JP6128344B2 - 抗ヒトclcp1抗体とその用途 - Google Patents
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Description
一方、本発明者でもある高橋らはCLCP1分子が転移性肺がん細胞亜株に多く発現し、生体における肺がんにおいてもCLCP1が高率に発現していることを見出した。さらにCLCP1に対するsiRNA(small interference RNA)に細胞内で生合成されるshRNA(short hairpin RNA)を恒常的に発現させることによってがんの増殖阻害、転移抑制が引き起こされることを確認している(例えば非特許文献1〜4を参照)。
しかしながら、siRNAに細胞内で生合成されるshRNAを恒常的に発現させることによる該分子の発現阻害で上記の通りの効果が確認されているものの、本分子はマウスとヒトの相同性はアミノ酸レベルで約85%であるが、当該分子特異的に結合するモノクローナル抗体は、市販品や学術論文での報告もほとんどない。このような理由により、その抗体の作用や機能等について十分に解明されず、またその抗体の用途も、今後の研究進展が待たれるところであった。
さらに、当該抗体を用いた種々の実験によって、その抗体が肺がん細胞の転移抑制作用を奏することを見出した。即ち、本抗体は、肺がん細胞に対して以下の5つの作用の中のいずれか1つ以上の作用を持つことを明らかにし、当該抗体の有用性が確認された。
(1)当該抗体が肺がん細胞の遊走阻害作用を発揮すること、
(2)当該抗体が肺がん細胞の浸潤抑制作用を発揮すること
(3)当該抗体が肺がん細胞の転移抑制作用を発揮すること
(4)当該抗体が肺がん細胞の増殖抑制作用を発揮すること
(5)当該抗体が肺がん細胞の細胞障害作用を発揮すること
癌の転移は癌細胞の原発巣からの離脱・遊走、細胞外マトリックス・基底膜への浸潤、血管内侵入、遠隔部位での接着、血管外侵入、基底膜・細胞外マトリックスへの 浸潤、増殖という過程を経る。中でも、細胞外マトリックス・基底膜への浸潤の過程は二回行われることから極めて重要なステップであると考えられる。上記阻害効果を持つ抗体を含む組成物は、がん治療剤として大変有効である。
さらに、がん細胞の増殖阻害効果を発揮することで、上記阻害効果を持つ抗体を含む組成物は、がんの進行を食い止める、がん治療剤として大変有効である。
さらに、後述のように、CLCP1発現性の様々ながんの種が存在することを確認し、同様な効果が期待できることが示唆された。そのような対象のがん種として特に、腎がん、膀胱腫瘍、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、乳がんが挙げられる。
がん細胞に対するADCC作用を発揮することで、上記作用を持つ抗体を含む組成物は、がんを積極的に殺傷する、がん治療剤として大変有効であり、このがん治療剤は様々ながんに対して適用可能であることが判明した。
また、当該抗体を用いた、CLCP1発現性疾患の治療効果の診断であれば肺癌又はリンパ節転移がんに限定されず、治療効果の診断に転用可能であると考えられる。
〔1〕配列番号:2における456番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する、単離された抗体。
〔2〕配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識しない、〔1〕に記載された抗体。
〔3〕配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識しない、〔1〕に記載された抗体。
〔4〕CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性を有する、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の、単離された抗体。
〔5〕CLCP1を発現するがん細胞の浸潤阻害活性を有する、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の、単離された抗体。
〔6〕CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の、単離された抗体。
〔7〕CLCP1を発現するがん細胞の転移阻害活性を有する、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の、単離された抗体。
〔8〕CLCP1を発現するがん細胞に細胞障害活性を有する、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の、単離された抗体。
〔9〕前記CLCP1を発現するがん細胞が、腎がん、膀胱腫瘍、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、乳がん又は肺がん細胞である、〔4〕〜〔8〕のいずれか一項に記載の単離された抗体。
〔10〕重鎖可変領域の各相補性決定領域(VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3)及び軽鎖可変領域の各相補性決定領域(VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3)のアミノ酸配列が以下の(A)-(C)から選ばれる、〔1〕から〔9〕のいずれか一項に記載の単離された抗体。
(A)
(1)VH CDR1:配列番号:16に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VH CDR2:配列番号:17に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(3)VH CDR3:配列番号:18に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(4)VL CDR1:配列番号:21に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(5)VL CDR2:配列番号:57に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(6)VL CDR3:配列番号:22に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(B)
(1)VH CDR1:配列番号:7に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VH CDR2:配列番号:8に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(3)VH CDR3:配列番号:9に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(4)VL CDR1:配列番号:12に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(5)VL CDR2:配列番号:56に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(6)VL CDR3:配列番号:13に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(C)
(1)VH CDR1:配列番号:60に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VH CDR2:配列番号:61に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(3)VH CDR3:配列番号:62に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(4)VL CDR1:配列番号:65に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(5)VL CDR2:配列番号:66に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(6)VL CDR3:配列番号:67に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
〔11〕重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列が以下の(A)-(C)から選ばれる、〔1〕から〔10〕のいずれか一項に記載の単離された抗体。
(A)
(1)VH:配列番号:45若しくは配列番号:15に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VL:配列番号:55若しくは配列番号:20に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(B)
(1)VH:配列番号:6に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VL:配列番号:11に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(C)
(1)VH:配列番号:59に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VL:配列番号:64に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
〔12〕〔1〕から〔11〕のいずれか一項に記載の抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する、単離された抗体。
〔13〕Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dsFv、Diabody又はsc(Fv)2である、〔1〕〜〔12〕のいずれか一項に記載の単離された抗体。
〔14〕IgG抗体である、〔1〕〜〔13〕のいずれか一項に記載の単離された抗体。
〔15〕前記抗体がヒト化抗体である、〔1〕〜〔14〕のいずれか一項に記載の単離された抗体。
〔16〕〔1〕〜〔15〕のいずれか一項に記載の単離された抗体をコードする単離された核酸。
〔17〕〔16〕に記載された核酸を発現可能に保持するベクター。
〔18〕〔17〕に記載のベクターを有する形質転換細胞。
〔19〕以下の工程:
(a)〔18〕に記載の形質転換細胞を培養する工程;及び
(b)発現産物である抗体を分離・精製する工程;
を含む、抗体の製造方法。
〔20〕〔1〕から〔15〕のいずれか一項に記載の単離された抗体および医薬的に許容される担体を含有する、医薬組成物。
〔21〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の遊走阻害剤。
〔22〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の浸潤阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の浸潤阻害剤。
〔23〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の転移阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の転移阻害剤。
〔24〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の増殖阻害剤。
〔25〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の細胞障害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の細胞障害剤。
〔26〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体を含有する、腫瘍の治療又は予防に使用するための薬剤。
〔27〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体を含有する、がんの治療又は予防に使用するための薬剤。
〔28〕遊走阻害、細胞浸潤阻害、転移阻害、細胞増殖阻害から選ばれる少なくとも1つの阻害効果を有する、〔27〕に記載のCLCP1を発現するがんの治療又は予防に使用するための薬剤。
〔29〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識する抗体を含有する、細胞または組織におけるCLCP1の発現を免疫学的手法により検出するために用いられる薬剤。
〔30〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識する抗体を含有する、細胞または組織におけるCLCP1の発現を免疫学的手法により検出するために用いられるキット。
〔31〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識する抗体を含有する、がんの診断または予後診断用薬剤。
〔32〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識する抗体を含有する、がんの診断または予後診断用キット。
〔33〕以下の工程:
(a)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識する抗体と、分離された細胞または組織を接触させる工程;及び
(b)該細胞または該組織におけるCLCP1の発現を検出する工程;
を含む、免疫学的手法。
〔34〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識する抗体を、分離された病理組織に接触させ、免疫学的手法によって該病理組織における細胞のCLCP1の発現を検出する工程を含む、がんの診断法。
〔35〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識する抗体を、分離された病理組織に接触させ、免疫学的手法によって該病理組織における細胞のCLCP1の発現を検出する工程を含む、がんの予後診断法。
〔36〕以下の工程:
(a)被験物質をヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインと接触させる工程;
(b)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインと被験物質との結合活性を検出する工程;及び
(c)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインと結合する被験物質を選択する工程;
を含む、がん細胞の増殖、浸潤、遊走、若しくは、転移を阻害する候補物質、又は、がん細胞に細胞障害活性を有する候補物質のスクリーニング方法。
〔37〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性を有する抗体を対象に投与する工程を含む、CLCP1を発現するがん細胞の遊走を阻害するための方法。
〔38〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の浸潤阻害活性を有する抗体を対象に投与する工程を含む、CLCP1を発現するがん細胞の浸潤を阻害するための方法。
〔39〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の転移阻害活性を有する抗体を対象に投与する工程を含む、CLCP1を発現するがん細胞の転移を阻害するための方法。
〔40〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体を対象に投与する工程を含む、CLCP1を発現するがん細胞の増殖を阻害するための方法。
〔41〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の細胞障害活性を有する抗体を対象に投与する工程を含む、CLCP1を発現するがん細胞を障害するための方法。
〔42〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体を対象に投与する工程を含む、CLCP1を発現する腫瘍の治療又は予防に使用するための方法。
〔43〕ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体を対象に投与する工程を含む、CLCP1を発現するがんの治療又は予防に使用するための方法。
