JP6173030B2 - 積層可能な細胞濾過器 - Google Patents

Description

本発明は、単細胞又は細胞内区画を含む懸濁液からある直径よりも大きな粒子を除去するためのフィルタシステムであって、フィルタシステムの外径が、様々な寸法の開口を有する少なくとも２つの実験室容器に嵌合するように適応されているものに関する。

生物学的研究又は医学における診断において、組織のような試料を、隔離された細胞に解離することがしばしば要求される。組織解離は、しばしば、酵素消化、又は欧州特許第１８４３８５２号明細書に開示されたような断片化装置を用いる機械的解体によって達せられる。解離の場合、濾過によって、解離されていない組織断片から単細胞が分離される。

生物学的研究又は医学における診断のためのフィルタシステムが長い間知られている。より大きな粒子又は組織から、隔離された細胞を分離するために、まずガーゼが使用される。ガーゼは試料の液体を部分的に吸収するので、濾過のためのメッシュを有するいわゆる細胞濾過器がこの目的のために使用される。細胞濾過器は、分離される粒子、例えば標的細胞の寸法に応じて、複数のメッシュサイズにおいて利用可能である。

生物学的研究又は医学的診断のための最も一般的な実験室容器は、いわゆる管、すなわちフリップキャップ又はスクリューキャップを備えた円筒状の容器であるので、試料をさらに取り扱う必要なしにこのような管への濾過を行うことが望ましい。管は、複数の異なる体積のために利用可能であり、様々な寸法の開口を有する。細胞を用いて作業する研究者のために、特に１５ｍｌ及び５０ｍｌが一般的な管の大きさである。

実験室のために市販されている細胞濾過器は、使い捨てであり、無菌パックされており、様々な容器及び用途とともに使用するために利用可能である。例えば、欧州特許第０５９３７６７号明細書、スイス特許第２４１１９４号明細書又は米国特許２３３１２３４号明細書は、フィルタフランジが容器の開口によって支持されるような形式で管のような容器に挿入されるフィルタシステムを開示している。言い換えれば、フィルタシステムは管内に懸吊され、これは、このフィルタシステムが、フィルタシステムが設計された管寸法とともにしか機能しないことを意味する。

同様のフィルタシステムが国際公開第２００９／０９６７９０号に開示されており、フィルタには、容器の外側に嵌合する複数の支持縁部が設けられている。フィルタは、支持縁部を介して容器に支持される。容器（管）の上部に単に載置されるだけの従来のフィルタは、傾きやすい。

容器（管）に懸吊される従来のフィルタは、フィルタの側壁と容器との間にほとんどスペースを残さず、これは、フィルタに液体（懸濁液）が充填される際に通気を損なう。その結果、特に、僅かに粘性の試料が処理される場合に"流れ停止"が生じ、フィルタが手作業で持ち上げられる必要がある。フィルタ領域は、ふるい領域に触れることなくフィルタを取り扱いかつ無菌状態を保つためのグリップハンドルを備えたフレームに設けられている。しかしながら、グリップハンドルは、かなり小さく、実験室における通常の作業条件下で取り扱うのが困難である。さらに、ふるいの上方のフィルタシステムの体積は、標準的な管の体積を保持するには小さすぎ、これは、ピペッティングの際に液体がふるいを即座に通過しない場合、再充填を必要にする。

さらに、小さな体積を備える実験室容器のために設計されたフィルタシステムは、通常、小さなフィルタ領域を備える小さな寸法の物体である。小さなフィルタ領域は詰まりやすい及び／又は処理速度はかなり低い。他方で、より小さな直径を備える管の取り扱いは、減じられた洗浄体積、ラックスペース、遠心分離によって処理される試料のより多い数、及び遠心分離後のよりよいペレット形成という明らかな利点を有する。

欧州特許第１８４３８５２号明細書 欧州特許第０５９３７６７号明細書、 スイス特許第２４１１９４号明細書 米国特許２３３１２３４号明細書 国際公開第２００９／０９６７９０号

したがって、十分なフィルタ効率を提供するが小さな管寸法にも適したフィルタシステムが必要とされている。

したがって、本発明の課題は、高いフィルタ効率を有しかつ様々な開口寸法の管に適した、すなわち少なくとも標準的な１５ｍｌ及び５０ｍｌの試験管に適合する細胞濾過器を提供することである。

