションによって形成される、末梢循環と脳及び脊髄との間の生理学的関門を表し、尿素（６０ダルトン）などの非常に小さな分子であっても脳内への分子の輸送を制限する密着関門を作る。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液−脊髄関門、及び網膜内の血液−網膜関門は、ＣＮＳ内の近接毛細血管関門であり、本明細書において、まとめて血液脳関門又はＢＢＢと呼ばれる。ＢＢＢは、また、関門が毛細血管内皮細胞よりもむしろ上衣細胞から構成される血液−ＣＳＦ関門（脈絡叢）を包含する。
ノブズ−イントゥ−ホールズの二量体化モジュール及び抗体工学におけるそれらの使用は、Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73(1)）に記載されている。
「中枢神経系」又は「ＣＮＳ」は、身体の機能をコントロールする神経組織複合体を表し、それらには、脳及び脊髄が含まれる。
「血液脳関門レセプター」（本明細書では「Ｒ／ＢＢＢ」と略記）は、ＢＢＢを通過して分子を輸送する能力があるか、又は外因性の投与された分子を輸送するために使用される、脳内皮細胞上に発現される細胞外膜結合型レセプタータンパク質である。本明細書におけるＲ／ＢＢＢの例には、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、非限定的に低比重リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低比重リポタンパク質レセプター関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含む低比重リポタンパク質レセプター、ならびにヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。本明細書における例示的なＲ／ＢＢＢは、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）である。
「脳エフェクター本体」は、ＢＢＢを通して脳に輸送されるべき分子を表す。エフェクター本体は、典型的には、脳に送達したい特徴的な治療活性を有する。エフェクター本体には、例えばペプチド、タンパク質、及び抗体、特に脳ターゲットに対するモノクローナル抗体又はそのフラグメントなどの神経障害薬及び細胞傷害性薬物が含まれる。
「一価結合性本体」は、Ｒ／ＢＢＢと特異的に一価結合様式で結合することができる分子を表す。本発明の血液脳シャトル及び／又はコンジュゲートは、単一ユニットの一価結合性本体の存在によって特徴づけられ、すなわち本発明の血液脳シャトル及び／又はコンジュゲートは、１ユニットの一価結合性本体を含む。一価結合性本体には、非限定的に、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及びＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖフラグメントを含む抗体フラグメント、例えば単鎖Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子が挙げられる。一価結合性本体は、例えば、ファージディスプレイ又は免疫処置のような最新技術を用いて加工された足場タンパク質でありうる。一価結合性本体は、また、ペプチドでありうる。ある態様では、一価結合性本体は、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇドメイン及び血液脳関門レセプターに対する単一Ｆａｂ（ｓＦａｂ）を含む。ｓＦａｂは、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端にリンカーによって連結されている。ある態様では、ｓＦａｂはトランスフェリンレセプターに対するものである。
「一価結合様式」は、一価結合性本体とＲ／ＢＢＢとの間の相互作用が一つの単一エピトープを経由して起こる、Ｒ／ＢＢＢへの特異的結合を表す。一価結合様式は、単一エピトープの相互作用点が原因でＲ／ＢＢＢの任意の二量体化／多量体化を阻止する。一価結合様式は、Ｒ／ＢＢＢの細胞内ソーティングが変化することを阻止する。
用語「エピトープ」には、抗体と特異的結合する能力のある任意のポリペプチド決定基が含まれる。ある態様では、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなどの、化学的に活性な表面分子基（surface grouping of molecules）が含まれ、ある態様では、特異的三次元構造特性及び／又は特異的電荷特性を有しうる。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。
「トランスフェリンレセプター」（「ＴｆＲ」）は、脊椎動物での鉄取り込みに関与する、ジスルフィド結合した２個のサブユニット（見かけの分子量はそれぞれ約９０，０００）から構成される膜貫通糖タンパク質（分子量約１８０，０００）である。一態様では、本明細書におけるＴｆＲは、例えばSchneider et al. Nature 311 :675 - 678 (1984)におけるようなアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲである。
本明細書に使用する「神経障害」は、ＣＮＳに影響する、及び／又はＣＮＳに病因を有する疾患又は障害を表す。例示的なＣＮＳ疾患又は障害には、非限定的に、ニューロパチー、アミロイドーシス、ガン、眼疾患又は障害、ウイルス又は微生物感染、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、及びリソソーム蓄積病が挙げられる。本出願のために、血液−網膜関門によって残りの身体から普通は隔離されている眼がＣＮＳに含まれることを理解されたい。神経障害の具体例には、非限定的に、神経変性疾患（非限定的にレビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ−ドレイガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパチー（非限定的にアルツハイマー病及び核上性麻痺を含む）、プリオン病（非限定的に、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト−ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含む）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（非限定的にカナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハラーフォルデン−シュパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ−ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト−ルントボルク症候群を含む）、認知症（非限定的にピック病、及び脊髄小脳失調症を含む）、ガン（例えば、体内の他の場所のガンに起因する脳転移を含む、ＣＮＳ及び／又は脳のガン）が挙げられる。
「神経障害薬」は、１種又は複数の神経障害を処置する薬物又は治療薬である。本発明の神経障害薬には、非限定的に、小分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１種又は複数のＣＮＳターゲットの天然リガンド、１種又は複数のＣＮＳターゲットの天然リガンドの改変版、アプタマー、干渉核酸（すなわち低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、及び小分子、又は任意の前述の活性フラグメントが挙げられる。本発明の例示的な神経障害薬は本明細書に記載されており、それらには、非限定的に、抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、干渉核酸及び小分子、ならびにそれ自体であるか、あるいはＣＮＳ抗原、又は非限定的にアミロイド前駆タンパク質もしくはその部分、アミロイドβ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、タウ、α−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫もしくは他のＣＮＳガンのマーカー、及びニューロトロフィンなどのターゲット分子を特異的に認識及び／又はそれに作用する（すなわち阻害、活性化、もしくは検出する）かのいずれかの任意の前述の活性フラグメントが含まれる。神経障害薬、及び処置するためにそれらを使用することができる対応する障害の非限定的な例は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳損傷（神経発生）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、抗上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）抗体及び脳ガン、グリア細胞系由来神経因子（ＧＤＮＦ）及びパーキンソン病、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び筋萎縮性側索硬化症、うつ、リソソーム酵素及び脳のリソソーム蓄積病、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及び筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリン−１及び統合失調症、抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ）及びＨＥＲ２陽性ガンからの脳転移である。
「造影剤」は、化合物の存在及び／又は位置を直接又は間接的に検出可能にする１種又は複数の性質を有するその化合物である。そのような造影剤の例には、検出を可能にするラベル本体を組み入れているタンパク質及び小分子化合物が挙げられる。
「ＣＮＳ抗原」又は「脳ターゲット」は、抗体又は小分子でターゲティングできる、脳を含むＣＮＳ中に発現される抗原及び／又は分子である。そのような抗原及び／又は分子の例には、非限定的にβ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥｌ）、アミロイドβ（Ａβ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６が挙げられる。一態様では、抗原はＢＡＣＥｌである。
本明細書における「ネイティブな配列」のタンパク質は、タンパク質の天然変異体を含む、自然界で見られるタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質を表す。本明細書に使用する用語には、その天然起源から単離されたタンパク質又はリコンビナント産生されたタンパク質が含まれる。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種のインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び（所望の生物学的活性を示す限り）抗体フラグメントを包含する。
本明細書における「抗体フラグメント」は、抗原と結合する能力を保持するインタクトな抗体の部分を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；二特異性抗体；線状抗体；例えば単鎖Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。「単鎖Ｆａｂ」形式は、例えばHust M. et al. BMC Biotechnol. 2007 Mar 8;7:14に記載されている。
本明細書に使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表し、すなわち、その集団を構成する個別の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に発生しうる可能性のある変異体（そのような変異体は一般に少量存在する）を除き、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。概して種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体処方と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明により使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造することができ、又はリコンビナントＤＮＡ法によって製造することができる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、また、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載されている技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することができる。本明細書におけるモノクローナル抗体の具体例には、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体（その抗原結合性フラグメントを含む）が挙げられる。本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的に、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種から得られた又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であるものの、一方で鎖（一つ又は複数）の残りが、別の種から得られた又は別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントが挙げられる（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)）。本明細書における関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合性配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる（米国特許第５，６９３，７８０号）。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。そのうえ、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含みうる。これらの改変は、さらに、抗体の性能を精密化するために加えられる。一般にヒト化抗体は、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、上記のようなＦＲ置換（一つ又は複数）を除きＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分も含む。さらなる詳細については、Jones et al, Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992)を参照されたい。
本明細書における「ヒト抗体」は、ヒトＢ細胞から入手可能な抗体のアミノ酸配列構造に対応するアミノ酸配列構造を含むヒト抗体であり、それには、ヒト抗体の抗原結合性フラグメントが含まれる。そのような抗体は、非限定的に、免疫処置したときに内因性免疫グロブリンの産生なしにヒト抗体を産生する能力があるトランスジェニック動物（例えばマウス）による産生（例えばJakobovits et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993)；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号及び同第５，５４５，８０７号参照））；ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントを発現しているファージディスプレイライブラリーからの選択（例えば、McCafferty et al, Nature 348:552-553 (1990); Johnson et al, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993); Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Griffith et al, EMBO J. 12:725-734 (1993)；米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号参照）；ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞による作製（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号参照）；及びヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離を含む多様な技法により同定又は製造することができる。
本明細書における「多重特異性抗体」は、少なくとも２種の異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。例示的な多重特異性抗体は、Ｒ／ＢＢＢ及び脳抗原の両方と結合しうる。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。２、３個、又はそれよりも多い（例えば４個の）機能性抗原結合部位を有する加工抗体も考えられている（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７Ａ１号、Miller et al.参照）。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
