JP6129360B2 - 肝細胞への改良された幹細胞分化のための化合物 - Google Patents

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Description

本発明は、幹細胞を、更に成人型の肝細胞に分化するための化合物、その製造、及びそれを含有する医薬組成物に関する。
薬物の発見及び開発中に、肝機能をモデル化するための強固なｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に対する非常に大きい必要性が存在する。初代ヒト肝細胞培養物を使用する現時点の方法は、文書で十分に裏付けされた欠点、即ち、ドナー間の変動性及び機能的不安定性を有している。同様に、肝細胞腫株は、機能不全を示し、そして腫瘍細胞株に固有の混乱した遺伝子異常を経験する。
多能性幹細胞由来の組織は、ドナー間の変動性の問題に対処する見込みがあり、従って人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の肝細胞を試験した更に多くの報告は、これらが、ある種の機能において、成人より胎児組織に更に類似していることを示しているが、これは、成人のｉｎ ｖｉｖｏの状況への外挿を困難にすることができる。従って、多能性幹細胞を、薬物の発見、有効性及び安全な試験のために、更に関連性のあるモデルを産生するための、更に成熟した又は成人型肝細胞に分化するより良い方法に対する必要性が存在する。
ｈＩＰＳＣの成人型肝細胞への好結果な分化は、慢性の肝疾患、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療に対する薬物発見の努力を容易にするものである。慢性のＨＢＶ（ＣＨＢ）感染は、全世界で約３億５千万人に影響している巨大な未対処の医学的必要性である。現時点の治療法−ヌクレオシ（チ）ド阻害剤及びインターフェロン（ＩＦＮ）−は、ウイルスを排除することに対して無力であり、そしてウイルスの耐性及び／又は不都合な副作用に関係する。そのウイルスゲノムの配列の変動性に基づいて、ＨＢＶは、７種の遺伝子型（遺伝子型Ａ−Ｈ；Ａ−Ｄが主要な遺伝子型）に分類される。ＨＢＶ感染の結果の疾病は、年齢及び遺伝子型依存性である。従って、殆どのＣＨＢ感染は、垂直（母子）感染及び／又は幼児期感染の結果である。対照的に、ウイルスに暴露された成人の約９０％は、６ヶ月以内にＨＢＶ感染を排除することが可能である。更に、各種の臨床データは、ウイルスの遺伝子型がＨＢＶ疾患の進行及びＩＦＮ治療に対する反応に影響することを示している。ＨＢＶは、更にインターフェロン活性化遺伝子（ＩＳＧ）の下方制御を含む各種の機構による宿主の免疫反応を逃れることが知られている。ＨＢＶ及び宿主の先天免疫間の複雑な相互作用のより良好な理解は、ＣＨＢ感染の治療のための新しい宿主／ウイルス標的に導くことができる。然しながら、ＨＢＶに対する新規な更に有効な抗ウイルス剤を発見するための努力は、生理学的な、そして強固なｉｎ ｖｉｔｒｏの系の欠如によって妨げられている。産生株及び標的細胞の両方として使用される現時点の肝細胞腫ベースの系は、強固でもなく、ＨＢＶの遺伝子型の多様性を捕獲するものでもない。従って、より生理学的に関連し、そして好ましくは臨床的分離菌からの全ての主要なＨＢＶ遺伝子型の強固な感染を支援する新しいｉｎ ｖｉｔｒｏの系が高度に所望されるものである。このような系は、薬物のスクリーニングのプラットフォームとしてだけでなく、更にインターフェロン反応の遺伝子型依存性の評価を含むＨＢＶ疾患のモデル化のためにも有益であるものである。
従って、幹細胞由来の肝細胞の、各種の遺伝子型からの患者由来のＨＢＶの強固な感染を支援する、薬物のスクリーニングのプラットフォーム及び疾病のモデル化として使用するための、より成熟した肝細胞への改良された分化に対する必要性が存在する。
本発明は、以下の式Ｉ：
の化合物、並びにその医薬的に受容可能な塩及びエステルに関し、ここにおいて、Ｒ１−Ｒ１１は、本明細書中で以下に定義されるとおりである。更に本発明は、式Ｉの化合物を製造及び使用する方法、並びにこのような化合物を含有する医薬組成物に関する。式Ｉの化合物は、幹細胞を、薬物のスクリーニングのプラットフォーム及び疾病のモデル化プラットフォームとして使用するための、より成熟した又は成人型肝細胞に分化することにおいて有用である。
図１は、実施例１の化合物を使用する多剤投与において幹細胞機能を展開する遺伝子の全体的な増加した発現を示すヒートマップを提供する。生物学のヒートマップは、これらが、ｃＤＮＡ試料から得られるような多くの匹敵する試料（例えば、異なった状態の試料、異なった患者からの試料）中の多くの遺伝子の発現のレベルを表すために、分子生物学において典型的に使用される。図１において、‘緑色’は低い発現を示し、一方‘赤色’は高い発現を示す。グラフの表示は、それぞれの列中のデータに対して相対的であり、最低の発現（緑色）から中間（黒色）、そして最高の発現（赤色）への勾配をつくる。 図２は、実施例１−７の化合物による処理後の、一連の成熟関連遺伝子の遺伝子発現に基づく誘導された多能性幹細胞由来の肝細胞において肝細胞機能を展開する遺伝子の増加した発現を示す。 図３Ａ及び３Ｂは、ｉＣｅｌｌの肝細胞における強固なＨＢＶ感染を示す。図３Ａは、実施例１の化合物による誘導された多能性幹細胞由来の肝細胞の治療が、用量依存性様式で起こるＨＢＶ感染に対する細胞の感受性に導くことを示す棒グラフである。 図３Ｂは、ウイルス感染が、インターフェロン（１００ＩＵ／ｍｌ）によって阻害されることを示す棒グラフである。 図４Ａないし４Ｄは、ｉＣｅｌｌの肝細胞における全遺伝子型のＨＢＶ感染を示し、そしてこれらは、実施例１の化合物により処理された誘導された多能性幹細胞由来の肝細胞が、全ての四つの主要なＨＢＶ遺伝子型（Ａ−Ｄ）の強固な感染を支援することが可能であることを反映する一連の棒グラフである。実施例１の化合物の継続した存在が、強固なウイルス感染を維持するために必要である。細胞は、ＨＢＶ感染の前６日間、実施例１の化合物で前処理されたか（６日）、又は６日間及び感染中（全期間）前処理されたかのいずれかであった。インターフェロン（ＩＦＮ）は、ＨＢＶ感染の特異性を示すために使用した。 図４−１の説明と同じ。 図４−１の説明と同じ。 図４−１の説明と同じ。 図５は、実施例１の化合物により処理された誘導された多能性幹細胞由来の肝細胞が、患者の血清から単離されたＨＢＶ（臨床分離株）の感染を支援し、そして細胞培養物由来ウイルス（ＨｅｐＧ２．２．１５）からのものを支援しないことを示す棒グラフである。実施例１の化合物で処理されたｉＣｅｌｌの肝細胞は、患者由来の感染を支援したが、細胞培養物由来のＨＢＶは支援しない。 図６Ａ−Iないし６Ａ−ＩＶは、血清対精製ウイルスのＨＢＶ感染力に関し、そしてこれは、血清中に存在する過剰のＨＢｓＡｇサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の除去が、実施例１の化合物で処理された誘導された多能性幹細胞由来の肝細胞における強固なＨＢＶ感染を達成するために必須であることを示す一連の棒グラフである。細胞は、ＨＢＶ感染の前６日間、実施例１の化合物で前処理された（６日）。 図６−１の説明と同じ。 図６−１の説明と同じ。 図６−１の説明と同じ。 図６Ｂ−Ｉ及び６Ｂ−ＩＩは、過剰のＨＢｓＡｇサブウイルス粒子（ＳＶＰ）からのＨＢＶウイルス粒子の精製に関し、そして精製されたウイルス（デーン粒子）が、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配超遠心によってＨＢｓＡｇのＳＶＰから分離されたことを示す。