〔44〕CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害剤の製造における、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性を有する抗体の使用。
〔45〕CLCP1を発現するがん細胞の浸潤阻害剤の製造における、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の浸潤阻害活性を有する抗体の使用。
〔46〕CLCP1を発現するがん細胞の転移阻害剤の製造における、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の転移阻害活性を有する抗体の使用。
〔47〕CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害剤の製造における、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体の使用。
〔48〕CLCP1を発現するがん細胞の細胞障害剤の製造における、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の細胞障害活性を有する抗体の使用。
〔49〕CLCP1を発現する腫瘍の治療又は予防に使用するための薬剤の製造における、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体の使用。
〔50〕CLCP1を発現するがんの治療又は予防に使用するための薬剤の製造における、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体の使用。
〔51〕CLCP1を発現するがん細胞の遊走を阻害するための方法に使用するための、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性を有する抗体。
〔52〕CLCP1を発現するがん細胞の浸潤を阻害するための方法に使用するための、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の浸潤阻害活性を有する抗体。
〔53〕CLCP1を発現するがん細胞の転移を阻害するための方法に使用するための、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の転移阻害活性を有する抗体。
〔54〕CLCP1を発現するがん細胞の増殖を阻害するための方法に使用するための、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体。
〔55〕CLCP1を発現するがん細胞を障害するための方法に使用するための、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の細胞障害活性を有する抗体。
〔56〕CLCP1を発現する腫瘍の治療又は予防に使用するための方法に使用するための、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体。
〔57〕CLCP1を発現するがんの治療又は予防に使用するための方法に使用するための、ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体。
本発明によれば、前記記載の抗体を有効成分とした、CLCP1を発現するがん細胞の細胞障害を機序とするがん治療剤を容易に製造することが可能であり、がん疾患の治療および/がんの予防に用いることができる。
また、本発明は、癌細胞の増殖、浸潤、遊走、又は、転移を阻害する候補物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法によって得られる物質は、前記阻害を機序とするがん疾患の治療およびがん転移の予防に用いることができる候補物質となりうる。
本明細書において用語「単離された抗体」には、天然であって且つ何ら外的操作(人為的操作)が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。尚、単離された抗体は、典型的には、他の種類の抗体が混在していない状態、即ち単独で(同種の抗体の集合として)存在している。
二つのアミノ酸が実質的に同一であるか否かは、各アミノ酸配列を含む抗体(他の領域の配列は同一)の抗原に対する結合特異性(以下、特に記載のない限り「特異性」は「抗原に対する特異性」を意味する)を比較することによって判定できる。例えば、基準となる抗体の生理食塩水環境下での抗原に関する解離定数(Kd)をAとしたとき、比較対象の抗体のKdがA×10-1〜A×10の範囲であれば実質的な同一性を認定できる。
例えばcDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dNTPなどの前駆体(原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
ベクターや組成物の一部として核酸が存在していても、又は外来性分子として細胞内に核酸が存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」と言える。尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には「単離された状態の核酸」を意味する。
本明細書における用語「核酸」はDNA(cDNA及びゲノムDNAを含む)、RNA(mRNAを含む)、DNA類似体、及びRNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち1本鎖及び2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは2本鎖DNAである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。本明細書において「あるタンパク質(例えば抗体)をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られる核酸のことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸(例えば1又は複数個のイントロンを含むDNA)をも含む。
重鎖(H鎖)、軽鎖(L鎖)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、相補性決定領域(CDR)、第1相補性決定領域(CDR1)、第2相補性決定領域(CDR2)、第3相補性決定領域(CDR3)重鎖の第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖の第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖の第3相補性決定領域(VH CDR3)軽鎖の第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖の第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖の第3相補性決定領域(VL CDR3)。
本発明の第1の局面はヒトCLCP1(アミノ酸配列を配列番号:2、塩基配列を配列番号:1に示す)の細胞外ドメイン(配列番号:3)を特異的に認識する(「認識する」は「結合する」と言い換えることもできる。また、「認識する」とは、抗原に存在するエピトープを認識することを意味する)単離された抗体(以下、「本発明の抗体」ともいう)に関する。特に好ましくは、ヒトCLCP1細胞外ドメイン中のFA58Cドメインを含む領域(配列番号:4)を認識する抗体である。
さらに、本発明の別の局面は、配列番号:2における456番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する、単離された抗体に関する。
好ましくは、以下の(c)に記載のペプチドを認識し、以下の(a)、(b)及び(d)に記載の少なくとも1つのペプチドを認識しない、単離された抗体、又は、以下の(b)に記載のペプチドを認識し、以下の(a)、(c)及び(d)に記載の少なくとも1つのペプチドを認識しない、単離された抗体である。
(a)配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチド
(b)配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチド
(c)配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチド
(d)配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチド
より好ましくは、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識しない、単離された抗体、又は、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識しない、単離された抗体である。
さらにより好ましくは配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合し、配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、かつさらに、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない単離された抗体、又は、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合し、配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、かつさらに、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない単離された抗体である。
最も好ましくは、以下の(c)に記載のペプチドを認識し、以下の(a)、(b)及び(d)に記載のいずれのペプチドも認識しない、単離された抗体、又は、以下の(b)に記載のペプチドを認識し、以下の(a)、(c)及び(d)に記載のいずれのペプチドも認識しない、単離された抗体である。
(a)配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチド
(b)配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチド
(c)配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチド
(d)配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチド
本発明の抗体は、ヒトCLCP1抗原を認識して作用・活性を発揮する。具体的には、細胞表面にヒトCLCP1分子を発現するヒトがん細胞、好ましくはヒトCLCP1分子を高発現するがん細胞、さらに好ましくは肺癌細胞、特に転移性肺癌細胞に対して活性を発揮する。本抗体の活性としては、遊走阻害活性、或いは浸潤阻害、或いは転移阻害活性、さらには、増殖阻害活性である。さらに別の局面として、細胞障害活性(例えば、ADCC活性)である。
ヒトCLCP1分子は、肺癌細胞において高レベルの発現が認められることが知られていたが、他のがん種での発現はほとんど知られていなかった上、ヒトCLCP1の細胞外ドメインに対する抗体の機能についてはほとんど知られておらず、後述のように、本発明者らの検討によって興味深い知見が得られた。
尚、ここでの「遊走阻害活性」とは、当該生細胞が試験管内または、生体内において2次元または、3次元的に移動することを阻害する活性をいう。「浸潤阻害活性」とは当該生細胞が生体内において基底膜を通過することを阻害する活性をいい、または試験管内において当該生細胞の細胞外マトリックスやマトリゲルへの膜で上下に仕切られたチャンバーで、細胞が上のチャンバーから、下のチャンバーまで移動することを阻害する活性をいう。「転移阻害活性」とは生体内における癌細胞が原発巣から離脱・遊走し、細胞外マトリックス・基底膜への浸潤を経て、他の臓器または、同じ臓器の異なる位置へ広がることを阻害する活性をいう。「増殖阻害活性」とは、該抗体の投与によりその後の経過観察の結果として、がん細胞分裂/がん増殖を抑え、「がん細胞体積を対象のIgG群より低下させる、または重量増加を抑制する活性」をいう。「細胞障害活性」とは、がん細胞を障害し、「生存しているがん細胞数又は量を対象のIgG群より低下させる活性」をいう。
本発明において、「遊走・浸潤・転移・増殖阻害」には、遊走・浸潤・転移・増殖が完全に阻害される場合のみならず、遊走・浸潤・転移・増殖が部分的に阻害される場合も含まれる。「細胞障害活性」には、完全にがん細胞群が障害される場合のみならず、部分的に障害される場合も含まれる。なお、非特許文献4によりin vitro遊走阻害作用及び浸潤阻害作用が、in vivoでの「転移阻害活性」と相関していることが示されている。
最後に、遊走阻害、浸潤阻害試験で、上記との関連を見たところ、配列番号:2における456番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する、単離された抗体、より好ましくは、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識しない、単離された抗体、又は、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識しない、単離された抗体、もっとも好ましくはFA19-1、FA17-9、6AA_17-2抗体、特に好ましくはFA19-1が特に遊走阻害性、浸潤阻害性を有し、in vivo転移阻害の効果を生じると考えられた。
この結果に基づき、ヒトCLCP1の細胞外ドメインのうちそれぞれの抗体が以下のエピトープを認識することによって本発明の抗体を更に特徴づけることができた。本発明で同一のエピトープを認識する場合とは、競合実験:FCMにおいて一方ビオチン化抗体で互いに競合し、他方の結合が妨げられる場合をいう。
今回、取得に成功した抗体クローンは、認識するエピトープの異同に基づき、7種類に分類されることを示した。
即ち、FA58Cドメインを含む領域中のエピトープA:(1)配列番号2における456番目から470番目のアミノ酸配列(以下、「456aa-470aa」のように記載する)内に存在するエピトープを認識する、単離された抗体である。
そのような抗体として、例えば、(2)ヒトCLCP1抗原のアミノ酸配列部分配列(配列番号2の461aa-470aa)内に存在するエピトープを認識する、単離された抗体(第1の抗体)が挙げられる。第1の抗体は、転移阻害、特に肺転移阻害に有効であることが示された抗体クローンFA17-9、FA19-1を含み(に対応するものであり)、抗体クローンFA17-9、即ち「配列番号:6のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号:11のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体」が認識するエピトープと同一のエピトープ、或いは抗体クローンFA19-1、即ち「配列番号:15のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号:20のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体」が認識するエピトープと同一のエピトープを認識することによって特徴づけられる。第1抗体が認識するエピトープは、抗体クローンFA17-9、FA19-1が認識するエピトープに一致することから、第1抗体と抗体クローンFA17-9またはFA19-1を確認すべき抗体と同時にヒトCLCP1に反応させれば競合が認められ、第1抗体としての適格性は、抗体クローンFA17-9、FA19-1、特に好ましくはFA19-1を利用した競合実験:FCMによって確認することができる(実施例参照)。
第1抗体としての適格性は、部分ペプチド間の交差性として捉えることもでき、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合し、配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、かつさらに、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない単離された抗体として確認することができる。