本明細書における抗体には、変化した抗原結合活性又は生物学的活性を有する「アミノ酸配列変異体」が挙げられる。そのようなアミノ酸変化の例には、抗原に対する親和性が増強した抗体（例えば「親和性成熟」抗体）、及びＦｃ領域が存在するならば、変化したＦｃ領域、例えば変化した（増加もしくは減少した）抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び／もしくは補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を有する抗体（例えば、国際公開公報第００／４２０７２号、Presta, L.及び国際公開公報第９９／５１６４２号、Iduosogieら参照）；ならびに／又は増大もしくは減少した血清半減期（例えば国際公開公報第００／４２０７２号、Presta, L.参照）を有する抗体が挙げられる。
「親和性改変された変異体」は、親和性を変化（増加又は減少）させる、親抗体（例えば親キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体）の一つ又は複数の置換された超可変領域又はフレームワーク残基を有する。一態様では、さらなる発展のために選択された、結果として生じた変異体（１種又は複数）は、本発明によりＲ／ＢＢＢに対して減少した親和性を有する。そのような置換変異体を作製するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７個の部位）は、各部位に可能性のあるアミノ置換を作製するように突然変異される。このように作製された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭｌ３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として一価的にディスプレイされる。次に、ファージディスプレイされた変異体は、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。改変のための候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替的又は追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とそのターゲットとの間の接触点を同定することが有益でありうる。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書において作り上げられた技法による置換のための候補である。そのような変異体が作製された後に、変異体のパネルがスクリーニングに供され、変化した親和性を有する抗体をさらなる成長のために選択することができる。
本明細書における抗体は、存在するならばＦｃ領域に結合している任意の糖質が変化された「グリコシル化変異体」でありうる。例えば、抗体のＦｃ領域に結合しているフコースを欠如する成熟糖質構造を有する抗体は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）に記載されている。US2004/0093621（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合している糖質を二等分するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、国際公開公報第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairetら）及び米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）に参照されている。抗体のＦｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開公報第１９９７／３００８７号（Patelら）に報告されている。そのＦｃ領域に結合している糖質が変化された抗体に関する国際公開公報第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）及び国際公開公報第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）も参照されたい。グリコシル化が改変された抗体を記載しているUS2005/0123546（Umanaら）も参照されたい。本明細書に使用する場合の用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体アミノ酸残基を表す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）ならびに／又は「超可変ループ」由来の残基（例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901- 917 (1987)）を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書定義の超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「完全長抗体」は、抗原結合性可変領域に加えて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、ネイティブな配列の定常ドメイン（例えばヒトのネイティブな配列の定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。
「ネイキッドな抗体」は、細胞傷害性本体、ポリマー、又は放射性ラベルなどの異種分子とコンジュゲーションしていない（本明細書定義の）抗体である。
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブな配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因しうる生物学的活性を表す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合性、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃレセプター結合性、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）などが挙げられる。一態様では、本明細書における抗体は、本質的にエフェクター機能を欠如する。
用語「抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下での抗体によるヒトターゲット細胞の溶解を表す。用語「補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）」は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される過程を意味する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での定義されたタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。そのようなＦｃ部分の結合部位は、技術の現状において公知である。そのようなＦｃ部分の結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（KabatのＥＵインデックスによる番号付け）によって特徴づけられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑ及びＣ３の結合を含む補体活性化を示し、一方で、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３と結合しない。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全長抗体は異なる「クラス」に割り付けることができる。５個の主要なクラスの完全長抗体、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に類別することができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、周知である。本明細書に使用する用語「リコンビナント抗体」は、その抗体をコードする核酸を含むリコンビナントホスト細胞によって発現される抗体（例えばキメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体、又はその抗原結合フラグメント）を表す。リコンビナント抗体を産生するための「ホスト細胞」の例には、（１）哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞（Ｙ０細胞及びＮＳＯ細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えばNicotiana属に属する植物（例えばNicotiana tabacum）；（４）酵母細胞、例えばSaccharomyces属（例えばSaccharomyces cerevisiae）又はAspergillus属（例えばAspergillus niger）に属するもの；（５）細菌細胞、例えばEscherichia coli細胞又はBacillus subtilis細胞などが挙げられる。
本明細書に使用する「特異的に結合性」又は「に特異的に結合する」は、抗原に選択的又は優先的に結合する抗体を表す。結合親和性は、一般に、スキャチャード解析又は表面プラズモン共鳴技法（例えばBIACORE（登録商標）を使用）などの標準アッセイを用いて決定される。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて参照抗体からその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体を表し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体からその抗原への結合を５０％以上遮断する。
本明細書に使用する用語「細胞傷害性薬物」は、細胞機能を阻害もしくは抑制する、及び／又は細胞の死滅もしくは破壊を引き起こす物質を表す。細胞傷害性薬物には、非限定的に放射性同位体（例えばＡｔ２１１、I１３１、I１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びそのフラグメント；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素などの毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）が挙げられる。
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療成績又は予防成績を達成するために必要な薬用量及び時間で有効な量を表す。
本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。この用語には、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異型Ｆｃ領域が含まれる。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖カルボキシル末端に及ぶ。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあり、存在しない場合もある。本明細書において特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）の残基以外の可変ドメイン残基を表す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４種のＦＲドメイン、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４から成る。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中の以下の配列中に出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
本明細書に使用する用語「ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体」は、免疫グロブリンＣＨ２又はＣＨ３ドメイン由来のタンパク質本体を表す。「ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体」は、二量体を形成している２個の「ＣＨ２−ＣＨ３」ポリペプチドを含む。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭでありうる。一態様では、ＩｇＧ免疫グロブリン由来のＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体は、本明細書において「ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ本体」と呼ばれる。この用語には、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのネイティブな配列及び変異型ＣＨ２−ＣＨ３ドメインが含まれる。一態様では、「ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体」は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖Ｃ末端に及ぶヒト重鎖ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧドメイン由来である。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合も、しない場合もある。本明細書において特に明記しない限り、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番システムに従う。
「コンジュゲート」は、非限定的にラベル、神経障害薬又は細胞傷害性薬物を含む１種又は複数の異種分子にコンジュゲーションされた本発明の融合タンパク質である。
本明細書に使用する「リンカー」は、本発明の血液脳関門シャトル及び／又は融合タンパク質及び／又はコンジュゲートの異なる本体を共有結合させる化学リンカー又は単鎖ペプチドリンカーを表す。リンカーは、例えば脳エフェクター本体を一価結合性本体に連結する。例えば、一価結合性本体がＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体及び血液脳関門レセプターに対するｓＦａｂを含むならば、リンカーは、ｓＦａｂをＣＨ３−ＣＨ２ Ｉｇ本体のＣ末端に連結する。一価結合性本体に脳エフェクター本体を連結しているリンカー（第１のリンカー）及びＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端にｓＦａｂを連結しているリンカー（第２のリンカー）は、同一又は異なる場合がある。
１〜２０個のアミノ酸がペプチド結合により繋がったものから成る単鎖ペプチドリンカーを使用することができる。ある他の態様では、アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸より選択される。ある他の態様では、１種又は複数のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンより選択される。他の態様では、リンカーは化学リンカーである。ある態様では、該リンカーは、少なくとも２５アミノ酸長、好ましくは３２〜５０アミノ酸長のアミノ酸配列を有する単鎖ペプチドである。一態様では、該リンカーは（ＧｘＳ）ｎ［但し、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン（ｘ＝３、ｎ＝８、９もしくは１０、及びｍ＝０、１、２もしくは３）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７もしくは８、及びｍ＝０、１、２もしくは３）］であって、好ましくはｘ＝４、ｎ＝６又は７及びｍ＝０、１、２又は３であり、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝７、及びｍ＝２である。一態様では、該リンカーは（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１７）である。一態様では、該リンカーは（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号１３）である。
コンジュゲーションは、多様な化学リンカーを使用して行うことができる。例えば、一価結合性本体又は融合タンパク質、及び脳エフェクター本体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用してコンジュゲーションすることができる。リンカーは、脳への送達時にエフェクター本体の放出を促進する「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52: 127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
共有結合的コンジュゲーションは、直接的又はリンカーを介してのいずれかでありうる。ある態様では、直接コンジュゲーションは、タンパク質融合体の構築による（すなわち、Ｒ／ＢＢＢに対する一価結合性本体及びエフェクター本体をコードしている２種の遺伝子を遺伝子融合し、単一タンパク質として発現させることによる）。ある態様では、直接コンジュゲーションは、Ｒ／ＢＢＢに対する一価結合性本体の二つの部分の一つにある反応基と、脳エフェクター本体上の対応する基又はアクセプターとの間の共有結合の形成による。ある態様では、直接コンジュゲーションは、適切な条件下でコンジュゲーションされるべき他の分子と共有結合を形成する反応基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含むように、コンジュゲーションされるべき２個の分子の一方を改変（すなわち遺伝子改変）することによる。非限定的な一例として、所望の反応基（すなわちシステイン残基）を有する分子（すなわちアミノ酸）を、例えばＲ／ＢＢＢ抗体に対する一価結合性本体に導入し、神経薬と共にジスルフィド結合を形成させることができる。タンパク質への核酸の共有結合的コンジュゲーションの方法も、当技術分野において公知である（すなわち光架橋、例えばZatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74: 77-95 (2005)参照）。コンジュゲーションは、また、多様なリンカーを使用して行うことができる。例えば、一価結合性本体及びエフェクター本体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用してコンジュゲーションすることができる。ペプチド結合によって繋がった１〜２０個のアミノ酸から成るペプチドリンカーも使用することができる。そのようなある態様では、アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸より選択される。他のそのようなある態様では、１種又は複数のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンより選択される。リンカーは、脳に送達されるとエフェクター本体の放出を促進する「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52: 127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