ウイルスの精製が好結果であることを確認するために、ウイルスマーカー（ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶのＤＮＡ）及び電子顕微鏡分析を使用した。 図６−５の説明と同じ。 図７ａは、実施例１の化合物で処理された誘導された多能性幹細胞由来の肝細胞のマイクロアレイ分析である（ヒートマップ）。処理後、＞２倍（２時間）、＞３倍（２４時間）、又は＞６倍（７日）上方及び下方制御された遺伝子を示す。実施例１の化合物は、インターフェロン活性化遺伝子（ＩＳＧ）を２時間程度で下方制御した。更にＨＢＶ感染に対するｉＣｅｌｌの肝細胞の感受性においても役割を演じることができた二つの遺伝子（非ＩＳＧ）を示す：ＣＲＥＢ３Ｌ１（処理後２時間程度で下方制御）は、他のウイルス（ＨＣＶ、ＷＮＶ、及びＤＮＡウイルス）よって感染された細胞の増殖を阻害することが示され、そしてＳＬＣ１０Ａ１（処理後７日で上方制御）は、ＨＢＶ受容体として報告されている。 図７ｂは、インターフェロン活性化遺伝子（ＩＳＧ）に対する実施例１の化合物の影響に関し、そして誘導された多能性幹細胞誘導の肝細胞におけるＩＳＧ発現に対する実施例１の化合物の動力学的影響を示す円グラフを提供する。９７５個のインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）のリストは、公開データのデータベース中の既知のＩＳＧに基づく（表１を参照されたい）。 図７ｃは、ＩＳＧ発現（９７５個の遺伝子）に対する実施例１の化合物の影響に関し、そして化合物処理後、２４時間及び７日目において実施例１の化合物によって調節されたＩＳＧの例を示す円グラフを提供する。９７５個のインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）のリストは、公開データのデータベース中の既知のＩＳＧに基づく（表１を参照されたい）。
表１は、処理後２時間（2 HOUR）、２４時間（24 HOUR）、及び７日目（DAY 7）におけるＩＳＧに対する実施例１の化合物の動力学的影響を示す（ｐ値＜０．０５）。
Gene_Symbol：遺伝子記号
Raw Est Fold Change：補正前推定倍数変化
Unadjusted p-value：未補正p-値
表１
他に示さない限り、本記載及び特許請求の範囲において使用される以下の特定の用語及び語句は、以下のように定義される：
用語“部分”は、一つの原子、或いは一つ又はそれより多い化学結合によってもう一つの原子又は分子に接続し、これによって分子の一部を形成する化学的に結合した原子の群を指す。例えば、式Ｉの可変基Ｒ１−Ｒ１１は、共有結合によって式Ｉの核構造に接続された部分を指す。
一つ又はそれより多い水素原子を持つ特別な部分に対する言及において、用語“置換された”は、この部分の少なくとも一つの水素原子が、もう一つの置換基又は部分によって置換されているという事実を指す。
用語“所望により置換された”は、部分（一つ又はそれより多い水素原子を持つ）の一つ又はそれより多い水素原子を、もう一つの置換基で置換することができるが、しかし必ずしもそうであることはないという事実を指す。
用語“ハロゲン”は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードの部分を指す。
他に示さない限り、用語“水素”又は“ヒドロ”は、水素原子（−Ｈ）の部分を指し、そしてＨ２ではない。
用語ｉＣｅｌｌの肝細胞は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）からの誘導された多能性幹細胞由来の肝細胞を指す。
他に示さない限り、用語“その式の一つの化合物”又は“式の一つの化合物”又は“その式の化合物類”又は“式の化合物類”は、その式によって定義されるとおりの化合物の属から選択されるいずれもの化合物を指す（いずれものこのような化合物のいずれもの医薬的に受容可能な塩又はエステルを含む）。
用語“医薬的に受容可能な塩”は、生物学的に又は他の様式で望ましい遊離塩基又は遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等、好ましくは塩酸、及び有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、Ｎ−アセチルシステイン等と共に形成することができる。更に、塩は、有機酸への無機塩基又は有機塩基の添加によって調製することができる。無機塩基から誘導される塩は、制約されるものではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム塩等を含む。有機塩基から誘導される塩は、制約されるものではないが、第一、第二、及び第三アミン、天然に存在する置換されたアミンを含む置換されたアミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩を含む。
本発明の化合物は、医薬的に受容可能な塩の形態で存在することができる。本発明の化合物は、更に医薬的に受容可能なエステルの形態で存在することもできる（即ち、式Ｉの酸のメチル及びエチルエステル）。本発明の化合物は、更に溶媒和、即ち水和されることもできる。溶媒和は、製造法の過程において起こることができるか、又は即ち、最初に無水の式Ｉの化合物の吸湿性の結果として起こることができる（水和）。
同じ分子式を有するが、しかしその原子の結合の特質又は配列、或いは空間におけるその配置において異なる化合物は、“異性体”と呼ばれる。空間におけるその原子の配置において異なる異性体は、“立体異性体”と呼ばれる。ジアステレオ異性体は、一つ又はそれより多いキラル中心において逆の配置を持つ、鏡像異性体ではない立体異性体である。互いに重ね合わせることができない鏡像である一つ又はそれより多い不斉中心を保有する立体異性体は、“鏡像異性体”と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する場合、例えば炭素原子が四つの異なった基に結合している場合、一対の鏡像異性体が可能である。鏡像異性体は、その不斉中心又は複数の中心の絶対配置によって特徴付けすることができ、そしてＣａｈｎ、Ｉｎｇｏｌｄ及びＰｒｅｌｏｇのＲ−及びＳ−順位則によって、又は分子が偏光された光の平面を回転し、そして右旋性又は左旋性（即ち、それぞれ（＋）又は（−）−異性体）と命名される様式によって記載される。キラル化合物は、個々の鏡像異性体又はこれらの混合物のいずれかとして存在することができる。等しい比率の鏡像異性体を含有する混合物を、“ラセミ混合物”と呼ぶ。
用語化合物の“治療的に有効な量”は、疾病の症状を予防、緩和又は寛解する、或いは治療されている患者の生存時間を延長するために有効な化合物の量を意味する。治療的に有効な量の決定は、当技術の技能内である。本発明による化合物の治療的に有効な量又は投与量は、広い範囲で変化することができ、そして当技術において既知の様式で決定することができる。このような投与量は、投与される具体的な化合物（類）、投与の経路、治療される症状、並びに治療される患者を含む、それぞれの特定の場合の個々の要求に対して調節される。一般的に、体重が概略７０Ｋｇの成人に対する経口又は非経口投与の場合、指示された場合に上限及び下限を超えることはできるが、約０．１ｍｇないし約５，０００ｍｇ、１ｍｇないし約１，０００ｍｇ、又は１ｍｇないし１００ｍｇの日量が適当であることができる。日量は、一回の投与として、又は分割された投与として投与することができ、或いは非経口投与に対して、これは、連続注入として与えることができる。
