JP6176392B2 - 自己切断カセットを含むタンパク質精製方法及びこれの用途 - Google Patents
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Description
そこで、本発明では、ソルターゼA切断機能ドメインを結合させる方向構成及びソルターゼAと切断配列との間にリンカー適用を介して既存の方法より優秀なタンパク質収得率を得ることができることを確認して、本発明を完成した。
本発明のさらに他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供するところにある。
(i)目的タンパク質と、
(ii)下記の配列式Iのペプチドと、
[配列式I]
L−P−X−T−G;
(iii)ソルターゼA(Sortase A)切断機能ドメインと、
(iv)タグと、を含み、前記(i)乃至(iv)は、融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシル末端順序で存在して、前記配列式IでLはロイシン(Leucine)であり、Pはプロリン(Proline)であり、Xは任意のアミノ酸で、Tはトレオニン(Threonine)であり、Gはグリシン(Glycine)である。
本発明で「発現ベクター」とは、特定原核または、真核宿主細胞内で特定遺伝子を発現させるためにプロモーターなどが動作可能になるように連結されたベクターを意味する。これは、宿主細胞によりベクターのバックボーン(backbone)が変わり、本発明では大腸菌で発現可能なベクターであり、より好ましくはpET21b、pLIC、pET23aベクター(Novagen)であってもよい。
形質転換の目的となる細胞をいわゆる宿主細胞ともいい、これには真核細胞または原核細胞を問わない。本発明で細胞は、好ましくは大腸菌(Escherichia coli)であってもよく、より好ましくはE.coli Origami2(DE3)またはE.coli BL21(DE3)の大腸菌菌株であってもよい。
(i)マイクロチュールリン抑制剤、類似分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、またはDNAインターカレータとして機能できる化学療法剤、
(ii)酵素的に機能できるタンパク質毒素、
(iii)特定癌遺伝子(oncogene)の発現を抑制させることができるマイクロRNA (miRNA)、siRNA、shRNA、及び
(iv)放射線同位元素などが含まれる。
目的タンパク質は、癌細胞表面抗原に対する抗体であることが好ましいが、これに限定されない。
1−1:PCR反応液及び条件
本発明で利用する各種遺伝子を収得してベクターを製造するためのPCR反応液の組成とPCR実行条件は下記のとおりである。
先に、PCR反応液は2.5mM dNTP mix 5ul、5X PrimeSTAR緩衝液10ul、100μM正・逆方向プライマー各々1ulずつ、100ng/uLの鋳型DNA 1ul、2.5U/uL PrimeSTAR重合酵素0.5ul及び蒸溜水31.5ulを含み、計50ulで製造した。
前記製造したPCR反応液を98℃で10秒、68℃で1分のサイクルを29回繰り返すtwo−step PCRを進めた。PCR完了したサンプルは4℃に保管した。
先に、プライマー1_sfi(5’−ccgtg gcc cag gcg gcc GCA AGC AGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC−3’:配列番号19)または、プライマー1(5’−ATGT CAT ATG GCA AGC AGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC−3’:配列番号20)、及びプライマー2(5’−CTG CAT TTC GTG CCA CTC GAT CTT CTG GGC CTC GAA GAT GTC GTT−3’:配列番号21)を利用してBAP(biotin acceptor peptide)をコードするDNA配列をPCRで増幅した。
プライマー8(5’−ATG TCA TAT GGA CAT TCA GAT GAC ACA GAGT−3’:配列番号27)及びプライマー9(5’−ggaaccaccgccggtctcgggaag AAG ATC TTC TTC ACT AAT TAAC−3’:配列番号28)を利用して、リンカー(7A.A.)(GGSSRSS:配列番号5)が連結されたtarget−LPETG−リンカー(7A.A.)をコードするDNA配列をPCRで増幅した。
すべての発現実験は、E.coli Origami2(DE3)またはBL21(DE3)を利用して行った。100mg/lのアンピシリン及び0.5%(w/v)のグルコースを含むdYT培地(30ml)に単一バクテリアコロニーを接種して、37℃で夜中培養した。LB、SB、またはdYT medium(100mg/lのアンピシリン、50mM K2HPO4)0.3lに前培養(preculture)を接種して37℃で培養した(バッフルがある1lフラスコ、1l flask with baffles、200rpm)。OD600値が0.6である時IPTGを最終濃度0.5mMになるべく添加して発現を誘導した。培養を18時間18℃に維持した。細胞を遠心分離で収集して(10,000rpm、10分、4℃)、30mlの50mM Tris−HCl(pH8.0)及び150mM NaClで懸濁して、超音波(sonication)で破砕した。組抽出を遠心分離して(10,000rpm、30分、4℃)、上澄み液を0.2mmフィルターでろ過して、下記実施例3のNi FFクロマトグラフィーに直接適用した。