「ラベル」は、本明細書において融合タンパク質と連結された、検出又は画像法のために使用されるマーカーである。そのようなラベルの例には、放射性ラベル、フルオロフォア、クロモフォア、又は親和性タグが挙げられる。一態様では、ラベルは、医用画像法のために使用される放射性ラベル、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、又はこれもヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、鉄などのような核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法（ｍｒｉ）としても知られている）のためのスピンラベルである。「個体」又は「対象」は哺乳類である。哺乳類には、非限定的に、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が挙げられる。ある態様では、個体又は対象はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定するとき９５％又は９９％よりも大きい純度で精製される。抗体純度の判定方法の総説については、例えばFlatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
用語「添付文書」は、治療用処方の販売パッケージに慣例上入れられる説明書であって、そのような治療用処方の使用に関する適応、用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む説明書を表すために使用される。
用語「薬学的製剤」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような剤形の処方であって、その製剤が投与される対象に容認できないほど有毒な追加的な成分を含有しない処方を表す。
「薬学的に許容されうる担体」は、薬学的製剤中の活性成分以外の成分であって、対象に無毒の成分を表す。薬学的に許容されうる担体には、非限定的に、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存料が挙げられる。
本明細書に使用する「処置」（及び「処置する」又は「処置すること」などのその文法的変形）は、処置される個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を表し、予防のため、又は臨床病理の経過中のいずれかに行うことができる。望ましい処置効果には、非限定的に、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接又は間接的病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が挙げられる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発生を遅延又は疾患の進行を減速するために使用される。
組成物及び方法
本発明の方法及び製造品は、Ｒ／ＢＢＢに結合する血液脳関門シャトル及び／又は融合タンパク質を使用又は組み入れる。一価結合性本体の産生又はスクリーニングのために使用されるべきＲ／ＢＢＢ抗原は、例えば所望のエピトープを含む可溶型又はその部分（例えば細胞外ドメイン）でありうる。代替的又は追加的に、細胞表面にＢＢＢ−Ｒを発現している細胞は、一価結合性本体を作製又はスクリーニングするために使用することができる。一価結合性本体を作製するために有用な他の形態のＲ／ＢＢＢは、当業者に明らかであろう。本明細書におけるＲ／ＢＢＢの例には、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、低比重リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及びＬＲＰ８、ならびにヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。
本発明によると、Ｒ／ＢＢＢに対する「一価結合性」本体（例えばＴｆＲに対する一価結合性本体）は、そのような一価結合性本体がＣＮＳ（例えば脳）の取り込みの改善を示すことを実証している本明細書におけるデータに基づき選択される。そのような結合性本体を同定するために、非限定的にスキャッチャードアッセイ及び表面プラズモン共鳴技法（例えばBIACORE（登録商標）使用）ならびに本明細書記載のｉｎ ｖｉｖｏ研究を含む、一価結合様式を測定するための多様なアッセイが利用できる。
したがって、本発明は、血液脳関門を通して例えば神経障害薬などの脳エフェクター本体を輸送するために有用な一価結合性本体の製造方法であって、それがＲ／ＢＢＢに対して一価結合様式を有することから、Ｒ／ＢＢＢに対する一価結合性部分のパネルから一価結合性本体を選択することを含む方法を提供する。一価結合様式は、レセプターの正常な細胞内ソーティングを妨害しないことによって、あるＲ／ＢＢＢについて効率的なＢＢＢ通過を確実にする。
ニューロパチー障害のために、非限定的に麻薬性／オピオイド鎮痛薬（すなわちモルヒネ、フェンタニル、ヒドロコドン、メペリジン、メサドン、オキシモルフォン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、トラマドール、コデイン及びオキシコドン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（すなわちイブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルビプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、及びトルメチン）、コルチコステロイド（すなわちコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン及びトリアムシノロン）、抗片頭痛薬（すなわちスマトリプチン（sumatriptin）、アルモトリプタン、フロバトリプタン、スマトリプタン、リザトリプタン、エレトリプタン、ゾルミトリプタン、ジヒドロエルゴタミン、エレトリプタン及びエルゴタミン）、アセトアミノフェン、サリチラート（すなわちアスピリン、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、ジフルニサル、及びサルサラート）、抗けいれん薬（すなわちカルバマゼピン、クロナゼパム、ガバペンチン、ラモトリジン、プレガバリン、チアガビン、及びトピラマート）、麻酔薬（すなわちイソフルラン、トリクロロエチレン、ハロタン、セボフルラン、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、ノボカイン、プロパラカイン、テトラカイン、アルチカイン、ブピバカイン、カルチカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカイン、サキシトキシン及びテトロドトキシン）、及びｃｏｘ−２阻害剤（すなわちセレコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブ）を含む鎮痛薬である神経薬を選択することができる。めまいを併発したニューロパチー障害のために、非限定的にメクリジン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン及びジアゼパムを含む抗めまい薬である神経薬を選択することができる。悪心を併発したニューロパチー障害のために、非限定的にプロメタジン、クロルプロマジン、プロクロルペラジン、トリメトベンズアミド、及びメトクロプラミドを含む制吐薬である神経薬を選択することができる。神経変性疾患のために、成長ホルモン又は神経栄養因子である神経薬を選択することができ；例には、非限定的に脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−２及び他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１レセプター拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン（artemin）、パーセフィン、インターロイキン、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＦＲ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ、ネトリン、カーディオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリン、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）が挙げられる。ガンのために、化学療法剤である神経薬を選択することができる。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN（登録商標）（シクロホスファミド（cyclosphosphamide））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホナート；ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、及びウレドパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（triethiylenethiophosphoramide）及びトリメチロロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN（登録商標）を含む）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（scopolectin）、及び９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラスタチン（pancratistatin）；サルコディクチン（sarcodictyin）；スポンジスタチン（spongistatin）；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン（mechlorethamme）、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン（chlorozotocin）、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソウレア（nitrosurea）；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えばカリチアマイシン、特にカリチアマイシンγＩＩ及びカリチアマイシンωＩＩ（例えばAgnew, Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)参照）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォア及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン（aclacinomysin）、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）（ドキソルビシン）（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；フォリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エフロールニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；メイタンシンなどのメイタンシノイド及びアンサミトシン（ansamitocin）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラクリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）（多糖複合体）（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン（rhizoxin）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（mitolactol）；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド（例えば、TAXOL（登録商標）（パクリタキセル）（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、ABRAXANE（商標）（クレモフォール不含、パクリタキセルのアルブミン加工ナノパーティクル製剤）（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、及びTAXOTERE（登録商標）（ドキセタキセル（doxetaxel））（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル（chloranbucil）；ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（leucovovin）；ビノレルビン（vinorelbine）（NAVELBINE（登録商標））；ノバントロン（novantrone）；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸塩；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（XELODA（登録商標））；上記の任意の薬学的に許容されうる塩、酸又は誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語）、及びＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ELOXATIN（商標））を５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせた処置方式の略語）などの上記の２種以上の組み合わせが挙げられる。
ガンの成長を促進することができるホルモンの効果を調節、低減、遮断、又は阻害するように作用し、多くの場合に全身性又は全身処置の形態である抗ホルモン剤も、この化学療法剤の定義に含まれる。それらは、ホルモン自体でありうる。例には、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標）（タモキシフェン）を含む）、EVISTA（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びFARESTON（登録商標）（トレミフェン）を含む抗エストロゲン薬及び選択的エストロゲンレセプターモデュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン薬；エストロゲンレセプターダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；卵巣を抑制又は活動停止にするように機能する薬剤、例えば、LUPRON（登録商標）及びELIGARD（登録商標）（酢酸ロイプロリド）などの黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン（tripterelin）；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなどの他の抗アンドロゲン薬；ならびに例えば４（５）−イミダゾール、アミドグルテチミド、MEGASE（登録商標）（酢酸メゲストロール）、AROMASIN（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン（formestanie）、ファドロゾール、RIVISOR（登録商標）（ボロゾール）、FEMARA（登録商標）（レトロゾール）、及びARIMIDEX（登録商標）（アナストロゾール）などの、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬が挙げられる。加えて、化学療法剤のそのような定義には、クロドロネート（例えばBONEFOS（登録商標）又はOSTAC（登録商標））、DIDROCAL（登録商標）（エチドロネート）、ＮＥ−５８０９５、ZOMETA（登録商標）（ゾレドロン酸／ゾレドロネート）、FOSAMAX（登録商標）（アレンドロネート）、AREDIA（登録商標）（パミドロネート）、SKELID（登録商標）（チルドロネート）、又はACTONEL（登録商標）（リセドロネート）などのビスホスホネート；及びトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に結びつけられるシグナル伝達経路での遺伝子の発現を阻害するもの；THERATOPE（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えばALLOVECTIN（登録商標）ワクチン、LEUVECTIN（登録商標）ワクチン、及びVAXID（登録商標）ワクチン；LURTOTECAN（登録商標）（トポイソメラーゼ１阻害剤）；ABARELLX（登録商標）（ｒｍＲＨ）；ラパチニブジトシレート（ＧＷ５７２０１６としても公知のＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ならびに上記の任意の薬学的に許容されうる塩、酸又は誘導体が挙げられる。