用語“医薬的に受容可能な担体”は、溶媒、分散媒体、被覆、抗細菌性及び抗真菌性薬剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに医薬的投与と適合性の他の物質及び化合物を含む医薬的投与と適合性のいずれもの、そして全ての物質を含むことを意図している。いずれもの慣用的な媒体又は薬剤が活性化合物と非適合性である場合を除き、本発明の組成物中のこれらの使用は意図されている。補足的な活性化合物も、更にこの組成物に組込むことができる。
詳細には、本発明は、以下の式Ｉ：
の化合物、並びに医薬的に受容可能なその塩及びエステルに関し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立に水素又はハロゲンであり；そしてＲ１１は、水素又はヒドロキシである。他に示さない限り、式Ｉの属内の化合物は、全ての可能な立体異性体（即ち、（Ｒ）−鏡像異性体、（Ｓ）−鏡像異性体）、並びにそのラセミ及び非ラセミ（ｓｃａｌｅｍｉｃ）混合物を包含する。
一つの態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、全て水素である。もう一つの態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の少なくとも一つはハロゲンである。もう一つの態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の少なくとも一つはフルオロである。もう一つの態様において、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ５は全て水素であり、そしてＲ２又はＲ４の一つはフルオロであり、そして他方は水素である。
もう一つの特別な態様において、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は全て水素である。もう一つの態様において、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも一つはハロゲンである。もう一つの態様において、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも一つはクロロである。もう一つの態様において、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ１０は全て水素であり、そしてＲ７又はＲ９の一つはクロロであり、そして他方は水素である。
一つの態様において、Ｒ１１は水素である。更に具体的な態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の一つはハロゲン（好ましくはフルオロ）であり、そして他は水素であり；そしてＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は水素である。
もう一つの態様において、Ｒ１１はヒドロキシである。更に具体的な態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の一つはハロゲン（好ましくはフルオロ）であり、そして他は水素であり；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は水素であり、そしてＲ１１はヒドロキシである。
一つの態様において、本発明は、以下の式ＩＡ：
の化合物、並びに医薬的に受容可能なその塩及びエステルに関し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立に水素又はハロゲンであり；そしてＲ１１は、ヒドロキシである。
もう一つの態様において、本発明は、以下の式ＩＢ：
の化合物、並びに医薬的に受容可能なその塩及びエステルに関し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立に水素又はハロゲンであり；そしてＲ１１は、ヒドロキシである。
一つの態様において、本発明は、以下の式：
の化合物に関する。
もう一つの態様において、本発明は、以下の式：
の化合物に関する。
もう一つの態様において、本発明は、以下の式：
の化合物に関する。
もう一つの態様において、本発明は、以下の式：
の化合物に関する。
もう一つの態様において、本発明は、以下の式：
の化合物に関する。
もう一つの態様において、本発明は、以下の式：
の化合物に関する。
もう一つの態様において、本発明は、以下の式：
の化合物に関する。
一般的に、これらの化合物の調製において使用される出発物質及び試薬は、商業的供給業者、例えばＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能であるか、又は当業者にとって既知の方法によって調製されるかのいずれかである。以下の合成反応スキームは、単に、それによって、本発明の化合物を合成することができる幾つかの方法の例示であり、そしてこれらの合成反応スキームに対する各種の改変を行うことができ、そして当業者に示唆するものである。更なる例示は、具体的な実施例中に見出すことができる。
本発明の化合物は、いずれもの慣用的な手段によって調製することができる。これらの化合物を合成するために適した方法は、実施例中に提供される。一般的に、式Ｉの化合物は、以下に例示するスキームによって調製することができる。
商業的に入手可能であるか又はニトロ化合物１の水素及び炭素上のパラジウムによる還元から調製することができるジアミノ安息香酸メチル２から出発して、ピリジン無水物３と凝縮し、そしてその後ｉｎ ｓｉｔｕでヨウ素で酸化して、ベンゾイミダゾール４を製造することができる。ベンゾイミダゾールの２−メトキシ−３−ヨード−ピリジン部分を、ジオキサン中の４Ｍの塩酸及び数時間の１００℃の加熱で、３−クロロ−ピリミドン５に転換することができる。化合物５の塩化アリールは、トリエチルアミン又はＮ−メチルモルホリンのような塩基との、アセトニトリル又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような極性溶媒中の求核芳香族置換及び数時間の加熱により２−フェニル−エチルアミンと置換することができる。得られた化合物は、テトラヒドロフラン及び水中の水酸化リチウム並びに温和な加熱のような標準的な方法を使用して脱エステル化して、ベンゾイミダゾールカルボン酸６を得ることができる。７のような最終化合物は、酸６及びベンジルアミンとの、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような極性溶媒中のＮ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン、及びヘキサフルオロリン酸Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムのような標準的なアミドカップリング条件による縮合によって調製することができる。
ある種の例示的態様が本明細書中に描写及び記載されているが、本発明の化合物は、適当な出発物質を使用して、本明細書中に一般的に記載される方法及び／又は当業者にとって利用可能な方法によって調製することができる。
実施例１
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドの合成。