今回、複数の抗体クローンが選択されたものの、エピトープAを認識する抗体が繰り返し選択されていることが明らかとなった。この現象が生ずる原因について検討した結果、エピトープAは抗原性が極端に高いエピトープであり、それがエピトープのオーバーラップを引き起こしていると予想された。
なお、エピトープAを認識する第1の抗体は、FA17-9、FA19-1はじめ、FA2-10、FA7-6、FA9-1、FA12-3、FA14-9、FA20-3のモノクローナル抗体が認識する。
FA58Cドメインを含む領域中のエピトープAを認識する(1)配列番号2の456aa-470aa内に存在するエピトープを認識する抗体の第2の抗体は、転移阻害に有効であることが示された、(3)配列番号2の456aa-465aa内に存在するエピトープを認識する、単離された抗体、(に対応するものであり)第2抗体が認識するエピトープは、抗体クローン6AA_17-2又は、2AA_62-4が認識するエピトープに一致することから、第2抗体と抗体クローン6AA_17-2又は、2AA_62-4を確認すべき抗体と同時にヒトCLCP1に反応させれば競合が認められ、第2抗体としての適格性は、抗体クローン6AA_17-2又は、2AA_62-4、特に好ましくは6AA_17-2を利用した競合実験によって競合する抗体として確認することができる。第2抗体としての適格性は、部分ペプチド間の交差性として捉えることもでき、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合し、配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、かつさらに、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない単離された抗体として確認することができる。
一方、抗体のアミノ酸配列を解析し、重鎖可変領域の各相補性決定領域(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)及び軽鎖可変領域の各相補性決定領域(VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)のアミノ酸配列、並びに重鎖可変領域全体(VH)及び軽鎖可変領域全体(VL)のアミノ酸配列を同定することに成功した(同定された各アミノ酸配列を以下に示す)。
抗体1:FA17-9
(1)VH CDR1:配列番号:7に示すアミノ酸配列
(2)VH CDR2:配列番号:8に示すアミノ酸配列
(3)VH CDR3:配列番号:9に示すアミノ酸配列
(4)VL CDR1:配列番号:12に示すアミノ酸配列
(5)VL CDR2:配列番号:56に示すアミノ酸配列
(6)VL CDR3:配列番号:13に示すアミノ酸配列
(7)VH:配列番号:6に示すアミノ酸配列(該アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号:5)
(8)VL:配列番号:11に示すアミノ酸配列(該アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号:10)
抗体2:FA19-1
(1)VH CDR1:配列番号:16に示すアミノ酸配列
(2)VH CDR2:配列番号:17に示すアミノ酸配列
(3)VH CDR3:配列番号:18に示すアミノ酸配列
(4)VL CDR1:配列番号:21に示すアミノ酸配列
(5)VL CDR2:配列番号:57に示すアミノ酸配列
(6)VL CDR3:配列番号:22に示すアミノ酸配列
(7)VH:配列番号:15に示すアミノ酸配列(該アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号:14)
(8)VL:配列番号:20に示すアミノ酸配列(該アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号:19)
抗体3:6AA_17-2
(1)VH CDR1:配列番号:60に示すアミノ酸配列
(2)VH CDR2:配列番号:61に示すアミノ酸配列
(3)VH CDR3:配列番号:62に示すアミノ酸配列
(4)VL CDR1:配列番号:65に示すアミノ酸配列
(5)VL CDR2:配列番号:66に示すアミノ酸配列
(6)VL CDR3:配列番号:67に示すアミノ酸配列
(7)VH:配列番号:59示すアミノ酸配列(該アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号:58)
(8)VL:配列番号:64に示すアミノ酸配列(該アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号:63)
(A)
(1)VH CDR1:配列番号:7に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VH CDR2:配列番号:8に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(3)VH CDR3:配列番号:9に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(4)VL CDR1:配列番号:12に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(5)VL CDR2:配列番号:56に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(6)VL CDR3:配列番号:13に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(B)
(1)VH CDR1:配列番号:16に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VH CDR2:配列番号:17に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(3)VH CDR3:配列番号:18に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(4)VL CDR1:配列番号:21に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(5)VL CDR2:配列番号:57に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(6)VL CDR3:配列番号:22に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(C)
(1)VH CDR1:配列番号:60に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VH CDR2:配列番号:61に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(3)VH CDR3:配列番号:62に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(4)VL CDR1:配列番号:65に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(5)VL CDR2:配列番号:66に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(6)VL CDR3:配列番号:67に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域(FR領域)の配列は、ヒトCLCP1抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。
例えば、本発明の抗体をヒト化抗体として構築する場合には、公知のヒト抗体のFR領域を用いることができる。
(A)
(1)VH:配列番号:6に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VL:配列番号:11に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(B)
(1)VH:配列番号:45若しくは配列番号:15に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VL:配列番号:55若しくは配列番号:20に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
(C)
(1)VH:配列番号:59示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列、
(2)VL:配列番号:64に示すアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原(CLCP1又はその一部)を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。抗原としては、ヒトCLCP1の他、マウスCLCP1などヒト以外の種のCLCP1を用いることができる。これらのCLCP1は、生体試料を精製することにより得ることができる。また、組換えCLCP1を用いることもできる。組換えヒトCLCP1は例えば、CLCP1をコードする遺伝子(遺伝子の一部であってもよい)を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。
免疫惹起作用を増強するために、特に前述したように、CLCP1の細胞外ドメイン(配列番号:3)(又はその一部)、好ましくは、FA58Cドメインを含む領域(配列番号:4)を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン(His)タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。このハイブリドーマをモノクローン化した後、選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物(例えばマウス)の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
ヒト型キメラ抗体は例えば、上記のH鎖可変領域の構造及び/又はL鎖可変領域の構造を有する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。
まず、本発明の抗体を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、常法に従ってcDNAを合成する。合成したcDNAをベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築する。このcDNAライブラリーから、H鎖遺伝子フラグメント及びL鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、H鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークエンシングを行うことにより、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基にH鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断/再結合等により作製する。得られたH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒトH鎖定常領域をコードするDNAとライゲーションして発現用ベクターに組込むことによりH鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV(パピローマウイルス)basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法によりL鎖発現ベクターを作製する。これらH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
次に、これらいずれかの方法により選択したFRと上記CDRとを組み合わせることによりH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAを設計する。この設計を基にH鎖可変領域をコードするDNAとL鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断/再結合等によりそれぞれ作製する。そしてH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンH鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みH鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンL鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV(パピローマウイルス)basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以上の方法で作製されたH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型CDR移植抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
Fabは、IgGをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される分子量約5万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のH鎖の一部及びL鎖をコードするDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりFabを調製することもできる。
Fab'は、後述のF(ab')2のH鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約5万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Fab同様に、Fab'をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
F(ab')2は、IgGをペプシン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される断片(Fab')がジスルフィド結合で結合した分子量約10万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Fab同様に、F(ab')2をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
Fvは、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現できる(例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.(1994)152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989)178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology(1989)178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989)121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989)121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991)9, 132-137参照)。
scFvは、H鎖可変領域とL鎖可変領域とからなるFvを、片方の鎖のC末端と他方のN末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い(GGGGS(配列番号:23))3などを用いることができる。例えば、上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAとペプチドリンカーをコードするDNAを用いてscFv抗体をコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりscFvを調製することができる。