ガンの治療又は予防のための神経薬として選択することができる別の群の化合物は、抗ガン免疫グロブリン（非限定的にトラスツズマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ（alemtuxumab）、セツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、パニツムマブ及びリツキシマブを含む）である。場合により、非限定的に放射性ラベルを有するトシツモマブを含む、毒性ラベルと一緒になった抗体を、所望の細胞（すなわちガン細胞）をターゲティングして殺滅するために使用することができる。
眼疾患又は眼障害のために、抗血管新生眼科薬（すなわちベバシズマブ、ラニビズマブ及びペガプタニブ）、眼科用緑内障薬（すなわちカルバコール、エピネフリン、臭化デメカリウム、アプラクロニジン、ブリモニジン、ブリンゾラミド、レボブノロール、チモロール、ベタキソロール、ドルゾラミド、ビマトプロスト、カルテオロール、メチプラノロール、ジピベフリン、トラボプロスト及びラタノプロスト）、カルボニックアンヒドラーゼ阻害薬（すなわちメタゾラミド及びアセタゾラミド）、眼科用抗ヒスタミン薬（すなわちナファゾリン、フェニレフリン及びテトラヒドロゾリン）、眼用ルブリカント（ocular lubricant）、眼科用ステロイド（すなわちフルオロメトロン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デキサメタゾン、ジフルプレドナート、リメキソロン、フルオシノロン、メドリゾン及びトリアムシノロン）、眼科用麻酔薬（すなわちリドカイン、プロパラカイン及びテトラカイン）、眼科用抗感染症薬（すなわちレボフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン（moxif oxacin）、クロラムフェニコール、バシトラシン／ポリミキシンｂ、スルファセタミド、トブラマイシン、アジスロマイシン、ベシフロキサシン、ノルフロキサシン、スルフイソキサゾール、ゲンタマイシン、イドクスウリジン、エリスロマイシン、ナタマイシン、グラミシジン、ネオマイシン、オフロキサシン、トリフルリジン（trif uridine）、ガンシクロビル、ビダラビン）、眼科用抗炎症薬（すなわちネパフェナク、ケトロラク、フルビプロフェン、スプロフェン、シクロスポリン、トリアムシノロン、ジクロフェナク及びブロムフェナク）、及び眼科用抗ヒスタミン薬又はうっ血除去薬（すなわちケトチフェン、オロパタジン、エピナスチン、ナファゾリン、クロモリン、テトラヒドロゾリン、ペミロラスト、ベポタスチン、ナファゾリン、フェニレフリン、ネドクロミル、ロドキサミド（lodox amide）、フェニレフリン、エメダスチン及びアゼラスチン）である神経薬を選択することができる。発作障害のために、非限定的にバルビツレート系抗けいれん薬（すなわちプリミドン、メタルビタール、メホバルビタール、アロバルビタール、アモバルビタール、アプロバルビタール、アルフェナール（alphenal）、バルビタール、ブラロバルビタール及びフェノバルビタール）、ベンゾジアゼピン系抗けいれん薬（すなわちジアゼパム、クロナゼパム、及びロラゼパム）、カルバメート系抗けいれん薬（すなわちフェルバメート）、カルボニックアンヒドラーゼ阻害薬系抗けいれん薬（すなわちアセタゾラミド、トピラマート及びゾニサミド）、ジベンザゼピン系抗けいれん薬（すなわちルフィナマイド、カルバマゼピン、及びオクスカルバゼピン）、脂肪酸誘導体系抗けいれん薬（すなわちジバルプロエクス及びバルプロ酸）、γ−アミノ酪酸アナログ（すなわちプレガバリン、ガバペンチン及びビガバトリン）、γ−アミノ酪酸再取り込み阻害薬（すなわちチアガビン）、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ阻害薬（すなわちビガバトリン）、ヒダントイン系抗けいれん薬（すなわちフェニトイン、エトトイン、ホスフェニトイン及びメフェニトイン）、その他の抗けいれん薬（すなわちラコサミド及び硫酸マグネシウム）、プロゲスチン（すなわちプロゲステロン）、オキサゾリジンジオン系抗けいれん薬（すなわちパラメタジオン及びトリメタジオン）、ピロリジン系抗けいれん薬（すなわちレベチラセタム）、スクシンイミド抗けいれん薬（すなわちエトスクシミド及びメトスクシミド）、トリアジン系抗けいれん薬（すなわちラモトリジン）、及び尿素系抗けいれん薬（すなわちフェナセミド及びフェネトライド）を含む抗けいれん薬又は抗てんかん薬である神経薬を選択することができる。
リソソーム蓄積病のために、それ自体であるか、又は疾患において障害される酵素の活性を他の方法で模倣する神経薬を選択することができる。リソソーム蓄積障害の処置のための例示的なリコンビナント酵素には、非限定的に、例えば米国特許出願公開第２００５／０１４２１４１号に示される酵素（すなわち、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、β−グルクロニダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−ガラクトセレブロシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、酸性セラミダーゼ、アスパルトアシラーゼ、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ１及びトリペプチジルアミノペプチダーゼ１）が挙げられる。
アミロイドーシスのために、非限定的に、β−セクレターゼ、タウ、プレセニリン、アミロイド前駆タンパク質又はその部分、アミロイドβペプチド又はそのオリゴマーもしくはフィブリル、デスレセプター６（ＤＲ６）、終末糖化産物レセプター（ＲＡＧＥ）、パーキン、及びハンチンチンから選択されるターゲットに特異的に結合する抗体又は他の結合分子（非限定的に小分子、ペプチド、アプタマー、又は他のタンパク質バインダーを含む）；コリンエステラーゼ阻害薬（すなわちガランタミン、ドネペジル、リバスチグミン及びタクリン）；ＮＭＤＡレセプター拮抗薬（すなわちメマンチン）、モノアミン枯渇剤（monoamine depletor）（すなわちテトラベナジン）；メシル酸エルゴロイド；抗コリン作動性抗パーキンソン病薬（すなわちプロシクリジン、ジフェンヒドラミン、トリヘキシフェニジル（trihexylphenidyl）、ベンズトロピン、ビペリデン及びトリヘキシフェニジル）；ドーパミン作動性抗パーキンソン病薬（すなわちエンタカポン、セレギリン、プラミペキソール、ブロモクリプチン、ロチゴチン、セレギリン、ロピニロール、ラサギリン、アポモルヒネ、カルビドパ、レボドパ、ペルゴリド、トルカポン及びアマンタジン）；テトラベナジン；抗炎症薬（非限定的に、非ステロイド系抗炎症薬（すなわち、インドメタシン（indomethicin）及び上に列挙した他の化合物を含む）；ホルモン（すなわちエストロゲン、プロゲステロン及びロイプロリド）；ビタミン（すなわち葉酸塩及びニコチンアミド）；ジメボリン（dimebolin）；ホモタウリン（すなわち３−アミノプロパンスルホン酸；３ＡＰＳ）；セロトニンレセプター活性モデュレーター（すなわちキサリプロデン）；インターフェロン、ならびにグルココルチコイドを含む神経薬を選択することができる。
ウイルス又は微生物疾患のために、非限定的に抗ウイルス化合物（非限定的に、アダマンタン抗ウイルス薬（すなわちリマンタジン及びアマンタジン）、抗ウイルス性インターフェロン（すなわちペグインターフェロンα−２ｂ）、ケモカインレセプター拮抗薬（すなわちマラビロク）、インテグラーゼ鎖転移阻害薬（すなわちラルテグラビル）、ノイラミニダーゼ阻害薬（すなわちオセルタミビル及びザナミビル）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（すなわちエファビレンツ、エトラビリン、デラビルジン及びネビラピン）、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（テノホビル、アバカビル、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、エンテカビル、エムトリシタビン、アデホビル、ザルシタビン、テルビブジン及びジダノシン）、プロテアーゼ阻害薬（すなわちダルナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、リトナビル、ネルフィナビル（nelfmavir）、アンプレナビル、インジナビル及びサキナビル）、プリンヌクレオシド（すなわちバラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、リバビリン、ガンシクロビル、バルガンシクロビル及びシドホビル）、及びその他の抗ウイルス薬（すなわちエンフビルチド、ホスカルネット、パリビズマブ及びホミビルセン））、抗生物質（非限定的にアミノペニシリン（すなわちアモキシシリン、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン（flucoxacillin）、テモシリン、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラシリン及びバカンピシリン）、セファロスポリン（すなわちセファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セファドロキシル、セフラジン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、及びセフォキシチン）、カルバペネム／ペネム（すなわちイミペネム、メロペネム、エルタペネム、ファロペネム及びドリペネム）、モノバクタム（すなわちアズトレオナム、チゲモナム（tigemonam）、ノカルジシン（norcardicin）Ａ及びタブトキシニン−β−ラクタム、別のβ−ラクタム抗生物質と組み合わせたβ−ラクタマーゼ阻害薬（すなわちクラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタム）、アミノグリコシド（すなわちアミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、及びパロモマイシン）、アンサマイシン（すなわちゲルダナマイシン及びハービマイシン）、カルバセフェム（すなわちロラカルベフ）、グリコペプチド（すなわちテイコプラニン及びバンコマイシン）、マクロライド（すなわちアジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン及びスペクチノマイシン）、モノバクタム（すなわちアズトレオナム）、キノロン（すなわちシプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン及びテマフロキサシン）、スルホンアミド（すなわちマフェニド、スルホンアミドクリソイジン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム及びスルファメトキサゾール）、テトラサイクリン（すなわちテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン及びオキシテトラサイクリン）、抗悪性腫瘍性又は細胞傷害性抗生物質（すなわちドキソルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ペントスタチン及びバルルビシン）及びその他の抗細菌化合物（すなわちバシトラシン、コリスチン及びポリミキシンＢ）を含む）、抗真菌薬（すなわちメトロニダゾール、ニタゾキサニド、イミダゾール、クロロキン、ヨードキノール及びパロモマイシン）、及び抗寄生虫薬（非限定的にキニーネ、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、スルファドキシン、プログアニル、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニン（artemesinin）、ハロファントリン（halofantrine）、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、メベンダゾール、パモ酸ピランテル、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、リファンピシン、アンホテリシンＢ、メラルソプロール、エフロルニチン（efornithine）及びアルベンダゾールを含む）が含まれる神経薬を選択することができる。虚血のために、非限定的に、血栓溶解薬（すなわちウロキナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ及びテネクテプラーゼ）、血小板凝集阻害薬（すなわちアスピリン、シロスタゾール、クロピドグレル、プラスグレル及びジピリダモール）、スタチン（すなわちロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン（fiuvastatin）、ロスバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン及びピタバスタチン）、及び血流又は血管柔軟性を高めるための、例えば血圧医薬品を含む化合物が含まれる神経薬を選択することができる。
行動障害のために、神経薬は、非限定的に非定型抗精神病薬（すなわちリスペリドン、オランザピン、アリピプラゾール（apripiprazole）、クエチアピン、パリペリドン、アセナピン、クロザピン、イロペリドン及びジプラシドン）、フェノチアジン抗精神病薬（すなわちプロクロルペラジン、クロルプロマジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、トリフルオペラジン、チオリダジン及びメソリダジン）、チオキサンテン（すなわちチオチキセン）、その他の抗精神病薬（すなわちピモジド、リチウム、モリンドン、ハロペリドール及びロキサピン）、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（すなわちシタロプラム、エスシタロプラム、パロキセチン、フルオキセチン及びセルトラリン）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（すなわちデュロキセチン、ベンラファキシン、デスベンラファキシン、三環系抗うつ薬（すなわちドキセピン、クロミプラミン、アモキサピン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、トリミプラミン、イミプラミン、プロトリプチリン及びデシプラミン）、四環系抗うつ薬（すなわちミルタザピン及びマプロチリン）、フェニルピペラジン抗うつ薬（すなわちトラゾドン及びネファゾドン）、モノアミンオキシダーゼ阻害薬（すなわちイソカルボキサジド、フェネルジン、セレギリン及びトラニルシプロミン）、ベンゾジアゼピン（すなわちアルプラゾラム、エスタゾラム、フルラゼパム（flurazeptam）、クロナゼパム、ロラゼパム及びジアゼパム）、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害薬（すなわちブプロピオン）、ＣＮＳ刺激薬（すなわちフェンテルミン、ジエチルプロピオン、メタンフェタミン、デキストロアンフェタミン、アンフェタミン、メチルフェニデート、デクスメチルフェニデート、リスデキサンフェタミン、モダフィニル（modafmil）、ペモリン、フェンジメトラジン（phendimetrazme）、ベンズフェタミン、フェンジメトラジン（phendimetrazme）、アルモダフィニル（armodafmil）、ジエチルプロピオン、カフェイン、アトモキセチン、ドキサプラム、及びマジンドール）、抗不安／鎮静／催眠薬（非限定的にバルビツレート（すなわちセコバルビタール、フェノバルビタール及びメホバルビタール）、ベンゾジアゼピン（上記）、及びその他の抗不安／鎮静／催眠薬（すなわちジフェンヒドラミン、ナトリウムオキシベート、ザレプロン、ヒドロキシジン、抱水クロラール、アオルピデム（aolpidem）、ブスピロン、ドキセピン、エスゾピクロン、ラメルテオン、メプロバメート及びエチクロルビノール）を含む）、セクレチン（例えばRatliff-Schaub et al. Autism 9: 256-265 (2005)参照）、オピオイドペプチド（例えばCowen et al, J. Neurochem. 89:273-285 (2004)参照）、及び神経ペプチド（例えばHethwa et al. Am. J. Physiol. 289: E301-305 (2005)参照）を含む行動変容化合物から選択することができる。
ＣＮＳ炎症のために、炎症自体に対処する神経薬（すなわちイブプロフェン又はナプロキセンなどの非ステロイド系抗炎症薬）、又は炎症の根底にある原因を処置する神経薬（すなわち抗ウイルス薬又は抗ガン薬）を選択することができる。
別の態様では、脳エフェクター本体は、インタクトな抗体又は完全長抗体である。インタクトな抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り付けることができる。インタクトな抗体には五つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。一態様では、インタクトな抗体はエフェクター機能を欠如する。
抗体を作製するための技法は公知であり、例が、本明細書上記の定義の部に提供される。一態様では、抗体は、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体又はその抗原結合フラグメントである。
Ｒ／ＢＢＢに対する一価結合性本体の結合を決定するために様々な技法が利用可能である。そのような一アッセイは、ヒトＲ／ＢＢＢ（及び脳抗原）に対する結合能を確認するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイによると、抗原（例えばリコンビナントｓＲ／ＢＢＢ）をコーティングされたプレートが、Ｒ／ＢＢＢに対する一価結合性本体を含む試料と共にインキュベーションされ、関心が持たれる抗原に対する一価結合性本体の結合が決定される。