この課題は、細胞懸濁液から粒子を分離するための細胞濾過器であって、懸濁液の流れの方向に対して実質的に垂直な少なくとも１つのフィルタ領域を備えた上側部分と、様々な寸法の開口を備えた少なくとも２つの管の開口に嵌合するように適応された下側部分とを備え、下側部分は、第１の管の開口の直径を有する肩部若しくはフランジを有する第１の部分と、第２の管のネックのための受容部としての内側及び外側の壁部を有する第２の部分とを有し、第１の部分の直径は第２の部分の直径よりも大きい、細胞濾過器によって達成される。

少なくとも１つの第２の部分の内側及び外側の壁部は、第２の管のネックを受容するように形成されており、すなわち、第２の管に嵌合するための受容部として成形されている。受容部は、細胞濾過器が管に対して傾斜するのを防止するために管に対して圧力ばめホルダを提供するように第２の管に嵌合すべきである。本発明による細胞濾過器の少なくとも１つの第２の部分の内側及び外側の壁部は、少なくとも２つの異なる標準的な管（例えば１５ｍｌ及び５０ｍｌの管）における細胞濾過器の傾斜しない積み重ねを可能にする。さらに、細胞濾過器は、管に積み重ねられており、クリップ留め又は螺合させられていないので、管から簡単に取り外すことができる。

懸濁液の流れの方向に対して実質的に垂直に配置された少なくとも１つのフィルタ領域は、流れの方向に対して正確に垂直に又は流れの方向に対して僅かにずれて（０°〜１５°で）配置されていてよい。

本発明による細胞濾過器は、細胞懸濁液から粒子を分離するために使用することができる。粒子を分離することは、例えば、機械的手段（例えばグラインディング又は断片化）又は化学的手段（例えば酵素消化）によって解離された組織から単細胞を分離することを含む。この場合、標的細胞は望ましくない粒子から分離される。さらに、粒子を分離することは、手を加えていない細胞又は組織から細胞を砕解することによって得られるミトコンドリア、核酸、リボソーム及びベシクルのような細胞内区画の分離を含む。細胞濾過器は、それ自体、組織（例えば脾臓）を細胞濾過器のメッシュに押し通すことによって組織の分散のために利用することもできる。

本発明による細胞濾過器の概略的な側面図である。 １５ｍｌの標準的な管と５０ｍｌの標準的な管が配置された細胞濾過器の側面図である。 円筒形の上側部分を備えた細胞濾過器の側面図である。 細胞濾過器に挿入されるフィルタフレームの斜視図である。 下側部分における肩部／リム状支持構造における複数の凹所を備えた細胞濾過器の斜視断面図である。 フランジの間の広い通気領域を備えたかなり小さなフランジを備えた細胞濾過器の斜視図である。 積み重ねられた細胞濾過器の斜視図である。 溝を具備した、下側部分から分離された細胞濾過器の上側部分の斜視図である。 発明の以下の特徴の組合せを備えた、積み重ねられた細胞濾過器の斜視断面図である。

図１は、本発明による細胞濾過器の概略的な側面図を示している。１５ｍｌの標準的な管１が、細胞濾過器の下側部分７の受容部２に挿入されている。下側部分７は、５０ｍｌの標準的な管（図示せず）の開口に載るための肩部若しくはフランジ４を有する。上側部分６は、ふるい領域３と、容器体積５とを有する。

本発明による細胞濾過器のふるい領域は、フレームに設けられているのではなく、上側部分の閉鎖された本体内に設けられている。したがって、細胞濾過器は、ふるいに触れることなく無菌パッケージから簡単に取り出すことができ、ふるいの汚染を防止し、本発明によれば、濾過器のいずれかの部分から突出したグリップ若しくはハンドルを必要としない。このような細胞濾過器が据え付けられた管は、難なく標準的なラックに貯蔵することができる。

発明の第１の実施の形態において、フィルタ領域の直径は、細胞濾過器の下側部分の第１及び第２の部分の内径よりも大きい。もちろん、第１及び第２の部分の内径は、受容部２に配置される管の外径と、肩部若しくはフランジ４とに対応している。細胞濾過器の下側部分の第１及び第２の部分の内径よりも小さな直径を有するフィルタ領域を利用することも可能である。この変化態様の場合は、細胞濾過器の上側部分により多くの貯蔵体積が設けられるが、フィルタ表面積は減じられる。ほとんどの用途の場合に、発明のこの変化態様はあまり好ましくない。