dsFvは、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の適切な位置にCys残基を導入し、H鎖可変領域とL鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたFv断片である。各鎖におけるCys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したH鎖可変領域及びL鎖可変領域をそれぞれコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりdsFvを調製することができる。
尚、適当なリンカーを用いてscFv抗体、dsFv抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。本発明の抗体(抗体断片を含む)に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させることにより、融合抗体又は標識化抗体を構成することができる。標識物質としては125I等の放射性物質、などを用いることができる。
Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。Diabodyは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でVL及びVHが、互いに結合できない位に短い、例えば、5残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、Diabodyは2つの抗原結合部位を有することとなる。Diabodyは、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい(例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である(Hudson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
本発明の別の局面は本発明の抗体をコードする核酸分子(以下、「本発明の核酸」ともいう)に関する。
本発明の核酸は化学合成、生化学的切断/再結合など常法で調製することができる。本発明の核酸は、これに限定されるものではないが、本発明の抗体の調製に利用される。
本発明の別の局面は、上記本発明の核酸を発現可能に保持するベクター(以下、「本発明のベクター」ともいう)、及び、該ベクターを有する形質転換細胞(以下、「本発明の形質転換細胞」ともいう)に関する。本発明の核酸又は当業者に周知のシグナル配列をつけた核酸(例えば実施例に記載の核酸を参照)を適当なベクターに組み込むことによって、宿主細胞内で本発明の抗体を発現させるために使用される発現ベクターを得ることができる。本発明の核酸を発現可能な状態で保持することができ、且つ保持した当該核酸を宿主細胞内で発現させることができる限り、任意のベクターを使用することができる。本発明の核酸のベクターへの挿入は、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた方法(Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)等、常法で行うことができる。使用するベクターの種類に応じて適切な宿主細胞が採用される。宿主細胞として例えばエッシュリヒア・コリ(Escherichia coli)等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞を用いることができる。
(a)本発明の形質転換細胞を培養する工程;及び
(b)発現産物である抗体を分離・精製する工程;
本発明の核酸を保持させたベクターで宿主細胞を形質転換することによって得られる形質転換細胞を培養することにより、形質転換細胞内又は培養液中に本発明の抗体を発現させることができる。そして、当該発現産物を分離・精製すれば本発明の抗体を取得できる。分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせればよい。
本発明の別の局面は、本発明の抗体および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物に関する。
更なる局面として、本発明の抗体を含有するCLCP1を発現するがんの治療又は予防に使用するための薬剤、及び、それを用いた治療又は予防方法、CLCP1を発現するがん細胞の遊走・浸潤・転移・増殖阻害剤、細胞障害剤並びに、CLCP1を発現する腫瘍の治療又は予防に使用するための薬剤が提供される。
また、以下の(a)から(g)を提供する。
(a)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の遊走阻害剤
(b)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の浸潤阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の浸潤阻害剤
(c)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の転移阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の転移阻害剤
(d)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の増殖阻害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の増殖阻害剤
(e)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の細胞障害活性を有する抗体を含有する、がん細胞の細胞障害剤
(f)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性、浸潤阻害活性、転移阻害活性、増殖阻害活性及び細胞障害活性から選ばれる少なくとも1つの活性を有する抗体を含有する、腫瘍の治療又は予防に使用するための薬剤
(g)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインを認識し、CLCP1を発現するがん細胞の遊走阻害活性、浸潤阻害活性、転移阻害活性、増殖阻害活性及び細胞障害活性から選ばれる少なくとも1つの活性を有する抗体を含有する、がんの治療又は予防に使用するための薬剤
ここでのがんの種類は、CLCP1を発現するがんであれば、特に限定されない。そのようながんの一例として、特に肺癌、リンパ節への転移がんを例示することができる。また、該がんの治療又は予防に使用するための薬剤は、遊走阻害、細胞浸潤阻害、転移阻害、細胞増殖阻害から選ばれる少なくとも1つの阻害効果および/又は細胞障害作用を有する。これらの製剤はがん転移に対して予防的に投与することもできる。
CLCP1への特異的結合性を保持することを条件として、上述の方法に従って得られた抗体に種々の改変を施すことができる。本発明では、このような改変抗体を利用してもよい。
本発明の上記製剤の投与経路も特に限定されない。即ち、本発明の上記製剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射、標的細胞への直接導入など)によって対象(患者)に適用され得る。
本発明の上記製剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人(体重約60kg)を対象として一回当たりの有効成分量が約0.001〜約100000 mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、三日に一回、一週間に1回、一月に1回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
本発明の別の局面は、以下の工程(a)及び(b)を含む、免疫学的手法に関する。
(a)本発明の抗体と、分離された細胞または組織を接触させる工程;及び
(b)該細胞または該組織におけるCLCP1の発現を検出する工程;
免疫学的手法としては、例えば、免疫組織化学的染色法、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、FCM、免疫沈降法、イムノブロッティング等が挙げられる。例えば、上記免疫学的手法のうち免疫組織化学的染色法によって、細胞または組織等の生体組織におけるCLCP1の発現量を検出する手順は、一般に後述の手順(1)〜(10)で実施される。
該免疫学的手法は、本発明の抗体を含有する、細胞または組織におけるCLCP1の発現量を免疫学的手法により検出するために用いられる薬剤と言い換えることができる。また、該免疫学的手法は、例えば、以下に述べる肺癌の診断方法に使用することができる。
細胞または組織としては、特に制限はないが、がん細胞、がん組織、がんの可能性がある細胞又は組織等が例示できる。
本発明の別の局面は、本発明の抗体を含有する、細胞または組織におけるCLCP1の発現を免疫学的手法により検出するために用いられる薬剤に関する。
該薬剤は、当業者に周知の担体を含むことができる。また、該薬剤は、例えば、以下に述べる肺癌の診断方法に使用することができる。
本発明の別の局面は、本発明の抗体を含有する、細胞または組織におけるCLCP1の発現を免疫学的手法により検出するために用いられるキットに関する。すなわち、本発明の抗体をはじめとして、標識の検出に必要な基質、強陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせてキットとすることができる。
また、該キットは、例えば、以下に述べる肺癌の診断方法に使用することができる。
本発明の更なる局面は、本発明の抗体が、肺がん、特に良好な肺癌への染色性を示した事実に基づき、がんの浸潤の部位、また、その度合い(浸潤度)あるいは転移状況、その部位を診断する方法を提供する(以下、「本発明の診断方法」ともいう)。本発明の診断方法は、本発明の抗体を、分離された病理組織に接触させ、免疫学的手法によって該病理組織におけるCLCP1の発現を検出する工程を含む。
本明細書において、「CLCP1の発現を検出する」とは、CLCP1を発現する細胞当たりのCLCP1の発現量、又は、CLCP1を発現する細胞の割合を検出することを意味し、細胞が癌であるおそれとCLCP1の発現、または、組織へのがんの浸潤度あるいは転移している部位とCLCP1の発現(免疫学的手法による染色強度、および、強染色される癌細胞の割合とも表現することができる)との間に強い関連性がある。
本発明の診断法によれば転移している状況・部位、あるいは、新たな組織に浸潤していくがん細胞の存在様式が視覚的にとらえることができる。
以下、本発明の診断方法を詳述する。
まず、生体よりがんの浸潤、転移が疑われる組織を分離する。
当該方法で得られる情報(検出結果)は、病理組織で肺癌細胞が浸潤の度合いあるいは転移している部位を判定するために利用される。
ここで、後述の実施例に示すように、浸潤度の異なる複数の肺癌組織、肺がん腫を、抗CLCP1抗体を用いて免疫染色したところ、染色性に顕著な違いを認め、染色性の高い部位が病理学的所見の癌部と一致していた。即ち、肺癌細胞の浸潤度・転移状況とCLCP1の発現量、細胞のCLCP1発現頻度との間に強い関連性が存在する。本発明の診断法によれば転移している部位及びその状況、あるいは、新たな組織に浸潤していくがん細胞の存在様式が視覚的にとらえることができる。即ち、肺癌細胞の浸潤度判定用のマーカーとしてもCLCP1が有効であることが判明した。
さらに、肺癌では正常肺に比較して有意にCLCP1発現が高い(染色性強度、組織中の細胞の発現頻度)。
この知見に基づき本発明の他の一態様では、上記ステップの検出結果を病理組織の悪性度を判定するために利用した方法、即ち癌細胞の悪性度を判定する方法が提供される。
一方、患者以外の者、即ち癌が認定されていない者を対象とした場合に得られた情報は、癌浸潤あるいは転移に関して罹患の有無の判定評価等に利用できる。本発明の方法によれば染色性という客観性に優れた指標を基に癌の診断を行えることから、その価値は非常に高いといえる。
対象(被検者、生体、患者)がヒトである場合、癌の診断は、通常、医師(医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。)によって行われるが、本発明の診断方法によって得られる、病理組織におけるCLCP1の発現量に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の診断方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
本発明の診断方法の対象となるがんの種類は特に制限されないが、例えば、腎がん、膀胱腫瘍、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、乳がん又は肺癌等、特に好ましくは肺癌が挙げられる。
対象(被検者、生体)から分離された細胞を用意する。癌患者に限らず、健常者(癌のおそれがある者を含む)をここでの対象とすることもできる。バイオプシー(生検)で採取した、対象の臓器や組織の一部を被検癌細胞として本発明の方法に供することができる。
本発明において「病理組織」とは、本発明の方法における検出をする際の試料(対象)となる組織である。病理組織は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態の病理組織に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、病理組織が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被検癌細胞がその由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。
抗体または抗体断片を接触させる際には、通常、病理組織は生体で存在していた状態、即ち周囲の細胞と結合した状態で(組織片として)調製され、本発明の方法に使用される。尚、病理組織を周囲の細胞から分離(単離)した後に本発明の方法に使用してもよい。なお、ここで、「接触」させるとは、抗体を含有した溶液にがん細胞又はがん組織を浸す、或いはがん細胞又はがん組織に抗体を含有した溶液を十分に滴下、或いは噴霧し、該抗体が、がん細胞またはがん組織中のCLCP1を認識できうる生理条件下におくことをいう。
通常は、病理組織において、CLCP1の発現の有無、及び発現している場合にはその量が調べられることになる。CLCP1を検出する際に厳密にCLCP1量を定量することは必須でない。例えば、病理組織の浸潤度あるいは転移している部位を判定するためにCLCP1を検出する場合には、浸潤度あるいは転移している部位の指標となる標準試料のCLCP1量と比較することによって病理組織の浸潤度あるいは転移している部位を判定することが可能な程度にCLCP1量を測定できればよい。
また、本発明の診断方法によれば、分離された病理組織の一部が、周囲の病理組織よりも染色強度が強い場合、該病理組織は癌のおそれがあると診断される。
ここでの癌の種類は、特に限定されない。そのような癌の例として、腎がん、膀胱腫瘍、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、乳がん等、好ましくは肺癌を例示することができる。後述する実施例において、肺癌組織標本を本発明の抗体で免疫染色したところ、該肺癌組織標本中の肺癌部位は、該肺癌組織標本中の非肺癌部位よりも強く染色されることが明らかになった。
特に、免疫学的手法(例えば免疫組織化学的染色法、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、FCM、免疫沈降法、イムノブロッティング等)でCLCP1を検出することが好ましい。免疫学的手法では抗CLCP1抗体が使用され、当該抗体の結合性(結合量)を指標としてCLCP1タンパク質が検出される。免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。
免疫組織化学的染色法によれば、迅速に且つ感度よくCLCP1を検出できる。また、操作も簡便である。従って、CLCP1の検出に伴う被検者(患者)への負担も小さくなる。
免疫組織化学的染色法では通常、まず被検病理組織に抗CLCP1抗体を接触させるステップを実施し、その後、抗CLCP1抗体の結合量を調べる。具体的には、以下に示す免疫組織化学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。
