JP6119968B2

JP6119968B2 - アミノ酸イオン液体を用いたペプチドの製造方法

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Publication number: JP6119968B2
Application number: JP2013008762A
Authority: JP
Inventors: 真也古川; 遼太朗中谷; 隆稲山
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Priority date: 2013-01-21
Filing date: 2013-01-21
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2033-01-21
Also published as: JP2014139149A

Description

本発明は、イオン液体を利用してペプチドを製造する方法に関する。

ペプチドは、医薬品の活性成分などとして幅広い需要が見込めるため、種々の方法で合成されてきた。近年では、イオン液体を利用するペプチドの合成方法が提案され、着目されている。
例えば、特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２には、イオン液体と結合したアミノ酸等に、保護基を有するアミノ酸を反応させるペプチド等の合成方法が記載されている。これら文献では、イオン液体とアミノ酸等を結合させて、有機溶媒へのアミノ酸の溶解度を向上させるとともに、イオン液体を保護基としても使用する。しかしこの方法では、保護基および縮合剤（カップリング剤）を使用しているため、工程が多く、複雑である。
一方、特許文献２のように、ペプチド加水分解酵素又は縮合剤の不存在下で、イオン液体化されたアミノ酸又はペプチドを、別のアミノ酸又はペプチドと反応させることにより、ペプチドを合成する方法も存在する。縮合剤の不存在下で行うため、工程を簡略化できるメリットは大きいものの、実際のところその反応効率において未だ課題が残っていた。

一方、特許文献３のように、イオン液体化されたアミノ酸又はペプチドを、プロテアーゼ等の加水分解酵素の存在下、別のアミノ酸又はペプチドと反応させることにより、ペプチドを合成する方法も存在する。しかし、特許文献３に具体的に記載されている製造方法は、少量存在する水相においてのみ反応を進行させる反応である。よって反応場である水相のｐＨや温度等の反応条件を厳しく選定する必要があり、その反応効率においてやはり未だ課題が残っていた。また特に特定のアミノ酸又はペプチドの組み合わせでは反応が進行しないことも懸念された。加えて、特定の酵素は高価で入手が困難または工業的使用に不適当な場合もあった。

なお、特許文献３に記載の反応は、イオン液体化された第一のアミノ酸のカルボキシ基と第二のアミノ酸のアミノ基を結合させる反応であり、特許文献１および２に記載の方法（イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドのアミノ基と第二のアミノ酸又はペプチドのカルボキシ基を結合させる反応）とは、その反応点が異なるものである。

