JP6210111B2 - 蛍光免疫測定用センサーチップ及び蛍光免疫測定方法 - Google Patents

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Description

本発明は、１つのセンサーチップによって、同一サンプル中の複数のマーカーを同時に検出・測定することができる蛍光免疫測定用センサーチップ及び蛍光免疫測定方法に関する。
疾患の早期発見や潜在的なリスクなどを発見するための免疫測定では、サンプル中の極微量なアナライトを検出・測定するために、高感度化が求められている。
サンプル中の極微量のアナライトを高感度に検出・測定する方法として、例えば、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）を用いた測定方法が知られている。
図５は、従来の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」とも言う。）の構成を説明するための概略構成図である。
図５に示すように、ＳＰＦＳ装置１００は、センサーチップ装填部１１１を備えており、このセンサーチップ装填部１１１に、センサーチップ１１０が装填されるように構成されている。
センサーチップ１１０は、誘電体部材１１２と、誘電体部材１１２の主面１１２ａに金属薄膜１１４を介して形成される、微細流路１１８上の所定位置にリガンドが固定化されることで構成されたセンサー部１１６とを有している。
ＳＰＦＳ装置１００のセンサーチップ装填部１１１に装填されたセンサーチップ１１０の誘電体部材１１２側には、誘電体部材１１２の入射面１１２ｉから入射され、金属薄膜１１４において全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる所定の入射角θAでセンサー部１１６に向かって励起光１２２を照射する光源１２０を備えるとともに、さらに光源１２０から照射され、金属薄膜１１４で反射した反射光１２４を受光する受光手段１３２が備えられている。
一方、センサーチップ１１０の上方には、センサー部１１６に固定されているリガンドで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光１３４を受光する光検出手段１３０が設けられている。
なお、センサーチップ１１０と光検出手段１３０との間には、蛍光１３４を効率良く集光するための集光部材１２６と、蛍光１３４以外の光を除去して蛍光１３４のみを選択的に透過する波長選択機能部材１２８が設けられている。
このようなＳＰＦＳ装置１００は、以下のとおり使用される。
先ず、センサー部１１６に微細流路１１８を介してアナライトを含有する検体溶液を流入させ、その後、このアナライトを標識する蛍光物質を、同様に微細流路１１８を介して流入させることで、センサー部１１６に蛍光物質で標識されたアナライトが捕捉された状態とする。
そして、この状態で光源１２０より誘電体部材１１２を介して、金属薄膜１１４において全反射減衰が生じる所定の入射角θAで励起光１２２を照射することで、エバネッセント波と、金属薄膜１１４からの表面プラズモンとの共鳴によって増強された電場が発生し、それによりセンサー部１１６に捕捉された蛍光物質による蛍光１３４を効率良く励起させる。
そして、この励起された蛍光１３４を光検出手段１３０で検出することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出・測定する。
このような免疫測定装置は、患者の血液や尿、唾液などの体液中に含まれる疾患マーカーの測定に用いられることが多いが、その際、単一のマーカーの測定ではなく、関連する複数のマーカーの測定を行い、それらの総合的な結果から患者の病態を診断することが一般的である。
このため、特許文献１や特許文献２では、１つのフローセルやセンサーチップなどのデバイスに複数のセンサー部（アッセイ領域）を設けることで、複数のマーカーについての測定を１つのデバイスで同時に行うことが開示されている。
特表２００１−５１６８７９号公報 国際公開２０１２−０９０７５９号