(1)固定・パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド、無水エチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ(例えば3〜5μm厚)に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理(抗原賦活)
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び/又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液(例えば1%溶液)で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(6)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた2次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(8)発色反応
トリス緩衝液にDAB(3,3'-diaminobenzidine)を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間(例えば5分間)切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(9)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする(通常、数分間)。
(10)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
抗CLCP1抗体は、上述の方法に従って調製することができる。
CLCP1への特異的結合性を保持することを条件として、上述の方法に従って得られた抗体に種々の改変を施すことができる。本発明では、このような改変抗体を利用してもよい。
本発明の予後診断方法の対象となるがんの種類は特に制限されないが、例えば、腎がん、膀胱腫瘍、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、乳がん又は肺癌等、特に好ましくは肺癌が挙げられる。
本発明の予後診断方法は、本発明の抗体を、分離された病理組織に接触させ、免疫学的手法によって該病理組織におけるCLCP1の発現を検出する工程を含む。当該工程の詳細は、上記の本発明の診断方法の例による。
本発明の予後診断方法では、分離された病理組織の組織染色強陽性症例群の生存率は、組織染色弱陽性・陰性症例群の生存率より低いと診断される。
例えば、カプラン・マイヤー(Kaplan - Meier)分析法における生存率の術後1年(12か月)経過時点で、組織染色強陽性症例群の生存率が73%であるのに対し、組織染色弱陽性・陰性症例群が93%であり、術後3年(36か月)経過時点で、組織染色強陽性症例群55%、組織染色弱陽性・陰性症例群90%と診断される。
ここで、組織染色強陽性とは、図37B上のように、分離された病理組織における細胞の細胞膜が明瞭に描出される(細胞膜の輪郭が顕微鏡下で視認できる)染色結果を意味し、組織染色弱陽性とは、図37B下のように、分離された病理組織における細胞の細胞膜が不明瞭にしか描出されない(細胞膜の輪郭が顕微鏡下で視認できない)染色結果を意味し、組織染色陰性とは、分離された病理組織における細胞の細胞膜が全く描出されない染色結果を意味する。
また、本発明は、本発明の抗体を含有する、上記予後診断方法に用いるためのキットや薬剤もまた提供するものである。
本発明の別の局面は、以下の工程(a)から(c)を含む、癌細胞の増殖、浸潤、遊走、若しくは、転移を阻害する候補物質、又は、がん細胞に細胞障害活性を有する候補物質のスクリーニング方法に関する。
(a)被験物質をヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインと接触させる工程;
(b)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインと被験物質との結合活性を検出する工程;及び
(c)ヒトCLCP1抗原の細胞外ドメインと結合する被験物質を選択する工程;
各工程は、上述した技術または公知の技術を用いて実施される。
具体的な本発明の一例を以下に実施例として示すが、本発明の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
NCBI ESTデータベースからCLCP1に対応するESTを選択し、3’側は3’-RACEにて確定し、ヒトCLCP1全長のcDNA配列を決定して、データベースに登録した(GenBankデータベース Accession No.:AB073146 、Koshikawa K, et al Oncogene 21: 2822-2828 、2002)。このヒトCLCP1のcDNA配列(GenBankデータベース Accession No.: AB073146 (NM_080927と同一配列))に基づいて、このORF開始点(364番目)直前の336〜356番目の塩基配列(5’-CTATGCAGGC AGACTGCCGG C-3’(配列番号:24))に基づき、5'側末端にHindIII認識配列(AAGCTT)を付加し、読み枠の異なるATG(下線部)からの翻訳開始を防止するためにATG =>TTG変異を加えた(下線部)プライマー:5’-CCCAAGCTTT GCAGGCAGAC TGCCGGC-3’(配列番号:25))、及び終止コドン直前の2664 〜 2688番目の塩基配列の相補配列にKpnI認識部位(GGTACC)を5'側末端に付加したプライマー5'- CGAGGTACCAAGGATTTCTTTAAAAACATCACAT -3'(配列番号:26))を作製した。このプライマーとRNAeasy kit(Qiagen社)を用いて調整した正常肺組織由来RNAを用いて RT-PCRを行い、ヒトCLCP1のcDNAを増幅し、PCR産物をクローニングベクターpBSSKII(Stratagene)のHindIII-KpnI間にクローニングし塩基配列を確認した(付加配列を含めて約2362bp、翻訳領域2331bp, 777コドン(CLCP1 HindIII-KpnI))。塩基配列の確認は、オートシークエンサー(アプライドバイオシステム社製)を用いた。配列確認後に、CLCP1をHindIII/KpnIで切り出し、Michigan大学医学部N Inohara博士から提供されたHA-tag蛋白発現用ベクターpcDNA3-HAのHindIII-KpnI間に挿入し、HA-tag付加された全長CLCP1発現ベクターpcDNA3-CLCP1-HAを得た。
ヒトCLCP1全長(アミノ酸位置1〜775)、ヒトCLCP1細胞外領域全長(アミノ酸位置1〜526)を動物細胞に発現させるためのベクターは、CMVプロモータで制御され、IRES配列により目的遺伝子とPuromycin-EGFP fusion proteinが同時に発現するpQCXIPGを用いた。一方、ヒトFA58Cドメインを含むヒトCLCP1部分長(アミノ酸位置284〜526)を動物細胞に発現させるためのベクターは上記pQCXIPGのマルチクローニングサイトの上流にChicken egg white Lysozymeの分泌シグナル配列(アミノ酸配列:MRSLLILVLCFLPLAALG|AAA(配列番号:27)、遺伝子配列:ATGAGGTCTTTGCTAATCTTGGTGCTTTGCTTCCTGCCCCTGGCTGCTCTGGGG|GCGGCCGCC(配列番号:28)。「|」は、シグナル配列と構造蛋白質との境界を示す)を付加し、導入遺伝子の翻訳産物を細胞外に強制分泌させることを可能にするベクター(lyssig-pQCXIPG)を用いた。pQCXIPG及びlyssig-pQCXIPGは、発明者らが「BD Retro-XTM Q Vectors」のpQCXIPをベースとして改変したベクターである。
目的遺伝子のPCRによる増幅は、すべて上記pcDNA3-CLCP1-HAを鋳型としてKOD-Plus-(TOYOBO)を用いて行った。
ヒトCLCP1全長は、5’Primer:5’-AATAGCGGCCGCACCATGGCGAGCCGGGCGGTG-3'(配列番号:29、下線部はNotIサイト)と、3’Primer:5'-ACGCGTCGACAAGGATTTCTTTAAAAACATCACATTC-3’(配列番号:30、下線部はSalIサイト)を用いて増幅したPCR産物(サイクル[99℃ 30秒、61℃ 30秒、68℃ 2分]を34サイクル)、ヒトCLCP1細胞外領域全長は、5’Primer:5’-AATAGCGGCCGCACCATGGCGAGCCGGGCGGTG-3'(配列番号:29、下線部はNotIサイト)と、3’Primer:5'−ACGCGTCGACTACATCTTTGGTTACATTTGGAG-3’(配列番号:31、下線部はSalIサイト)を用いて増幅したPCR産物(サイクル[99℃ 30秒、61℃ 30秒、68℃ 2分]を34サイクル)をそれぞれ制限酵素NotIとSalIで消化した断片をpQCXIPGのNotI-XhoIサイトへ導入し、発現ベクターpQCXIPG-fullとpQCXIPG-ECを構築した。一方、FA58Cドメインを含むヒトCLCP1部分長は、5’Primer:5’-AATAGCGGCCGCTCTTTTTACATTTAAGACAAGTGG-3'(配列番号:32、下線部はNotIサイト)と、3’Primer:5'-ACGCGTCGACAAGGATTTCTTTAAAAACATCACATTC-3’(配列番号:30、下線部はSalIサイト)を用いて増幅したPCR産物(サイクル[99℃ 30秒、61℃ 30秒、68℃ 2分]を34サイクル)を制限酵素NotIとSalIで消化した断片をlyssig-pQCXIPGのNotI-XhoIサイトへ導入し、発現ベクターpQCXIPG-FAを構築した。
抗原発現細胞株を樹立には、Pantropic Retroviral Expression System(Clontech;K1063-1)を用いた。Collagen-coated 100mm dishに80〜90%コンフルエント状態のGP2-293(Clontech;K1063-1)を準備し、Lipofectamine 2000を用いて上記構築した発現ベクター(pQCXIPG-fullもしくはpQCXIPG-ECもしくはpQCXIPG-FA)とpVSV-G(Clontech;K1063-1)各11.2μgずつをco-transfectionした。48時間後、ウイルス粒子を含む上清を回収し、超遠心(18,000rpm, 1.5h, 4℃)によりウイルスを沈殿させ、その沈殿物を30μLのTNE(50mM Tris-HCl [pH 7.8], 130mM NaCl, 1mM EDTA)で懸濁し、レトロウイルスベクター濃縮液を調製した。
レトロウイルスベクター濃縮液5μLを8μg/mLのHexadimethrine bromide(SIGMA;H-9268)を含んだ150μLのDMEM(SIGMA;D5796)-10%FBSで希釈し、ウイルス粒子入りの培地を調製した。96穴のマイクロプレートに約40%コンフルエントの状態になるように準備した293Tの培地を、調製したウイルス粒子入りの培地と交換することにより、pQCXIPG-fullもしくはpQCXIPG-ECもしくはpQCXIPG-FAを遺伝子導入した。遺伝子導入後、5μg/mLのPuromycin(SIGMA;P-8833)を含むDMEM(SIGMA;D5796)-10%FBSで拡大培養し、抗原発現細胞株(hCLCP1-full/293T、hCLCP1-EC/293T、hCLCP1-FA/293T)を樹立した。
樹立した上記発現細胞株(hCLCP1-EC/293T、hCLCP1-FA/293T)をDMEM-10%FBS(5μg/mL puromycin)もしくはCD293(Invitrogen)で培養した上清を約1L回収し、そこからmyc-tag抗体を化学修飾した担体を充填したアフニティカラム、もしくは、TALON Purification Kit(Clontech;K1253-1)を用いて、myc-His Tag付きのリコンビナント蛋白質を精製後、PBSで透析し、SDS-PAGE及びウェスタンブロットにて精製蛋白質を確認した。プロテインアッセイキットII(BioRad;500-0002JA)を用いて蛋白質濃度を決定し、免疫原用抗原とした。
ヒトCLCP1細胞外領域精製蛋白質もしくはヒトCLCP1のFA58Cドメインを含む部分長精製蛋白質を同量のコンプリートアジュバント(SIGMA;F5881)と混合してエマルジョンにし、BALB/cマウス(メス)に5〜50μg/headで3〜7日おきに数回免疫した。最終免疫の3〜5日後にマウスからリンパ球細胞を摘出し、マウス骨髄腫細胞P3U1(P3-X63Ag8U1)との細胞融合を行った。
細胞融合は次に示す一般的な方法を基本として行った。全ての培地中のFetal Bovine Serum(FBS)は、56℃で30min保温する処理により、非働化したものを使用した。P3U1は、RPMI1640-10%FBS(Penicillin, Streptomycin 含)で培養して準備した。
摘出したマウスのリンパ球細胞とP3U1を10:1〜2:1の割合で混合し、遠心した。沈殿した細胞に50%ポリエチレングリコール4000(Merck;1.09727.0100)を融合促進剤として徐々に加えながら穏やかに混合し、細胞融合を行った。さらにRPMI1640を徐々に加えながら穏やかに混合後、遠心した。沈殿した融合細胞を、15%FBSを含むHAT培地(RPMI1640, HAT-supplement(Invitrogen;11067-030), Penicillin, Streptomycin)で適宜希釈し、200μL/wellで96穴のマイクロプレートに播種した。
融合細胞をCO2インキュベータ(5%CO2、37℃)中で培養し、コロニーが十分に形成されたところで、培養上清をサンプリングしてスクリーニングを行った。
スクリーニングは、免疫に使用したCLCP1抗原を感作した96穴プレートに対するELISAで陽性となったものの中から、全長CLCP1を強制発現させた293T(hCLCP1-full/293T)に対するフローサイトメトリーで反応性が確認されたハイブリドーマを選別した。15%FBSを含むHT培地(RPMI1640, HT-supplement(Invitrogen;21060-017), Penicillin, Streptomycin)でこれらを拡大培養後、限界希釈(limiting dilution)法により単クローン化した。このようにして、抗ヒトCLCP1抗体(細胞外領域全長蛋白質(アミノ酸位置1〜526)を免疫原として1クローン(抗体番号:EC6-8)、FA58Cドメインを含んだ部分長蛋白質(アミノ酸位置284〜526)を免疫原として10クローン(抗体番号:FA2-10、FA7-6、FA9-1、FA10-3、FA12-3、FA14-9、FA16-3、FA17-9、FA19-1、FA20-3))を産生するハイブリドーマクローンを11種類得た。
以上のように得られた抗体の、内因性ヒトCLCP1への反応性を検証するため、CLCP1高発現細胞H460−LNM35株に対する反応性を次のように確認した。各ハイブリドーマクローンの培養上清からProtein A-Sepharoseを用いた一般的なアフィニティー精製法により抗ヒトCLCP1抗体をそれぞれ精製した。得られた精製抗体をそれぞれ5μg/mLに希釈し、H460-LNM35に対する反応強度をフローサイトメトリーにより確認した。この時、細胞表面に結合した抗CLCP1モノクローナル抗体の検出はPhycoerythrin標識-抗マウスIgG抗体を用いたが、全てのサンプルにおいて同条件で行った。その結果、図2に示すように、抗体番号:FA10-3、FA16-3を除く9クローン(抗体番号:EC6-8、FA2-10、FA7-6、FA9-1、FA12-3、FA14-9、FA17-9、FA19-1、FA20-3)で反応が確認され、内因性のヒトCLCP1に対して反応性を示すことが明らかとなった。特に、EC6-8、FA17-9、FA19-1の3クローンで格段に反応性が強いことが示唆された。
確立した抗ヒトCLCP1抗体9クローンを一般的な方法によりビオチン化した。一定濃度のビオチン化抗体(1μg/mL)に対して、未標識抗体を2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mLで添加した各反応液とH460-LNM35株を反応させ、Phycoerythrin標識-StreptAvidinを用いて細胞表面に結合したビオチン化抗体量をフローサイトメトリーで検出することで、阻害実験を行った。この実験系では、評価するビオチン化抗体と添加した未標識抗体が認識するエピトープが近傍であれば、ビオチン化抗体の結合量が阻害されるため、未標識抗体添加濃度依存的にその反応が変化する。これを得られたモノクローナル抗体における全ての組み合わせで行うことによりエピトープ解析(エピトープグルーピング)を行った。特に反応性が強い3クローンにおける解析結果を図3に示す。縦軸がビオチン化抗体(Phycoerythrin標識-StreptAvidin)の結合量(平均蛍光強度;MFI)、横軸が未標識抗体の添加量(μg/mL)である。全クローンの結果から、EC6-8以外の8クローン(抗体番号:FA2-10、FA7-6、FA9-1、FA12-3、FA14-9、FA17-9、FA19-1、FA20-3)は全て近傍のエピトープを認識することが示唆された。