図２は、１５ｍｌの標準的な管１と、５０ｍｌの標準的な管８とが配置された細胞濾過器の側面図を示している。フィルタ領域３は、第１及び第２の部分の、すなわち受容部２及び肩部若しくはフランジ４における内径９及び１０よりも大きな直径を有する。好適には、フィルタ領域３の直径は、第１の部分の内径よりも少なくとも１％、好適には１０％〜２５％大きく、第２の部分の内径１０よりも少なくとも２５％、好適には５０％〜１５０％大きい。

別の実施の形態において、細胞濾過器の上側部分は、標準的な５０ｍｌの管の蓋と実質的に等しい外径を有する。

細胞濾過器の上側部分は、実質的に円筒形又は円錐形であることができる。下側部分は実質的に円錐として成形されているか、又は異なる外径を有する少なくとも２つの円錐形部分が設けられていることができる。図３は、円筒形の上側部分を備えた細胞濾過器を示している。

それらの形状にかかわらず、細胞濾過器の上側及び下側の部分は、互いに角度を成している。特に１５ｍｌの標準的な管を備えた細胞濾過器を用いる場合、詰まりを防止するために角度は小さすぎるべきではない。角度が大きすぎると、管の中への延びが大きくなりすぎ、細胞濾過器の全体的な寸法が、少なくとも２つの細胞濾過器の積み重ねを妨げる。細胞濾過器の上側及び下側の部分の間の角度は、好ましくは図１に符号８で示したように１０５〜１６５°である。

発明の別の実施の形態において、細胞濾過器には、少なくとも２つの細胞濾過器の積み重ねを可能にするための内径及び内部スペースを有する上側部分が設けられている。細胞濾過器の上側部分は、好適には少なくとも１０ｍｌ、特に１５〜３０ｍｌの体積を有する（図１における符号５）。

積み重ね可能な細胞濾過器は、順次濾過又は分割濾過のために使用することができる。すなわち、細胞懸濁液は、まず、大きなメッシュサイズを有する細胞濾過器を通って、より小さなメッシュサイズを有する第２の細胞濾過器内へ濾過され、必要であれば、さらにより小さなメッシュサイズを有する別の濾過器内へ濾過される。フィルタを詰まらせずに細胞懸濁液から粗い粒子を取り除くことができ、これにより、処理時間を短縮する。

細胞濾過器は、異なる内径を有する管の開口を収容するための肩部若しくはフランジを備えた、異なる外径を有する下側部分の２つ、３つ、４つ又は５つの部分を有してよい。図３は、管８及び１２のための肩部若しくはフランジ４及び１１の２つのセットを有する細胞濾過器を示す。特に、細胞濾過器は、１５ｍｌ及び５０ｍｌの体積を有する管に嵌合する異なる外径を有する下側部分の２つの部分を有する。１５ｍｌ及び５０ｍｌを有する一般的な管は、例えばBD Falcons又はCorning Centrifuge Tubesとして得ることができる。

細胞濾過器の下側部分における肩部若しくはフランジは、好適には、細胞濾過器の傾斜しない積み重ねを可能にするように配置される。この特許出願において用いられる"肩部若しくはフランジ"という用語は、管状の容器の開口上への又は管状の容器の開口内への細胞濾過器のための適切な機械的支持を提供するために細胞濾過器の下側部分に形成されたエッジ又はリムのようなあらゆる構造物を含むことが意図されている。当業者は、細胞濾過器の下側部分が傾斜しない形式で管に積み重ねられることを可能にする構造に想到する。

発明の別の実施の形態において、細胞濾過器には、通気のための少なくとも１つの凹所を有する肩部若しくはフランジが設けられている。肩部若しくはフランジは、通気のための１〜２５個の凹所を有してよい。図５は、下側部分における肩部／リム状の支持構造における複数の凹所を備えた細胞濾過器を示す。図６に示した発明の変化態様では、細胞濾過器は、フランジの間の広い通気領域を備えたかなり小さなフランジを有する。このような場合、細胞濾過器は、フランジの間に通気領域を備えた３〜１０個のフランジを有してよく、これらの通気領域は、肩部／リム／エッジのような構造における凹所と同じように作用する。

流れの方向に対して平行に向けられた濾過領域は、流れの方向に対して垂直に向けられた濾過領域ほど濾過性能又は能力に貢献しない。例えば、流れの方向に対して垂直に向けられた濾過領域を３５％拡大させることにより、流れの方向に対して平行に向けられた濾過領域を１７０％拡大させるのとほぼ同じ濾過スループットが達成される。したがって、細胞濾過器には好適には細胞懸濁液の流れの方向に対して垂直な１つの濾過領域のみが設けられる。したがって、管内にフィルタを懸吊する特徴を有するよりも、直径が管よりも大きな、流れ方向に対して垂直な濾過領域を有することがより効率的である。