N Engl J Med 2009; 361: 858-867 Therapeutic Research 2010; 31(7): 968-971 JAMA 2010; 304(22): 2494-2502 「Serial changes in highly sensitive troponin I assay and early diagnosis of myocardial infarction.」JAMA. 2011 Dec 28;306(24):2684-93 「慢性心不全患者における高感度心筋トロポニンI測定の有用性に関する検討」 Therapeutic Research Vol.31 no.7 2010
このような免疫測定装置を用いて、例えば、心筋梗塞の検査を行う場合、心筋梗塞マーカーとしては、ミオグロビン、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオシン軽鎖およびトロポニン等が用いられている。
ミオグロビンは、筋細胞の細胞質内に豊富に存在する低分子蛋白であるので、壊死心筋から容易に血中に流出し、心筋梗塞の発症後１〜３時間で異常値を示す。しかし、骨格筋のミオグロビン含量は心筋より多いため、ミオグロビンの心筋特異性は低い。従って、ミオグロビンは心筋特異性が低いという欠点はあるが、ミオグロビン濃度は簡便・迅速に測定できるため、現時点では急性心筋梗塞の早期診断及び経静脈的血栓溶解療法の成否の判定における有用なマーカーの一つである。
また、トロポニンは筋原繊維の細いフィラメントに存在するタンパク質複合体で、トロポニンＴ（分子量３７０００）、トロポニンＩ（分子量２２５００）、トロポニンＣ（分子量１８０００）の３つのサブユニットからなる。トロポニンは、心筋疾患により引き起こされる心筋細胞の破壊により心筋細胞から血液中に放出され、血液中ではトロポニンＴ、トロポニンＩおよびトロポニンＣの３つのサブユニットが単独、又は２つ若しくは３つの異なるサブユニットからなる複合体を形成して存在する。
トロポニンのサブユニットのうちトロポニンＩは、正常なヒトの血液中にはほとんど存在せず、心筋疾患に罹患したヒトの血液中に特異的に存在するので、早期に心筋疾患を検出することができるバイオマーカーとして知られている。たとえば、非特許文献４には、急性心筋梗塞の早期診断における高感度トロポニンＩの有用性が記載されている。また、非特許文献５には、慢性心不全患者における高感度ｃＴｎＩ測定の有用性も記載されている。
また、トロポニンＴも極めて心筋特異性が高く、心筋梗塞発症後早期から長期間にわたって異常値を示すので、従来のマーカーでは検出できなかった微小心筋障害を診断することが可能となった。すなわち、ｃＴｎＴは発症早期（発症後３〜４時間以降）から７〜１０日までの長い期間にわたる心筋梗塞の診断に有用である。欧州心臓病学会と米国心臓病学会の合同作業チームは、心電図変化と臨床症状に基づく急性心筋梗塞の診断基準を、２０００年にｃＴｎＴまたはｃＴｎＩの血中濃度に心電図所見と臨床症状を加味して診断する新しい基準に変更している。２００７年、Circulation（2007; 115: e356-e375）に国立臨床生化学検査アカデミーから，急性冠症候群（ＡＣＳ）と心不全領域におけるバイオマーカーのガイドラインが発表され，ＡＣＳの診断において，トロポニン測定を診断補助に用いることはｃｌａｓｓ Ｉ，エビデンスレベルＡと記載された。さらに、非特許文献３には、老齢者の心血管イベントの発現比率とｃＴｎＴ値との相関が大規模臨床（ｎ＝４２２１）で検証されている。ｃＴｎＴ値は、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ ２０１０で測定され、下限値は３ｐｇ／ｍＬ、カットオフ値は１３．５ｐｇ／ｍＬとされた。その結果、カットオフ値以下であってもｃＴｎＴ値によって心血管イベントの発現比率に差が認められ、低濃度域においてｃＴｎＴ値を測定することの意義が示唆されている。
このような心筋梗塞マーカーを複数検出・測定することによって、精度良く患者の疾患を検査し、把握することができる。
しかしながら、従来の免疫測定装置では、測定可能なマーカーの濃度範囲が狭く、トロポニンなどの検体溶液中の含有濃度が低く高感度が求められるマーカーと、ミオグロビンなどの検体溶液中の含有濃度が高く高感度を必要としないマーカーとを同一検体を用いて同時に測定することはできなかった。