特表２００８−５３７７３３号公報国際公開第２０１２／０１４８０９号パンフレット国際公開第２０１２／０１４８０８号パンフレット

Acc. Chem. Res. 2006, 39, 897-908 J. Org. Chem. 2005, 70, 3251-3255

本発明は、イオン液体を利用してペプチドを製造する方法において、簡便で、かつ、反応速度の速い方法を提供することを目的とする。

本発明は、イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと、第二のアミノ酸若しくはペプチド又はそれらのエステルとを、特定の触媒の存在下で反応させると、上記課題を解決できるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は以下の内容を含み得るものである。
［１］（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと、（Ｂ）第二のアミノ酸若しくはペプチド又はそれらのエステルとを、（Ｃ）ハロゲン化水素、水素原子の一部又はすべてがハロゲン置換された有機酸、および該有機酸の塩から選択される1種以上の存在下で反応させる工程を含む、ペプチドの製造方法。
［２］（Ａ）イオン液体化されたアミノ酸又はペプチドが、４級ホスホニウム型イオン、４級アンモニウム型イオン、イミダゾリウム型イオン、ピリジニウム型イオン、ピロリジニウム型イオンおよびピペリジニウム型イオンから選択される1種以上のカチオンと、アミノ酸又はペプチドのアニオンとが、イオン結合しているカルボキシラートである、［１］記載の製造方法。
［３］（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを構成するカチオンが、４級アルキルホスホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン、ジアルキルイミダゾリウムイオン、アルキルピリジニウムイオン、ジアルキルピロリジニウムイオン及びジアルキルピぺリジニウムイオンから選ばれる少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記４級アルキルホスホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン、ジアルキルイミダゾリウムイオン、アルキルピリジニウムイオン、ジアルキルピロリジニウムイオン及びジアルキルピぺリジニウムイオンにおけるアルキル基の炭素数が、１〜１２である、［３］に記載の製造方法。
［５］（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドが、アミノ酸又はペプチドのアミノ基又はカルボキシ基の少なくとも一部において保護されているものである、［１］〜［４］の何れか１項記載の製造方法。
［６］（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを構成するアミノ酸が、プロリン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、およびスレオニンから選択される、［１］〜［５］の何れか１項記載の製造方法。
［７］（Ｂ）第二のアミノ酸又はペプチドを構成するアミノ酸が、プロリン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、およびスレオニンから選択される、［１］〜［６］の何れか１項記載の製造方法。
［８］（Ｂ）成分が、アミノ酸又はペプチドのアルキルエステルである、［１］〜［７］の何れか１項記載の製造方法。
［９］（Ｃ）成分が、塩化水素、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、およびそれらの塩から選択される1種以上である、［１］〜［８］のいずれか１項記載の方法。
［１０］（Ｃ）成分が、トリクロロ酢酸またはその塩である、［９］記載の方法。
［１１］反応場における水または溶媒の含有量が、反応場全体の１０質量％以下である、［１］〜［１０］のいずれか１項記載の方法。
［１２］ペプチド結合の形成を０〜２００℃の温度で行う、［１］〜［１１］のいずれか１項記載の方法。
［１３］ペプチド結合の形成を４０〜８０℃の温度で行う、［１２］記載の方法。

本発明によると、ペプチドの合成速度を顕著に向上させることができる。さらにこの方法では、縮合剤（カップリング剤）を使用せずに合成が可能である。また本発明ではペプチド加水分解酵素ではなく、触媒としてハロゲン化水素、水素原子の一部又はすべてがハロゲン置換された有機酸、および該有機酸の塩から選択される1種以上を用いるので、入手がより容易であり、かつ反応後の酵素回収も不要となり、より簡便にペプチド合成を行うことができる。
さらに、本発明によると、副反応を制御することができ、高収率を期待することができる。

実施例及び比較例の２４時間後のＬ−Val−Ｌ−Ｐｒｏ収率(mol%)である。

本発明では、（Ｃ）ハロゲン化水素、水素原子の一部又はすべてがハロゲン置換された有機酸、および該有機酸の塩から選択される1種以上の存在下で、（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと、（Ｂ）第二のアミノ酸若しくはペプチド又はそれらのエステルとを反応させて、当該第一のアミノ酸又はペプチドと当該第二のアミノ酸若しくはペプチド又はそれらのエステルとの間にペプチド結合を形成させることを特徴とする。
より詳細には、当該第一のアミノ酸又はペプチドのアミノ基と、当該第二のアミノ酸若しくはペプチド又はそれらのエステルのカルボキシ基とを結合させることを特徴とする。

［（Ａ）成分］
本発明では、（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はイオン液体化された第一のペプチドを反応原料として用いる。
当該イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドとしては、(a)４級化ヘテロ原子を有する化合物を構成するカチオン、例えば、４級ホスホニウム型イオン、４級アンモニウム型イオン、イミダゾリウム型イオン、ピリジニウム型イオン、ピロリジニウム型イオンおよびピペリジニウム型イオン等と、(b)アミノ酸又はペプチドのアニオンとがイオン結合しているものが挙げられる。本発明においては、カルボキシラート、つまり、アミノ酸又はペプチド中のカルボキシ基により、上記４級化ヘテロ原子を有する化合物を構成するカチオンとイオン結合を形成しているものが好ましい。
具体的に上記(a)カチオンは、４級アルキルホスホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン、ジアルキルイミダゾリウムイオン、アルキルピリジニウムイオン、ジアルキルピロリジニウムイオン及びジアルキルピペリジニウムイオンから選ばれる少なくとも１種が好ましく、４級アルキルホスホニウムイオンまたは４級アルキルアンモニウムイオンから選ばれる少なくとも１種がより好ましく、４級アルキルホスホニウムイオンがさらに好ましい。
上記のカチオンにおけるアルキル基の各炭素数は１〜１２であるのが好ましく、より好ましくは１〜６であり、最も好ましくは１〜４である。複数あるアルキル基は同一でも異なっていてもよい。４級アルキルホスホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオンの場合には、同一であるのが好ましい。
炭素数が１〜１２のアルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基、イソデシル基、ウンデシル基、ドデシル基、等が挙げられる。
炭素数が１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
炭素数が１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。

