JP6218430B2 - デフレクタシールドを備えた遠心分離チャンバ - Google Patents

Description

本発明は、液体生物学的試料を少なくとも２つの成分又は部分に分離させるための遠心分離機用の高められたチャンバに関する。

血液又は骨髄のような懸濁液からの細胞の分別及び分離は、より医学的治療の一部になりつつある。このような治療のために、細胞は、患者から抽出され、次いで、所望の標的細胞を提供するために分離される。標的細胞は、通常、同じ又は異なる患者に導入される前に刺激される／操作される／拡張される。細胞の抽出、準備、分別、分離、操作及び導入は、標的細胞及び患者に課せられるストレスを減じるためにできるだけ迅速に行われるべきである。最善には、全プロセスは現場で患者に行われる。

遠心分離による細胞懸濁液の分別及び分離は、生物学的起源の試料を２つ以上の成分に分離するために技術分野において長く知られている。遠心分離システム、特に遠心分離チャンバは、分離される試料のタイプ、処理速度、分離の質又は処理される材料の量に対して最適化することができる。

遠心分離による血液などの懸濁液からの細胞の分離のために、分離プロセスを監視し、適切な入口／出口ポートを備えた遠心分離チャンバを提供することが有利である。これに関して、国際公開第２００９／０７２００６号及び国際公開第２００９／０７２００３号は、分離プロセスを制御するための手段と、遠心分離チャンバの回転軸に配置された少なくとも１つの入口及び出口ポートとを備えた、遠心分離システム及び遠心分離チャンバを開示している。国際公開第２００９／０７２００６号及び国際公開第２００９／０７２００３号の遠心分離機及びチャンバは、連続的な遠心分離を可能にする。この場合、試料、媒体、ガス及びその他の材料は、遠心分離プロセスを停止させたり、遠心分離機を再充填したりすることなく、例えば入口及び出口ポートを通じてシステムに出入りすることができる。

米国特許第５８３７１５０号明細書は、内側及び外側の側壁を有する装置を開示しており、血液を遠心分離によって複数の層に分離させることができる。血液及び分離された層は、側壁の開口を通じてチャンバに進入する及び／又はチャンバから出ることができ、前記開口は、方向遠心分離に対して配置されたシールドによってカバーされている。内側及び外側の側壁と、内側の側壁に設けられた開口とを備えた遠心分離チャンバは、製造するのが複雑である。内側の側壁における開口のシールドは、方向遠心分離に対して配置されているので、液体の取出し速度は低くなる。

米国特許第５８７９２８０号明細書は、チャンバからの除去のために排出された液体のプールを形成するためのバリアを備えた遠心分離チャンバに関する。液体のプールを形成することにより、既に分離された層の再混合を許容し、不十分な分離の質が生じる。さらに、バリアは、流れの方向遠心分離に対して配置されているので、チャンバからの液体の取出し速度が低くなる。

遠心分離によるあらゆる分離プロセスは、少なくとも、細胞懸濁液を遠心分離チャンバに提供するステップと、液体の密度に応じて液体を複数の層に分離するステップと、分離された層をチャンバからそれぞれ異なる容器へ排出するステップと、を含む。

分離ステップの質、すなわち、チャンバにおける層の純度は、遠心分離時間と、提供される重力（すなわちチャンバの回転速度）によって影響され得る。

遠心分離ステップの間の層の純度にかかわらず、特に排出の速度が高すぎると、層の排出の間に、分離された層が部分的に再び混合されることが観察された。排出速度を低下させると、隣接する層の再混合が減じられるが、望ましくないより長い処理時間を生ずる。

したがって、処理速度及び分離の質に関して遠心分離プロセスを改善する必要がある。

驚くべきことに、適切にサイズ決めされたデフレクタシールドを有する入口／出口ポートを備えた遠心分離チャンバを提供することによって、遠心分離プロセスを改良することができることが分かった。

国際公開第２００９／０７２００６号は、図２においてデフレクタシールドを備えた遠心分離チャンバを開示している。示されたデフレクタは、チャンバの円周の約１／３の幅を有する。このデフレクタの目的は説明されていないが、このサイズのデフレクタは、遠心分離の間の試料の層への分離を妨げる。国際公開第２００９／０７２００６号の図２Ａに示されたチャンバは、遠心力による試料の層への分離に適していない。