このため、測定項目ごとに検体溶液の希釈率を変更したり、磁性粒子を用いた測定計では、項目毎に磁性粒子数を調整するなどの手段がとられ、また、蛍光測定をする際の励起光や受光側装置の測光条件を変更するなどの手段で、個々に免疫測定を行っていた。しかしながら、前者の場合、必要な検体量が増え、患者の負担が大きくなってしまうという問題があった。また、後者の場合にも、測光条件を変更した後、測定装置が安定化するまでに時間を要するため、免疫測定に要する時間が長くなってしまうという問題があった。
本発明は、このような現状に鑑み、検体溶液中の含有濃度が低く高感度が求められるマーカーと、検体溶液中の含有濃度が高く高感度を必要としないマーカーとを同一検体を用いて同時に測定することができる蛍光免疫測定用センサーチップ及び蛍光免疫測定方法を提供することを目的とする。
本発明は、上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した蛍光免疫測定用センサーチップは、検体溶液中のマーカーを検出・測定するための蛍光免疫測定に用いられる蛍光免疫測定用センサーチップであって、
誘電体部材と、
前記誘電体部材の主面の一部に形成された金属薄膜と、
前記金属薄膜上の所定位置に形成された第１センサー部と、
前記誘電体部材上の所定位置に直接形成された第２センサー部と、
を備え、
前記第１センサー部に固定されたリガンドと、前記第２センサー部に固定されたリガンドとがそれぞれ異なる種類のマーカーを捕捉するように構成される。
本発明によれば、検体溶液中の含有濃度が低く高感度が求められるマーカーと、検体溶液中の含有濃度が高く高感度を必要としないマーカーとを同一検体を用いて同時に測定することができる。
また、１つのセンサーチップ上にそれぞれ異なる種類のマーカーを捕捉する複数のセンサー部を有し、高感度が求められるマーカーについてはＳＰＦＳによって測定し、高感度を必要としないマーカーについては近接場蛍光によって測定することによって、ダイナミックレンジの広い蛍光免疫測定を行うことができる。
本実施例におけるセンサーチップの構成を説明するための概略構成図である。 図２は、図１に示すセンサーチップを装填し蛍光免疫測定を行う蛍光免疫測定装置の構成を説明するための概略構成図である。 図３は、センサーチップ１０の別の実施例における構成を説明するための概略構成図である。 図４は、第１センサー部の形状と、励起光の照射領域の形状のパターンを説明するための模式図である。 図５は、従来の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」とも言う。）の構成を説明するための概略構成図である。
以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいて、より詳細に説明する。
図１は、本実施例におけるセンサーチップの構成を説明するための概略構成図、図２は、図１に示すセンサーチップを装填し蛍光免疫測定を行う蛍光免疫測定装置の構成を説明するための概略構成図である。
図１に示すように、本実施例のセンサーチップ１０は、誘電体部材１２と、誘電体部材１２の主面１２ａの一部に形成された金属薄膜１４と、金属薄膜１４上の所定位置にリガンドが固定されることで構成された第１センサー部１６ａと、誘電体部材１２上の所定位置に直接リガンドが固定されることで構成された第２センサー部１６ｂ，１６ｃとを有している。
第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃの面積は、特に限定されるものではないが、後述する励起光２２が照射される照射領域の面積以上であることが好ましい。
特に、蛍光免疫測定時のＳ／Ｎを向上させるためには、第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃの形状は、励起光２２が照射される領域と同じ形状であることが好ましい。
なお、第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃには、それぞれ不図示のウェル部材によって、添加された検体溶液が滞留するウェルが形成されている。
金属薄膜１４上に設けられた第１センサー部１６ａに固定されたリガンドは、例えば、トロポニンＩなどの高感度を求められるマーカーを捕捉するためのリガンドであり、一方で、誘電体部材１２上に設けられた第２センサー部１６ｂ，１６ｃに固定されたリガンドは、例えば、ミオグロビンなどの高感度を必要としないマーカーを捕捉するためのリガンドである。