大量の細胞懸濁液が濾過されるために、利用可能な、流れの方向に対して垂直なより多くの濾過領域を提供することが必要である。このような場合のために、細胞濾過器には、細胞懸濁液の流れの方向に対して垂直な少なくとも１つの濾過領域と、細胞懸濁液の流れの方向における少なくとも１つの濾過領域とを有する上側部分を設けることができる。

細胞濾過器の少なくとも１つの濾過領域は、細胞濾過器の上側部分に配置されたフレームに設けることができる。フレームは、流れの方向に対して垂直な少なくとも１つの濾過領域及び／又は細胞懸濁液の流れの方向における少なくとも１つの濾過領域を有することができる。図４は、例として、細胞濾過器に挿入されるフィルタフレームを示す。

本発明による細胞濾過器の上側及び下側の部分は、一体に形成するか又は別体として形成することができる（図５参照）。第１の場合には、細胞濾過器は一片から成る。細胞濾過器が、分離させることができる上側及び下側の部分を有する場合には、フィルタ領域を有する上側部分は、下側部分から分離され、第２の細胞濾過器に積み重ねられてよい。図７は、この実施の形態の積み重ねられた細胞濾過器を示す。

取り扱いやすくするために、特に細胞濾過器の使用者が手袋を着用している場合、細胞濾過器の上側部分には、流れの方向に又は流れの方向に対して垂直に向けられた溝の微細な波形を設けることができる。図８は、溝を具備した、下側部分から分離された細胞濾過器の上側部分を示す。

発明の別の実施の形態において、下側部分の第２の部分の受容部の外側壁部には、開口が設けられている。開口により、細胞濾過器の使用者は、据え付けられたより小さな管の充填レベルを観察することができる。さらに、下側部分の第２の部分の受容部の内側壁部が外側壁部よりも短いことが好ましい。両実施の形態は図６に示されている。

図９は、発明の以下の特徴の組み合わせを備えた、積み重ねられた細胞濾過器の側面図である：
−フィルタ領域の直径は第１及び第２の部分の直径よりも大きい。
−小さなフランジであって、フランジの間に広い通気領域を備える。
−上側部分に溝が設けられている。
−下側部分は、実質的に、上側部分に対して１０５〜１６５°の角度を成す円錐として成形されている。
−第２の部分の受容部は、標準的な１５ｍｌの管のネックを受容するように成形されている。
−細胞濾過器の上側及び下側の部分は別体である。
−下側部分の第２の部分の受容部の外側壁部には、第２の管における液体レベルを制御することを可能にするための開口が設けられている。
−下側部分の第２の部分の受容部の内側壁部は、外側壁部よりも短い。

図９は、発明をより理解するために、細胞濾過器における通常の使用における場合ではない２つの据え付けられた管を示している。図９に示された発明の全ての特徴が細胞濾過器において同時に実施される必要があるわけではないことに注意すべきである。

細胞濾過器は、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ガラス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、シリコーン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又は上述の材料のうちの１つ以上を含む組成物のような、様々な材料、好適にはプラスチックから製造されていてよい。

本発明による細胞濾過器は、１０〜５００μｍ、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は５００μｍのメッシュサイズを有するフィルタ領域を有してよい。フィルタは、ポリアミド（ＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ガラス、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、シリコーン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及び／又はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）のようなプラスチックから製造されてよい。

（図１〜３，５及び６に示したような）本発明による細胞濾過器及び従来技術（欧州特許第０５９３７６７号明細書、図４と同様のもの）の効率が比較された。両細胞濾過器は、５０ｍｌのFALCON管の上方数ｍｍのところでスタンドに固定され、これにより、濾液は、粘性の細胞懸濁液の場合に時々現れる流れ停止のリスクなしに管内へ落下する。gentleMACSディソシエータにおけるプログラムＢを用いた１０ｍｌＰＥＢにおけるマウス肝臓の分散によって、マウスの肝臓細胞懸濁液が生成された。細胞懸濁液は、９０ｍｌのＰＥＢで希釈された。９ｍｌの希釈された細胞懸濁液が各細胞濾過器に提供された。流過物が収集され、体積が測定された。

