JP6210901B2

JP6210901B2 - 新規オリゴ糖

Info

Publication number: JP6210901B2
Application number: JP2014024402A
Authority: JP
Inventors: 達也阿部; 菊地　裕人; 裕人菊地; 有塚　勉; 勉有塚; 敬司上野; 秀一小野寺; ▲徳▼夫塩見
Original assignee: EDUCATIONAL CORPORATION RAKUNO GAKUEN; Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Current assignee: EDUCATIONAL CORPORATION RAKUNO GAKUEN; Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2017-10-11
Anticipated expiration: 2034-02-12
Also published as: JP2015151348A

Description

本発明は、新規オリゴ糖等に関するものである。詳細には、ビート糖蜜より分離された、新規な３種類の三糖類、及び、これらの製造方法等に関するものである。

消費者の健康志向の高まりを受け、現在、様々な機能性成分を含む食品、サプリメント、医薬品等が開発されている。その中で、最も多く用いられている機能性成分のひとつにオリゴ糖がある。オリゴ糖は、整腸作用（腸内菌叢改善作用）、ミネラル吸収促進、抗う蝕作用、抗アレルギー作用などの様々な効能が知られている。

例えば、甜菜（ビート）からはラフィノース（特許文献１）が抽出及び精製され、その整腸作用、免疫賦活作用、アトピー性皮膚炎改善作用、肝機能改善作用などが解明されており、また、チコリーなどに含まれるイヌリン（多糖類）に酵素を作用させたあと精製して得られるダイフラクトースアンハイドライド（特許文献２）においても、カルシウム吸収促進作用、利尿作用などが解明されており、これらは機能性糖質として各種食品、サプリメント、医薬品等に利用されている。

また、オリゴ糖はその消化性、体内吸収性などから、栄養成分としても非常に重視されている。そして、現在、多くの種類のオリゴ糖が機能性成分あるいは栄養成分として使用されているが、嗜好の多様性や健康志向の高まりなどから、消費者及び当業界においては、更なる新規オリゴ糖の取得及びその機能開発が常に求められていると言える。

特公昭５６−０３９６４０号公報特開昭６２−２７５６９４号公報

本発明は、これまでにない新規なオリゴ糖、及び、その製造方法・精製方法等を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、ビート糖製糖工程から排出されるビート糖蜜を強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）に通液してオリゴ糖溶出画分を分離し、該画分を活性炭−セライトカラムに通液し、ここから３〜７％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液溶出画分を取得することで、新規な３種類の三糖類を得ることができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の実施形態を例示すると次のとおりである。
（１）下記化１に示す式（Ｉ）で表される４^Ｆ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルスクロース。
（２）下記化２に示す式（ＩＩ）で表される４^Ｆ−β−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース。
（３）下記化３に示す式（ＩＩＩ）で表される４^Ｆ−α−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース。

（４）ビート糖蜜を強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）に通液してオリゴ糖溶出画分を分離し、該画分を活性炭−セライトカラムに通液し、３〜７％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液溶出画分を取得する工程からなることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１つに記載のオリゴ糖の製造方法。
（５）エタノール溶出画分を、ＯＤＳ（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｙｌ）カラムを用いたＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって更に分離、精製する工程を含むことを特徴とする、（４）に記載の方法。
（６）ビート糖蜜が、イオン交換樹脂製糖法でのビート糖製糖工程汁からの砂糖回収後の糖蜜であることを特徴とする、（４）又は（５）に記載の方法。

本発明によれば、新規オリゴ糖である４^Ｆ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルスクロース、４^Ｆ−β−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース、及び、４^Ｆ−α−Ｄ−フルクトフラノシルスクロースを取得でき、これらを、プレバイオティクスとしての腸内菌叢改善や整腸作用、免疫賦活作用、抗う蝕作用などをうたった医薬品、機能性食品等に利用することが可能である。また、これらのオリゴ糖は、スクロース骨格のフルクトース残基の４位に単糖が結合した様式でありながら非還元性であるため非常に安定であり、新規甘味料等として各種一般食品などに利用することも可能である。