より具体的には、テトラブチルホスホニウムイオン、テトラエチルホスホニウムイオン、テトラメチルアンモニウムイオン、テトラエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルトリエチルアンモニウムイオン、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１，３−ジメチルイミダゾリウムイオン、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−ブチル−３−メチルピリジニウムイオン、１−ブチルピリジニウムイオン、１−メチル−１−ブチルピロリジニウムイオンなどが挙げられる。
テトラブチルホスホニウムイオン、テトラエチルホスホニウムイオン、テトラメチルアンモニウムイオン、テトラエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、またはヘキシルトリエチルアンモニウムイオンが好ましく、テトラブチルホスホニウムイオン、またはテトラエチルホスホニウムイオンがより好ましく、テトラブチルホスホニウムイオンがさらに好ましい。
これらは塩化物、臭化物、水酸化物などとして、東京化成工業株式会社、北興化学株式会社や東洋合成株式会社などから容易に入手することができる。
かさ高い有機カチオンとアニオンとを組み合わせた塩は融点が低く、低温でも溶融状態にある。このような塩類のうち、融点が100℃以下のものはイオン液体（ionic liquid）とよばれ、特に常温で液体状態のものを常温イオン液体（room temperature ionic liquid）という。例えば、「イオン液体とコロイド化学」（福岡大学理学集報36（1）：45-54）に記載された１−ブチル-３-メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート（bmimBF4）等を言い、この文献の内容は、本件明細書の記載に含まれるものとする。

本発明の「（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチド」を構成するアミノ酸としては、一分子内にアミノ基とカルボキシ基を少なくとも一つずつ有するものであれば、特に限定されないが、例えば、プロリン（Pro）、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、バリン(Val)、ロイシン(leu)、イソロイシン(Ile)、グリシン(Gly)、Ｎ−メチルグリシン、メチオニン(Met)、セリン(Ser)、アラニン(Ala)、β−アラニン、Ｎ−メチル−β−アラニン、スレオニン（Thr）、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン (Gln)、グルタミン酸(Glu)、ヒスチジン(His)、リジン(Lys)、及びアルギニン(Arg)、またはそれらの誘導体などが挙げられる。これらのアミノ酸のうち、プロリン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、またはスレオニンが好ましく、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、またはスレオニンがより好ましく、プロリン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンがさらに好ましく、プロリンがさらにより好ましい。

ペプチドとしては、前記アミノ酸の２以上がペプチド結合で結合した化合物が挙げられる。ペプチドを構成するアミノ酸の数は１００以下が好ましく、５０以下がより好ましく、１０以下がさらに好ましく、５以下がさらにより好ましい。

本発明の「（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチド」は、アミノ基又はカルボキシ基の少なくとも一部が保護されていてもよい。
アミノ基の保護基としては、例えば、ホルミル基、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル−カルボニル基（例、アセチル、プロピオニル）、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、ベンゾイル基、（Ｃ₇−Ｃ₁₀）アラルキル−カルボニル基（例、ベンジルカルボニル）、（Ｃ₇−Ｃ₁₄）アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル）、トリチル基、フタロイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレン基、シリル基（例、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ジメチルフェニルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジエチルシリル）、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル基（例、１−アリル）などが挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ）、ニトロ基などから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい。

ただし、本発明においては、イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドのアミノ基と第二のアミノ酸又はペプチドのカルボキシ基を結合させる反応となることが好ましいため、反応にかかるアミノ基は保護されていないほうが好ましい。

カルボキシ基の保護基としては、例えば、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、（Ｃ₇−Ｃ₁₀）アラルキル基（例、ベンジル）、フェニル基、トリチル基、シリル基（例、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ジメチルフェニルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジエチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル基（例、１−アリル）などが挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ）、ニトロ基などから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい。