２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル
２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、２，３−ジアミノ安息香酸メチル（１．５ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）と混合して、黄色の溶液を得て、これを窒素下で撹拌し、そして水／ドライアイス浴中で冷却した。これに、メタノール（１５ｍＬ）及びＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解された４−ヨード−２−メトキシニコチンアルデヒド（２．３７ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）を滴下により加えた。添加中に更なるメタノール（２５．０ｍＬ）を反応物に加えた。反応物を水／ドライアイス浴中に２．５時間保ち、３時間かけて室温まで温まらせ、そして次いで水／ドライアイス浴中で冷却した。これに、メタノール（１５ｍＬ）中に溶解したヨウ素（１．４９ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）を滴下により加え、そして次いで反応物を一晩で室温まで温まらせた。反応物を濃縮し、酢酸エチル（２００ｍＬ）及び飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（２００ｍＬ）で希釈し、そして混合した。相当な不溶性物質が存在し、そして混合物を濾過した。得られた固体を酢酸エチル及び水で洗浄した。濾液を分離し、そして得られた水層を酢酸エチル（１００ｍＬ）及びＤＣＭ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３及び食塩水で洗浄し、混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして赤色の油状物／固体として濃縮した。本来の抽出物からの不溶性固体をＤＣＭ（５×１００ｍＬ）で洗浄し、そして濾液を、暗赤色／黒色の固体として濃縮した。液体抽出粗製物及び固体抽出粗製物を最小量のＤＣＭ中に溶解し、混合し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１２０ｇ、ヘキサン中の０％から６０％への酢酸エチル）によって精製して、２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステルを、紫色の固体として０．７３ｇ得た。 ＬＣ／ＭＳ Ｃ１５Ｈ１２ＩＮ３Ｏ３（ｍ／ｅ）に対する計算値４０９．０、実測値４１０．０（Ｍ＋Ｈ）；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１２．６８（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８８−７．９５（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ）。ＤＣＭにより抽出された後に残った本来の不溶性固体を、その後沸騰メタノール（５×２０ｍＬ）で抽出した。メタノールの濾液を濃縮し、そして乾燥し、更なる生成物（ＬＣＭＳにより８３％純度）を、ナトリウム塩（仮定）として、そして暗紫色の固体として０．５７ｇ得た。ＤＣＭ及びメタノール抽出後に残った本来の不溶性固体から、更なる生成物（ＬＣＭＳにより９０％純度）を、ナトリウム塩（仮定）として、そして紫色の固体として０．８８ｇ得た。混合した収率は、５９％であった。
２−（４−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル
最初に二つの反応を並行して行い、そして加熱に先立って混合した。（２００ｍＬの丸底フラスコ中で、２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル（液体抽出で単離された固体）（０．８８ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（３ｍＬ）と混合して、黒色の懸濁液を得て、１，４−ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ（１４．６ｍＬ、５８．１ｍｍｏｌ）を分割して加え、そして混合物を室温で１７時間撹拌した。２００ｍＬの丸底フラスコ中で、メチル２−（４−ヨード−２−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル（フラッシュクロマトグラフィーで単離した）（０．７３ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（２ｍＬ）と混合して、黒色の懸濁液を得て、１，４−ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ（１２ｍＬ、４８．２ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で１７時間撹拌した）。分離した反応物を、１，４−ジオキサン（洗浄のため）及び１，４−ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ（２０ｍＬ）添加を伴って混合した。反応物を１００℃の油浴中で３時間加熱し、そして次いで室温まで冷却させた。反応物を濾過し、そして固体を１，４−ジオキサン、水、１，４−ジオキサン、ヘキサンで洗浄し、そして実験室の真空系（ｈｏｕｓｅ ｖａｃｕｕｍ）で乾燥して、２−（４−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル（０．９１ｇ、７６．２％収率）を、黒色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ１４Ｈ１０ＣｌＮ３Ｏ３（ｍ／ｅ）に対する計算値３０３．０、実測値３０４．１（Ｍ＋Ｈ）；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．０５−８．１６（ｍ，２Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６６−７．７６（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９２−４．０４（ｍ，３Ｈ）。
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル
４０ｍＬのバイアル中で、２−（４−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル（０．９１ｇ、３．００ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニルエタノール（８２２ｍｇ、５．９９ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（９０９ｍｇ、９８８μＬ、８．９９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）と混合して、黒色の懸濁液を得た。バイアルを密封し、そして８５℃のドライブロック加熱器（ｄｒｙ ｂｌｏｃｋ）中で６．５時間加熱し、そして週末にかけて室温まで冷却させた。反応物を水で希釈し、そして得られた沈殿物を水及びヘキサンで洗浄して、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル（０．８７ｇ、７１．８％収率）を、明るい紫色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２２Ｈ２０Ｎ４Ｏ４（ｍ／ｅ）に対する計算値４０４．０、実測値４０５．２（Ｍ＋Ｈ）；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．５３（ｓ，１Ｈ），１１．２６（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），１０．８５（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７６−７．８２（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．４２（ｍ，３Ｈ），７．２６−７．３４（ｍ，２Ｈ），６．２２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．８５−５．００（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．６４−３．７７（ｍ，１Ｈ），３．５３−３．６３（ｍ，１Ｈ）。
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸
２００ｍＬの丸底フラスコ中で、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル（０．８７ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）及びＬｉＯＨ（２５８ｍｇ、１０．８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）及び水（５ｍＬ）と混合して、紫色の懸濁液を得た。反応物を室温で一晩撹拌した。翌日、反応物を５０℃のドライブロック加熱器で３．５時間加熱し、そして室温に冷却した。反応物を水で希釈し、濃縮し、更なる水で希釈し、そして１ＭのＨＣｌで酸性化し、そして濾過した。得られた固体を水及びヘキサンで洗浄し、そして実験室の真空系で乾燥して、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸（０．８６ｇ、１０２％収率）を、紫色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２１Ｈ１８Ｎ４Ｏ４（ｍ／ｅ）に対する計算値３９０．０、実測値３９１．２（Ｍ＋Ｈ）；１Ｈ ＮＭＲ；（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．３５（ｓ，１Ｈ），１１．１９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），１０．９７（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｄｄ，Ｊ＝７．７，３．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２２−７．４４（ｍ，５Ｈ），６．２０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．９２（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．５４−３．７４（ｍ，３Ｈ）。
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミド
１００ｍＬの丸底フラスコ中で、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸（０．８４ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）、３−フルオロ−ベンジルアミン（２９６ｍｇ、２７０μＬ、２．３７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（６１２ｍｇ、８２７μＬ、４．７３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）と混合して、黒色の溶液を得て、そしてこれに、ＨＡＴＵ（９８２ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。翌日、反応物を水中に滴下し、そして得られた沈殿物を濾過し、そして水、酢酸エチル、及びヘキサンで洗浄した。紫色の固体は、最小量の沸騰エタノール中に完全に溶解せず、そして冷却して形成された得られた固体を濾過し、そしてエタノール及びヘキサンで洗浄して、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドを、明るい紫色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２８Ｈ２４ＦＮ５Ｏ３（ｍ／ｅ）に対する計算値４９７．０、実測値４９７．９（Ｍ＋Ｈ）；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６−ＴＦＡ）δ：１１．２５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１０．７７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），９．３２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７１−７．９７（ｍ，２Ｈ），７．１４−７．６３（ｍ，１０Ｈ），７．０３−７．１３（ｍ，１Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．６８（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．６５（ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例２
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸ベンジルアミドの合成
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸ベンジルアミドを、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸、ベンジルアミン、ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ及びＤＭＦから、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドと類似の方法を使用して合成して、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸ベンジルアミドを得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２８Ｈ２５Ｎ５Ｏ３（ｍ／ｅ）に対する計算値４７９．０、実測値４８０（Ｍ＋Ｈ）．１Ｈ ＮＭＲ（互変異性体１：２；ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．３８−１３．５２（ｍ，１Ｈ），１１．１４−１１．３８（ｍ，１Ｈ），１０．３３−１１．０２（ｍ，１Ｈ），９．１８−９．４３（ｍ，１Ｈ），７．６９−７．９９（ｍ，２Ｈ），７．１５−７．６１（ｍ，１２Ｈ），６．１２−６．３０（ｍ，１Ｈ），５．７４−５．９９（ｍ，１Ｈ），４．５２−４．９６（ｍ，３Ｈ），３．４９−３．３０（ｍ，２Ｈ）。