このように、第１センサー部と第２センサー部とにおいて、異なるマーカーを捕捉するリガンドを固定することで、１つのセンサーチップ１０において、複数のマーカーの同時検出・測定を行うことができる。
また、後述するように、第１センサー部１６ａにおいてＳＰＦＳ測定を行い、第２センサー部１６ｂ，１６ｃにおいて近接場蛍光測定を行うことによって、ダイナミックレンジの広い蛍光免疫測定を行うことができる。
また、本実施例において、誘電体部材１２は、図１に示すように、断面が台形状をなした六面体形状に形成されている。そして、その上側の面が上述した主面１２ａを構成するとともに、この六面体の内の一面が、励起光２２の入射面である入射面１２ｉを構成している。
なお、誘電体部材１２の形状は、上述した六面体形状に限定されない。少なくとも第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃが形成される主面１２ａと、励起光２２が入射する面である入射面１２ｉが形成されるとともに、入射面１２ｉから入射した励起光２２が、誘電体部材１２の内部を通過し、全反射条件となる所定の入射角θで第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃを照射するように構成されていればよく、その形状は、例えば円錐形状や、三角錐や四角錐などの角錐形状、或いはかまぼこ状であってもよいものである。また、誘電体部材１２に二面以上の入射面１２ｉを形成することも可能である。
また、誘電体部材１２の材質は、少なくとも励起光に対して光学的に透明な材料から形成されていればその材質は特に限定されないが、安価で取り扱い性に優れるセンサーチップを提供する上で、例えば樹脂材料から形成されていることが好ましい。誘電体部材１２を樹脂材料から形成する場合は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。
誘電体部材１２の形成方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のような樹脂材料を用いる場合には、射出成形によって形成することができる。
金属薄膜１４は、一般的なＳＰＦＳ装置に用いられるセンサーチップを構成する金属薄膜と同様の金属を用いることができる。すなわち、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、その中でも金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。
第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃは、特定のマーカーと特異的に結合するリガンドがそれぞれ固定化されることで形成されている。この第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃに特定のマーカーを含有した検体溶液を添加し、その後、このマーカーを標識する蛍光物質を同様に添加することで、第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃに蛍光物質で標識されたマーカーが固定化された状態とすることができる。
このように構成されたセンサーチップ１０は、図２に示すように、蛍光免疫測定装置１に装填されて使用される。
蛍光免疫測定装置１は、図２に示すように、センサーチップ１０を装填するための装填部１１と、装填部１１に装填されたセンサーチップ１０に向かって励起光２２を照射するための光源２０とを少なくとも備えている。
そして、光源２０は、不図示の移動手段によって、所定の仰角に固定された状態で、図中の矢印Ｘで示す一軸方向にのみ移動できるように構成されている。なお、この矢印Ｘで示す一軸方向とは、誘電体部材１２の入射面１２ｉと平行な方向である。
なお、本実施例では、光源２０が移動するように構成されているが、センサーチップ１０が装填された装填部１１を、矢印Ｘで示す一軸方向にのみ移動できるように構成してもよい。すなわち、光源２０とセンサーチップ１０とが相対的に移動可能なように構成されていればよい。
なお、測定の安定化や蛍光免疫測定装置１の製造コストの削減という観点からは、光源２０などの光学系を移動させることは好ましくなく、センサーチップ１０が装填された装填部１１のみが移動するように構成したほうがよい。