本発明の「（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチド」は、４級化ヘテロ原子を有する化合物（例えば、上記４級ホスホニウム型イオン、４級アンモニウム型イオン、イミダゾリウム型イオン、ピリジニウム型イオン、ピロリジニウム型イオンおよびピペリジニウム型イオン等から選ばれる１種以上のカチオンと、水酸化物イオンからなる化合物）と、アミノ酸又はペプチドとを、例えば略等モルで混合し、非減圧下、もしくは減圧下（特に限定されないが、例えば2500〜20000Pa(または20〜150mmHg)）で加熱し（好ましくは40〜70℃）、水を蒸発させて脱水縮合して、イオン液体化されたアミノ酸又はペプチドを調製することができる。
なお、４級化ヘテロ原子を有する化合物、アミノ酸及びペプチド、イオン液体化されたアミノ酸又はペプチドについてのAcc. Chem. Res. 2007, 40, pp.1122-1129の記載は、本件明細書の記載に含まれるものとする。

［（Ｂ）成分］
本発明では、上記（Ａ）成分と反応させる第二の成分として、（Ｂ）第二のアミノ酸又は第二のペプチド、あるいは、当該第二のアミノ酸のエステル又は第二のペプチドのエステルを用いる。第二のアミノ酸又はペプチドを構成するアミノ酸としては、一分子内にアミノ基とカルボキシ基を少なくとも一つずつ有するものであれば、特に限定されないが、例えば、プロリン（Pro）、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、バリン(Val)、ロイシン(leu)、イソロイシン(Ile)、グリシン(Gly)、Ｎ−メチルグリシン、メチオニン(Met)、セリン(Ser)、アラニン(Ala)、β−アラニン、Ｎ−メチル−β−アラニン、スレオニン（Thr）、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン (Gln)、グルタミン酸(Glu)、ヒスチジン(His)、リジン(Lys)、及びアルギニン(Arg)、またはそれらの誘導体などが挙げられる。これらのうち、プロリン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、またはスレオニンが好ましく、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、またはスレオニンがより好ましく、プロリン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンがさらに好ましい。

第二のペプチドとしては、前記のアミノ酸の２以上がペプチド結合で結合した化合物が挙げられる。ペプチドを構成するアミノ酸の数は１００以下が好ましく、５０以下がより好ましく、１０以下がさらに好ましく、５以下がさらにより好ましい。

第二のアミノ酸又はペプチドのエステルとしては、上記第二のアミノ酸または上記第二のペプチドのアルキルエステルまたはベンジルエステルが挙げられ、アルキルエステルがより好ましい。アルキルエステルのアルキル基としては、直鎖又は分枝鎖の、置換又は非置換の、炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。好ましくは炭素数１〜３のアルキル基であり、メチル基、エチル基がより好ましい。これらのエステルは１種又は複数の混合物として用いてもよい。

なお、本発明においては、イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドのアミノ基と第二のアミノ酸又はペプチド若しくはそれらのエステルのカルボキシ基を結合させる反応となることが好ましいため、反応にかかるカルボキシ基部位でエステル化されていることが好ましい。

本発明では、第二のアミノ酸又はペプチド若しくはそれらのエステルのアミノ基が保護されていないものを用いるのが好ましいが、保護されているものを用いることもできる。
本発明では、（Ｂ）成分として、第二のアミノ酸又はペプチド若しくはそれらのエステルがイオン液体化されているものを用いることもできる。この場合、イオン液体化するために上記したのと同じ４級化ヘテロ原子を有する化合物を用い、上記（Ａ）成分についてと同様の方法でイオン液体化することができる。

本発明では、上記（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを反応溶媒でかつ反応原料として用いて、（Ｂ）第二のアミノ酸又はペプチド若しくはそれらのエステルと反応させることを特徴とする。すなわち、本発明では、本質的に、（Ａ）成分以外の成分を反応溶媒として用いない。換言すると、本発明では、（Ａ）成分に、（Ｂ）成分が溶解して、反応が行われる。従って、本発明では、（Ａ）：（Ｂ）＝２０：１〜１：１０の条件下で反応させる。本発明では、（Ａ）成分を、（Ｂ）成分に対して等モル以上の量で、好ましくは、（Ａ）：（Ｂ）＝２０：１〜１：１で、より好ましくは（Ａ）：（Ｂ）＝１０：１〜２：１で使用する。しかしながら、量の過剰の程度は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分の特性によって決定されるものである。