国際公開第２００９／０７２００６号 国際公開第２００９／０７２００３号 米国特許第５８３７１５０号明細書 米国特許第５８７９２８０号明細書

したがって、本発明の課題は、処理速度及び分離の質に関して遠心分離プロセスを改善することである。

発明の第１の目的は、試料を少なくとも２つの成分に分離するための遠心分離チャンバであって、ベースプレートとカバープレートとを有する円筒、及び試料の入口及び／又は出口のための少なくとも１つのポートを備えた回転軸を備え、ポートは、ベースプレート及び／又はカバープレート上に又はベースプレート及び／又はカバープレート内に配置された管に接続されており、管は、遠心分離チャンバ内への１つ以上の開口を有し、管の少なくとも１つの開口には、少なくとも１つの、平坦な形状のデフレクタが設けられており、デフレクタは、円筒に対して実質的に平行な面と、デフレクタの基部における、円筒の内周面の多くとも１／１０の幅とを有する、遠心分離チャンバを提供することである。

従来技術による標準的な遠心分離チャンバの断面図である。 本発明による遠心分離チャンバの断面図である。 それぞれの流れ線と、ポート及び管から排出されるチャンバの体積とを示す断面図である。 チャネルを閉鎖するためのキャップに取り付けられたデフレクタの斜視図である。 全ての開口／管がベースプレートに配置されておりかつ異なる入口／出口に接続されている、遠心分離チャンバの斜視断面図である。 全ての開口／管がベースプレートに配置されておりかつ同じ入口／出口に接続されている、遠心分離チャンバの斜視断面図である。 ベースプレート及び／又はカバープレートに通気孔が設けられた遠心分離チャンバの斜視断面図である。 試料の遠心分離が白血球層、赤血球層及び血漿層への試料の分離を生じたことを示す断面図である。 ポンプ速度に応じた、バッファを有する内側層の排出による細胞損失を示す表である。 試料の遠心分離が白血球層、赤血球／顆粒球層、及びフィコール及び血漿層への試料の分離を生じたことを示す断面図である。

本発明の遠心分離チャンバの概略的な説明
本発明によるチャンバは、円形のベースプレートと、円形のカバープレートとを有する。ベースプレートと、カバープレートとは両方とも、回転軸に対して実質的に垂直に向けられている。チャンバは、さらに、ベースプレート及びカバープレートに対して実質的に垂直に向けられた円筒又は壁部を有する。これにより、ベースプレートと、カバープレートと、円筒とを、水密及び気密形式で互いに接着又は溶接することができる。これにより、閉鎖された遠心分離チャンバが形成されている。遠心分離チャンバは、ポット状の底部と、蓋の形態の上側部分とから成る。

図１は、例えば国際公開第２００９／０７２００６号又は国際公開第２００９／０７２００３号に開示されたような、従来の標準的な遠心分離チャンバを示す。この遠心分離チャンバには、チャンバの軸において２つの入口／出口ポートが設けられており、これらの入口／出口ポートは、管を介してチャンバへの開口に接続されている。チャンバは、開口を遮蔽するデフレクタを有さない。

図２は、本発明による遠心分離チャンバを示す。このチャンバは、図１に示したチャンバと同様に、チャンバの軸において２つの入口／出口ポートを有する。これらの入口／出口ポートは、ベースプレート及びカバープレートに埋め込まれた管に接続されており、チャンバへの開口において終わっている。ベースプレート及びカバープレートの開口には、デフレクタが設けられており、このデフレクタは、チャンバの排出の際、液体の望ましくない再混合を減じる。

本発明による遠心分離チャンバは、２つ以上の成分への試料の物理的分離を高める及び／又は加速すること、又は、すなわち、試料を複数の異なる層に分別し、最終的に複数の異なる容器へ分別することに適している。試料は、好適には、血液、骨髄穿刺液、白血球試料、細胞、又は、細胞又は細胞成分を含む成分又は同様のものなどの、生物学的試料である。

本発明によるチャンバは、例えば、以下のプロセスにおいて使用することができる：
−試料の望ましくない部分又は層を少なくとも部分的に排出することによって試料の体積を減じる。
−試料を、異なる密度を有する層に分離し、層をチャンバから様々な容器へ除去し、例えば血液又は骨髄を様々な部分に分離する。
−分離された又は分離されていない細胞を、例えばバッファ媒体によって洗浄し、その後、洗浄された細胞を媒体から分離し、洗浄液を排出する。
−密度勾配標本を提供するためにフィコール又はパーコールのような添加物を添加することによって細胞を分離する。
−液体を除去することにより試料標本を濃縮する。
−遠心分離、磁気分離及び／又は免疫学的分離及び／又は蛍光流れ分離による分離の前の試料準備。
−分離又は洗浄ステップに続く又は分離又は洗浄ステップの後の細胞活性化、細胞増殖、細胞トランスフェクション、細胞染色などの細胞処理。