実施例３
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸４−フルオロ−ベンジルアミドの合成
２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸４−フルオロ−ベンジルアミドを、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸、ベンジルアミン、ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ及びＤＭＦから、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドと類似の方法を使用して合成して、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸４−フルオロ−ベンジルアミドを得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２８Ｈ２４ＦＮ５Ｏ３（ｍ／ｅ）に対する計算値４９７．０，実測値４９８（Ｍ＋Ｈ）．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．３５−１３．５３（ｍ，１Ｈ），１１．１３−１１．３８（ｍ，１Ｈ），１０．３５−１１．０３（ｍ，１Ｈ），９．１９−９．４２（ｍ，１Ｈ），７．６８−７．９７（ｍ，２Ｈ），７．２４−７．５８（ｍ，９Ｈ），７．０８−７．２２（ｍ，２Ｈ），６．１３−６．３０（ｍ，１Ｈ），５．７４−６．０２（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．９８（ｍ，３Ｈ），３．４９−３．２９（ｍ，２Ｈ）。
実施例４
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸ベンジルアミドの合成
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステルを、２−（４−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル、２−（３−クロロ-フェニル）−エチルアミン、トリエチルアミン、及びＡＣＮから、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステルと類似の方法を使用して合成して、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステルを得た。
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸を、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸メチルエステル、ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、及び水から、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸と類似の方法を使用して合成して、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸を得た。
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸ベンジルアミドを、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸、ベンジルアミン、ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ及びＤＭＦから、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドと類似の方法を使用して合成して、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸ベンジルアミドを得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２８Ｈ２４ＣｌＮ５Ｏ２（ｍ／ｅ）に対する計算値４９７．０、実測値４９８（Ｍ＋Ｈ）。
実施例５
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸４−フルオロ−ベンジルアミドの合成
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸４−フルオロ−ベンジルアミドを、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸、ベンジルアミン、ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ及びＤＭＦから、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドと類似の方法を使用して合成して、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸４−フルオロ−ベンジルアミドを得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２８Ｈ２３ＣｌＦＮ５Ｏ２（ｍ／ｅ）に対する計算値５１５．０、実測値５１６（Ｍ＋Ｈ）．１Ｈ ＮＭＲ（互変異性体，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．３０−１３．５１（ｍ，１Ｈ），１１．１１−１１．４９（ｍ，１Ｈ），９．９８−１０．９５（ｍ，１Ｈ），９．０６−９．３６（ｍ，１Ｈ），７．６８−８．００（ｍ，２Ｈ），６．９３−７．６５（ｍ，１１Ｈ），６．２２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４７−４．７４（ｍ，２Ｈ），３．５９−３．８５（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）。
実施例６
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドの合成
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドを、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸、ベンジルアミン、ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ及びＤＭＦから、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドと類似の方法を使用して合成して、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−３−カルボン酸４−フルオロ−ベンジルアミドを得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２８Ｈ２３ＣｌＦＮ５Ｏ２（ｍ／ｅ）に対する計算値５１５．０、実測値５１６（Ｍ＋Ｈ）．１Ｈ ＮＭＲ（互変異性体，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．４２（ｓ，１Ｈ），１１．１５−１１．４６（ｍ，１Ｈ），１０．００−１０．９１（ｍ，１Ｈ），９．０８−９．４１（ｍ，１Ｈ），７．６９−８．００（ｍ，２Ｈ），６．９８−７．５９（ｍ，１１Ｈ），６．２２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４９−４．７８（ｍ，２Ｈ），３．６３−３．８２（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）。