［（Ｃ）成分］
本発明では、（Ｃ）ハロゲン化水素、水素原子の一部又はすべてがハロゲン置換された有機酸、および該有機酸の塩から選択される1種以上の存在下で（Ａ）成分と（Ｂ）成分を反応させて、当該第一のアミノ酸又はペプチドと当該第二のアミノ酸またはペプチド間にペプチド結合を形成させることを特徴とする。ペプチド結合は、イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドのアミノ基と第二のアミノ酸又はペプチドのカルボキシ基が結合したペプチド結合である。

ハロゲンとしては、塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素であり、塩素、臭素、フッ素が好ましく、塩素がより好ましい。

ハロゲン化水素としては、塩化水素、臭化水素、フッ化水素、またはヨウ化水素であり、塩化水素、臭化水素、フッ化水素が好ましく、塩化水素がより好ましい。

有機酸としては、例えば、一価又は多価カルボン酸、例えば、炭素数２〜４１、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜５のモノカルボン酸、炭素数３〜４２、好ましくは炭素数２〜１３、より好ましくは炭素数２〜６のジカルボン酸、炭素数４〜４３、好ましくは炭素数４〜１４、より好ましくは炭素数４〜９のトリカルボン酸、炭素数５〜４５、好ましくは炭素数５〜１５、より好ましくは炭素数５〜１０のテトラカルボン酸が挙げられる。

有機酸として具体的には、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オクチル酸、安息香酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、ジアセチル酒石酸、リンゴ酸、アジピン酸等が挙げられ、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸が好ましく、酢酸がより好ましい。
水素原子の一部又はすべてがハロゲン置換された有機酸は、上述した塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素により、有機酸上の水素基の一部又はすべてが置換されたものである。当該ハロゲン置換された有機酸としては、例えば、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸等が好ましく、より好ましくはトリクロロ酢酸が適当である。

水素原子の一部又はすべてがハロゲン置換された有機酸の塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩が挙げられる。
無機塩基との塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、銀塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
有機塩基との塩として、例えば、メチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、グアニジン、ピリジン、ピコリン、コリン、シンコニン、メグルミン、アミノ酸（アルギニン、リジン等）等との塩が挙げられる。
（Ｃ）水素原子の一部又はすべてがハロゲン置換された有機酸の塩としては、トリクロロ酢酸アンモニウム塩が好ましい。

本発明では、反応場に実質的に水または溶媒が存在しないことが好ましい。水または溶媒が存在する場合には、その量は反応場全体の０〜１０質量％であるのが好ましく、５質量％以下であるのがより好ましく、２質量％以下であるのがより好ましく、１質量％以下であるのがより好ましく、０．１質量％以下であるのがさらに好ましい。
本発明では、反応場が不活性ガス雰囲気下、好ましくは、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス雰囲気下であることが好ましい。

本発明では、(A)イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと（Ｂ）第二のアミノ酸又はペプチド若しくはそれらのエステルとの反応は、両者を混合し、例えば０〜２００℃の温度、好ましくは、室温（２０℃）〜１００℃、好ましくは４０℃〜８０℃の温度に保持して行うのが好ましい。反応の終了はHPLCによる生成物反応の停止確認により確認するのが好ましく、最終反応生成物は、樹脂、有機溶媒、および晶析の方法により単離するのがよく、その同定はＨＰＬＣにより行うのがよい。
尚、アミノ基又はカルボキシ基が保護されている第一や第二のアミノ酸、ペプチド、又はそれらのエステルを反応原料として用いた場合には、これらの保護基を、常法により、例えば、接触還元法等により、脱離（脱保護）させることができる。
本発明の合成方法により得られたペプチド（オリゴペプチドやポリペプチド）は、機能性食品や調味料などを含む食品、輸液などの栄養組成物や飼料などの有効成分として、医薬品の活性成分として、又、各種試薬の有効成分などとして、幅広く使用することができる。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。なお、実施例は本発明の単なる例示であり、特に断らない限り、本発明の範囲が実施例に限定されることはない。