一局面では、本発明の一価結合性本体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原活性について検査される。
一局面では、本発明の一価結合性本体は、Ｘ線構造決定のエピトープマッピングを用いて、Ｒ／ＢＢＢに対する単一抗原結合活性について検査される。
全身投与された血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの取り込みならびに血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの他の生物学的活性を評価するためのアッセイは、実施例に開示するように、又は関心が持たれる血液脳関門シャトル及び／もしくはコンジュゲートについて公知のように行うことができる。ＣＮＳの実質間隙内の濃度の測定は、また、ラベルされた血液脳関門シャトル及び／又は、例えばコンジュゲートのＥＬＩＳＡ又は放射能測定と組み合わせた微量透析法又は毛細血管枯渇法（capillary depletion method）を用いて使用することができる。
薬学的製剤
本発明により使用される血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの治療用製剤は、場合による薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で保管用に調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤は、採用される用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、それらには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
本明細書における製剤は、また、必要に応じて１種よりも多い活性化合物を、場合により相互にマイナスに影響しない相補的活性を有する活性化合物を含有しうる。そのような医薬の種類及び有効量は、例えば、製剤中に存在する血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの量、ならびに対象の臨床パラメーターに依存する。例示的なそのような医薬を後述する。
活性成分は、また、例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリメタクリル酸メチルマイクロカプセルにより、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノパーティクル及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルション中に封入することができる。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、又はポリビニルアルコール、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸−Ｌ−グルタミン酸γ−エチルコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニルコポリマー、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用されるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。一態様では、製剤は等張である。
本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートは、多様なｉｎ ｖｉｖｏ方法で利用することができる。例えば、本発明は、ＢＢＢを通して治療用化合物を輸送する方法であって、血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートをＢＢＢに曝露することにより、一価結合性本体がそれに連結された治療用化合物を、ＢＢＢを通して輸送することを含む方法を提供する。別の例では、本発明は、ＢＢＢを通して神経障害薬を輸送する方法であって、血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートをＢＢＢに曝露することにより、一価結合性本体がそれに連結された神経障害薬を、ＢＢＢを通して輸送する方法を提供する。一態様では、本明細書におけるＢＢＢは、哺乳類（例えばヒト）における、例えば非限定的にアルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、ガン、外傷性脳損傷などを含む神経障害を有するＢＢＢである。
一態様では、神経障害は、ニューロパチー、アミロイドーシス、ガン（例えばＣＮＳ又は脳に波及する）、眼疾患又は眼障害、ウイルス又は微生物感染、炎症（例えばＣＮＳ又は脳の炎症）、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、リソソーム蓄積病などより選択される。
ニューロパチー障害は、不適切もしくは制御不能の神経シグナル伝達又はその欠如によって特徴づけられる神経系の疾患又は異常であり、ニューロパチー障害には、非限定的に、慢性痛（侵害受容性疼痛を含む）、ガン関連痛を含む体組織への損傷によって起こる疼痛、神経因性疼痛（神経、脊髄、又は脳における異常によって起こる疼痛）、及び心因性疼痛（精神障害に完全又は大部分関係する）、頭痛、片頭痛、ニューロパチー、ならびにめまい又は悪心などの、多くの場合にそのようなニューロパチー障害に随伴する症状及び症候群が挙げられる。
アミロイドーシスは、非限定的に続発性アミロイドーシス、加齢性アミロイドーシス、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）；グアム島のパーキンソン−認知症複合、脳アミロイド血管障害、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症；クロイツフェルト−ヤコブ病、パーキンソン病、伝染性海綿状脳症、ＨＩＶ関連認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、及びβ−アミロイド沈着に関連する眼疾患（すなわち黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、及び白内障）を含む、ＣＮＳ中の細胞外タンパク質性沈着物に関連する一群の疾患及び障害である。
ＣＮＳのガンは、１種又は複数のＣＮＳ細胞（すなわち神経細胞）の異常増殖によって特徴づけられ、それには、非限定的に、神経膠腫、多形神経膠芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、聴神経腫、軟骨腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫（meduUoblastomas）、神経節膠腫、シュワン腫、神経線維腫、神経芽腫、及び硬膜外、髄内又は硬膜内腫瘍が挙げられる。
ＣＮＳのウイルス又は微生物感染には、非限定的に髄膜炎、脳炎、脊髄炎、血管炎及び膿瘍を含む、急性又は慢性でありうるＣＮＳ病態生理を招く、ウイルス（すなわちインフルエンザ、ＨＩＶ、ポリオウイルス、風疹）、細菌（すなわちNeisseria sp.、Streptococcus sp.、Pseudomonas sp.、Proteus sp.、E. coli、S. aureus、Pneumococcus sp.、Meningococcus sp.、Haemophilus sp.、及びMycobacterium tuberculosis）及び真菌などの他の微生物（すなわち酵母、Cryptococcus neoformans）、寄生虫（すなわちtoxoplasma gondii）又はアメーバによる感染が非限定的に挙げられる。ＣＮＳの炎症は、ＣＮＳへの損傷によって起こる炎症であり、損傷は、身体的損傷（すなわち事故、手術、脳外傷、脊髄損傷、振盪による）又はＣＮＳの１種もしくは複数の他の疾患もしくは障害（すなわち膿瘍、ガン、ウイルスもしくは微生物感染）に起因もしくは関係する損傷でありうる。
本明細書に使用するＣＮＳの虚血は、脳における異常血流又は血管挙動に関係する一群の障害又はその原因を表し、それには、非限定的に、局所脳虚血、全脳虚血、脳卒中（すなわち、くも膜下出血及び脳内出血）、及び動脈瘤が挙げられる。
神経変性疾患は、ＣＮＳにおける神経細胞の機能喪失又は死滅に関連する一群の疾患及び障害であり、それには、非限定的に、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、アルパース病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、アミロイドーシスによって起こる又は関連する変性、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭葉変性症、ケネディー病、多系統萎縮症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、横断性脊髄炎、レフサム病、及び脊髄小脳失調症が挙げられる。
発作性疾患及びＣＮＳ障害は、ＣＮＳにおける不適切及び／又は異常な電気伝導を伴い、それには、非限定的に、てんかん（すなわち欠神発作、無緊張発作、良性ローランドてんかん、小児期欠神、間代発作、複雑部分発作、前頭葉てんかん、熱性けいれん、点頭けいれん、若年性ミオクローヌスてんかん、若年性欠神てんかん、レノックス−ガストー症候群、ランドウ−クレフナー症候群、ドラベ症候群、大田原症候群、ウエスト症候群、ミオクローヌス発作、ミトコンドリア障害、進行性ミオクローヌスてんかん、心因発作、反射てんかん、ラスムッセン症候群、単純部分発作、二次性全般化発作、側頭葉てんかん、強直間代（toniclonic）発作、強直発作、精神運動発作、辺縁系てんかん、部分発作、全般発作、てんかん重積状態、腹部てんかん、無動発作、自律神経発作、両側汎発性ミオクローヌス、月経随伴性てんかん、失立発作、情動発作、焦点発作、笑い発作、ジャクソンマーチ、ラフォラ病、運動発作、多焦点性発作、夜間発作、光過敏性発作、偽発作、感覚発作、微細発作、シルバン（sylvan）発作、離脱性けいれん、及び視覚性反射発作）が挙げられる。
行動障害は、罹患対象の部分での異常行動によって特徴づけられるＣＮＳの障害であり、それには、非限定的に、睡眠障害（すなわち、不眠、睡眠時随伴症、夜驚症、概日リズム睡眠障害、及びナルコレプシー）、気分障害（すなわち、うつ、自殺性うつ、不安、慢性情動障害、恐怖症、パニック発作、強迫性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、慢性疲労症候群、広場恐怖症、外傷後ストレス障害、双極性障害）、摂食障害（すなわち食欲低下又は過食症）、精神病、発達性行動障害（すなわち自閉症、レット症候群、アスペルガー症候群（Aspberger's syndrome））、人格障害及び精神病性障害（すなわち統合失調症、妄想性障害など）が挙げられる。
リソソーム蓄積障害は、ときにＣＮＳに関連するか、又はＣＮＳ特異的症状を有する代謝障害であり、そのような障害には、非限定的に、テイ−サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩ型）、グリコーゲン蓄積疾患、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ファーバー病、カナバン白質ジストロフィー、及び神経セロイドリポフスチン症１及び２型、ニーマン−ピック病、ポンペ病、及びクラッベ病が挙げられる。
一局面では、医薬として使用するための本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートが提供される。さらなる局面では、神経疾患又は障害（例えばアルツハイマー病）の処置に使用するための本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートが提供される。ある態様では、処置の方法に使用するための本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートが提供される。ある態様では、本発明は、個体に本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの有効量を投与することを含む、神経疾患又は障害を有する個体を処置する方法に使用するための本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートを提供する。任意の上記態様による「個体」は、場合によりヒトである。
本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートは、単独で、又は他の薬剤と組み合わせてのいずれかで治療に使用することができる。例えば、本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートは、少なくとも１種の追加的な治療薬と同時投与することができる。ある態様では、追加的な治療薬は、処置するために採用されている本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートと同じ又は異なる神経障害を処置するために有効な治療薬である。追加的な治療薬の例には、非限定的に：上記の様々な神経薬、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネペジル、ガランタミン、ロバスチグミン（rovastigmine）、及びタクリンなど）、ＮＭＤＡレセプター拮抗薬（メマンチンなど）、アミロイドβペプチド凝集阻害薬、抗酸化剤、γ−セクレターゼモデュレーター、神経成長因子（ＮＧＦ）模倣体又はＮＧＦ遺伝子療法、ＰＰＡＲｙ作動薬、ＨＭＳ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（スタチン）、アンパカイン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡレセプター拮抗薬、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害薬、静脈内免疫グロブリン、ムスカリンレセプター作動薬、ニコチン（nicrotinic）レセプターモデュレーター、能動又は受動的アミロイドβペプチド免疫処置、ホスホジエステラーゼ阻害薬、セロトニンレセプター拮抗薬及び抗アミロイドβペプチド抗体が挙げられる。ある態様では、少なくとも１種の追加的な治療薬が、神経薬の１種又は複数の副作用を緩和する能力のために選択される。
そのような上述の併用療法は、組み合わせ投与（２種以上の治療薬が同一又は別々の製剤中に含まれる）及び分離投与（本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの投与が、追加的な治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に起こりうる）を包含する。本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートは、また、当技術分野において公知で、治療又は予防されるべき神経障害に適切な、放射線療法、行動療法、又は他の治療法などであるが、それに限定されるわけではない他のインターベンション治療と組み合わせて使用することができる。本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲート（及び任意の追加的な治療薬）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所処置を望むのであれば病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。
投薬は、投与が短期間又は長期間であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路により、例えば静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。本明細書において、非限定的に、様々な時点にわたる単回（monovalent）又は多回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが考えられている。
本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートは、適正な医療に一致するように製剤化、投薬、及び投与される。これに関連する考慮要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳類、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因が挙げられる。本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートは、問題となる障害を予防又は治療するために現在使用されている１種又は複数の薬剤と一緒に製剤化する必要はないが、場合により一緒に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの量、障害又は処置の種類、ならびに上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、上記と同じ投薬量で及び投与経路で使用されるか、又は本明細書記載の投薬量の約１〜９９％、もしくは適切であると経験的／臨床的に決定された任意の投薬量及び任意の経路により使用される。