本発明に係る新規オリゴ糖の製造、精製操作手順のフロー図を示す。４^Ｆ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルスクロースの２次元ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ）を示す。４^Ｆ−β−Ｄ−フルクトフラノシルスクロースの２次元ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ）を示す。４^Ｆ−α−Ｄ−フルクトフラノシルスクロースの２次元ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ）を示す。

本発明に係る新規オリゴ糖は、下記の３種類の三糖類である。以下、各オリゴ糖について詳細に説明する。

第一は、下記化１に示す式（Ｉ）で表される４^Ｆ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルスクロース（４^Ｆ−α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｓｕｃｒｏｓｅ）である（以下、オリゴ糖Ｉと言う場合もある）。これは、スクロースを構成するフルクトース残基の４位（Ｃ−４）にガラクトースが結合したものであり、白色結晶である。また、溶解性は、水に溶けやすくエタノールに溶けにくい。

第二は、下記化２に示す式（ＩＩ）で表される４^Ｆ−β−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース（４^Ｆ−β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｓｕｃｒｏｓｅ）である（以下、オリゴ糖ＩＩと言う場合もある）。これは、スクロースを構成するフルクトース残基の４位（Ｃ−４）にフルクトースが結合したものであり、白色結晶である。また、溶解性は、水に溶けやすくエタノールに溶けにくい。

第三は、下記化３に示す式（ＩＩＩ）で表される４^Ｆ−α−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース（４^Ｆ−α−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｓｕｃｒｏｓｅ）である（以下、オリゴ糖ＩＩＩと言う場合もある）。これも、スクロースを構成するフルクトース残基の４位（Ｃ−４）にフルクトースが結合したものであり、上記に示したオリゴ糖ＩＩの立体異性体である。物性は、白色結晶であり、溶解性は、水に溶けやすくエタノールに溶けにくい。

これらは、いずれもスクロース骨格のフルクトース残基の４位に単糖が結合した三糖類であり、且つ、非還元性であることが特徴である。還元末端を持つ二糖類では、フルクトースの４位にガラクトースやグルコースが結合したものが見られるが（ラクチュロースやマルチュロース）、還元末端を持たない三糖類以上のオリゴ糖ではこのような結合様式は今まで見当たらない。

これらの新規オリゴ糖は、一例として、ビート糖蜜より強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）及び活性炭−セライトカラムを用いた方法で取得することができる。けれども、これらの新規オリゴ糖の由来はビート糖蜜のみに限定されるものではなく、また、製造方法も強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）及び活性炭−セライトカラムを用いた方法のみに限定されるものではない。

ビート糖蜜から上記新規オリゴ糖を製造、取得する場合には、上述の通り、次のような強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）及び活性炭−セライトカラムを用いた方法が例示される。

製造原料となるビート糖蜜は、甜菜根を温水抽出して得た抽出液から砂糖（グラニュー糖）を分離、精製した残渣、その他のビート糖製糖工程汁からの砂糖回収後の液体、若しくはこれらの濃縮物である糖蜜を意味し、イオン交換樹脂製糖法でのビート糖製糖工程から得られるビート糖蜜を利用することが好ましい。

そしてまず、上記ビート糖蜜を強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）に通液してオリゴ糖溶出画分をクロマト分離する。使用する強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）としては、アンバーライトＣＧ−６０００Ｎａ（オルガノ株式会社製品）などが好適例として示されるが、これに限定されるものではない。

ここで得られたオリゴ糖溶出画分を、必要があれば溶媒に溶解し、活性炭−セライトカラムに通液する。活性炭−セライトカラムは、市販の活性炭とセライトを混合してカラムに充填したものを用いればよい。活性炭とセライトの混合比は１：４〜４：１程度が好ましく、特に好適なのは活性炭とセライトを等量（１：１）で混合したものである。