なお、蛍光免疫測定装置１のその他の構成としては、前述した従来のＳＰＦＳ装置１００と同様である。すなわち、誘電体部材１２の主面１２ａで反射した反射光２４を受光する受光手段１３２、センサーチップ１０の上方に配置される光検出手段１３０、およびセンサーチップ１０と光検出手段１３０との間に配置される集光部材１２６や波長選択機能部材１２８などが設けられている。また、上述するように光源２０が移動可能に構成されている場合、蛍光や反射光２４が受光可能となるように、光検出手段１３０および受光手段１３２も移動可能に構成されているものとする。
このように構成される蛍光免疫測定装置１は、基本的には、上述した従来のＳＰＦＳ装置１００と同様に、以下のように使用される。
先ず、第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃにマーカーを含有する検体溶液を添加し、その後、このマーカーを標識する蛍光物質を同様に添加することで、第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃに蛍光物質で標識されたマーカーが固定化された状態とする。
そして、この状態でまず、光源２０より誘電体部材１２を介して金属薄膜１４上に形成された第１センサー部１６ａに対して励起光２２を照射するとともに、光源２０の仰角を順次変更する。このとき、受光手段１３２によって反射光２４を受光して、そのシグナル強度の変化を測定することで、誘電体部材１２上に形成された金属薄膜１４において全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる所定の入射角θAを探索する。
次いで、誘電体部材１２の内部を通過した励起光２２を、所定の入射角θAで第１センサー部１６ａに向かって照射し、金属薄膜１４の表面から、表面プラズモン共鳴によって増強されたエバネッセント波を放出させ、第１センサー部１６ａに固定化された蛍光物質による蛍光を励起させる。
そして、この増強されたエバネッセント波によって励起された蛍光を光検出手段１３０で検出することで、検体溶液中の含有濃度が低く高感度が求められるマーカーを検出・測定することができる。
すなわち、金属薄膜１４上に形成された第１センサー部１６ａでの蛍光免疫測定としては、ＳＰＦＳ測定が行われることになり、高感度のマーカー検出を行うことができる。
次いで、光源２０を移動させ、励起光２２を第２センサー部１６ｂに対して所定の入射角θAで照射する。これによって、誘電体部材１２の主面１２ａからエバネッセント波が放出され、第２センサー部１６ｂに固定化された蛍光物質による蛍光が励起される。
そして、このエバネッセント波によって励起された蛍光を光検出手段１３０で検出することで、検体溶液中の含有濃度が高く高感度を必要としないマーカーを検出・測定することができる。
すなわち、誘電体部材１２上に形成された第２センサー部１６ｂでの蛍光免疫測定としては、近接場蛍光測定が行われることになり、高感度を必要としないマーカー検出を行うことができる。
さらに、光源２０を移動させ、励起光２２を第２センサー部１６ｃに対して所定の入射角θAで照射することによって、第２センサー部１６ｂと同様に、近接場蛍光測定を行うことができる。
このように、金属薄膜１４上に形成された第１センサー部と、誘電体部材１２上に形成された第２センサー部とを有するセンサーチップ１０を用いることで、従来のＳＰＦＳ装置と同様な構成の蛍光免疫測定装置１によって、検体溶液中の含有濃度が低く高感度が求められるマーカーと、検体溶液中の含有濃度が高く高感度を必要としないマーカーとを同時に測定することができる。
なお、本実施例においては、第１センサー部１６ａにおいて、ＳＰＦＳ測定を行うために全反射減衰が生じる所定の入射角θAを探索して、第２センサー部１６ｂ，１６ｃにおいてもこの入射角θAで励起光を照射するようにしているが、近接場蛍光測定を行う第２センサー部１６ｂ，１６ｃでは励起光２２が全反射する入射角で励起光２２が照射されていればよい。
すなわち、第２センサー部１６ｃにおいて、全反射条件となる所定の入射角θを探索し、この入射角θで励起光２２を第２センサー部１６ｃ，１６ｂに順次照射して、近接場蛍光測定を行った後、第１センサー部１６ａにおいて、全反射減衰が生じる所定の入射角θAを探索し、この入射角θAで励起光２２を第１センサー部１６ａに照射して、ＳＰＦＳ測定を行うようにすることもできる。