本発明によるチャンバは、特に以下のプロセスに適している：
−人間の血液から赤血球及び血漿を分離及び排出することによって白血球を隔離する。
−人間の血液から白血球を分離し、その後、細胞ラベリングすることにより、白血球のある部分母集団、例えば、以下の表面マーカＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ２５，ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３のうちの１つ以上を有する白血球を隔離する。
−人間の血液から赤血球及び血漿を排出した後、細胞媒体及び／又は密度勾配添加物を用いる１つ以上の洗浄ステップにより、白血球を準備する。
−再生薬、末梢動脈、肝臓病又は心臓幹細胞治療における使用のために人間の血液から以下の表面マーカＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ２５，ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３のうちの１つ以上を有する細胞を隔離、濃縮又は除去する。
−サイトカイン捕捉システム。

発明の詳細な説明
本発明による遠心分離チャンバは、好適には、図２に示したように、回転シール及び好適には２つの流体ライン又は入口／出口ポート１を備えた回転軸を有する。遠心分離チャンバは、さらに、円筒９によって接続されたカバープレート４と、ベースプレート５とを有する。カバープレート４及びベースプレート５の両方に、それぞれの入口／出口ポート１に接続された管２，３と、チャンバ内への開口６，７とが設けられている。開口６，７にはデフレクタ８，１０が設けられている。ベースプレート５のデフレクタ８は、管の開口７と、円筒９との間において、管３に配置されている。これにより、デフレクタ８は、開口７を、開口と円筒壁９との間の体積から遮蔽する。カバープレート４のデフレクタ１０は、管２の開口６と、円筒の回転軸との間に配置されている。デフレクタ１０は、開口６を、円筒９の内部体積から遮蔽する。

発明の第１の実施の形態において、少なくとも１つのデフレクタが、管の少なくとも１つの開口と円筒との間に配置されている。ここに配置されていることにより、このデフレクタは、開口を、開口と円筒との間の体積から遮蔽し、この体積の排出の間、チャンバの別の部分からの、すなわち開口とチャンバの円筒９との間の体積からの液体の望ましくない吸込みを防止する。この実施の形態は、図２に開口７及びデフレクタ８によって示されている。

第２の実施の形態において、少なくとも１つのデフレクタは、管の少なくとも１つの開口と、円筒の回転軸との間に配置されている。第１の実施の形態とは対照的に、このデフレクタは、開口を、開口と円筒壁部との間のチャンバの体積から遮断し、チャンバの内部体積の排出時にこの体積から液体を吸い込むことを防止する。この実施の形態は、図２に開口６及びデフレクタ１０によって示されている。

発明の第３の実施の形態において、チャンバは、発明の第１及び第２の実施の形態の両方の位置にデフレクタを有する。すなわち、少なくとも１つのデフレクタは、第１の管の少なくとも１つの開口と円筒との間及び第２の管の少なくとも１つの開口と円筒の回転軸との間とに配置されている。開口に対するデフレクタの位置及び／又は円筒までの距離は、同じであっても、異なっていてもよい。図２は、発明のこの実施の形態を示しており、図２における開口６，７及びデフレクタ８，１０を備える。

発明の第３の実施の形態において、チャンバの２つの開口は、チャンバの２つの異なる体積に接続されている若しくはチャンバの２つの異なる体積へのアクセスを提供しており、チャンバに提供された液体を排出するために使用することができる。図３は、ポート及び管から排出されるそれぞれの流れ線及びチャンバの体積を示している。回転軸における下側のポートは、外側の体積若しくは層Ｏを排出するのに対し、回転軸における上側のポートは、内側の体積Ｉに接続されている。本発明のデフレクタの遮蔽効果により、排出中の層の再混合が減じられ、層を排出することにより得られる部分のより高い純度及び／又はより高い排出速度の実現を生じる。

好適には、デフレクタは管に配置されている。本発明による遠心分離チャンバは、デフレクタを備えた開口を有する１〜８、１０又は１２本の管、好適には、それぞれデフレクタを備えた開口を有する２〜４本の管を備えてよい。管／開口を、全てベースプレートに配置するか、全てカバープレートに配置するか又はベースプレート及びカバープレートに配置することができる。３つ以上の管／開口が用いられる場合には、管／開口がベースプレートに配置されるか、カバープレートに配置されるかにかかわらず、管／開口を対称的に分配することが好ましい。例えば、全部で４つの管を備えたチャンバは、ベースプレートに２つの管／開口を、カバープレートに２つの管／開口を、交差するような形で（９０°の角度を成して）有してよい。