上記ビオチン化抗体による阻害実験で、唯一、認識するエピトープが異なったEC6-8が認識するエピトープがどの領域であるかを免疫沈降法により解析した。標的蛋白質としては、細胞外領域全長蛋白質(アミノ酸位置1〜526)とFA58Cドメインを含んだ部分長蛋白質(アミノ酸位置284〜526)を用いた。EC6-8を結合させたProtein G-Sepharoseに、これらそれぞれの標的蛋白質を反応させて免疫沈降を行い、得られたサンプルからウェスタンブロットによりmycタグ抗体で標的蛋白質を検出することで、EC6-8との結合を確認した。結果を図4に示す。その結果、細胞外領域全長蛋白質(アミノ酸位置1〜526)とFA58Cドメインを含む部分長蛋白質(アミノ酸位置284〜526)、どちらも免疫沈降されてくることが明らかとなり、EC6-8が認識するエピトープがアミノ酸位置284〜526の領域内にあることが示された。内因性CLCP1に反応性を示す抗CLCP1抗体9クローン(抗体番号:EC6-8、FA2-10、FA7-6、FA9-1、FA12-3、FA14-9、FA17-9、FA19-1、FA20-3)において、上記ビオチン化抗体による阻害実験とあわせて明らかとなったエピトープグルーピングの結果を同じく図4に示す。
特に反応性が強い3クローンにおいて、相対的な親和性を次のように解析した。各精製抗体を同条件下(同数のH460-LNM35(1×105個)、同濃度の各精製抗体、同濃度の2次(検出)抗体)におけるフローサイトメトリーの平均蛍光強度の解析を行った。また、抗体濃度依存的な平均蛍光強度もデータを取得し、低濃度での検出限界を解析することで、相対的な親和性を評価した。その結果をグラフ化したものを図5に示す。グラフの横軸は使用した抗体濃度(ng/mL)、縦軸はフローサイトメトリーにおける平均蛍光強度(MFI)である。その結果、相対的な親和性は、EC6-8>FA17-9>FA19-1、となった。
更に以上のようにして得られた抗体が確かにCLCP1を認識しているか、以下のようにWestern blot及び免疫染色で内因性CLCP1に対する反応性を検討して再確認した。
Nagai H, et al Oncogene 26:4025-4031(2007)に示しているように、CLCP1高発現細胞 H460-LNM35細胞から、CLCP1に対するsiRNAに細胞内で生合成されるshRNA(short hairpin RNA)を恒常的に発現し、mRNAレベルでCLCP1の発現が著減していることが確認されている亜株を樹立しており(Nagai H, et al Oncogene 26:4025-4031(2007)siCLCP1-3 #9細胞)、このsiCLCP1-3、#9細胞(図8: CLCP1 Knockdown)とH460-LNM35細胞とを用いて、Western blotを施行した。
CLCP1高発現細胞株H460-LNM35とsiCLCP1-3 #9細胞 2x106個を溶解バッファ(Tris(pH=6.8) 50mM, Glycerol 5%, SDS 2%)に懸濁し、DC Protein Assay kit (Bio-Rad)を用いて蛋白濃度を測定した。その後、2-メルカプトエタノールを 5.3%添加し加熱した後に、20μgずつSDS-PAGEに供し、各抗体とHRP標識抗マウスあるいは抗ウサギ抗体にてウエスタンブロットを施行した。その結果FA19-1, FA17-9で同一サイズのシグナル(シグナル強度: FA19-1>FA17-9)が得られた(図12)。一方、siCLCP1-3 #9細胞ではシグナルは殆ど得られず、ウエスタンブロットでFA19-1及びFA17-9が特異的にCLCP1を認識していることが確認された。
CLCP1高発現細胞株H460-LNM35 1x107個を免疫沈降用溶解バッファ(HEPES(pH=7.5) 10mM, NaCl 300mM NP-40 0.5%, EDTA 5mM, DTT 0.5mM, Protease Inhibitor Cocktail Complete (Roche) x1)に懸濁した。その後、微量遠心管(Eppendorf tube)に1/10の懸濁液を入れ、それぞれFA2-10、FA7-6、FA9-1、FA12-3、FA14-9、FA17-9、FA19-1、FA20-3、EC6-8 (及び兎ポリクナール抗体)の各抗体1μgを加えて、2時間4℃で攪拌した。その後ProteinG-sepharose (GE ヘルスケア) 20μl加えてさらに1時間攪拌した。その後、3000rpm 1分間遠心しProteinG-sepharoseを沈殿させ、沈殿物を免疫沈降用溶解バッファにて4回洗浄した。その後その沈殿物をSDS-PAGEに供し、FA19-1抗体とHRP標識抗マウス抗体にてウエスタンブロット施行した。その結果、(兎ポリクナール抗体を除き)すべてのモノクローナル抗体で上記FA19-1/FA17-9と同一サイズのシグナルが得られ、これらのモノクローナル抗体が、CLCP1を特異的に認識していることが確認された(図7(A)下)。更に、FA9-1, FA17-9, FA19-1, EC6-8で特に強いシグナルが得られ、これらのモノクローナル抗体で特に強い反応性を持つことが確認された。
以上のように免疫沈降でCLCP1蛋白の強いシグナルが得られた、FA9-1, FA17-9, FA19-1, EC6-8の4抗体に関して、上記siCLCP1-3、#9細胞(図8(A)下: CLCP1 Knockdown)とH460-LNM35細胞(図8(A)上)とを用いて免疫組織染色を行った。その結果、FA19-1のみで、H460-LNM35細胞特異的に細胞表面にシグナルが得られ、今回の実験条件ではFA19-1のみがパラフィン包埋した標本の免疫組織染色でCLCP1検出に使用できることが確認された(図8(A))。
その後、肺癌組織標本もFA19-1で染色を試み、肺癌症例でもFA19-1強陽性となる症例が確認された(図8(B, C))。
以上のようにして得られた抗体が、さらに組織中の転移評価に用いられるか試験した。具体的には以下のように行なった。
(1)切片作製
各々の肺癌の臨床検体(肺扁平上皮癌あるいは、肺腺癌)は、ホルマリン固定後パラフィン包埋組織検体を用いた。検体はミクロトームにより3μmの厚さで薄切後,剥離防止コートスライドグラス(MAS-GP, typeA, MATSUNAMI)に張り付けた。
(2)染色
以下但し書きのない場合は切片を室温にて処理した。スライドグラス上の切片を,脱パラフィン処理後,イムノセイバー(日新EM,イムノセイバーを蒸留水にて200倍に希釈)に浸し,電動ポットにて98℃に保温した状態で50分間反応させ抗原賦活化を行った。次に,20分3%過酸化水素加メタノール処理にて内因性ペルオキシダーゼを不活化させた。PBSで5分間ずつ3回洗浄を行った。一次抗体は抗CLCP1抗体(FA19-1)を用い,1%BSA/1%メチロザール/PBSにより250倍に希釈して1時間反応させた。PBSで5分間ずつ3回洗浄を行った。二次抗体はビオチン標識馬抗マウス免疫グロブリン抗体(Vectastain ABC Kit, VectorLab.)を用い,30分間反応させた。ABC reagent(Vectastain ABC Kit, Vector Lab.)を滴下し,ABC法により60分間反応させた。PBSで5分間ずつ3回洗浄を行った。DAB(3,3’-Diaminobenzidine)反応液(20mgDAB/100ml)は,蒸留水100mlにDABトリス錠(武藤化学薬品)を2錠加え溶解後,過酸化水素を3,4滴加えて作製した。DAB反応液に12分間切片を浸し発色させた。水道水,蒸留水にて水洗後,ヘマトキシリンによる核染を行い,脱水・透徹・封入し,鏡検した。肺癌組織への染色結果を(図8(B,C))に示す。
その結果、二人の肺癌患者検体の染色結果を示す。
検体1((図8(B): 肺扁平上皮癌)では、癌組織が染色陽性である。
図8(B)左:肺癌組織で均一に細胞表面が染色陽性となり、周辺非癌部分(所謂、間質部分)は染色陰性である。
図8(B)中:癌が正常肺組織に浸潤している部分は浸潤癌細胞が染色陽性で、残存正常肺部分は染色陰性である。
図8(B)右:癌と離れた正常肺組織部分は染色陰性である。なお、黒点に見えるのは鉄粉沈着部である。
以上のように癌組織と非癌組織が明瞭に染め分けられていた。この結果は顕微鏡による病理学的な所見のがん部と一致した。
検体2(図8(C):肺腺癌)も癌組織の染色は陽性である。しかし、検体1と比較すると、(おそらくCLCP1遺伝子発現が検体1よりも低いために)染色がやや弱く、染色が不均一な部位も見られる。
図8(C)左:肺癌組織で均一に染色陽性である。細胞表面が強く染色陽性であるが、細胞質も染色される。周辺非癌部分(所謂、間質部分)は染色陰性である。
図8(C)中:同一肺癌組織の他の部位でも、大部分が染色陽性である。しかし、やや染色が不均一で、染色陰性の癌細胞も見られる。周辺非癌部分(所謂、間質部分)では、ごく一部の間質細胞が例外的に染色陽性となっているが、ほとんどの周辺非癌部分は染色陰性である。
図8(C)右:癌と離れた正常肺組織部分は染色陰性である。なお、黒点に見えるのは鉄粉沈着部である。
以上のように、検体2でも癌組織と非癌組織が明らかに染め分けられていた。この結果は顕微鏡による病理学的な所見のがん部と一致した。
以上から、FA19-1は、組織染色においてもパラフィン包埋した標本の免疫組織染色に使用できることが確認され、図8に示される肺癌組織標本中の非肺癌部位の染色強度よりも病理組織の染色強度が強い場合は、該病理組織は肺癌のおそれがあると診断される。なお、本発明の抗体での染色された部位は、病理形態学的に肺癌と推察される部分と一致し、染色されなかった部分は正常部位と推察される部分と一致し、総じて顕微鏡の病理学的所見と一致していた。
実施例11と同様な手法で、FA19-1を用い、下記正常な組織切片に対し染色性を確認した。
その結果、濾胞上皮の細胞質以外では、特異的かつ、顕著な染色性はなかった。
抗CLCP1抗体FA19-1抗体を用いて肺癌検体を、前述のとおりの組織染色法で染色、肺がん検体染色性と予後予測の関連を検討した。
その結果、肺がんの組織染色が、細胞膜染色強陽性群では、カプラン・マイヤー(Kaplan - Meier)分析法 における生存率の術後1年(12か月)経過時点で、抗CLCP1抗体の組織染色強陽性症例(細胞膜染色強陽性症例)群の生存率が73%であるのに対し、弱陽性・陰性症例(細胞膜染色弱陽性、又は陰性症例)群が93%であり、術後3年(36か月)経過時点で、強陽性症例群55%、弱陽性・陰性症例群90%となり、強陽性症例群の生存率が継続的に低い。この差異を、2群間の生存率の有意差を検定するのに一般的に用いられるlogrank test(ログランク検定)又はgeneralized Wilcoxon test (一般化ウィルソン検定、Gehan-Wilcoxon検定)を用いて検定すると、ログランク検定でp=0.012, 一般化ウィルソン検定でp=0.0072となり、統計学的に有意に強陽性症例の生存率が低いことが判明した(図37A)。
なお、ここで本抗体の免疫組織学的反応性は強陽性(+)、弱陽性(±)、陰性(-)の3群に分別された。具体的には、図37B上のように細胞膜が明瞭に描出される症例(細胞膜の輪郭が視認できる)染色を強陽性、図37B下のように細胞膜が不明瞭にしか描出されない症例(細胞膜の輪郭が視認できない)を弱陽性、更に細胞膜が全く描出されない症例を陰性とした。
まず抗体曝露として、RPMI1640培地(0.25% FCS)で、5x104 〜 2x105細胞/mlの濃度のH460-LNM35細胞の細胞浮遊液を作製し、微量遠心管(Eppendorf tube)に分注し、各抗体を1.5μg 〜 5μg/mlの濃度で加え、室温で30分静置した。その後、その処理細胞を用いて、浸潤活性試験(invasion assay)を文献(Kozaki K et al. Cancer Res. 60: 2535-40, 2000.) に記載の方法に準じて行った。すなわち、10μgの基底膜再構成基質マトリゲルでコートしたポアサイズ8-μmのセルカルチャーインサート、或いは、基底膜再構成基質マトリゲルでコートされた「マトリゲルインベージョンチャンバー(ベクトン・ディッキンソン)」を、各穴(下層)にRPMI1640(5% FCS)培養液を1 ml添加した24穴プレートに設置し、チャンバー内(上層)に、RPMI1640培地(0.25% FCS)で調製し抗体曝露したH460-LNM35細胞浮遊液(5x104 〜 2x105細胞/ml)を0.5 ml播種した(2.5 x 104 〜 1x105 細胞/チャンバー)。その後、37℃、5% CO2の条件下、48時間インキュベーションした。上層に残った細胞およびマトリゲルを綿棒できれいにふき取り、下層に残った細胞を70% エタノール溶液で固定後、ギムザ染色液で染色した。下層の細胞を顕微鏡で計測し、抗体無添加群をもとに各抗体の浸潤活性(%)を下記式により求めた。結果を図6(A)に示す。
浸潤活性(%)=抗体添加時の浸潤癌細胞数/抗体無添加時の浸潤癌細胞数×100
図6(A)の結果より、特に抗体FA17-9とFA19-1が、高転移性ヒト肺がん細胞H460-LNM35細胞に対して、対照の抗体(マウスIgG)よりも強い浸潤阻害活性を有することが示された。
上記と同様に、抗体曝露として、RPMI1640培地(0.25% FCS)で、5x104 〜 2x105細胞/mlの濃度のH460-LNM35細胞の細胞浮遊液を作製し、微量遠心管(Eppendorf tube)に分注し、各抗体を1.5μg 〜 5μg/mlの濃度で加え、室温で30分静置する。その後、その処理細胞を用いて、遊走活性試験(motility assay)を文献 (Kozaki K et al. Cancer Res. 60: 2535-40, 2000.) に記載の方法に準じて行った。すなわち、ポアサイズ8-μmのセルカルチャーインサート(ベクトン・ディッキンソン)を、各穴(下層)にRPMI1640培地(0.25% FCS)を1 ml添加した24穴プレートに設置し、チャンバー内(上層)に、RPMI1640培地(0.25% FCS)で調製し抗体曝露したH460-LNM35細胞浮遊液(5x104 〜 2x105細胞/ml)を0.5 ml播種した(2.5 x 104 〜 1x105 細胞/チャンバー)。その後、37℃、5% CO2の条件下、24時間インキュベーションした。上層に残った細胞を綿棒できれいにふき取り、下層に残った細胞を70% エタノール溶液で固定後、ギムザ染色液で染色した。下層の細胞を顕微鏡で計測し、抗体無添加群をもとに各抗体の遊走活性(%)を下記式 により求めた。結果を図6(B)に示す。
遊走活性(%)=抗体添加時の遊走癌細胞数/抗体無添加時の遊走癌細胞数×100
図6(B)の結果より、特に抗体FA17-9とFA19-1が、高転移性ヒト肺がん細胞H460-LNM35細胞に対して、対照の抗体(マウスIgG)よりも強い遊走阻害活性を有することが示された。
以前、発明者らは親株であるNCI-H460をマウス移植による転移能の強弱で2種類の亜株に分離している。高転移株であるNCI-H460-LNM35の細胞膜上に存在するCLCP1の発現量が、低転移株であるNCI-H460-N15よりも高いことがFA19‐1による染色で確認された(図17)。同様に親株のNCI-H460をFA19-1による染色を行うと、ヘテロな細胞集団であることが認められた。このことから細胞膜上に発現しているCLCP1が転移能に一定のかかわりがあることが初めて示唆された(図17)。
[実施例17]各種がん細胞株でのCLCP1抗原発現状況(FCM)
FCMにて各種がん細胞株のCLCP1発現を抗CLCP1抗体(FA19-1;5μg/mL)を用いたFCMで評価した。用いた細胞株とその由来を表2−1及び表2−2に記載した。
肺がんのほか、CLCP1発現顕著ながん種細胞株として特に、腎癌(例えばCaki-1細胞株)、膀胱癌(例えばT24細胞株)、前立腺癌(例えばPC3細胞株)、膵臓癌(例えばPK-45p細胞株)、胃癌(例えばGCIY細胞株)、大腸癌(例えばSW480細胞株)、乳癌(例えばBT-20細胞株)が挙げられる。特に、図20中MFIの20以上の場合、発現が顕著に亢進しているといえる。