ただし、測定時間の短縮という観点からは、励起光２２を照射する入射角の探索は少ない方が好ましいため、第１センサー部１６ａにおいて、ＳＰＦＳ測定が可能な所定の入射角θAを探索し、この入射角θAによって全てのセンサー部における蛍光免疫測定を行った方がよい。
図３は、センサーチップ１０の別の実施例における構成を説明するための概略構成図である。
この実施例のセンサーチップ１０は、図１に示したセンサーチップ１０と基本的には同様な構成であり、同一の構成部材には、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
図３に示すように、このセンサーチップ１０では、誘電体部材１２上に流路３０が形成されており、この流路３０内に第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃが設けられている。
すなわち、流路３０内の一部に金属薄膜１４が形成され、この金属薄膜１４上に高感度を求められるマーカーを捕捉するためのリガンドが固定されて第１センサー部１６ａが形成される。
また、流路３０内に直接、高感度を必要としないマーカーを捕捉するためのリガンドが固定されて第２センサー部１６ｂ，１６ｃが形成される。
また、この実施例では、流路３０に、検体流入口３２と検体排出口３４が設けられており、検体排出口３４には、検体溶液が一時的に滞留する液溜部３５が設けられている。
このように構成されたセンサーチップ１０では、例えば、ピペットなどを用いて検体溶液を検体流入口３２に注入するとともに、ピペットによって検体溶液を吸引・注入を繰り返すことで、ピペット、流路３０、液溜部３５において、検体溶液が第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃに対して往復移動し、第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂ，１６ｃに固定化されたリガンドに、迅速かつ効率良く検体溶液中のマーカーが捕捉されることになる。
このため、蛍光免疫測定のために必要となる検体量を減らすことができ、患者の負担を減らすことができる。
なお、この実施例では検体溶液を往復送液するため液溜部３５を設けているが、検体流入口３２と検体排出口３４とを、例えば、ポンプなどの循環送液手段（不図示）によって接続し、検体溶液を一方向に循環送液するようにしてもよい。
１．測定可能範囲について：
被測定マーカーとして、トロポニンＩおよびミオグロビンを用いて、それぞれ順次濃度を変更しながらＳＰＦＳ測定および近接場蛍光測定することで、測定可能な濃度範囲を測定した。表１に測定可能範囲を示す。
Figure 0006210111
患者から採取した検体溶液中においてトロポニンＩは低濃度であり、一方でミオグロビンはトロポニンＩと比べて高濃度であることが知られている。このため、トロポニンＩはＳＰＦＳ測定を行い、ミオグロビンは近接場蛍光測定することが好ましいことがわかる。
２．送液条件とＳ／Ｎの関係について：
図１に示すセンサーチップ１０を用いて検体溶液を所定時間静置した場合、図３に示すセンサーチップ１０を用いて検体溶液を流路３０に１回だけ通過させた場合（ワンパス）、および、検体溶液を流路３０に所定回数往復送液した場合においてそれぞれＳ／Ｎを測定した。
なお、被測定マーカーとしてはトロポニンＩを用い、心筋梗塞患者プール血清を各送液条件で送液した後、ＳＰＦＳ測定によって光検出手段１３０で検出された光量をシグナル（Ｓ）とし、トロポニンＩを含まない血清を各送液条件で送液した後、ＳＰＦＳ測定によって光検出手段１３０で検出された光量をノイズ（Ｎ）としてＳ／Ｎを算出した。表２に測定結果を示す。なお、検体溶液送液後の洗浄工程および蛍光物質によるトロポニンＩの標識工程における反応条件は、いずれも同一条件とした。
Figure 0006210111
表２に示すように、往復送液を行い、また、往復回数を多くすることによってＳ／Ｎが向上している。すなわち、検体溶液は往復送液することが好ましく、往復回数としては５０回以上が好ましい。
３．光学系とセンサーチップの移動について：
光学系（光源２０、光検出手段１３０など）を固定して、センサーチップ１０を移動した場合の測定結果のばらつきと、センサーチップ１０を固定して、光学系を移動した場合の測定結果のばらつきをそれぞれ測定した。