溶解物の上澄み液を5mlのNi−NTA(GE)コラムにロードして、20倍コラム体積のバッファーA(50mM Tris−Cl、pH8.0、150mM NaCl、30mMイミダゾール、及び5mM BME)で洗浄後、5倍コラム体積のバッファーB(50mM Tris−Cl、pH8.0、150mM NaCl)で洗浄した。洗浄後、タンパク質−結合レジンのaliquoteを切断バッファー(5mM CaCl2及び5mM tri−Glyを含むバッファーB)で平衡化させた後、25℃で1時間反応させた。
タンパク質純度は、SDS−PAGEゲルをクマシーブルー染色法で分析した。また、一部サンプルに対して発現及び精製の有無をウェスタンブロッティングで確認した。
前記融合タンパク質の構造面で目的タンパク質を基準として全体融合タンパク質のN末端またはC末端に目的タンパク質が連結された場合、精製効率の変化を確認した。
5−1:リンカーの長さ最適化
図1のII乃至IVに該当する融合タンパク質を発現するベクターをOrigami2(DE3)またはBL21(DE3)に形質転換して、これをLB、SBまたはdYT培地で培養して前記実施例2の方法を介して収得した細胞溶解物で発現の有無を確認した。これを実施例3に開示された通り、Ni_NTA(GE)コラムに結合させて精製を行って、コラムに結合した状態にあるタンパク質を確認した。
リンカーがSortase AドメインのN末端の部分の他にもC末端の部分にも存在する場合、収得率に変化があるかを確認するために、Sortase AドメインとHisタグとの間にリンカーを追加で挿入した融合タンパク質を利用して比較した。
前記多数のグリシン(Glycine)とセリン(Serine)と、一つのアルギニン(Arginine)からなるリンカーをドメイン間に干渉を減らすことができる多くの種類のリンカーに交換して、これによるコラム結合率または収得率を確認した。
ソルターゼAが切断配列(LPXTG)を認識して切断機能をするためには、カルシウム及び/またはトリグリシン(triglycine)がなければならないと知られている。本発明では、切断反応の最適条件を確認するために、カルシウムまたはトリグリシンの有無と濃度条件を異なるようにして切断タンパク質収得率を確認した。
7−1:濃度最適化
本実施例では、効率的な薬物の接合に必要なトリグリシンの最適濃度条件を確立した。薬物としてはトリグリシンが融合したビオチンを使って、その濃度をそれぞれ0、10nM、100nM、500nM、1μM、10μM、100μM、500μM、1mMで反応バッファー(50mM Trisバッファー、pH8.0/150mM NaCl/5mM CaCl2)と混合して反応させた後、目的タンパク質とビオチンの接合を陰性対照群と比較した。陰性対照群は、三つの条件(1:50mM Trisバッファー、pH8.0/2:50mM Trisバッファー、pH8.0+500μMトリグリシン−ビオチン/3:反応バッファー)を使った。目的タンパク質−ビオチンの接合反応は、ウェスタンブロットを利用して目的タンパク質に結合されているMycタグを利用して目的タンパク質の総濃度を確認して、ストレプトアビジンを利用して目的タンパク質とビオチンの接合反応度を確認した。
前記実施例7−1で確立されたトリグリシン−ビオチンの濃度を利用して、最適反応時間条件を分析した。目的タンパク質の濃度は、500μM及び1mMの二つの濃度に固定して、時間を0、30分、1、2、3、4、6時間及び16時間で反応させた後、目的タンパク質とビオチンの接合を陰性対照群と比較した。
Claims (30)
- (i)目的タンパク質と、
(ii)下記の配列式Iのペプチドと、
(iii)ソルターゼA(Sortase A)切断機能ドメインと、
(iv)タグと、を含む、自己切断融合タンパク質として、前記(i)乃至(iv)は、融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシル末端順序で存在することであり、前記(ii)下記配列式Iのペプチドと前記(iii)ソルターゼA切断機能ドメインとの間にペプチドリンカーを更に含み、前記ペプチドリンカーは、Sa(SG4)n(GGSSRSS)GbScのアミノ酸配列からなるもので、前記Sa(SG4)n(GGSSRSS)GbScのアミノ酸配列でSはセリン(Serine)、Gはグリシン(Glycine)、Rはアルギニン(Arginine)であり、aは0乃至5、bは0乃至5、cは0乃至5、nは0乃至10である自己切断融合タンパク質:
[配列式I]
L−P−X−T−G,
前記配列式Iで,Lはロイシン(Leucine)であり、Pはプロリン(Proline)であり、Xは任意のアミノ酸で、Tはトレオニン(Threonine)であり、Gはグリシン(Glycine)である。 - 前記Xは、グルタミン酸(Glutamic Acid、E)であることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーは、19乃至40個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーは、19乃至25個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーは、配列番号7のアミノ酸配列で構成されることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記ソルターゼAは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus、S.aureus)由来ソルターゼAであることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記ソルターゼAは、配列番号8のアミノ酸配列で構成されることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記タグは、ポリヒスチジンタグ(polyhistidine