ジペプチド生成反応に及ぼす（Ｃ）成分の添加効果
市販のＬ−プロリン(以下Ｌ−Ｐｒｏ、Ｓｉｇｍａ社製)と４０質量％水酸化テトラブチルホスホニウム水溶液（以下ＴＢＰ−ＯＨ）を等モル（Ｌ−Ｐｒｏ：ＴＢＰ−ＯＨ＝１：１）になるように混合し（合計50ｇ）、５０ｍｍＨｇに減圧しながら６０℃に加温した水浴中で攪拌し、水を蒸発させることで脱水縮合を行った（水分含量０．１１質量％）。このようにして調製したイオン液体化Ｌ−プロリン−テトラブチルホスホニウム（以下Ｌ−Ｐｒｏ−ＴＢＰ）は無色透明の液体であった。
上記Ｌ−Ｐｒｏ−ＴＢＰの１ｋｇに対し、Ｌ−バリンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ｖａｌ−ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ社製）が５００ｍｍｏｌとなるように当該Ｌ−Ｖａｌ−ＯＭｅ・ＨＣｌを加え、Ｌ−Ｐｒｏ−ＴＢＰにＬ−Ｖａｌ−ＯＭｅ・ＨＣｌを溶解させた（反応場全体に対する水の量０．１１質量％）。得られた溶液をよく攪拌して溶液全体が均一になったことを確認後、Ｌ−Ｐｒｏ−ＴＢＰ１００ｍｏｌ％に対し塩化水素、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリクロロ酢酸アンモニウムのいずれか一つを１０ｍｏｌ％となるように添加した。均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら６０℃に加温して反応を開始した。各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｌ−バリル−Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｐｒｏ）の生成確認を行った。
なお、ＴＢＰ−ＯＨは北興化学より入手した。

２４時間後のＬ−Val−Ｌ−Ｐｒｏ収率は、上記塩化水素、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリクロロ酢酸アンモニウムを添加しなかった場合(比較例１)、反応開始時に添加したＬ−Val−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で５．２モル％となったのに対し、塩化水素を添加した場合は３１．１モル％(実施例１)、ジクロロ酢酸を添加した場合は２８.２モル％(実施例２)、トリクロロ酢酸を添加した場合は６９.５モル％(実施例３)、トリクロロ酢酸アンモニウムを添加した場合は６４．１モル％(実施例４)となった。さらにトリクロロ酢酸の添加を実施したサンプルについて、反応時間を延長して最終収率確認を行ったところ、反応時間４８時間で８０モル％となった。結果を以下の表１にまとめる。図１は表１を図示したものである。

表１

Claims

（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと、（Ｂ）第二のアミノ酸若しくはペプチド又はそれらのエステルとを、（Ｃ）トリクロロ酢酸またはその塩の存在下で反応させる工程を含む、ペプチドの製造方法。
（Ａ）イオン液体化されたアミノ酸又はペプチドが、
４級ホスホニウム型イオン、４級アンモニウム型イオン、イミダゾリウム型イオン、ピリジニウム型イオン、ピロリジニウム型イオンおよびピペリジニウム型イオンから選択される1種以上のカチオンと、アミノ酸又はペプチドのアニオンとが、イオン結合しているカルボキシラートである、請求項１記載の製造方法。
（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを構成するカチオンが、４級アルキルホスホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン、ジアルキルイミダゾリウムイオン、アルキルピリジニウムイオン、ジアルキルピロリジニウムイオン及びジアルキルピぺリジニウムイオンから選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の製造方法。
前記４級アルキルホスホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン、ジアルキルイミダゾリウムイオン、アルキルピリジニウムイオン、ジアルキルピロリジニウムイオン及びジアルキルピぺリジニウムイオンにおけるアルキル基の炭素数が、１〜１２である、請求項３に記載の製造方法。
（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドが、アミノ酸又はペプチドのアミノ基又はカルボキシ基の少なくとも一部において保護されているものである、請求項１〜４の何れか１項記載の製造方法。
（Ａ）イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを構成するアミノ酸が、プロリン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、およびスレオニンから選択される、請求項１〜５の何れか１項記載の製造方法。
（Ｂ）第二のアミノ酸又はペプチドを構成するアミノ酸が、プロリン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、およびスレオニンから選択される、請求項１〜６の何れか１項記載の製造方法。
（Ｂ）成分が、アミノ酸又はペプチドのアルキルエステルである、請求項１〜７の何れか１項記載の製造方法。
反応場における水または溶媒の含有量が、反応場全体の１０質量％以下である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
ペプチド結合の形成を０〜２００℃の温度で行う、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
ペプチド結合の形成を４０〜８０℃の温度で行う、請求項１０記載の方法。