上記と同様に、抗体曝露として、RPMI1640培地(10% FCS)でH460-LNM35細胞の6x104細胞/ml細胞浮遊液を準備し、培養用6-well plate (ベクトン・ディッキンソン)に0.5 mlずつ播種(3x104細胞/well)した。その後各wellに表示の抗体を表示濃度(図7(B): 1, 2.5, 5 μg/ml, 図13:0.5, 1, 2.5, 5 μg/ml)加えて、その後、37℃, 5% CO2の 条件下、24時間インキュベーションした。その後PBSで洗浄後に各wellに溶解バッファ(Tris(pH=6.8) 50mM, Glycerol 5%, SDS 2%)200 μl加え細胞溶解液を調製した。上記のようにDC Protein Assay kit (Bio-Rad)を用いて細胞溶解液の蛋白濃度を測定した。その後、2-メルカプトエタノールを 5.3%添加し加熱した後に、5μgずつSDS-PAGEに供し、FA19-1抗体とHRP標識抗マウス抗体にてウエスタンブロットを施行した。その結果対照のマウスIgG曝露及び無処理細胞に比して、FA9-1, FA17-9, FA19-1, EC6-8 (図7(B)、図13)でCLCP1シグナルの減弱が見られた。Nagai H, et al Oncogene 26:4025-4031(2007)でみられたSEMA4B曝露によるCLCP1の分解と同様に、抗CLCP1抗体曝露によりCLCP1の分解が誘導されることが確認された。
同様にH460-LNM35細胞を培養用6-well plateにて、FA17-9, FA19-1及び対照マウスIgGに曝露し(濃度1 μg/ml, 5 μg/ml)、37℃, 5% CO2の条件下、24時間インキュベーションした。その後PBS洗浄しPBS/0.5mM EDTA液にて細胞を剥離し、細胞懸濁液を作製した。その後、処理したものと同じ各抗体と、Alexa Flour 488標識抗マウス抗体(Molecular Probe)を用いてFACS Caliber (ベクトン・ディッキンソン)にてフローサイトメトリー解析を行った(図14)。その結果、細胞表面のCLCP-1発現量はFA19-1曝露により減少することが確認された。抗CLCP1抗体FA19-1曝露により細胞表面のCLCP1の分解又は細胞内へのインターナリゼーションが誘導されることが確認された。
実施例3に示したように作製されたヒトCLCP1細胞外領域精製蛋白質(ECD:Extra-cellular domain)を免疫原として、新規抗体2AA_62-4、2AA_83-6、2AA_111-3、2AA_171-1、2AA_197-3のクローンを得た。また、同様に実施例3に示したように作製されたヒトCLCP1のFA58Cドメインを含む部分長精製蛋白質(FA)を免疫原として、新規抗体6AA_17-2、6AA_44-3、6AA_60-1、6AA_61-2、6AA_95-5を取得した。
実施例9と同様の方法で、新規抗体のFCMにおける抗体結合強度の評価を行った。3クローン(2AA_171-1、6AA_17-2、2AA_197-3)でFA19-1以上の反応性を示した (図24)。
(1)部分たんぱく質断片に対するELISAの反応性からの認識ドメインの推定
実施例3で調製した免疫用抗原に対するELISAによって、抗体の認識ドメインの推定を行った。ヒトCLCP1細胞外領域精製蛋白質もしくはヒトCLCP1のFA58Cドメインを含む部分長精製蛋白質をPBSで0.5μg/mLに希釈した溶液をプレート(NUNC;MaxiSorp)に50μL/wellで添加し、室温で4時間以上静置することで固相化した。BSAでブロッキングした後、1次反応としてPBSで1μg/mLに希釈した各抗体を添加し、室温に1時間静置した。HRP標識抗マウス抗体を2次反応とした常法により、各固相化蛋白質に対して結合した抗体を検出した。その結果、2AA_ 171-1は、細胞外ドメインを認識するがFA58Cドメインを含む部分長を認識しないことが判明した(図25)。
(試験手順方法の具体的記載)
実施例7と同様の方法でFCMにおける新規抗体の競合阻害実験を行った。ビオチン化抗体に対して、各未標識抗体を添加することにより、全組み合わせの阻害実験を行った。FCMでFA19-1以上の反応性を示した3クローン(2AA_171-1、6AA_17-2、2AA_197-3)についての結果を例として表3及び図31に示す。6AA_17-2、2AA_62-4はEC6-8、FA19-1双方に競合した。
(1)と(2)の結果から推測されるエピトープグルーピングを行い、その結果を図33に示す。 2AA_171-1のみがFA58Cを含む領域以外を認識し、他はFA58Cを含む領域を認識する。6AA_17-2、2AA_62-4はEC6-8、FA19-1双方に競合し、その2つが認識するエピトープと近傍のエピトープを認識する。2AA_83-6、6AA_44-3、6AA_60-1、6AA_61-2、6AA_95-5は同じエピトープを認識するが、EC6-8、FA19-1とは異なり、2AA_111‐3や2AA_197‐3は他のすべての抗体と競合しなかった。
実施例18に記載の方法と同様に6well plateで培養のNCI-H460-LNM35細胞又はA549細胞を未標識の各抗体5μg/mLで24時間曝露後、PBS/0.5mM EDTA液にて剥離した細胞をFCM(図34)及びWB(図35)により細胞膜上に残存したCLCP1分子をビオチン化抗体で検出した。その結果、強い internalization 活性が認められた。
図34において対照抗体を添加した場合の細胞膜上のCLCP1の検出量を100%とした際の、残存分子の割合をMFI値で換算することによって解析した結果を図36に示す。転移阻害活性が高いFA19-1とのinternalization 活性比較した場合、FA19-1以上に internalization 誘導活性を有した機能性抗体が3クローン確認できた(図36)。
結合活性を反応速度論的に解析するため、Biacoreを用いて結合活性測定を行った。以下の操作は全てBiacore3000(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)を用いて行った。評価系としては、抗マウス抗体をキャプチャーとしたキャプチャー法を用いた。
アミンカップリング法によりCM5センサーチップ(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)に、抗マウス抗体(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)を固層化した。そこへHBS EP Buffer(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)で2μg/mLに希釈した各種モノクローナル抗体を10μL/minの速度でチップ上に流し、その後、アナライトとして5段階希釈した293T由来CLCP1細胞外領域全長の精製蛋白質を20μL/minの速度で流した。この際のアナライトの希釈濃度は、各モノクローナル抗体につき次のように決定した。まずアナライトを5μg/mLに固定した条件で各種抗体のKD値(M)を算出し、このKD値が示す濃度(M)の10倍の濃度から2倍に段階的希釈した5段階とした。このセンサーグラムを解析することで、各種抗体の結合速度定数及び解離速度定数を算出し、KD値を求めた(図39)。
選択された陽性ハイブリドーマを培養し、一般的な方法によりtotal RNAを取得した。次に、GeneRacerTMキット(Invitrogen)を用いた5’-RACE法により、cDNAを取得した。得られたcDNAを鋳型とし、GeneRacerTM 5’Primer(5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’(配列番号:33))とCH1(mouse IgG1 constant領域1) 3’Primer(5’-AATTTTCTTGTCCACCTGG-3’(配列番号:34))を用いてPlutinum Taq High Fidelity(Invitrogen)でPCR(サイクル [94℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 50秒]を35サイクル)を実施した。これによってVH遺伝子(cDNA)を単離した。一方、VL遺伝子も同様にGeneRacerTM 5’Primerと、Ck(κconstant領域)3’Primer(5’-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3’(配列番号:35))を用いてPCRを実施し、VL遺伝子(cDNA)を単離した。
VH遺伝子及びVL遺伝子をそれぞれpT7Blueベクターにサブクローニングした後、オートシークエンサー(アプライドバイオシステム社製)又は蛍光式オートシークエンサーを用いて配列を解析した。その結果得られたVHの塩基配列及びVLの塩基配列がコードするアミノ酸、及び各CDRの配列を決定した(図9〜11、図38)。
(FA17-9アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号:7に示すアミノ酸配列
VH CDR2:配列番号:8に示すアミノ酸配列
VH CDR3:配列番号:9に示すアミノ酸配列
VL CDR1:配列番号:12に示すアミノ酸配列
VL CDR2:配列番号:56に示すアミノ酸配列
VL CDR3:配列番号:13に示すアミノ酸配列
VH:配列番号:6に示すアミノ酸配列
VL:配列番号:11に示すアミノ酸配列
(FA17-9塩基配列)
VH:配列番号:5に示す塩基配列
VL:配列番号:10に示す塩基配列
VH CDR1:配列番号:16に示すアミノ酸配列
VH CDR2:配列番号:17に示すアミノ酸配列
VH CDR3:配列番号:18に示すアミノ酸配列
VL CDR1:配列番号:21に示すアミノ酸配列
VL CDR2:配列番号:57に示すアミノ酸配列
VL CDR3:配列番号:22に示すアミノ酸配列
VH:配列番号:15に示すアミノ酸配列
VL:配列番号:20に示すアミノ酸配列
(FA19-1塩基配列)
VH:配列番号:14に示す塩基配列
VL:配列番号:19に示す塩基配列
VH CDR1:配列番号:60に示すアミノ酸配列
VH CDR2:配列番号:61に示すアミノ酸配列
VH CDR3:配列番号:62に示すアミノ酸配列
VL CDR1:配列番号:65に示すアミノ酸配列
VL CDR2:配列番号:66に示すアミノ酸配列
VL CDR3:配列番号:67に示すアミノ酸配列
VH:配列番号:59に示すアミノ酸配列
VL:配列番号:64に示すアミノ酸配列
(6AA_17-2塩基配列)
VH:配列番号:58に示す塩基配列
VL:配列番号:63に示す塩基配列
同定した遺伝子配列をもとに、以下に示すPCR増幅用primerを設計した。FA17-9、FA19-1ともに同じゲノム配列由来の抗体であるため、同じプライマーを使用した。
重鎖用Forward primer:5’-CCCaagcttACCATGGAATGGAGTTGGATATTTC-3’(配列番号:68)
重鎖用Reverse primer:5’-CCGctcgagACGGTGACCGTGGTCC-3’(配列番号:69)
軽鎖用Forward primer:5’-CCCaagcttACCATGAGACCGTCTATTCAGTTCC-3’(配列番号:70)
軽鎖用Reverse primer:5’-AATAcgtacgTTTGATTTCCAGCTTGGTCCC-3’(配列番号:71)
(小文字は制限酵素配列)
これらのprimerにより増幅されたPCR産物を常法によりヒトIgG1の定常領域を組み込んだロンザ社の抗体産生用ベクターに導入した。ロンザ社推奨プロトコールにより、キメラ抗体産生細胞株を樹立し、その培養上清からProtein Aを用いてキメラ化抗体の精製抗体を得た。
FA17-9のキメラ化抗体、FA19-1のキメラ化抗体の反応性確認としてFCMを行った。10μg/mL〜0.01μg/mLの抗体の濃度にて元々のマウス抗体と同等の結合活性を示した(図21)。
抗体濃度0.1〜10μg/mL又はE/T ratio(エフェクター/ターゲット比)100〜5と変化させてADCC活性を測定した。使用する抗体は実施例25で結合活性が確認された、FA17-9のキメラ化抗体とFA19-1のキメラ化抗体を使用した。ターゲット細胞としては、癌細胞株、例えばNCI-H460-LNM35を用いた。エフェクター細胞は、ヒトの末梢血から密度勾配遠心による常法で調製したPBMCを使用した。
ADCC活性評価は、lactate dehydrogenase release assayにより行った。細胞傷害活性(%)は以下の式によって算出した。
[% Cytotoxicity] = 100×(E−SE−ST)/(M−ST)
ここで、EとはExperimental releaseを表し、抗体とEffector細胞が、Target細胞と共に保温された時のTarget細胞からreleaseされたlactate dehydrogenase活性である。SEとは、Effector細胞からの自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。STとは、Target細胞からも自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。Mとは、Target細胞の最大に放出されるlactate dehydrogenase活性を表し、これはLysis Solution (9% Triton X-100)の添加により、Target細胞から放出されたlactate dehydrogenase活性である。
抗体濃度(図22A)又はE/T ratio(エフェクター/ターゲット比)(図22B)を変化させてNCI-H460-LNM35 細胞をターゲットとしたADCC活性を評価した。ターゲット細胞(NCI-H460-LNM35)104個に対してエフェクター細胞を2×105個と条件を固定し、キメラ化抗体の添加量を10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mLと変化させて各条件におけるADCC活性を上記の式により算出した。その結果、FA19-1キメラ化抗体の方がFA17-9キメラ化抗体よりも高いADCC活性を認め、抗体濃度10μg/mLで最大であった。次に抗体添加濃度を10μg/mLに固定し、ターゲット細胞104個に対して、エフェクター細胞を100倍(106個)、50倍(5×105個)、20倍(2×105個)、10倍(105個)、5倍(5×104個)と変化させ、E/T ratioの影響を確認した。その結果、E/T ratio = 50の条件で最大のADCC活性を認め、FA19-1キメラ化抗体の場合にCytotoxity:32.4%を認めた。
上記検討で最大のADCC活性が認められた条件(キメラ化抗体の10 μg/mL、E/T ratio = 50)にて、5名のドナー(A〜E)由来のエフェクター細胞とNCI-H460-LNM35 又はA549のターゲット細胞に対するADCC活性を測定した。その結果、全てのドナーでCytotoxityが認められ、特にCLCP1が強発現しているA549に対しては47.1%という強いCytotoxityが認められ (図23)、CLCP1に対する抗体を用いた細胞傷害活性が認められるという初めての知見を得た。
CDR-grafting法に従い、ヒトフレームワークを選択し、マウスモノクローナル抗体FA19-1のCDRに置き換えた。
具体的には重鎖可変領域フレームワーク、軽鎖可変領域フレームワークに分けてホモロジー検索を行った結果、FA19-1抗体重鎖可変領域フレームワーク領域(以下、FR1からFR4領域(配列番号:36〜39)、以下、全体合わせてFR)はヒト抗体のAccession number U00570(配列番号:40)のFR領域(配列番号:41〜44)と高い相同性を持つことが分かった(図40参照)。マウスFA19-1抗体の重鎖におけるFRとCDR移植先ヒト抗体のFR 部分の相同性は67/87=77.0%であった。このヒト抗体のAccession number U00570のFR領域に適切にFA19-1の重鎖CDR1〜CDR3(配列番号:16〜18)が移植されるようにアミノ酸配列を設計し、ヒト化抗体重鎖可変領域アミノ酸を設計した(配列番号:45)。以下、ヒト型化重鎖をFA19RHAと表記する。
KSN/slc nude mice(日本エスエルシー株式会社より入手)の、左鼠径(そけい)部皮下にH460-LNM35細胞を移植し、その後抗体投与し、肺転移・リンパ節転移の変化を観察した。各群の個体数は4匹、投与量は10 μg/ g (BW)で投与回数10回とした。