tag)、GSTタグ(glutathione−S−transferase tag)、HAタグ(Hemagglutinin tag)、FLAGタグ、Mycタグ、マルトース結合タンパク質タグ(maltose binding protein tag)、キチン結合タンパク質タグ(Chitin binding protein tag)及び蛍光タグからなる群の中から選択されることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記タグは、ポリヒスチジンタグであることを特徴とする請求項8に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記ポリヒスチジンタグは、連続したヒスチジンが6乃至12個であるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項9に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素及び抗体からなる群で選択されることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記目的タンパク質は、抗体の軽鎖または、重鎖の全部または一部であることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記目的タンパク質は、抗体の軽鎖可変領域(VL)または重鎖可変領域(VH)であることを特徴とする請求項12に記載の自己切断融合タンパク質。
- 前記自己切断融合タンパク質は、配列番号17または18のアミノ酸配列で構成されることを特徴とする請求項1に記載の自己切断融合タンパク質。
- 請求項1から請求項14のいずれかに記載の自己切断融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- 請求項15に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項16に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
- 前記細胞は、真核細胞または原核細胞であることを特徴とする請求項17に記載の形質転換された細胞。
- 前記細胞は、大腸菌(Escherichia coli)であることを特徴とする請求項18に記載の形質転換された細胞。
- 前記大腸菌は、Origami2(DE3)またはBL21(DE3)であることを特徴とする請求項19に記載の形質転換された細胞。
- (1)請求項17に記載の細胞を培養して細胞溶解物を得る工程と、
(2)細胞溶解物から目的タンパク質を精製する工程と、を含む、目的タンパク質の精製方法。 - 前記目的タンパク質を精製する工程(2)は、
(a)細胞溶解物を融合タンパク質に存在するタグと結合するコラムに注入する工程と、(b)コラムを洗浄する工程と、
(c)カルシウム及びトリグリシンからなる群中で選択された一つ以上を含む切断−バッファーで平衡化させて切断反応させる工程と、
(d)コラムから切断−バッファーを収得してタグが除去された目的タンパク質を収得する工程と、を含むことを特徴とする請求項21に記載の目的タンパク質の精製方法。 - 前記工程(c)で,切断−バッファーは、少なくともトリグリシンを含むことを特徴とする請求項22に記載の目的タンパク質の精製方法。
- 前記工程(c)で,切断−バッファーは、カルシウム0.1乃至10mM及びトリグリシン0.1乃至10mMを含むことを特徴とする請求項22に記載の目的タンパク質の精製方法。
- 前記工程(c)で,切断−バッファーは、カルシウム0.2乃至5mM及びトリグリシン0.2乃至5mMを含むことを特徴とする請求項24に記載の目的タンパク質の精製方法。
- (1)請求項1に記載の融合タンパク質とトリグリシン−薬物(GGG−drug)をカルシウムを含む切断−バッファー内で反応させて、目的タンパク質にトリグリシン−薬物(GGG−drug)を接合させる工程と、
(2)切断−バッファーを収得して、タグが除去された目的タンパク質とトリグリシン−薬物(GGG−drug)接合体を収得する工程と、を含む、治療用抗体−薬物結合体の製造方法。 - 前記工程(1)で、切断−バッファーは、カルシウム0.1乃至10mMを含むことを特徴とする請求項26に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。
- 前記工程(1)で、切断−バッファーは、トリグリシン−薬物(GGG−drug)500nM乃至1mMを含むことを特徴とする請求項26に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。
- 前記工程(1)で、接合させる時間は、3乃至16時間であることを特徴とする請求項26に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。
- 前記目的タンパク質は、癌細胞表面抗原に対する抗体であることを特徴とする請求項26に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。
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