本発明による細胞濾過器は、３４６ｍｍ²の底部フィルタ面積を有していたのに対し、（図４に示したような）従来技術による細胞濾過器は、５９５ｍｍ²の側部フィルタ面積と、３４６ｍｍ²の底部フィルタ面積とを有していた（合計フィルタ面積：９４１ｍｍ²）。

よりよい比較のために、従来技術の細胞濾過器の側壁は、４分の１ずつシールされた。

効率的な細胞濾過器の場合、流過物体積はフィルタ面積に比例して増大することが予測される。以下の表から見て取れるように、従来技術による細胞濾過器のフィルタ面積は、本発明による細胞濾過器のフィルタ面積の１７２％を有するが、従来技術による細胞濾過器の流過物は、５５％しか増大させられていない。これは、底部フィルタ領域と比較して、側壁フィルタ領域のより低い濾過効率によって生ぜしめられる。

別の実験において、本発明によるフィルタ領域の３５％（４７５ｍｍ²）の増大が、従来技術の細胞濾過器（９４１ｍｍ²）よりも高い流過物体積を生じることが示された。

同じフィルタ面積において、本発明による細胞濾過器は従来技術の細胞濾過器よりも効率的である。ほとんどの濾過問題において、本発明による細胞濾過器の濾過能力は十分である。

さらに、本願の請求項に規定されたような形状により、本発明による細胞濾過器は、標準的な１５ｍｌ及び５０ｍｌの試験管に確実に配置することができるのに対し、従来技術の細胞濾過器は、標準的な５０ｍｌの試験管にしか嵌合しないか又は別個のスタンドを必要とする。

１ 管、 ２ 受容部、 ３ ふるい領域、 ４ 肩部若しくはフランジ、 ５ 容器体積、 ６ 上側部分、 ７ 下側部分、 ８ 管、 ９，１０ 内径、 １１ フランジ、 １２ 管

Claims (13)

1. 細胞懸濁液から粒子を分離するための細胞濾過器であって、懸濁液の流れの方向に対して垂直な少なくとも１つのフィルタ領域を備えた上側部分と、それぞれ異なる寸法の開口を備えた少なくとも２つの管の開口に嵌合するように適応された下側部分とを備える、細胞懸濁液から粒子を分離するための細胞濾過器において、前記下側部分が、第１の管の開口の直径を有する肩部若しくはフランジを有する第１の部分と、第２の管のネック用の受容部としての内側壁部及び外側壁部を有する少なくとも１つの第２の部分とを有し、前記第１の部分の直径は前記第２の部分の直径よりも大きいことを特徴とする、細胞懸濁液から粒子を分離するための細胞濾過器。
2. 前記フィルタ領域の直径は、前記第１の部分及び前記第２の部分の直径よりも大きい、請求項１記載の細胞濾過器。
3. 前記肩部若しくはフランジには、通気のための少なくとも１つの凹所が設けられている、請求項１又は２記載の細胞濾過器。
4. 前記上側部分が、円筒として成形されており、前記下側部分は、１０５〜１６５°の角度を成す円錐として成形されている、請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
5. 前記上側部分は、円筒として成形されており、前記下側部分は、それぞれ異なる外径を有する少なくとも２つの円錐形の部分を有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
6. 前記上側部分は、細胞懸濁液の流れの方向に対して垂直な少なくとも１つのフィルタ領域と、前記細胞懸濁液の流れの方向における少なくとも１つのフィルタ領域とを含む、請求項１から５までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
7. 前記第１の部分の前記肩部若しくはフランジの外径は、標準的な５０ｍｌの管の内径に等しい、請求項１から６までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
8. 前記第２の部分の前記受容部の前記内側壁部及び前記外側壁部は、標準的な１５ｍｌの管のネックを受容するように成形されている、請求項１から７までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
9. 前記上側部分は、細胞濾過器の積み重ねを可能にするために、前記上側部分の内径と等しい外径を有する第３の部分を有する、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
10. 前記上側部分及び前記下側部分は、一体に形成されている、請求項１から９までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
11. 前記上側部分及び前記下側部分は、別体である、請求項１から９までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
12. 前記下側部分の前記第２の部分の前記受容部の前記外側壁部には、開口が設けられている、請求項１から１１までのいずれか１項記載の細胞濾過器。
13. 前記下側部分の前記第２の部分の前記受容部の前記内側壁部は、前記第２の管への前記細胞濾過器の延びを最小限にするために、前記外側壁部よりも短い、請求項１から１２までのいずれか１項記載の細胞濾過器。