開口は、穴又はライン入口として成形することができ、遠心分離チャンバにおける開口の位置は、開口が、特定の試料の分離のために又はチャンバ内への又はチャンバからの特定の流体の排出のために最も適しているように構成することができる。特定の試料の複数の成分及び試料における各成分の相対的な体積に応じて、開口を、特定の層の最速の除去及び／又は検出が達せられるように位置決めすることができる。さらに、開口の寸法は、例えば標的細胞の寸法及び／又は最適な体積流量を考慮して、所望の層のために最適化することができる。

本発明において利用されるデフレクタは、プレートのような平坦な形状であり、デフレクタの表面は、円筒に対して実質的に平行である。すなわち、デフレクタは、実質的に円筒と同じ曲率半径で湾曲させられている。デフレクタの形状は、矩形、三角形、半円形又は楕円形であってよい。好適な実施の形態において、デフレクタは、遠心分離の間細胞に加えられるせん断力を小さくするために、管の開口に配置された広い基部と、より小さな先端領域とを有する。デフレクタのエッジは、これらのエッジにおける細胞膜の切断又は裂断による細胞損失を回避するように面取りされているべきである。最も好ましくは、デフレクタは、半円形又は半楕円形である。図４は、例として、チャネルを閉鎖するためのキャップに取り付けられたこのようなデフレクタを示している。

デフレクタの寸法は、望ましくない体積流量、例えば回転軸寄りに配置されたチャンバの部分の排出が望まれる場合に、チャンバの外側へ向かう方向でみて開口の背後に配置されたチャンバの部分から排出される体積を減じるのに十分であるべきである。

デフレクタの寸法は、チャンバの体積に依存する。すなわち、遮蔽される体積が大きくなるほど、デフレクタ及び意図される排出速度は大きくなるべきである。デフレクタの形状にかかわらず、デフレクタは、基部において（管の開口において）円筒の内周の１／１０〜１／６０、好適には１／２５〜１／４０の幅を有するべきである。例えば、１０ｃｍの内径を有する円筒には、基部における（管の開口における）１〜２ｃｍの幅を有するデフレクタが設けられる。

デフレクタの高さは、好適には、基部における幅と同じであるか又は基部における幅よりも小さく、例えば基部における幅の５０〜９５％である。デフレクタは、細胞を損傷又は切断する恐れのある鋭いエッジを有することなく機械的にできるだけ薄くなっているべきである。好適には、デフレクタの厚さは０．５ｍｍ〜２ｍｍである。

デフレクタの（１つの）面の寸法は、幅及び高さにおける任意の範囲から計算又は評価することができるが、通常は０．１ｃｍ²〜１０ｃｍ²である。あらゆる場合に、デフレクタの寸法は、試料が層に分離することを妨げるべきでなく、分離された層からの液体の望ましくない流れを減じるべきである。

本発明のチャンバは、同じ又は異なる寸法及び／又は高さ及び／又は幅を有する複数のデフレクタを有してよい。

図２及び図３は、チャンバのベース及びカバーに配置された管若しくはチャネルを備えたチャンバを側面図を示しており、各管にはデフレクタが設けられている。この場合、ベースプレートにおける開口及びデフレクタは、チャンバの壁部から２〜２０ｍｍに配置されており、カバープレートにおける開口及びデフレクタは、チャンバの壁部から０．１〜１０ｍｍに配置されている。開口及びデフレクタの位置は、遠心分離の間に液体で満たされるチャンバの残留体積を規定する。

開口及びデフレクタの位置を調節することによって、すなわち円筒に対する開口及びデフレクタの距離を調節することによって、この残留体積は、所望の分離プロセスの必要性に合わせて調節することができる。例えば、小さな残留体積が望まれる場合には、開口及びデフレクタは、より円筒寄りに配置されるべきであり、大きな残留体積が望まれる場合には、開口及びデフレクタは、円筒からより遠くに配置されるべきである。チャンバが、デフレクタを備えた２つ以上の開口を有する場合には、円筒からの開口の距離は同じであっても、異なってもよい。