オリゴ糖溶出画分を活性炭−セライトカラムに通液した後、エタノール水溶液でオリゴ糖を溶出する。溶出に好適な溶媒は３〜７％（ｖ／ｖ）濃度のエタノール水溶液であり、更に好ましくは４〜６％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液であって、５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液が最も適している。この溶出溶媒としてはエタノール水溶液を使用するが、極性等の性質に差異がないのであれば他のアルコール類の水溶液を使用しても差し支えない。しかし、アルコール類以外の溶媒（酸、他の有機溶媒など）を使用する方法は、本発明には適していないため除外される。

このようにして得られたエタノール溶出画分は、そのまま溶媒を除去してオリゴ糖Ｉ、オリゴ糖ＩＩ、オリゴ糖ＩＩＩの混合物として用いても良いが、さらに調製用のＯＤＳ（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｙｌ）カラムを用いたＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によってオリゴ糖Ｉ、オリゴ糖ＩＩ、オリゴ糖ＩＩＩをそれぞれ分離、精製することができる。ＯＤＳカラムとしては、逆相カラムであるＯＤＳ−８０Ｔシリーズ（東ソー株式会社製品）などの低分子化合物分離用のものを用いるのが好ましい。

以上のようにして、ビート糖蜜より本発明に係る新規オリゴ糖（オリゴ糖Ｉ、オリゴ糖ＩＩ、オリゴ糖ＩＩＩ）を分離、精製することができる。なお、上記工程については、その目的や効果を逸脱しない範囲で、工程順序の変更や別工程の追加が可能である。
このようにして得られた新規オリゴ糖は、同じ構成糖の三糖類であるラクトスクロース、ラフィノース、ケストースなどと同様の機能（整腸作用、甘味作用など）を発揮することが期待でき、さらに、同じ結合様式である二糖類のラクチュロースやマルチュロースなどと同様の機能（抗う蝕作用など）も併せて発揮することが期待できる。

以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。

（ビート糖蜜からの新規オリゴ糖分離・精製）
ビート由来の新規三糖類（オリゴ糖Ｉ、オリゴ糖ＩＩ、オリゴ糖ＩＩＩ）は、以下のようにして取得した。

シュガービート（三糖類含量約０．１％）を温水抽出して得たロージュースからグラニュー糖を分離、精製した残渣であるビート糖蜜（三糖類固形分比約１０％）について、アンバーライトＣＧ−６０００Ｎａ（オルガノ株式会社製品）に通液してオリゴ糖溶出画分（三糖類固形分比約７０％）を分離し、分離画分を減圧濃縮した。このオリゴ糖画分（乾燥重量１３ｇ）について、脱塩水に溶解して１００ｍＬとして活性炭−セライトカラムクロマトグラフィー（ｃｈａｒｃｏａｌ（和光純薬工業株式会社製品）：Ｃｅｌｉｔｅ−５３５（ナカライテスク株式会社製品）＝１：１、φ５５×４７０ｍｍ）に供し、その後、水溶出（７Ｌ）、５％エタノール水溶液溶出（２１．４Ｌ）、１０％エタノール水溶液溶出（５．１Ｌ）、２０％エタノール水溶液溶出（３Ｌ）をそれぞれ行った。このうち、５％エタノール水溶液溶出画分（Ｒ５）のフラクション１５（Ｒ５−１５；５４９ｍｇ）、フラクション１９（Ｒ５−１９；３２６ｍｇ）に新規オリゴ糖が含まれており、さらにここからＯＤＳカラム（ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｓ、φ２０×２５０ｍｍ；東ソー株式会社製品）を用いた調製用ＨＰＬＣにてオリゴ糖Ｉ（１５．０ｍｇ）、オリゴ糖ＩＩ（５．４ｍｇ）、オリゴ糖ＩＩＩ（４．０ｍｇ）をそれぞれ単離した。