疾患の予防又は処置のために、本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲート（単独で、又は１種もしくは複数の他の追加的な治療薬と組み合わせて使用する場合）の適切な投薬量は、処置される疾患の種類、血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防的目的それとも治療的目的で投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴ならびに血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートへの応答、ならびに担当医師の裁量に依存する。血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートは、患者に１回で、又は一連の処置にわたり適宜投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば０．１mg/kg〜１０mg/kg）の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートが、例えば、１回もしくは複数の別々の投与又は連続複数回（continuous inmultimeric）による患者への投与のための初回候補投薬量でありうる。ある典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲でありうる。状態に応じて数日以上にわたる反復投与のために、処置は、一般に疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続する。抗体の例示的な一投薬量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲である。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kgの一つ又は複数の用量（又はその任意の組み合わせ）が、患者に投与されうる。そのような用量は、間欠的に、（例えば患者が抗体の投与を約２〜約２０、又は例えば約６回受けるように）例えば１週間に１回又は３週間に１回投与することができる。初回のより高い負荷用量に続き１回又は複数のより低い用量を投与することができる。しかし、他の投薬方式も有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技法及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
製造品
本発明の別の局面では、上記障害の治療及び／又は予防に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に関連するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成することができる。容器は、それ自体である組成物又は状態を治療、予防及び／もしくは診断するために有効な別の組成物と組み合わされた組成物を収容し、無菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、皮下注射針により刺通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本発明の血液脳シャトル及び／又はコンジュゲートである。ラベル又は添付文書は、組成物が選ばれた状態を処置するために使用されることを示す。そのうえ、製造品は、（ａ）組成物がその中に収容された第１の容器（その際、組成物は、本発明の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートを含む）；及び（ｂ）組成物がその中に収容された第２の容器（その際、組成物は、さらなる細胞傷害性薬物又は他の治療薬を含む）を含みうる。本発明のこの態様における製造品は、さらに、組成物が特定の状態を処置するために使用することができることを示す添付文書を含む。代替的又は追加的に、製造品は、さらに、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びブドウ糖溶液などの薬学的に許容されうる緩衝液を含む第２（又は第３）の容器を含みうる。それは、さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び利用者の観点から望ましい他の物質を含みうる。
場合により製造品は、さらに、対象における神経障害を処置するための説明を有する添付文書を含み、ここで、その説明は、本明細書開示の血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートを用いた処置が、神経障害を処置することを示し、場合により血液脳関門シャトル及び／又はコンジュゲートが、Ｒ／ＢＢＢへの一価結合様式のせいでＢＢＢを通した取り込みが改善されたことを示す。
実施例
実施例１：発現プラスミドの作製
基本／基準哺乳類発現プラスミドの説明
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクションにより所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子／タンパク質（例えば抗体−Ｆａｂ多量体タンパク質）の発現のために、以下の機能的エレメントを含む転写ユニットを使用した：
− イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス由来最初期エンハンサー及びプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（ＳＳ）、
− 発現されるべき遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖）、及び
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
発現されるべき所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセット以外に、基本／基準哺乳類発現プラスミドは：
− E. coliにおいてこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８由来複製起点、及び
− E. coliにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
以下の抗体−ｓＦａｂ融合ポリペプチド／タンパク質をコードする発現プラスミドを構築した：
四価Ｍａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）（図１Ｃ）（Ｍａｂ３１＝Ａβを認識するヒトモノクローナル抗体。Ｍａｂ３１のＩＮＮ＝ガンテネルマブ（Gantenerumab））
重鎖（１０１３２＿ｐＰＭ２８４＿Ｍａｂ３１（ＩｇＧ１）−（Ｇ ４ Ｓ） ４ −ＶＬ−Ｃｋ−（Ｇ ４ Ｓ） ６ −ＧＧ−ＶＨ−ＣＨ１）（配列番号１）：
Ｍａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖融合タンパク質の組成：
− Ｃ末端Ｌｙｓを有さないＭａｂ３１ヒトＩｇＧ１重鎖
− グリシンセリン−リンカー
− マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Ｌ５９６Ｖ及びＬ５９８Ｉ）（Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258）
− ヒトＣ−κ軽鎖
− グリシンセリン−リンカー
− マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bio-engineering (2009) 102, 1251-1258）
− ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３重鎖ドメイン
軽鎖（５１７０−ＶＬ−Ｍａｂ３１−ＢｓｍＩ−Ｌ２−Ｎｅｏ−ＢＧＨｐＡ）（配列番号２）
Ｍａｂ３１軽鎖の組成
− Ｍａｂ３１ヒトＣκ軽鎖
三価Ｍａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）（図１Ｂ）
ノブ重鎖（１０１３４＿ｐＰＭ２８７＿Ｍａｂ３１（ＩｇＧ１）＿ノブ＿ＳＳ＿−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＬ−Ｃｋ−（Ｇ４Ｓ）６−ＧＧ−ＶＨ−ＣＨ１）（配列番号３）
ノブＭａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖融合タンパク質の組成
− 追加的なジスルフィド架橋の形成のための、Ｃ末端Ｌｙｓを有さずＣＨ３ノブ突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ突然変異を含むＭａｂ３１ヒトＩｇＧ１重鎖
− グリシンセリン−リンカー
− マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Ｌ５９６Ｖ及びＬ５９８Ｉ）（Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258）
− ヒトＣ−κ軽鎖
− グリシンセリン−リンカー
− マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bio-engineering (2009) 102, 1251-1258）
− ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３重鎖ドメイン
ホール重鎖（１０１３３＿ｐＰＭ２８６＿Ｍａｂ３１（ＩｇＧ１）＿ホール＿ＳＳ）（配列番号４）
ホールＭａｂ３１重鎖融合タンパク質の組成
− 追加的なジスルフィド架橋の形成のためのＣＨ３ホール突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｙ４０７Ｖ及びＬ３６８Ａ及びＹ３４９Ｃ突然変異を含むＭａｂ３１ヒトＩｇＧ１重鎖
軽鎖（５１７０−ＶＬ−Ｍａｂ３１−ＢｓｍＩ−Ｌ２−Ｎｅｏ−ＢＧＨｐＡ）（配列番号２）
Ｍａｂ３１軽鎖の組成
− Ｍａｂ３１ヒトＣκ軽鎖
実施例２：単一及び二重Ｍａｂ３１−Ｆａｂ構築物の精製
抗体鎖は、Ｆ１７培地（Invitrogen Corp.）中で培養されたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎細胞系２９３由来）の一過性トランスフェクションによって作製した。トランスフェクションのために、「293-Fectin」トランスフェクション試薬（Invitrogen）を使用した。抗体鎖は、それぞれ四価Ｍａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖及びＭａｂ３１に対応する軽鎖、又はノブ及びホール三価Ｍａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖及びＭａｂ３１に対応する軽鎖をコードする２種（四価Ｍａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３））又は３種（三価Ｍａｂ３１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３））の異なるプラスミドから発現させた。２又は３種のプラスミドは、トランスフェクションのときに等モルのプラスミド比で使用した。トランスフェクションは、製造業者の説明書に明記されたように行った。抗体融合タンパク質を含有する細胞培養上清は、トランスフェクションの７日後に回収した。上清は、精製まで凍結保管した。
タンパク質は、濾過後の細胞培養上清から精製した。上清をプロテインＡセファロースカラム（GE Healthcare）に適用し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。抗体の溶出は、１００mMクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）の直後に試料をｐＨ６．５に中和することで達成した。濃縮後、凝集したタンパク質及び他の副産物は、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200; GE Healthcare）によって単量体性抗体から２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に分離した。不完全に集合した分子及び他の副産物の定量のために、各単一フラクションを分析用ＳＥＣ（TSK G3000SWXL）及びチップベースのキャピラリー電気泳動システム（CE-SDS, LabChipGX, Caliper）で分析した。副産物を有さない単量体性抗体フラクションをプールした。MILLIPOREAmicon Ultra（３０分子量カットオフ）遠心分離濃縮器を使用して濃縮後、タンパク質を−８０℃で保管した。最終産物の分析特徴づけは、ＵＶタンパク質測定、ＣＥ−ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、及びまたエンドトキシン測定によって行った。
実施例３：単一Ｆａｂ及び二重Ｆａｂ構築物のＥＬＩＳＡ結合データ
マウストランスフェリンレセプター（ｍＴｆＲ）へのｍＡｂ３１−８Ｄ３構築物の結合は、不完全ＥＬＩＳＡにより判定した。この目的のために、リコンビナントｍＴｆＲ（細胞外ドメイン；Sino Biological）をＰＢＳ中に１μg/mLでMaxisorbマイクロタイタープレート（Nunc）に４℃で一晩コーティングした。１％Ｃｒｏｔｅｉｎ−Ｃ／ＰＢＳ（ブロッキング緩衝液; Roche）中でＲＴにおいて１時間ブロッキングし、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（洗浄緩衝液）で４回洗浄後、ｍＡｂ３１−８Ｄ３構築物をブロッキング緩衝液中に０．０１から１５０nMの間の濃度でウェルに加え、ＲＴで１時間インキュベーションした。４回の洗浄段階の後に、抗ヒト−ＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson Immunoresearch）をブロッキング緩衝液中に１：１０，０００希釈して添加することによって構築物を検出し（１ ＲＴ）、続いて６回洗浄し、ＴＭＢ（Sigma）中でインキュベーションした。吸光度は、１Ｎ ＨＣｌで発色を停止させた後に４５０nmで読み取った。
図３に、ｍＴｆＲへの二価ｍＡｂ３１−８Ｄ３−ｄＦａｂの結合性が８Ｄ３ ＩｇＧの結合性に匹敵し、一方で一価構築物ｍＡｂ３１−８Ｄ３−ｓＦａｂが低下した親和性を示すことを示す。
ｍＡｂ３１の機能性をＥＬＩＳＡによって確認した。簡潔には、ＰＢＳ中に７μg/mLのＡβ（１−４０）をMaxisorpプレート上に３７℃で３日間コーティングし、フィブリル状Ａβを生成させ、次にＲＴで３時間乾燥させた。プレートは、ＰＢＳ中の１％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ及び０．１％ＲＳＡ（ブロッキング緩衝液）を用いてＲＴで１時間ブロッキングし、次に洗浄緩衝液で１回洗浄した。ｍＡｂ３１構築物は、ブロッキング緩衝液中に濃度最大１００nMで加え、４℃で一晩インキュベーションした。４回の洗浄ステップの後に、上記のように構築物を検出した。
図４に、両方のｍＡｂ３１−８Ｄ３構築物（ｓＦａｂ及びｄＦａｂ）が、固定化Ａβフィブリルに未改変ｍＡｂ３１に匹敵する親和性で結合することを示す。
実施例４：単一Ｆａｂ構築物だけがＢＢＢを通過し、プラークを装飾する
脳の切片作製及び免疫組織化学染色：
脳は、ＰＢＳ潅流後に調製し、矢状断凍結切片を、Paxinos及びFranklinの脳図解書により横方向に約１．９２から１．６８ミリメートルの間で切断した。Leica CM3050Sクリオスタットを使用して−１５℃で公称厚さ２０ミクロンの脳切片を作製し、予冷したガラススライド（Superfrost plus, Menzel, Germany）上に置いた。各脳について、切片３枚を８０ミクロン間隔で同じスライド上に置いた。
切片をＰＢＳ中で５分間再水和させ、続いて−２０℃に予冷した１００％アセトンで２分間浸漬した。全てのその後の段階は室温で行った。脳切片を有するスライドをUltra V block（LabVision）中で５分間連続インキュベーションすることにより非特異的結合部位を遮断し、続いてＰＢＳで洗浄し、２％正常ヤギ血清を加えたＰＢＳに入れたパワーブロック溶液（power block solution）（BioGenex）中で２０分間インキュベーションした。スライドは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２％正常ヤギ血清に入れて、二次抗体、すなわち濃度２０μg/mlのAlexa Fluor 555色素（#A-21433, lot 54699A、Molecular Probes）コンジュゲーション型親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖及び軽鎖特異的）と共に直接１時間インキュベーションした。ＰＢＳで高度に洗浄後、プラークの局在は、０．５μg/mlのＢＡＰ−２、すなわちロシュ社内のＡβに対するAlexa Fluor 488色素コンジュゲーション型マウスモノクローナル抗体と共に、パワーブロック溶液（BioGenex）及び１０％正常ヒツジ血清を有するＰＢＳ中で１時間インキュベーションすることにより、Ａβプラークについて二重ラベルすることで判定した。ＰＢＳで洗浄後、５０mM酢酸アンモニウム（ｐＨ５）中の４mM ＣｕＳＯ４中で３０分間インキュベーションすることで消光することによってリポフスチンの自己蛍光を減少させた。スライドを再蒸留水ですすいだ後に、スライドを共焦点マトリックス（Micro Tech Lab, Austria）で包埋した。
共焦点顕微鏡法
前頭皮質（一次運動野領域）中にプラーク含有領域を有する各ＰＳ２ＡＰＰ−マウスの脳の各切片から３画像を取得した。１エアリーのピンホール設定のLeica TCS SP5共焦点システムを用いて画像を記録した。
Alexa Fluor 488色素で免疫ラベルされたプラークを、レーザー出力３０％で光電子増倍管のゲイン及びオフセットを調整して（典型的にはそれぞれ７７０Ｖ及び−０％）、同じスペクトル条件（励起４８８nm及び帯域発光５００〜５５４nm）で捕捉した。
組織切片の可触性面に結合した二次Alexa Fluor 555抗体は、励起５６１nmのレーザー線で、適用された検出抗体の発光波長範囲に及ぶ５７０〜７２５nmの範囲のウインドウで記録した。画像取得のために、装置の設定、特にレーザー出力、スキャン速度、ゲイン及びオフセットを一定に保ち、被験ヒト抗Ａβ抗体について強度の測定値を比較できるようにした。レーザー出力を３０％に設定し、ＰＭＴゲインの設定は、典型的には８５０Ｖ、公称オフセットは０％であった。これにより、淡染プラークと濃染プラークの両方を同じ設定で視覚化することが可能になった。取得周波数は４００Hzであった。