なお、被測定マーカーとしてトロポニンＩを用いて、トロポニンＩの濃度が異なる血清を１０回ずつＳＰＦＳ測定し、変動係数（ＣＶ：Coefficient of Variation）を算出した。表３に測定結果を示す。
Figure 0006210111
表３に示すように、光学系を移動させるよりも、センサーチップを移動させた方が変動係数が低くなり、測定の安定性が向上することがわかる。
４．励起光の入射角の探索について：
図１に示すセンサーチップ１０を用い、表４に示す励起光の入射角の探索方法でそれぞれ蛍光免疫測定を行った。なお、３種類の検体溶液について、第１センサー部１６ａにおいてトロポニンＩを測定し、第２センサー部１６ｂにおいてミオグロビンを測定して、それぞれ光検出手段１３０によって検出された光量をシグナル（Ｓ）とした。
一方で、トロポニンＩおよびミオグロビンを含まない検体溶液について、第１センサー部１６ａ、第２センサー部１６ｂにおいて測定し、それぞれ光検出手段１３０によって検出された光量をノイズ（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎを算出した。
また、蛍光免疫測定を開始して、励起光２２の入射角を探索し、第１センサー部１６ａおよび第２センサー部１６ｂにおける測定が完了するまでの時間を測定所要時間とした。表５に測定結果を示す。
Figure 0006210111
Figure 0006210111
表５に示すように、Ａ〜Ｃのいずれの方法を用いたとしても、ミオグロビンのＳ／Ｎに大きな違いはなかった。一方で、ＡまたはＣのように、第１センサー部１６ａにおいて、入射角θAを探索することによって、トロポニンＩのＳ／Ｎは向上した。このため、Ｓ／Ｎの向上という観点から、入射角の探索は、ＳＰＦＳ測定を行う第１センサー部１６ａで行うことが好ましい。
また、Ｃのように、入射角の探索を２回行った場合、ＡまたはＢのように、入射角の探索を１回しか行わなかった場合と比べて、測定所要時間が約２．５倍に増加してしまった。このため、測定所要時間の短縮という観点から入射角の探索は１回だけにすることが好ましい。
これらの結果から、蛍光免疫測定のＳ／Ｎを向上させるとともに、測定所要時間を短縮させるためには、上記Ａのように、ＳＰＦＳ測定を行う第１センサー部１６ａのみで入射角の探索を行うことが好ましい。
５．センサー部の形状について：
センサーチップ１０の金属薄膜１４上に、図４にそれぞれ示すような形状の第１センサー部１６ａを形成し、直径３ｍｍの円形断面を有する励起光２２を用いて、ＳＰＦＳ測定を行った。
なお、第１センサー部１６ａの形状としては、形状Ａは８ｍｍ×８ｍｍの正方形状、形状Ｂは直径６ｍｍの円形状、形状Ｃは直径３ｍｍの円形状である。なお、図４において、符号２３は励起光２２の照射領域である。
また、被測定マーカーとしてはトロポニンＩを用い、光検出手段１３０によって検出された光量をシグナル（Ｓ）とし、一方で、トロポニンＩを含まない検体溶液を用いて、同様に測定し、光検出手段１３０によって検出された光量をノイズ（Ｎ）として、Ｓ／Ｎを算出した。表６に測定結果を示す。
Figure 0006210111
表６に示すように、第１センサー部１６ａの面積を、励起光２２が照射される領域の面積に近づけ、また、第１センサー部１６ａの形状を、励起光２２が照射される領域の形状に近づけることによって、Ｓ／Ｎが向上していることがわかる。
これは、マーカーの検出領域、すなわち、励起光２２が照射される領域にマーカーが濃縮することから、シグナルが強くなるためである。
以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、第１センサー部を１つ、第２センサー部を２つ有するセンサーチップ１０について説明をしたが、第１センサー部および第２センサー部の数は限定されるものではなく、同時測定が必要なマーカーの種類に応じて適宜変更できるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
１ 蛍光免疫測定装置
１０ センサーチップ
１１ 装填部
１２ 誘電体部材
１２ａ 主面
１２ｉ 入射面
１４ 金属薄膜
１６ａ 第１センサー部
１６ｂ 第２センサー部
１６ｃ 第２センサー部
２０ 光源
２２ 励起光
２４ 反射光