開口及びデフレクタは、分離プロセスの必要性に応じてベースプレート及び／又はカバープレートに設けることができる。発明の別の実施の形態において、チャンバには、２つの異なるポートに通じる２つの異なる管において、円筒から異なる距離を有する２つの開口が設けられており、各開口にデフレクタが設けられている。全ての開口／管がベースプレートに配置されておりかつ異なる入口／出口に接続されている例が、図５に示されている。

発明のさらに別の実施の形態において、チャンバには、同じポートに通じる２つの異なる管において、円筒から同じ距離を有する２つの開口が設けられており、各開口にデフレクタが設けられている。全ての開口／管がベースプレートに配置されておりかつ同じ入口／出口ポートに接続されている例が、図６に示されている。

チャンバは、これらの組み合わされた管の１つ以上を有してよく、例えば、ベースプレートの２つの管／開口が第１のポートに接続されてよく、カバープレートの２つの管／開口が第２のポートに接続されてよく、ベース及びカバープレートの管は、互いに９０°の角度を形成している。組み合わされた管の利点は、チャンバからの液体のより高い排出速度を達成することができるということである。

キャップによってカバーされたベースプレート及び／又はカバープレートにおけるチャネルを提供することにより、ベースプレート及び／又はカバープレートに管を埋め込むことができる。この場合、デフレクタは、好適には、製造中にキャップに取り付けられる。図４は、例として、デフレクタ８，１０を備えたこのようなキャップを示している。キャップは、例えば適切な接着又はＨＦ溶接によって、水密形式でチャネルに挿入することができる。図４に示されたキャップはさらに、出口／入口ポートのための管を有するチャンバのための回転軸（Ａ）を提供する。

発明の択一的な態様において、管は、キャップによってカバーされたチャネルではなく、プレートの外側から回転軸まで達する、ベースプレート及び／又はカバープレートにおけるボアである。発明のこの実施の形態は図５に示されている。ボア１，２は、製造中にチャンバの外部へ開放しており、例えばプラグ３によって、水密及び気密形式で閉鎖される必要がある。

チャンバは、２ｃｍ〜２０ｃｍ、好適には８〜１５ｃｍの内径と、５ｍｍ〜１０ｃｍ、好適には２ｃｍ〜７ｃｍの内側高さとを有してよい。チャンバの総体積は、１０ｃｍ³〜２０００ｃｍ³、好適には２００ｃｍ³〜１０００ｃｍ³であることができる。

遠心分離は、好適には、１０〜２０００ｘｇ、好適には１００〜５００ｘｇで行われる。好適な実施の形態において、遠心分離される試料に適した温度を提供するようにチャンバを加熱及び冷却することができる。この目的のために、チャンバに又はチャンバを包囲して、加熱及び／又は冷却手段を配置することができる。

チャンバは、円形のベースプレートと、円形のカバープレートと、水密及び気密形式で接着又は溶接された円筒とから製造されているので、任意のチャンバの体積は、同じ内径を有するカバープレート／ベースプレートを備えたより高い円筒を使用することによって拡大することができる。拡大した体積を備えるチャンバには、より大きな体積の試料を充填することができ、これにより、より大きな質量を運動させ、円筒壁部に作用するより大きな力を生じる。特に遠心分離の高い荷重及び高い速度とともに使用される場合に、チャンバの十分な機械的安定性を提供するために、円筒の外側に１つ以上のフィンを提供することが有利である。外側にこのようなフィンを備えたチャンバは、図５、図６及び図７に示されている。

発明の別の実施の形態において、チャンバには、ベースプレート及び／又はカバープレートにおいて通気孔が設けられており、通気孔は、回転軸における通気管を介してチャンバの内部体積に接続されている。通気管は、好適には、デフレクタが設けられた開口と、回転軸の入口／出口ポートとを接続する線に対して垂直である。図７は、例えばこの実施の形態を示している。この場合、開口１は管２を介してポート３に接続されている。回転軸における通気孔４は、ベースプレートにおけるオリフィス５への管６を介して、チャンバの外部雰囲気へ開放している。チャンバの通気及び／又はガス抜きは、駆動システム（図示せず）を介する遠心分離の間でさえもベースプレートにおけるオリフィスによって行うことができる。

本発明のチャンバは、円筒と、ベースプレートと、カバープレートとから成る。円筒と、ベースプレートと、カバープレートとは、製造を単純にしかつ遠心分離プロセス中のあらゆる不均衡を減じるために、丸い又は円形の物体であることができる。別の実施の形態において、少なくとも円筒は僅かに楕円形に成形されていてよく、この場合、第１の寸法における直径は、第１の寸法に対して垂直に向けられた第２の寸法における直径よりも０．５〜１０％、好適には０．５〜５％大きい。例えば、円筒は、第１の寸法において１２０ｍｍの直径を有してよく、第１の寸法に対して垂直に向けられた第２の寸法において、１２２ｍｍの直径を有してよい。