なお、上記新規オリゴ糖の製造、精製操作手順についてのフロー図を図１に示した。

（オリゴ糖の構造解析）
実施例１で取得した各オリゴ糖について、以下のようにして構造解析を行った。

オリゴ糖Ｉ、オリゴ糖ＩＩ、オリゴ糖ＩＩＩについて、各糖の酸加水分解物のＨＰＡＥＣ（Ｈｉｇｈ−ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＡｎｉｏｎ−ＥｘｃｈａｎｇｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析、各糖のＴＯＦ−ＭＳ（ＴｉｍｅＯｆＦｌｉｇｈｔ−ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、及び、各糖の２次元ＮＭＲ（２Ｄ−ＮＭＲ（ＮｕｃｌｅａｒＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ））分析により構造解析を行った。酸加水分解物のＨＰＡＥＣ分析結果より、オリゴ糖ＩからＤ−ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ、Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅが、そしてオリゴ糖ＩＩとオリゴ糖ＩＩＩからＤ−ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅが遊離されること（つまり、これらが各オリゴ糖の構成糖であること）が示された。また、ＴＯＦ−ＭＳ分析により、各糖は５２７の［Ｍ＋Ｎａ］^＋イオンピークを与えた。これらの結果を下記表１に示した。

そして、各糖の２次元ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ）は図２〜４に、２次元ＮＭＲスペクトルデータ（化学シフト（δ_Ｃ、δ_Ｈ）、カップリング値（Ｊ_ＨＨ））は下記表２に示す結果であった。

２次元ＮＭＲ分析の結果からは、オリゴ糖Ｉがスクロースを構成するフルクトース残基の４位（Ｃ−４）にガラクトースが結合した配置であり且つこれらがαフォームを形成していること、オリゴ糖ＩＩがスクロースを構成するフルクトース残基の４位（Ｃ−４）にフルクトースが結合した配置であり且つこれらがβアノマーフラクトシルフォームを形成していること、及び、オリゴ糖ＩＩＩがスクロースを構成するフルクトース残基の４位（Ｃ−４）にフルクトースが結合した配置であり且つこれらがαアノマーフラクトシルフォームを形成していることが明らかとなった。

以上の結果より、オリゴ糖Ｉは４^Ｆ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルスクロース（４^Ｆ−α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（４^Ｆ−α−Ｄ−ＧａｌＳｕｃ））、オリゴ糖ＩＩは４^Ｆ−β−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース（４^Ｆ−β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（４^Ｆ−β−Ｄ−ＦｒｕＳｕｃ））、オリゴ糖ＩＩＩは４^Ｆ−α−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース（４^Ｆ−α−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（４^Ｆ−α−Ｄ−ＦｒｕＳｕｃ））であることが確かめられた。

本発明を要約すれば、以下の通りである。

そして、ビート糖蜜を強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）に通液してオリゴ溶出画分を分離し、該画分を活性炭−セライトカラムに通液し、３〜７％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液溶出画分を取得することで、新規オリゴ糖である４^Ｆ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルスクロース、４^Ｆ−β−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース、及び、４^Ｆ−α−Ｄ−フルクトフラノシルスクロースを取得できる。

Claims

下記化４に示す式（Ｉ）で表される４^Ｆ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルスクロース。
下記化５に示す式（ＩＩ）で表される４^Ｆ−β−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース。
下記化６に示す式（ＩＩＩ）で表される４^Ｆ−α−Ｄ−フルクトフラノシルスクロース。
ビート糖蜜を強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ型）に通液してオリゴ糖溶出画分を分離し、該画分を活性炭−セライトカラムに通液し、３〜７％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液溶出画分を取得する工程からなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴ糖の製造方法。
エタノール溶出画分を、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによって更に分離、精製する工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
ビート糖蜜が、イオン交換樹脂製糖法でのビート糖製糖工程汁からの砂糖回収後の糖蜜であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。