H460-LNM35細胞(5 x 106 cells)移植後10day(10日後)移植腫瘍の容積を測定し、容積ができるだけ均一な個体4匹ずつで、3群で試験した(図15A)。
Day10〜day37(移植後10日後-37日後)に、三日に一度の間隔で、計10回腹腔内に抗体投与(10 μg/g(BW))した。Day46(移植後46日後)で堵殺し、体重・腫瘍容積・腫瘍重量測定した。統計解析は体重・腫瘍容積・重量ではt-検定、肺転移数・リンパ節重量はMann-WhitneyのU検定で検討した。
腫瘍容積を図15A-Dに、堵殺時の各重量(腫瘍重量を除いた体重、腫瘍重量、後腹膜リンパ節、同側腋窩リンパ節、反対側鼠径(そけい)リンパ節)及び肺転移結節数を図16に示した。
腫瘍の治療効果については、FA19-1の投与で対照のIgG 群より腫瘍増殖抑制傾向があり、day34(移植後34日後)では有意差を認めた。しかし、day41(移植後41日後)では有意差は無かった。
一方、FA17-9はday34(移植後34日後)でやや腫瘍増殖抑制傾向があったが、day41(移植後41日後)では、効果として差は確認できなかった。堵殺時の重量では寧ろ対照より大きい傾向に見られるが有意差は無かった。また、FA17-9は抗体投与終了後増大速度が速くなった(DATA示さず)。
がん細胞転移抑制効果については、特に肺転移において、FA19-1を投与することで有意に転移抑制が確認された。FA17-9もFA19-1に比べると弱いながらも、転移抑制傾向が認められた(図16C)。また、各リンパ節転移においても、対照抗体投与群のばらつきが大きいため有意差はないが、FA19-1やFA17-9投与群では転移によるリンパ節腫大はほとんどないことが確認された(図16D-F)。
なお、各個体の抗体投与における衰弱はなく、腫瘍重量を除いた体重は変化がなかった(図16A)。
すなわち、本実験から、この抗体が転移抑制効果に加えて、細胞増殖阻害効果を有していることが明らかにされた。
なお、特に肺転移において、FA17-9、FA19-1が転移抑制データは再現性よく、取得でき、6AA_17-2投与においても、肺転移を抑制するデータが取得できた(図26)。
モノクローナル抗体FA19-1、6AA_17-2、EC6-8、FA17-9のCLCP1認識部位の検討を行った。FA17-9については、重鎖軽鎖ともにFA19-1と相同性が高くusageが同じであるため、認識部位が一致すると考えられた。したがって、認識部位の絞込みの段階では割愛した。
まず、認識領域を絞り込むために、配列番号2の195aa(aa:アミノ酸残基)-492aaと195aa-453aa部分の大腸菌リコンビナント蛋白質を作製し、これらに対する各抗体の反応性をELISAで確認した。配列番号2の195aa-492aaと195aa-453aaの大腸菌リコンビナント蛋白質はそれぞれ以下のプライマーによりPCRで増幅させたCLCP1部分長断片を、EcoRIとSalIで消化し、pET28aのEcoRI-XhoIサイトに挿入した大腸菌発現ベクターを構築した。これをBL21にトランスフォーメーションし、1mMのIPTGで発現誘導後、不溶性画分から8M Ureaで可溶化し、TALONカラムを用いて精製蛋白質を調製した。
共通5’プライマー:CGGAATTCTGTTTGGACACTGCATCC(配列番号:73)
195aa-492aa 3’プライマー:ACGCGTCGACTGGTTGCGTAAATTTTGG(配列番号:74)
195aa-453aa 3’プライマー:ACGCGTCGACAGGAATAAACTGACATCC(配列番号:75)
下線はEcoRI若しくはSalI切断サイトを示す。
調製した精製蛋白質に対するELISAを各種抗体について行った。なお、コントロールとして同時に細胞外領域全長の大腸菌リコンビナント蛋白質に対しても行った。その結果、検討した3種の抗体は全て、配列番号2の195aa-492aaの大腸菌リコンビナント蛋白質に対して反応性を示し、195aa-453aaの大腸菌リコンビナント蛋白質に対しては反応性を示さなかった(図27)。したがって、これらの抗体の認識部位は、配列番号2の195aa-492aaの精製蛋白質にのみ存在する配列番号2の454aa-492aaの領域にあることが判明した。
195aa-465aa 3’プライマー:ACGCGTCGACAGGTGGAGGTTGAGTAAG(配列番号:77)
195aa-461aa 3’プライマー:ACGCGTCGACAGTAAGTTTTGGAGGACG(配列番号:78)
195aa-457aa 3’プライマー:ACGCGTCGACAGGACGACCTTTAGGAAT(配列番号:79)
下線はSalI切断サイトを示す。
FA19-1については、配列番号2の195aa-465aaまでの蛋白質には反応せず、195aa-469aaの精製蛋白質に対しては反応性を示した(図28)。ただ、195aa-492aaに対する反応性に比べると若干弱いことから、配列番号2の465aa周辺部分に抗体の結合に影響する配列が含まれていることが考えられた。一方、それ以外の蛋白質に対しては、吸光度は抗体無添加と同等のレベルであり、反応性を有していないことが示された。
6AA_17-2については、配列番号2の195aa-465aaでは反応性を示すが、195aa-461aaでは全く反応性が失われることから、少なくとも配列番号2の461aa-465aaの配列が結合には必要であることが示唆された(図29)。
EC6-8においては、配列番号2の195aa-461aaでは反応性を示すが、195aa-457aaでは全く反応性が失われることから、少なくとも配列番号2の457aa-461aaの配列が結合には必要であることが示唆された(図30)。
次に、GST融合蛋白質発現ベクターであるpGEX4T-1にCLCP1の部分配列を導入して大腸菌リコンビナント蛋白質を作製し、それに対する結合活性をELISAによって解析することで、さらに詳細なFA17-9、FA19-1、6AA_17-2、EC6-8の認識配列の同定を試みた。導入する部分配列は配列番号2の451aa-460aa(以下、GST451-60)、456aa-465aa(以下、GST456-65)、461aa-470aa(以下、GST461-70)、466aa-475aa(以下、GST466-75)の4種類で検討した。pGEX4T-1への該配列をコードする遺伝子の導入は、以下のプライマーとPCRにより行った。
GST451-60/F2プライマー;CGGGATCCTTTATTCCTAAAGGTcgtcctccaaaactttgaagatctctcgag(配列番号:81)
GST456-65/F1プライマー;actcaacctccaccttgaagatctctcgagCGGCCGCATCGTGACTGACTGACG(配列番号:82)
GST456-65/F2プライマー;CGGGATCCCGTCCTCCAAAACTTactcaacctccaccttgaagatctctcgag(配列番号:83)
GST461-70/F1プライマー;cctcggaacagcaattgaagatctctcgagCGGCCGCATCGTGACTGACTGACG(配列番号:84)
GST461-70/F2プライマー;CGGGATCCACTCAACCTCCACCTcctcggaacagcaattgaagatctctcgag(配列番号:85)
GST466-75/F1プライマー;gacctcaaaaacacttgaagatctctcgagCGGCCGCATCGTGACTGACTGACG(配列番号:86)
GST466-75/F2プライマー;CGGGATCCCCTCGGAACAGCAATgacctcaaaaacacttgaagatctctcgag(配列番号:87)
GST-peptide/Rプライマー;AACTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTC(配列番号:88)
下線:BamHI又はPstIサイト
小文字:F1プライマーとF2プライマーのアニーリング配列
F2プライマーの5’側のBamHIサイト以降からF1プライマーの3’末端までがCLCP1部分長をコードする配列
図28の結果から、配列番号2の454aa-469aa及びそのややC末側を含んだ部分に認識部位があることが分かる。一方、図44の結果で、461aa-470aaに対して十分な反応性が確認されているとともに、それ以外の部分に対しては結合が認められていない(その他のペプチドで生じている吸光度はバックグランドレベルである)。総じて配列番号2の461aa-470aaに認識部位があるが、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合し、配列番号:2における466番目から475番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、かつさらに、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない単離された抗体、との特定もできる。
図29の結果から、配列番号2の454aa-465aa内に認識部位があることが分かる。一方、図44ではさらにその中でも456aa-465aaに対して強い反応性を示しており、それ以外の部分に対しては結合が観察されていない(その他のペプチドで生じている吸光度はバックグランドレベルである)。したがって、本抗体の認識部位は配列番号2の456aa-465aaにあるが、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合し、配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、かつさらに、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない単離された抗体、との特定もできる。
図30の結果から、配列番号2の454aa-461aa内に認識部位があることが分かる。一方、図44では451aa-460aaに対して強い反応性を示している。461aa-470aaには反応していない。したがって、この共通部分である454aa-460aaが本抗体の認識部位であると考えられる。配列番号:2における451番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合し、配列番号:2における461番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、単離された抗体、との特定もできる。
Claims (27)
- 配列番号:2における456番目から470番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する、単離された抗体であって、配列番号:2における456番目から465番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、配列番号:2における451番目から460番目のアミノ酸配列からなるペプチドを認識せず、かつ、重鎖可変領域の各相補性決定領域(VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3)及び軽鎖可変領域の各相補性決定領域(VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3)のアミノ酸配列が以下の(1)から(6)である、抗体:
(1)VH CDR1:配列番号:60に示すアミノ酸配列、
(2)VH CDR2:配列番号:61に示すアミノ酸配列、
(3)VH CDR3:配列番号:62に示すアミノ酸配列、
(4)VL CDR1:配列番号:65に示すアミノ酸配列、
(5)VL CDR2:配列番号:66に示すアミノ酸配列、及び
(6)VL CDR3:配列番号:67に示すアミノ酸配列。 - 重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列が以下の(1)及び(2)である、請求項1に記載の単離された抗体:
(1)VH:配列番号:59に示すアミノ酸配列、及び
(2)VL:配列番号:64に示すアミノ酸配列。 - 前記抗体がヒト型キメラ抗体である、請求項1及び2のいずれか一項に記載の単離された抗体。
- 前記抗体がヒト型CDR移植抗体である、請求項1に記載の単離された抗体。
- IgG抗体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離された抗体。
- Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dsFv、Diabody又はsc(Fv)2である、請求項1及び2のいずれか一項に記載の単離された抗体。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離された抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項7に記載された核酸を発現可能に保持するベクター。
- 請求項8に記載のベクターを有する形質転換細胞。
- 以下の工程:
(a)請求項9に記載の形質転換細胞を培養する工程;及び
(b)発現産物である抗体を分離・精製する工程;
を含む、抗体の製造方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離された抗体および医薬的に許容される担体を含有する、医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がん細胞の遊走阻害剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がん細胞の浸潤阻害剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がん細胞の転移阻害剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がん細胞の増殖阻害剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がん細胞の細胞障害剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、腫瘍の治療又は予防に使用するための薬剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がんの治療又は予防に使用するための薬剤。
- 遊走阻害、細胞浸潤阻害、転移阻害、細胞増殖阻害から選ばれる少なくとも1つの阻害効果を有する、請求項18に記載のCLCP1を発現するがんの治療又は予防に使用するための薬剤。
- 前記がんが、腎がん、膀胱腫瘍、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、乳がん又は肺がんである、請求項18または19に記載の薬剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、細胞または組織におけるCLCP1の発現を免疫学的手法により検出するために用いられる薬剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、細胞または組織におけるCLCP1の発現を免疫学的手法により検出するために用いられるキット。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がんの予後診断用薬剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を含有する、がんの予後診断用キット。
- 以下の工程:
(a)請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体と、分離された細胞または組織を接触させる工程;及び
(b)該細胞または該組織におけるCLCP1の発現を検出する工程;
を含む、免疫学的手法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を、分離された病理組織に接触させ、免疫学的手法によって該病理組織における細胞のCLCP1の発現を検出する工程を含む、がんの診断に役立つデータを提示する方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を、分離された病理組織に接触させ、免疫学的手法によって該病理組織における細胞のCLCP1の発現を検出する工程を含む、がんの予後診断に役立つデータを提示する方法。
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