ベース及びカバーは、同じ楕円形を有してよいか、又は丸い／円形の物体であることができる。デフレクタを備えた開口を有する管は、楕円形の円筒のより大きな寸法に向けられていることが好ましい。この場合、細胞は、遠心力によって、円筒壁に沿って、円筒のより大きな寸法の方向に、すなわち開口の近くに移動させられる。

チャンバ及びキャップ及び／又はデフレクタは、セラミック、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ガラス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）及び／又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及び／又は熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、シリコーン、又は上記材料のうちの１つ以上を含む組成物のような、様々な材料から形成されてよい。さらに、チャンバは、コラーゲン、キチン、アルギン酸塩、及び／又はヒアルロン酸誘導体、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、及びそれらのコポリマのような生分解性材料、を含んでよい又はから形成されてよい。

別の実施の形態において、本発明によるチャンバは、チャンバのベースプレート又はカバープレートに位置決めされた、試料分離の進行を制御するための手段を有する。試料分離の進行を制御するための手段は、好適には、チャンバのベースプレート又はカバープレートに配置されたチャネル又はギャップに位置決めされており、これにより、遠心分離の間に試料はチャネル又はギャップに進入することができ、これにより、検出可能になる。遠心力により、試料の様々な成分は層を形成し、これらの層は、例えばカメラ又は光検出器を用いて、光によって検出可能である。これにより、信号が発生され、信号は、層形成又は試料分離がいつ完了したかを決定することを可能にする。試料分離の進行を制御するための適切な手段は、引用したことにより本明細書に組み入れられる国際公開第２００９／０７２００６号又は国際公開第２００９／０７２００３号に開示されている。

別の実施の形態において、チャンバは、細胞の培養のための容器として働くことができる又は細胞の培養のための容器を収容することができるように構成されている。これにより、遠心分離チャンバは、細胞分離プロセス、細胞培養目的、及び遠心分離チャンバにおいて成長した細胞のさらなる処理のために利用することができる。チャンバは、細胞の成長、細胞又は様々な種類の細胞を分離、洗浄、濃縮すること、又はその他のような、広範囲の細胞培養方法が行われることを可能にする。この目的のために、チャンバは、例えばガス、細胞培養媒体又は同様のもののための別の入口／出口開口を有してよい。細胞培養条件は技術分野において公知である。

別の実施の形態において、本発明の遠心分離は、引用により本明細書に組み入れられる国際公開第２００９／０７２００６号、国際公開第２００９／０７２００３号又は欧州特許第０８６９８３８号明細書から公知のような試料処理システムの一部であることができる。試料処理ユニットは、遠心分離チャンバの入口／出口ポートに接続されることができ、分離コラムホルダ、ポンプ、分離プロセス中の液体の（中間）貯蔵のための複数の容器、及び流体回路とホルダに位置決めされた分離コラムとを通る流体流を少なくとも部分的に制御するように構成された複数の弁を含んでよい。

人間骨髄穿刺液からの白血球の濃縮は、ＣＤ１３３＋造血幹細胞及び前駆細胞を隔離するために研究された。このような細胞は、心筋幹細胞治療のような幹細胞治療のために使用され、細胞はまず患者の骨髄から隔離され、次いで同じ患者の心筋に導入される。心筋への細胞の導入は、患者の麻酔中に行われるので、細胞の隔離は、少ない細胞損失でできるだけ迅速に行われる必要がある。濃縮されたＣＤ１３３＋細胞のための付加的な用途は、再生医学、末梢動脈、及び肝臓病の分野におけるものである。

全血の遠心分離が、本発明による遠心分離チャンバにおいて、図１に示された遠心分離チャンバにおける比較のために行われた。各チャンバは、国際公開第２００９／０７２００６号に開示された分離システムにおいて構成され、人間の血液を白血球、赤血球及び血漿を含む部分に分離するために使用された。分離の進行は、遠心分離チャンバの上方に据え付けられたカメラユニットによって監視された。