３０ 流路
３２ 検体流入口
３４ 検体排出口
３５ 液溜部
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ センサーチップ
１１１ センサーチップ装填部
１１２ 誘電体部材
１１２ａ 主面
１１２ｉ 入射面
１１４ 金属薄膜
１１６ センサー部
１１８ 微細流路
１２０ 光源
１２２ 励起光
１２４ 反射光
１２６ 集光部材
１２８ 波長選択機能部材
１３０ 光検出手段
１３２ 受光手段
１３４ 蛍光

Claims (9)

  1. 検体溶液中のマーカーを検出・測定するための蛍光免疫測定に用いられる蛍光免疫測定用センサーチップであって、
    誘電体部材と、
    前記誘電体部材の主面の一部に形成された金属薄膜と、
    前記金属薄膜上の所定位置に形成された第１センサー部と、
    前記誘電体部材上の所定位置に直接形成された第２センサー部と、
    を備え、
    前記第１センサー部に固定されたリガンドと、前記第２センサー部に固定されたリガンドとがそれぞれ異なる種類のマーカーを捕捉する蛍光免疫測定用センサーチップ。
  2. 前記第１センサー部および前記第２センサー部の面積がそれぞれ、前記センサーチップの主面に照射される励起光の照射領域の面積以上である請求項１に記載の蛍光免疫測定用センサーチップ。
  3. 前記第１センサー部および前記第２センサー部の形状がそれぞれ、前記励起光の照射領域の形状と同じである請求項２に記載の蛍光免疫測定用センサーチップ。
  4. 前記誘電体部材上に流路が形成されており、該流路内に前記第１センサー部および前記第２センサー部が設けられている請求項１から３のいずれかに記載の蛍光免疫測定用センサーチップ。
  5. 請求項１から４のいずれかに記載の蛍光免疫測定用センサーチップを用いて検体溶液中のマーカーを検出・測定する蛍光免疫測定方法であって、
    前記検体溶液中のマーカーを蛍光物質により標識するとともに、前記マーカーを前記第１センサー部および前記第２センサー部に捕捉させるマーカー捕捉工程と、
    前記第１センサー部に対して、前記誘電体部材を介して光源から励起光を所定の入射角で照射し、前記第１センサー部に捕捉されたマーカーの蛍光物質から生じる蛍光を検出する第１検出工程と、
    前記第２センサー部に対して、前記誘電体部材を介して前記光源から前記励起光を所定の入射角で照射し、前記第２センサー部に捕捉されたマーカーの蛍光物質から生じる蛍光を検出する第２検出工程と、
    を含む蛍光免疫測定方法。
  6. 請求項４に記載の蛍光免疫測定用センサーチップを用いて検体溶液中のマーカーを検出・測定する蛍光免疫測定方法であって、
    前記検体溶液中のマーカーを蛍光物質により標識するとともに、前記検体溶液を前記流路に注入して、前記検体溶液を前記第１センサー部および前記第２センサー部に対して往復移動させることによって、前記マーカーを前記第１センサー部および前記第２センサー部に捕捉させるマーカー捕捉工程と、
    前記第１センサー部に対して、前記誘電体部材を介して光源から励起光を所定の入射角で照射し、前記第１センサー部に捕捉されたマーカーの蛍光物質から生じる蛍光を検出する第１検出工程と、
    前記第２センサー部に対して、前記誘電体部材を介して前記光源から前記励起光を所定の入射角で照射し、前記第２センサー部に捕捉されたマーカーの蛍光物質から生じる蛍光を検出する第２検出工程と、
    を含む蛍光免疫測定方法。
  7. 前記第１検出工程の後、前記光源を固定した状態で、前記センサーチップを移動させることで、前記励起光を前記第２センサー部に照射して、前記第２検出工程を行う請求項５または６に記載の蛍光免疫測定方法。
  8. 前記第１検出工程において、前記励起光の入射角が、前記金属薄膜において前記励起光の全反射減衰が生じる入射角である請求項５から７のいずれかに記載の蛍光免疫測定方法。
  9. 前記第１検出工程の後、前記励起光の入射角が、前記全反射減衰が生じる入射角となるように、前記光源の仰角を固定した状態で、前記センサーチップと前記光源とを相対的に移動させることで、前記励起光を前記第２センサー部に照射して、前記第２検出工程を行う請求項８に記載の蛍光免疫測定方法。
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