共焦点スキャンは、HCX PL APO 20× 0.7 IMM UV水浸対物レンズを用いて単一光学層として分解能５１２×５１２ピクセルで記録し、垂直軸の光学的測定深さを双方的にコントロールして組織切片内の画像化を確実にした。前頭皮質の層２〜５に位置するアミロイドプラークを画像化し、蛍光強度を定量した。
統計解析
免疫陽性領域をＴＩＦＦ画像として視覚化し、ImageJバージョン１．４５（NIH）を用いて蛍光強度及び面積（ピクセル単位で測定）の定量のために処理した。定量のために、５のバックグラウンド強度を各画像において差し引きし、５平方ピクセル未満の陽性領域をフィルタリングして除去した。選択された等値面の合計蛍光強度は、単一の個別陽性領域の合計強度として決定し、平均ピクセル強度は、合計強度を被解析ピクセル数で除算して計算した。
平均及び標準偏差の値は、各動物の３枚の異なる切片から取得した９枚の写真から得られた、測定された全ての等値面からMicrosoft Excel（Redmond/WA, USA）で計算した。統計解析は、群比較のためのスチューデントのｔ検定又はマン−ホイットニーＵ検定を用いて行った。
１０mg/ml ｍＡｂ３１（図１Ａの構築物）、１３．３mg/kg ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１（図１Ｂの構築物）及び１６．７mg/kg ｄＦＡｂ−ｍＡｂ３１（図１Ｃの構築物）をマウス尾にｉ．ｖ．注射し、８時間後に脳をＰＢＳで潅流した。上記のように切片を調製し、ヤギ抗ヒトＩｇＧで染色した。ｍＡｂ３１構築物について、特異的なシグナルはほとんど検出されなかった（図４Ａ）。ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１について、プラーク及び毛細血管の両方の拡がった染色が検出されたが（図４Ｂ）、一方でｄＦａｂ−ｍＡｂ３１について毛細血管の染色だけが検出された（図４Ｃ）。これは、トランスフェリンレセプターへの一価結合様式（ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１の方が、ＢＢＢで脳内皮細胞を通過してずっと効率的に構築物を運ぶことを明確に示した。二価結合分子（ｄＦａｂ−ｍＡｂ３１）の定量を図５に示す。データは、ｄＦａｂ−ｍＡｂ３１構築物についてプラーク装飾の増加がなく、構築物の毛細血管蓄積が原因の合計強度の増加だけがあることを示している。
実施例５：脳の単一Ｆａｂ構築物曝露の定量
実験手順を実施例４に記載する。図６に、１０mg/ml ｍＡｂ３１（図１Ａの構築物）及び１３．３mg/kg ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１（図１Ｂの構築物）を用いてｓＦａｂ−ｍＡｂ３１の脳曝露の定量を示す。ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１構築物を注射した８時間後に、すでにｍＡｂ３１に比べてかなりの取り込みがある（約５５倍の増加）。２５mg/ml ｍＡｂ３１（図１Ａの構築物）及び３３．３mg/kg ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１（図１Ｂの構築物）を用いて、投与の２４時間後に類似のデータが得られた。図６にも、ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１の一過性毛細血管染色が、経時的なターゲティング効果及びＢＢＢ通過を明らかにすることを示す。全てのこれらのデータは、図６に示すように高度に有意である。
図７に、低用量でのｍＡｂ３１（図１Ａの構築物）及びｓＦａｂ−ｍＡｂ３１構築物（図１Ｂの構築物）のデータを示す。再び、ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１構築物だけが脳内皮細胞を通過し、脳内のプラークを装飾することができる。すでに投与の８時間後に最大の効果に到達する。脳内のＡβプラークへの結合シグナルが増加する傾向があるのは、ｍＡｂ３１構築物が高用量（１０mg/kg）及び相対的に長期間（７日間）の場合だけである（図７）。全てのこれらのデータは、図７に示すように高度に有意である。
実施例６：二重Ｆａｂ構築物による細胞表面ＴｆＲの特異的ダウンレギュレーション
実験の詳細：ｂＥｎｄ３細胞を６ウェルプレート形式で培養する。集密に達した２〜３日後にｄＦａｂ−ｍＡｂ３１、ｓＦａｂ−ｍＡｂ３１又は未処理対照で２４時間処理する。次に、培地を除去／吸引し、細胞を氷冷ＰＢＳ（−ＭｇＣｌ）（−ＣａＣｌ）（Gibco 14190-094）５ml/ウェルで２回洗浄する。トリプシン／ＥＤＴＡ（Lonza CC-5012）１ml／ウェルを添加し、全ての細胞が剥離するまで３７℃で１５分間インキュベーションする。トリプシン中和溶液（氷冷）（Lonza CC-5002）１mlで反応を停止する。トリプシン／ＥＤＴＡ＋中和溶液２mlを５０ml容Falconチューブ中に収集し、氷上に置く。細胞を４℃及び１４００rpmで１０分間遠心分離する。ペレットを氷冷ｂＥｎｄ３培地（ＤＭＥＭ−１２（Gibco31331）＋１０％ＦＢＳ）５０ml中に再懸濁する。細胞を４℃及び１４００rpmで１０分間遠心分離する。ペレットを氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（BD554656）３ml中に再懸濁する。細胞数：ａ）ｓＦａｂチューブ（細胞２．５×１０５個/ml）の生存率：４７％、ｂ）ｄＦａｂチューブ（細胞３．１８×１０５個/ml）の生存率：５５％、ｃ）対照チューブ（細胞４．６×１０５個/ml）の生存率：５７％。ＦＡＣＳ染色：細胞１×１０５個／エッペンドルフチューブとなるように分配し、遠心分離する（４℃、１０分、１５００rpm）。上清を吸引する；ａ）ＣＤ７１−ＰＥ（クローンＲ１７２１７−ＩｇＧ２ａモノクローナル）（santa cruz sc-52504）は２０μL抗体／ペレット（染色体積１００μL）を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（BD554656）で１００μLに調整、ｂ）ＣＤ３１−ＡＰＣ（BD551262）（ラット抗マウスＩｇＧ２ａ（２００μg/ml））は５μg抗体／ペレット（染色体積１００μL）を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（BD554656）で１００μLに調整、ｃ）８Ｄ３−Ａｌｅｘａ４８８（染色体積１００μL）は氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（BD554656）で希釈（１：５０）、ｄ）Ａｌｅｘａ４８８、ＡＰＣ及びＰＥ（全てＢＤ製）についてのアイソタイプ対照。氷冷して暗条件で１時間インキュベーションする。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１．５mlに調整し、遠心分離する（４℃、１０分、１５００rpm）。ペレットを氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１．５mlで２回洗浄し、最終的にペレットをＰＢＳ ５００μL中に再懸濁する。ＦＡＣＳ測定は、Guavaフローサイトメトリー装置を使用して行った。データは、二重（ｄＦａｂ）構築物（図８Ｂ）が細胞表面でのトランスフェリンレセプターをダウンレギュレーションするように見えることを示している。これは、単一（ｓＦａｂ）構築物を用いたこのアッセイの設定で検出不能であり（図８Ａ）、一価結合様式が、脳内皮細胞上の細胞表面でのトランスフェリンレセプターの量を決定する細胞輸送及びリサイクリングに直接的な効果を有さないことを示している。
実施例７：単一及び二重Ｆａｂ構築物のｉｎ ｖｉｖｏ細胞内ソーティング
ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ２トランスジェニックマウスに以下の構築物：ＭＡｂ３１（１０mg/kg）、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（１３．３mg/kg）又はｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（１７．４４mg/kg）をｉ．ｖ注射（尾注射）した。注射された用量は分子サイズを反映し、ＭＡｂ３１を参照として使用した。注射の１５分後又は８時間後に、マウスをＣＯ２で安楽死させ、以下のように処理した。心臓の右心房を切開することにより、血液及び潅流溶液が流出できるようにした。左心室を切開し、強制給餌プローブ＃１０を大動脈内に押し込んだ。ＰＢＳ約２０mlを注射し（約１０ml/min、室温）、続いてＰＢＳ中の２％ＰＦＡ３０mlを注射した。脳を摘出し、同じ潅流液中で追加的に７時間００分インキュベーションした。ビブラトームを使用して、脳自由浮遊性切片１００ミクロンを作製し、それを免疫蛍光染色のために使用した。切片を最初に透過性にし、ＰＢＳ−０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００−１０％ロバ血清を使用してブロッキングした。次に、ＰＢＳ−５％ロバ血清中に希釈した表示の一次抗体と共に切片を一晩インキュベーションした。Molecular Probes製二次抗体を製造業者の推奨にしたがって使用した。Leica SP5共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、画像処理及び３Ｄ復元のためにImarisソフトウェアを使用した。
これらのデータは、末梢投与されたｓＦａｂ−ＭＡｂ３１及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１の脳内皮細胞による取り込みを明らかにするものである。ＭＡｂ３１、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１は、Ａｌｅｘａ５５５と連結されたヤギ抗ヒト抗体を使用して検出した。図９に示すように、注射の１５分後にｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ａ）及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ｂ）の両方が脳血管系を装飾したが、それらの分布に差はなかった。注射の８時間００分後に、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１は実質に達し、アミロイドプラークを装飾するが（図９Ｃ矢印）、一方でｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（図９Ｄ）は、１５分の時点に類似して脳血管系内に留まった。ｄＦａｂ−ＭＡｂ３１を用いたときに実質中からアミロイドプラークは検出されない。
図１０：本研究に使用された全ての構築物の完全性をコントロールするために、ＭＡｂ３１（図１０Ａ）、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図１０Ｂ）又はｄＦａｂ−ＭＡＢ３１（図１０Ｃ）を使用して１８ヶ月の脳凍結切片の染色を行った。結果は、３種の構築物の全てがトランスジェニックマウスの脳内のアミロイドプラークを検出したことを示した。
図１１〜１２：高分解能共焦点顕微鏡法から、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１（図１１）及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１（図１２）が脳毛細血管の管腔側を装飾せず、内皮細胞の管腔膜を通過して小胞様構造内及び内皮細胞のサイトゾル内に含まれることを示している。図１１及び図１２の矢印は、内皮細胞核の反管腔側のｓＦａｂ−ＭＡｂ３１構築物又はｄＦａｂ−ＭＡｂ３１構築物を含む小胞を示す。まとめると、これらのデータは、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１及びｄＦａｂ−ＭＡｂ３１の両方が内皮細胞に進入できるが、ｓＦａｂ−ＭＡｂ３１だけが血管系を通過してアミロイドプラークに到達できることを示唆している。
本発明の方法及び組成物は、ＣＮＳに分布する抗体の部分を劇的に改善して、したがってＣＮＳ中でより容易に治療濃度に到達する方策を提供する。本発明の方法及び組成物は、新規であり、最適で乱されていない細胞内経路／ソーティングを利用してＢＥＣ内の異なるオルガネラを通過して反管腔側に到達する効率を有意に改善する。
実施例８：ＢＢＢを通過するために重要な一価レセプター結合様式
抗Ａβモノクローナル抗体ｍＡｂ３１は、非常に特異的であり、強力なＡβプラーク結合体であり、本発明者らに脳実質内のターゲットの会合を定量するための強力な読み取りを提供する。本発明者らは、ｍＡｂ３１親抗体に比べて２種の脳シャトル構築物の脳曝露量を検討するためにＰＳ２ＡＰＰダブルトランスジェニックアミロイドーシスモデルを用いた。３種の変異体を１０mg/kgで静脈内注射し、注射の８時間後にプラークに存在する抗体の量を定量することによって脳曝露の程度を決定した。ｄＦａｂ構築物のために、ｍＡｂ３１に比べてプラーク装飾の有意な増加は検出されなかった（図１３Ａ）。しかし、ｓＦａｂ構築物について、親ｍＡｂ３１抗体に比べてプラーク装飾の大きな増加があった。ｓＦａｂ構築物について、アミロイドプラークでのターゲット会合は、ラベル化二次抗体を用いた蛍光強度定量に基づき５０倍よりも大きく改善した。ｓＦａｂ構築物は大きなプラーク装飾を示したものの（図１３Ｄ）、ｄＦａｂは、微小血管にのみ検出可能であり（図１３Ｃ）、ｄＦａｂ構築物が脳微小血管をターゲティングし、その中に進入するが、反管腔側から逃避できないことを示した。本発明者らは、低用量２．６６mg/kgでｓＦａｂ構築物のターゲット会合能を検討し、最大７日までｉｎ ｖｉｖｏ曝露時間を延長した。単回注射後８時間以内に最大プラーク装飾に到達し、続いて少なくとも１週間にわたる持続的プラーク結合が生じた（図１３Ｅ）。
前回の研究で、親ｍＡｂ３１は、注射の７日後に最大プラーク結合に到達することが示された。微小血管構造における染色の定量から、ｓＦａｂ構築物の局在化がＢＢＢで非常に一過性であったことが示され、これは、構築物が関門を通過する相対的に迅速な速度を例示している。注射の７日後の２mg/kgの親抗体ｍＡｂ３１（図１３Ｆ）及び等モル濃度のｓＦａｂ構築物（図１３Ｇ）について、代表的なプラーク染色画像は、ｓＦａｂ脳シャトル構築物でプラーク結合が増加したことを明らかにしている。ｓＦａｂ構築物は、リソソーム区画とほんの最低限の共局在を示し、それは、リソソームへのＴｆＲの正常な構成的輸送を反映している可能性がある。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、また、ｓＦａｂ構築物のリサイクリング及びトランスサイトーシスを示した。まとめると、これらの結果は、ｓＦａｂ構築物がＴｆＲの正常な輸送を妨害しないことを示唆している。対照的に、ｄＦａｂ構築物は、リソソーム区画と強い共局在を示すが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでもトランスサイトーシス活性を示さない。
実施例９：ＢＢＢを通した抗体送達の増加は、強化されたｉｎ ｖｉｖｏ効力に変換される
次の一連の実験で、本発明者らは、一価結合様式を用いた脳曝露の顕著な増加が長期処置研究で抗Ａβ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効力を改善するかどうかを問うた。本発明者らは、ｓＦａｂ構築物及び対照親抗体ｍＡｂ３１を１週間に１回３ヶ月間注射した。前回の５ヶ月研究で、治療用抗体ｍＡｂ３１は、２０mg/kgでプラーク負荷を軽減することが示された。図１４に示すデータに基づき、本発明者らは、脳曝露の改善がｉｎ ｖｉｖｏ効力の強化に繋がるかどうかを検討するために２種の低用量を選択した。最終でのターゲットプラーク結合は、両方の用量で親ｍＡｂ３１抗体よりもｓＦａｂ構築物と強いターゲット会合があったことを示した（図１４Ａ〜Ｄ）。ＡＰＰＰＳ２二重トランスジェニックマウスでのアミロイドーシスの程度をベースラインで、ならびにビヒクル、低用量親ｍＡｂ３１及び低用量ｓＦａｂ構築物処置の後に定量した。これらの低用量で、親モノクローナルｍＡｂ３１を用いてｉｎ ｖｉｖｏ効果は検出されず（図１４Ｅ）、それは、前回の５ヶ月間長期試験に基づき予期されたことであった。対照的に、皮質及び海馬の両方におけるプラーク数の有意な減少が、低用量２．６７mg/kgのｓＦａｂ構築物で観察された。ずっと低い用量０．５３mg/kgであっても（図１４Ｅ）、ｓＦａｂ構築物は統計的有意性に到達しなかったものの、特に皮質においてｓＦａｂ構築物を有利とする傾向が見られた。プラークサイズの二次分析から、ｍＡｂ３１についての作用様式に一致して、小さなプラークについてプラーク数のより顕著な減少が明らかとなった。これらのデータは、一価様式のＴｆＲ結合によって可能にされる脳透過の増加が、アルツハイマー病病態の慢性動物モデルにおける治療用抗体の効力における有意な改善に繋がることを示している。
実施例１０：ＴｆＲ＋ＢａＦ３細胞に対する異なる抗体融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏエフェクター機能（ＡＤＣＣ）
トランスフェリンレセプター発現ＢａＦ３細胞（DSMZ, #CLPZ04004）（ＴｆＲ＋）を、異なる抗体−融合分子によって誘導される抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）実験のためのターゲット細胞として使用した。
簡潔には、ＢａＦ３細胞１×１０４個を丸底９６ウェル中に蒔き、場合により抗体融合タンパク質の存在化又は不在下でヒトＮＫ９２エフェクター細胞（高親和性ＣＤ１６クローン７Ａ２Ｆ３；Roche GlycArt）と共にエフェクター／ターゲット比３：１で同時培養した。４時間インキュベーション後に（３７℃、５％ＣＯ２）死／瀕死細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出によって測定される細胞傷害性を判定した。これについて、細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離し、上清５０μlを平底プレートに移した。ＬＤＨ反応混液５０μl（Roche LDH reaction mix, cat. no. 11644793001; Roche Diagnostics GmbH）を添加し、反応物を３７℃及び５％ＣＯ２で２０分間インキュベーションした。その後、Tecan Sunrise Readerを用いて波長４９２／６２０nmで吸光度を測定した。