遠心分離チャンバ
実施例において使用された本発明によるチャンバは、図２に示されており、約１２ｃｍの内径と、約３．５ｃｍの内側高さとを有していた。上部チャネルの開口は、チャンバの周縁部に、外壁に隣接して（壁部まで０．５ｍｍの距離に）配置されている。下部チャネルの開口は、外壁まで約６ｍｍの距離に配置され、約７０ｍｌの、下部チャネルの開口と外壁との間の総体積を提供する。チャンバの両開口には、約１．５ｃｍの、基部における（開口における）幅と、約１ｃｍの高さとを有する半円形のデフレクタが設けられていた。両デフレクタは、円筒の曲率半径に従って僅かに湾曲させられ、同じ寸法及び形状を有していた。

本発明によらないチャンバ（標準的な遠心分離チャンバ）は、上記のように同じ寸法、ポート、チャネル及び開口を有していた。例えば図１に示したように又は国際公開第２００９／０７２００６号に開示されたようにデフレクタは設けられていない。

１．細胞分離プロセスの例
２５０ｍｌの血液がチャンバに導入され、約１５分間４００ｘｇ（約２５００ｒｐｍ）の遠心力に曝された。図８に概略的に示したように、試料の遠心分離は、試料を、白血球（ｌ）、赤血球（ｅ）及び血漿（ｐ）を含む層に分離した。遠心分離の間、層をチャンバにおけるリングとして観察することができ、外側のリングは赤血球部分から成る。白血球（ＣＤ１３３＋細胞を含む）は、赤血球層に隣接した薄い白色のリングを形成する。内側のリングは、黄色に着色された血漿成分から成る。

赤血球を含む外側層（ｅ）は、上部チャネルを通じてチャンバから部分的に取り出された。層（ｅ）は、白血球を含む層（ｌ）が下部チャネルの開口とチャンバ壁部との間の位置に到達するまで取り出された。次いで、黄色に着色された血漿成分を含む層（ｐ）は、下部チャネルを通じて容器内へ取り出された。チャンバを空にした後、白血球を含む層（ｌ）は、標準的なバッファによって複数回洗浄された。この目的のために、バッファは入口ポートを通じてチャンバに付加され、遠心力は層を分離し始める。次いで、バッファを含む内側層は、白血球を含む層（ｌ）の体積が７０ｍｌに減じられるまで取り出され、次いで、プロセスは反復される（排出ステップ）。

結果
図９は、ポンプ速度に応じて、バッファを含む内側層の排出（排出ステップ）による細胞損失を示す表である。人為結果を排除するために各ポンプ速度について同じ試料を用いた３つの実験が行われた。細胞濃度は、自動化された血液学分析器（例えばSysmex KX-21N）を用いて決定された。標準的な遠心分離チャンバを用いる場合、許容可能な細胞損失は、極めて低いポンプ速度によってしか得ることができない（左側欄）。このような低いポンプ速度は、医学治療目的のための細胞分離のためには許容できない。

（左側から）第２及び第３の欄から見て取れるように、より高いポンプ速度は、本発明によるチャンバの場合に僅かにより高い細胞損失を生じる（１％未満）が、標準的なチャンバの場合は５％の細胞損失を生じる。医学治療のためには、２．５％よりも高い細胞損失は許容できない。

右側から第１及び第２の欄は、本発明によるチャンバにおいて高いポンプ速度により得られた細胞損失を示している。本発明による遠心分離チャンバは、ポンプ速度を４倍に高めることができ、これは、（左側から第１及び第４の欄と比較して）同じ細胞損失を有する標準的なチャンバと比較して、著しくより速い処理時間を生じる。

言い換えれば、本発明によるデフレクタを備える遠心分離チャンバは、より少ない目標細胞の損失とともに、より高いポンプ速度を可能にする。

２．細胞洗浄プロセスの例
実施例１に説明されたような本発明によるチャンバと、上記のような同じ寸法、ポート、チャネル及び開口を有するが、デフレクタを有さない、本発明によらないチャンバ（標準的な遠心分離チャンバ）とにおいて、細胞洗浄が行われた。

この実施例において、本発明によるチャンバは、密度勾配遠心法のために使用された。１００ｍｌの血液と１００ｍｌのフィコールとがチャンバに導入され、２つの層を生じ（図１０の上側の図に概略的に示されている）、約１５分間４００ｘｇ（約２５００ｒｐｍ）の遠心力に曝された。試料の遠心分離は、試料を、白血球（ｌ）、赤血球／顆粒球（ｅ）、フィコール（Ｆ）及び血漿（ｐ）を含む層に分離した（図１０の下側の図に概略的に示されている）。チャンバにおいて、層はリングとして観察され、外側のリングは赤血球／顆粒球から成り、（チャンバの軸線に向かう方向で）フィコール層が続く。次いで、白血球を含む薄い白色のリングが観察される。内側のリングは、黄色に着色された血漿部分から成る。