実施例７
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸２−フルオロ−ベンジルアミドの合成
２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸２−フルオロ−ベンジルアミドを、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸、ベンジルアミン、ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ及びＤＭＦから、２−［４−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルアミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸３−フルオロ−ベンジルアミドと類似の方法を使用して合成して、２−｛４−［２−（３−クロロ−フェニル）−エチルアミノ］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸２−フルオロ−ベンジルアミドを得た。ＬＣ／ＭＳ Ｃ２８Ｈ２３ＣｌＦＮ５Ｏ２（ｍ／ｅ）に対する計算値５１５．０、実測値５１６（Ｍ＋Ｈ）．１Ｈ ＮＭＲ（互変異性体，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．３３−１３．４９（ｍ，１Ｈ），１１．１４−１１．４５（ｍ，１Ｈ），１０．０５−１０．９２（ｍ，１Ｈ），９．０８−９．３２（ｍ，１Ｈ），７．７０−７．９８（ｍ，２Ｈ），７．０２−７．６１（ｍ，１１Ｈ），６．１６−６．３２（ｍ，１Ｈ），４．５３−４．８０（ｍ，２Ｈ），３．４３−３．８４（ｍ，２Ｈ），２．７５−３．１２（ｍ，２Ｈ）。
式Ｉの化合物は、価値のある特質を保有する。前記化合物が、更に正確な医学的試験及び研究のためのより成熟した又は成人型肝細胞への幹細胞の分化において有用であることが見いだされている。より成熟した又は成人型肝細胞への幹細胞の分化における本発明の化合物の活性は、以下のアッセイによって証明される。更に、細胞をＨＢＶに対する感受性を導く宿主遺伝子に対する本発明の化合物の効果も、更に記載される。
人工多能性幹細胞によるＩｎ ｖｉｔｒｏの試験
ヒトｉＰＣＳ由来の肝細胞（ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞）を、成人の器官をより良好にモデル化する、より大きい機能性のために好都合な条件を同定する目標で、式Ｉの化合物に暴露した。高処理量のマイクロ流体定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、成人の一次ヒト肝細胞と比較した場合、低いか又はｈｉＰＳＣ由来の肝細胞の未成熟な表現型を示すかのいずれかである、肝細胞機能のスペクトルを示す３２個の遺伝子の発現を検討した。一次スクリーニング中に、多くの成熟関連遺伝子の数の有意な増加をもたらす多数の化合物が確認された。遺伝子発現の変化は、二次スクリーニングにおいて検証及び確認され、そして機能的配列を検索した。
細胞及び培養条件
新鮮なｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞（２０−２３日目）を、ｉＣｅｌｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅに従って、９６ウェルのＢＩＯ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶで被覆されたプレート（ＢＤカタログ番号３５４４２９）に、ウェル当たり６０ｋ細胞で播種し、そして培養した 播種から４時間後、培地Ｃを除去し、そして培地Ｄ中の１：５０のＭａｔｒｉｇｅｌ（カタログ番号３５４２２７）オーバーレイで置換えた。本出願人等は、播種後２４時間に培地Ｄ中の５ｕＭの細胞及び１％ＤＭＳＯを投与した。３日目に、培地を除去し、そして本出願人等は、再び５ｕＭを投与した。４日目に、本出願人等は、ＲＮＡを回収した。
遺伝子発現のプロファイリング
試料のＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴＴＭ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号４３８７２９９）を使用して、化合物処理後の各種の時点で−８０℃に冷凍して単離した。全ての試料を、マイクロ流体定量的ＰＣＲによって、Ｂｉｏｍａｒｋ Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ９６．９６チップ（ＢＭＫ−Ｍ−９６．９６）及びＡＢＩ Ｔａｑｍａｎプローブを使用して加工した。正規化及びモデルベースの発現測定は、Ｂｉｏｇａｚｅｌｌｅ ｑＢＡＳＥ及びＧｅｎｏｒｍソフトウェアを使用して計算した。三重の全ての試料のデータを平均し、そして相対的遺伝子発現値に対して、５個のハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。発現値は、ベヒクル対照に対する倍数の変化によって計算した。図１及び２を参照されたい。
最良の的中化合物を、細胞成熟度を増加する、例えば成人特異的マーカーの増加又は胎児特異的マーカーの減少のために予測される様式で遺伝子発現を変更する化合物の能力に基づいて選択した。第二次の確認スクリーニングのために、的中化合物を、遺伝子のより広い範囲に対する用量反応に対して選択した。本出願人等は、実施例１の化合物が、肝細胞機能に広がる遺伝子の全体的増加を多数の投与において起こすことを発見した（図１）。実施例１の化合物及び五つの他の構造的類似体（図２−７）に対する暴露は、一連の成熟関連遺伝子の遺伝子発現に基づくｉＣｅｌｌ肝細胞の類似の表現型の変化をもたらした（図２）。実施例１の化合物を使用した結果は、ｉＣｅｌｌ肝細胞の５＋の独立のバッチに対して再現可能な遺伝子発現の変化を示し、そして作用及び機能的配列の機構を確認する目標で更に研究される。実施例１の化合物による処理において、ｉＣｅｌｌ肝細胞は、ＨＢＶの多数の遺伝子型に感染され、そしてＩＨＣ及びＥＬＩＳＡに基づいて、強固な数の感染された細胞を産生することが可能である。
マイクロアレイアッセイ
実施例１の化合物で処理されたｉＣｅｌｌ肝細胞は；インターフェロン活性化遺伝子（ＩＳＧ）発現に対する動力学的影響を含む遺伝子の宿主の上方及び下方制御をもたらす。図７ａ、７ｂ、７ｃ、及び表１を参照されたい。
血清からのＨＢＶの精製
２００マイクロリットルのＨＢＶを含有する血清を、ＳＷ４１試験管中で１０−５０％のＯｐｔｉｐｒｅｐの勾配にかけた。試料を１００，０００×ｇで２時間４Ｃで遠心した。５００マイクロリットルの画分を上部から収集し；それぞれの画分をＨＢｓＡｇ（ＥＬＩＳＡ）及びＨＢＶ ＤＮＡ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）に対して分析した。ウイルスを含有する画分を、−８０Ｃで保存した。図６ｂを参照されたい。