全ての試料を三つ組で試験し、以下の対照に基づき結果を計算した：
− ターゲット細胞のみ（＋培地）
− 最大ＬＤＨ放出：ターゲット細胞＋３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
− 自然放出：ターゲット細胞＋ＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１）
特異的ＡＤＣＣ／溶解（％）は、次項により計算した：
図１５：ＦｃのＣ末端に融合されたＴｆＲ ｓｃＦａｂフラグメントを有する抗体融合体はＡＤＣＣを誘導しない。ＢＡ／Ｆ３マウス赤白血病細胞のＮＫ９２介在性殺滅は、ＬＤＨ放出を定量することによって測定した。「従来型」「Ｎ末端をＦｃに」配向のＴｆＲ結合性Ｆａｂ部分を有する融合構築物だけが顕著なＡＤＣＣを誘導し、一方で、逆配向の脳シャトル構築物は非誘導性である。構築物：８Ｄ３−ＩｇＧ（完全長８Ｄ３ ＩｇＧ）、ＯＡ−８Ｄ３（８Ｄ３ ＩｇＧの単一重鎖）、ｍＡｂ３１（図１Ａの抗体）、ｍＡｂ３１−８Ｄ３ ｓＦａｂ（図１Ｂの構築物）、ｍＡｂ３１−８Ｄ３−ｄＦａｂ（図１Ｃの構築物）。
実施例１１：ｍＴｆＲ抗体８Ｄ３のエピトープマッピング
モノクローナル抗体８Ｄ３のエピトープマッピングは、マウストランスフェリンレセプター１の細胞外ドメイン（９０〜７６３）の配列に対応する重複する固定化ペプチドフラグメント（長さ：アミノ酸１５個、移動：アミノ酸３個）のライブラリーにより実施した。ペプチドアレイの調製のために、Intavis CelluSpots（商標）技法を採用した。このアプローチでは、自動合成装置（Intavis MultiPep RS）を用いて改変セルロースディスク上にペプチドを合成し、セルロースディスクを合成後に溶解する。次に、高分子セルロースに共有結合したままの個別のペプチド溶液を、コーティング済み顕微鏡用スライド上にスポットする。３８４ウェル合成プレート中のアミノ改変セルロースディスクに９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応を利用してCelluSpots（商標）合成を段階的に実施した。各カップリングサイクルにおいて、対応するアミノ酸をＤＩＣ／ＨＯＢｔのＤＭＦ溶液で活性化した。カップリング段階の間に、未反応のアミノ基を無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物でキャッピングした。合成の完了時に、セルロースディスクを９６ウェルプレートに移し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン（triisoproylsilane）（ＴＩＳ）及び水の混合物で処理し、側鎖脱保護に供した。切断溶液の除去後、セルロースに結合しているペプチドをＴＦＡ、ＴＦＭＳＡ、ＴＩＳ及び水の混合物に溶かし、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、ＤＭＳＯ中に再懸濁した。続いてIntavisスライドスポッティングロボットを使用してこれらのペプチド溶液をIntavis CelluSpots（商標）スライド上にスポットした。
エピトープ分析のために、調製済みスライドをエタノールで、次にトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；５０mMトリス、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ８）で洗浄し、その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０加ＴＢＳ中に１０×Western Blocking Reagent（Roche Applied Science）及びスクロース２．５ｇを入れた液５mLで４℃にて１６時間ブロッキング段階を実施した。洗浄（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）後、スライドを抗体８Ｄ３のＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液（１μg/mL）と共に環境温度で２時間インキュベーションした。洗浄後、検出のために抗マウス二次ＨＲＰ抗体（ＴＢＳ−Ｔ中に１：２００００）と共にスライドをインキュベーションし、続いて化学ルミネセンス基質ルミノールと共にインキュベーションし、LumiImager（Roche Applied Science）で視覚化した。ＥＬＩＳＡ陽性スポットを定量し、対応するペプチド配列の割り付けにより抗体結合エピトープを同定した。
図１６：８Ｄ３は、マウストランスフェリンレセプターの細胞外ドメイン中の３種の異なるペプチドに結合する。アミノ酸３個が重複する１５残基長ペプチドへの抗体８Ｄ３の結合は、固定化ｍＴｆＲペプチドを担持するCelluSpotスライド上でインキュベーションされた抗体の化学ルミネセンス検出によって明らかにした。欄内：８Ｄ３によって結合されたペプチド＃３７３、３７４及び３７６。
抗体、タンパク質、ペプチド及び小分子を含む治療薬を、ＢＢＢを通して治療学的に関連する用量で送達することができる、血液脳関門レセプター、特にトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）に対する１群のバイオ治療用構築物を本実施例で説明する。ある種の加工バイオ治療用構築物の分布は、注射後数時間以内に脳血管間隙から実質間隙に変化した。これは、これらの特定の構築物が、重大な量のバイオ治療薬にＢＥＣを経由して実質にトランスサイトーシスさせる、ＢＥＣを経由する最適な輸送経路を利用することを示している。ＣＮＳへのバイオ治療用構築物の取り込み及びＣＮＳにおける分布の程度は、血液脳関門レセプター、特にＴｆＲへの一価結合様式に完全に依存した。ＴｆＲがＲ／ＢＢＢへのバイオ治療用構築物の結合により二量体化されるようになる場合、実質間隙内に検出可能なレベルは検出されなかった。本発明の方法論を用いて加工された、単回全身用量の単一Ｆａｂ抗Ａβモノクローナル構築物は、脳における有意な抗体取り込みを招いたばかりでなく、病的アミロイドプラークへの抗Ａβモノクローナル結合の装飾も劇的に増加させる。しかし、Ｒ／ＢＢＢに対する二重Ｆａｂ結合性構築物を使用して、ＣＮＳ内に検出可能なレベルは検出されなかった。本出願に示されたこの事実及び実験は、Ｒ／ＢＢＢに対する一価結合様式を用いてＣＮＳへのバイオ治療薬（抗体など）の取り込みを増加させることの背景となる主要な寄与メカニズムを明らかにしている。最初に、二重（又は多量体性）抗Ｒ／ＢＢＢ結合様式は、管腔側の細胞表面のＲ／ＢＢＢを迅速にダウンレギュレーションすることによって脳の取り込みを制限し、それで効率的なＢＢＢ通過の第一段階である血管系に取り込まれうる抗Ｒ／ＢＢＢの合計量を減少させる。第二に、二重（又は多量体性）抗Ｒ／ＢＢＢ結合様式は、構築物が反管腔側に到達することを抑制するＢＥＣにおいて細胞内で個別の誤ソーティングを誘導する。顕著には、Ｒ／ＢＢＢへの一価結合性は、脳の取り込み及び分布を改善し、血管系からＣＮＳ内のアミロイドプラークへの局在で完全な移行が観察される。第二に、Ｒ／ＢＢＢについてのバイオ治療用構築物の加工一価結合様式は、管腔側へのＲ／ＢＢＢのリサイクリングを確保して、追加的な融合ポリペプチド構築物の取り込みならびに反管腔側及び実質内への輸送を可能にする。第三に、一価結合様式のバイオ治療用構築物は、ＩｇＧのＦｃ部のＣ末端で加工され、それは、大部分の場合にｉｎ ｖｉｖｏ効力のために重要な治療用モノクローナル抗体のための独特な形式を保つ。これは、また、本出願で記載されたＩｇＧの他の部分に連結することによって達成することができる。これは、確立した前臨床及び臨床効力を有する開発済みのＩｇＧモノクローナルを、確立した機能及び効力を損なうことなしにこの輸送システムに組み入れることができるので、有利である。そのうえ、レセプター介在性輸送（ＲＭＴ）に基づく一価ターゲティングＲ／ＢＢＢ技法は、ＣＮＳ疾患のための広範囲の潜在的治療法のための扉を開くものである。本発明は、ＢＢＢを通した治療薬の輸送及びＣＮＳ分布を大きく改善する治療活性が証明された既存のＩｇＧ形式を保っているＢＢＢ透過治療薬を加工する方法を提供する。

Claims (42)

  1. 脳エフェクター本体、リンカー、及びトランスフェリンレセプターに結合する一つの一価結合性本体を含む血液脳関門シャトルであって、
    リンカーが、トランスフェリンレセプターに結合する一価結合性本体にエフェクター本体を連結し、トランスフェリンレセプターに結合する一価結合性本体が、配列番号１４、１５、又は１６のアミノ酸配列内に含まれる、トランスフェリンレセプター中のエピトープを認識する一つのｓｃＦａｂを含む、血液脳関門シャトル。
  2. 脳エフェクター本体が、神経障害薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞傷害性薬物、脳ターゲットに対する抗体、脳ターゲットに対するモノクローナル抗体、脳ターゲットに対するペプチドから成る群より選択される、請求項１記載の血液脳関門シャトル。
  3. 脳ターゲットが、β−セクレターゼ１、Ａβ、上皮成長因子、上皮成長因子レセプター２、タウ、リン酸化タウ、アポリポタンパク質Ｅ４、αシヌクレイン、αシヌクレインのオリゴマー性フラグメント、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６、アミロイド前駆タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター、及びカスパーゼ６から成る群より選択される、請求項２記載の血液脳関門シャトル。
  4. 脳エフェクター本体が、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドから成る群より選択される、請求項１から３記載の血液脳関門シャトル。
  5. トランスフェリンレセプターに結合する一価結合性本体が、リンカーによって脳エフェクター本体のＣ末端に連結されている、請求項４記載の血液脳関門シャトル。
  6. 脳エフェクター本体が、脳ターゲットに対する完全長抗体を含む、請求項１から５記載の血液脳関門シャトル。
  7. 脳エフェクター本体が、完全長ＩｇＧを含む、請求項６記載の血液脳関門シャトル。
  8. 脳エフェクター本体としての完全長ＩｇＧ抗体、リンカー、及びトランスフェリンレセプターと結合する一価結合性本体としての一つのｓｃＦａｂを含む血液脳関門シャトルであって、ｓｃＦａｂが、リンカーによってＩｇＧ抗体の重鎖の一つのＦｃ部分のＣ末端に連結されている、請求項７記載の血液脳関門シャトル。
  9. エフェクター本体が、Ａβに対する完全長抗体である、請求項６から８記載の血液脳関門シャトル。
  10. Ａβに対する抗体が、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を含む、請求項９記載の血液脳関門シャトル。
  11. Ａβに対する抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１０記載の血液脳関門シャトル。
  12. エフェクター本体が、リン酸化タウに対する完全長抗体であり、一価結合性本体が、トランスフェリンレセプターに対する一つのｓｃＦａｂである、請求項６から８記載の血液脳関門シャトル。
  13. エフェクター本体が、αシヌクレインに対する完全長抗体であり、一価結合性本体が、トランスフェリンレセプターに対する一つのｓｃＦａｂである、請求項６から８記載の血液脳関門シャトル。
  14. リンカーが、ペプチドリンカーである、請求項１から１３記載の血液脳関門シャトル。
  15. ペプチドリンカーが、少なくとも２０アミノ酸長を有するアミノ酸配列であるペプチドである、請求項１４記載の血液脳関門シャトル。
  16. ペプチドリンカーが、２５〜５０アミノ酸長を有するアミノ酸配列であるペプチドである、請求項１５記載の血液脳関門シャトル。
  17. トランスフェリンレセプターに結合する一価結合性本体が、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体及びトランスフェリンレセプターに結合する一つのｓｃＦａｂを含み、ｓｃＦａｂが、第２のリンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＣ末端に連結されている、請求項１から３記載の血液脳関門シャトル。
  18. 脳エフェクター本体、リンカー、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇドメイン、第２のリンカー、及びトランスフェリンレセプターに結合する一つのｓｃＦａｂを含む血液脳関門シャトルであって、脳エフェクター本体が、第１のリンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＮ末端に連結されており、ｓｃＦａｂが、第２のリンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に連結されている、請求項１７記載の血液脳関門シャトル。
  19. ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体がＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ本体である、請求項１７又は１８記載の血液脳関門シャトル。
  20. 請求項１から１９記載の血液脳関門シャトルをコードする単離された核酸。
  21. 請求項２０記載の核酸を含むホスト細胞。
  22. 請求項１から１９記載の血液脳関門シャトル及び薬学的担体を含む薬学的製剤。
  23. 医薬として使用するための、請求項１から１９記載の血液脳関門シャトル。
  24. 医薬の製造における請求項１から１９記載の血液脳関門シャトルの使用。
  25. 医薬が、神経変性障害の処置用である、請求項２４記載の使用。
  26. 神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項２５記載の使用。
  27. 血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するための、請求項１から１９記載の血液脳関門シャトル。
  28. ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体、リンカー、及びトランスフェリンレセプターに対する一つのｓｃＦａｂを含む、血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するための融合タンパク質であって、ｓｃＦａｂが、リンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＣ末端に連結されている融合タンパク質。
  29. 脳エフェクター本体が、神経障害薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞傷害性薬物、脳ターゲットに対する抗体フラグメント又はペプチドから成る群より選択され、脳ターゲットに対する抗体フラグメント又はペプチドが、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、Ｆ（ａｂ’）２から成る群より選択される、請求項２８記載の、血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するための融合タンパク質。
  30. トランスフェリンレセプターに対するｓｃＦａｂが、配列番号１４、１５、又は１６のアミノ酸配列内に含まれる、トランスフェリンレセプター中のエピトープを認識する、請求項２８又は２９記載の、血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するための融合タンパク質。
  31. リンカーがペプチドリンカーである、請求項２８から２９記載の、血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するための融合タンパク質。
  32. ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体がＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ本体である、請求項２８から３１記載の融合タンパク質。
  33. 請求項２８から３２記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
  34. 請求項３３記載の核酸を含むホスト細胞。
  35. 請求項２８から３２記載の、血液脳関門を通して脳エフェクター本体を輸送するための融合タンパク質と、リンカーによって融合タンパク質のＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＮ末端に連結された脳エフェクター本体とを含むコンジュゲート。
  36. 脳エフェクター本体が、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドから成る群より選択される、請求項３５記載のコンジュゲート。
  37. エフェクター本体のＣ末端が、リンカーによってＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ本体のＮ末端に連結されている、請求項３６記載のコンジュゲート。
  38. 請求項３５から３７記載のコンジュゲート及び薬学的担体を含む薬学的製剤。
  39. 医薬として使用するための、請求項３５から３７記載のコンジュゲート。
  40. 医薬の製造における、請求項３５から３７記載のコンジュゲートの使用。
  41. 医薬が、神経変性障害の処置用である、請求項４０記載の使用。
  42. 神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項４１記載の使用。
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