赤血球及びフィコール層（Ｆ）を含む（外側）層は、上部チャネルを通じてチャンバから部分的に取り出された。白血球を含む層が下部チャネルの開口の位置に到達するまで、層は取り出された。次いで、白血球を含む層は、下部チャネルを通じて再作用容器内へ取り出された。チャンバを空にした後、白血球を含む層は再びチャンバに導入され、標準的なバッファを用いて複数回洗浄された。この目的のために、バッファは入口ポートを通じてチャンバに付加され、遠心分離は層を分離し始める。次いで、白血球を含む層（外側）の体積が７０ｍｌに減じられるまで、バッファを含む内側層は取り出される。プロセスを複数回繰り返すことができる。

本発明によるチャンバにおける洗浄プロセスは、洗浄液のより速い排出速度により、標準的なチャンバにおけるよりも、同じ純度及び細胞損失で約４倍速くなる。

１ 入口／出口ポート、 ２，３ 管、 ４ カバープレート、 ５ ベースプレート、 ６，７ 開口、 ８，１０ デフレクタ、 ９ 円筒

Claims (12)

1. 試料を少なくとも２つの成分に分離するための遠心分離チャンバであって、ベースプレートとカバープレートとを有する円筒と、試料の入口及び出口のための少なくとも１つのポートを備えた回転軸とを備え、前記ポートは、前記ベースプレート及び／又は前記カバープレート上に又は前記ベースプレート及び／又は前記カバープレート内に配置された管に接続されており、該管は、前記遠心分離チャンバ内への１つ以上の開口を有する、遠心分離チャンバにおいて、前記管の少なくとも１つの開口には、該開口に半径方向で隣接して少なくとも１つの平坦な形状のデフレクタが設けられており、該デフレクタは、前記円筒に対して実質的に平行な面と、前記円筒の内周の多くとも１／１０の幅をその基部において有しており、前記管の少なくとも１つの開口と前記円筒との間に少なくとも１つのデフレクタが配置されていることを特徴とする、試料を少なくとも２つの成分に分離するための遠心分離チャンバ。
2. 前記管の少なくとも１つの開口と前記円筒の回転軸との間に少なくとも１つの第１のデフレクタが配置されており、前記管の少なくとも１つの開口と円筒との間に少なくとも１つの第２のデフレクタが配置されている、請求項１記載の遠心分離チャンバ。
3. 前記デフレクタは、その基部における幅よりも小さな高さを有する、請求項１又は２記載の遠心分離チャンバ。
4. キャップによってカバーされた、前記ベースプレート及び／又は前記カバープレートにおけるチャネルを提供することによって、前記ベースプレート及び／又は前記カバープレートに前記管が配置されている、請求項１から３までのいずれか１項記載の遠心分離チャンバ。
5. 前記デフレクタは、前記キャップに取り付けられている、請求項４記載の遠心分離チャンバ。
6. 前記開口は、前記キャップに設けられている、請求項５記載の遠心分離チャンバ。
7. 前記管は、プレートの外側から回転軸にまで達する、前記ベースプレート及び／又は前記カバープレートにおけるボアにより形成されている、請求項１から３までのいずれか１項記載の遠心分離チャンバ。
8. 前記円筒には、外面において１つ以上のフィンが設けられている、請求項１から７までのいずれか１項記載の遠心分離チャンバ。
9. 前記チャンバには、前記ベースプレート及び／又はカバープレートにおいて通気孔が設けられており、該通気孔は、回転軸における通気管を通じてチャンバの内部体積に接続されている、請求項１から８までのいずれか１項記載の遠心分離チャンバ。
10. 前記ベースプレート及び／又は前記カバープレートには、試料分離の進行を制御するための手段が設けられている、請求項１から９までのいずれか１項記載の遠心分離チャンバ。
11. 前記円筒は、楕円形を有し、第１の寸法における直径が、該第１の寸法に対して垂直に向けられた第２の寸法におけるよりも０．５〜１０％大きい、請求項１から１０までのいずれか１項記載の遠心分離チャンバ。
12. 前記デフレクタを備えた開口を有する管が、前記楕円形の円筒の前記第１の寸法における直径の方向に向けられている、請求項１１記載の遠心分離チャンバ。