ＨＢＶによるｉＣｅｌｌ肝細胞の感染
新鮮なｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞（２０−２３日目）を、ｉＣｅｌｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅに従って、９６ウェルのＢＩＯ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶで被覆されたプレート（ＢＤカタログ番号３５４４２９）のウェル当たり６０ｋ細胞で播種し、そして培養した 播種から４時間後、培地Ｃを除去し、そして培地Ｄ中の１：５０のＭａｔｒｉｇｅｌ（カタログ番号３５４２２７）オーバーレイで置換えた。播種後２４時間に、細胞を、１％のＤＭＳＯを含有する培地Ｄ中の１ｕＭの実施例１の化合物で処理した。新鮮な化合物を含有する培地を２日後に補充した。播種後４日目に、細胞を１０のＭＯＩ（感染効率）でＨＢＶで感染した。簡単には、精製したウイルスを、実施例１の化合物を含有する培地Ｄ中に希釈し、そして細胞と共に４−６時間又は一晩インキュベートした。ウイルスの接種菌液の除去後、１ｕＭの実施例１の化合物を含有する新鮮な培地を加え、そして細胞を２日毎に培地を交換しながら１４日間インキュベートした。培養培地を分泌されたウイルスの抗原（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ）及びＨＢＶ ＤＮＡに対して分析した。図３、４、５、６ａを参照されたい。
まとめれば、データは、内在性シグナルとして式Ｉの化合物を使用することが、ｉＣｅｌｌ肝細胞機能を改変するための、迅速な、効率のよい、非遺伝的で、そして費用効果の高い手段を提供することを示す。式Ｉの化合物を使用した、ＨＢＶで感染されたｉＣｅｌｌ肝細胞の産生は、基本的なウイルス学及び薬物発見に対する方法を提供する。幹細胞由来の細胞の機能的改善のための小分子ライブラリーのスクリーニングは、薬物発見のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの新しい世代に導くことができる。

Claims (28)

  1. 以下の式Ｉ：
    の化合物、或いは医薬的に受容可能なその塩であって；式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立に水素又はハロゲンであり；そしてＲ１１は、水素又はヒドロキシである、前記化合物。
  2. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が、全て水素である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の少なくとも一つがハロゲンである、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の少なくとも一つがフルオロである、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｒ１、Ｒ３、及びＲ５が全て水素であり、そしてＲ２又はＲ４の一つがフルオロであり、そして他方が水素である、請求項１に記載の化合物。
  6. Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０が、全て水素である、請求項１に記載の化合物。
  7. Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも一つがハロゲンである、請求項１に記載の化合物。
  8. Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも一つがクロロである、請求項１に記載の化合物。
  9. Ｒ６、Ｒ８、及びＲ１０が全て水素であり、そしてＲ７又はＲ９の一つがクロロであり、そして他方が水素である、請求項１に記載の化合物。
  10. Ｒ１１が水素である、請求項１に記載の化合物。
  11. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の一つがフルオロであり、そしてその他が水素であり；そしてＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素である、請求項１に記載の化合物。
  12. Ｒ１１がヒドロキシである、請求項１に記載の化合物。
  13. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５がフルオロであり、そしてその他が水素であり；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０が水素であり、そしてＲ１１がヒドロキシである、請求項１に記載の化合物。
  14. 以下の式：
    の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  15. 以下の式：
    の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  16. 以下の式：
    の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  17. 以下の式：
    の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  18. 以下の式：
    の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  19. 以下の式：
    の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  20. 以下の式：
    の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  21. 以下の式ＩＡ：
    の化合物、並びに医薬的に受容可能なその塩であって、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立に水素又はハロゲンであり；そしてＲ１１は、水素又はヒドロキシである、請求項１に記載の化合物。
  22. 以下の式ＩＢ：
    の化合物、並びに医薬的に受容可能なその塩であって、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立に水素又はハロゲンであり；そしてＲ１１は、水素又はヒドロキシである、請求項１に記載の化合物。
  23. 請求項１に記載の化合物及び医薬的に受容可能な担体を含んでなる医薬組成物。
  24. 幹細胞を肝細胞に分化するための、請求項１に記載の化合物を前記幹細胞に投与することを含んでなる方法。
  25. 前記肝細胞が、Ｂ型肝炎ウイルスに感染させられる、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記感染させられる肝細胞が、Ｂ型肝炎ウイルスを治療するための化合物をスクリーニングするために使用される、請求項２５に記載の方法。
  27. インターフェロン活性化遺伝子が、分化された肝細胞中で下方制御される、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記肝細胞が、Ｂ型肝炎ウイルスに感染させられる、請求項２７に記載の方法。
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