JP5787278B2 - ペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、イオン液体を利用してペプチドを高い収率で合成する製造方法、特に工業的に製造する方法に関する。

ペプチドは、医薬品の活性成分などとして幅広い需要が見込めるから、種々の方法で合成されてきた。近年では、イオン液体を利用するペプチドの合成方法が提案され、着目されている。例えば、特許文献１には、イオン液体とオリゴペプチド、オリゴサッカライド、オリゴヌクレオチドを結合させて、有機溶媒への溶解度を向上するとともに保護基としても使用する方法が開示されているが、この方法では、各反応の重合には保護基および縮合剤を使用している。非特許文献１には、イオン液体（BP6(1-butyl-3-methylimidazolium hexafluoro phosphate))中でのZ-Asp + PM→Z-APM反応を酵素（Thermolysin）を用いて実施し、イオン液体中でも酵素反応が行えることを実証している。この反応における収率は９０％と高いが、著しく低濃度であり、ここに開示の反応方法は、単なる有機溶媒中での酵素反応の溶媒置換にすぎないものである。又、特許文献２には、イオン液体（4-メチル-N-ブチルピリニジウムテトラフルオロボレート）中でのペプチド合成が開示されている。ここに記載の合成方法は、非特許文献１と同様に単なる有機溶媒中での酵素反応の溶媒置換であり、２０ｍＭとかなり低濃度での反応で、しかも保護基を使用している。
非特許文献２では、アミノ酸をイオン液体残基とイオン結合により結合させ、アミノ酸がイオン液体化できることを実証しており、特に、その用途を論じていないが、当初燃料電池の電解質としての利用を検討している。非特許文献３には、イオン液体を用いたポリペプチド、オリゴ糖、その他有機合成についてのレビューが記載されており、要旨の中に、基質-イオン液体を反応中間体として用いるという記載があるが、具体的なデータは示されていない。非特許文献４には、アミノ酸結合イオン液体に関する紹介のようなレビューが記載されており、具体的なデータはないが、溶媒あるいは触媒としての将来的な利用について言及している。
しかしながら、これまでに提案されているイオン液体を利用したペプチドの合成方法は、得られるペプチドの収率が低く、工業的なペプチド製造方法として十分なものではなかった。

特表２００８−５３７７３３号公報 特開２００８−３０１８２９号公報

Biotechnol. Prog. 2000, 16, 1129-1131 Acc. Chem. Res. 2007, 40, 1122-1129 機能性イオン液体を担体とする液相有機合成に関する研究の発展（日本語訳：南京工業大、胡いつ（Yi Hu） 李恒 黄和 韋萍、2007年3月発行） アミノ酸イオン液体研究の進展（日本語訳：遼寧大学、呉陽 張甜甜 宋渓明、2008年3月発行）

本発明は、イオン液体を利用してペプチドを高濃度で、かつ高収率で合成する製造方法、特に工業的に製造する方法を提供することを目的とする。

本発明は、イオン結合によりイオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを反応溶媒でかつ反応原料として用い、これを、特定量以下の水分の存在下で、第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルと反応させると、ペプチド加水分解酵素を用いることなく、ペプチドを高濃度で、かつ高収率で合成することができるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、ペプチド加水分解酵素又は縮合剤の不存在下、(A)イオン結合によりイオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを反応溶媒でかつ反応原料として用い、(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルと、反応系の全質量に対して２０質量％以下（好ましくは１０質量％以下）の水の存在下で反応させて、当該第一のアミノ酸又はペプチドと当該第二のアミノ酸又はペプチド間にペプチド結合を形成させることを特徴とするペプチドの製造方法を提供する。

本発明によると、ペプチド加水分解酵素を用いることなく、ペプチドを高濃度で、かつ高収率で合成することができる。従って、ペプチド加水分解酵素を分離する工程を省略できるという工業上の大きな利点がある。

本発明では、先ず、(A)イオン結合によりイオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを反応溶媒でかつ反応原料として用いる。ここで、当該イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドが、４級化ヘテロ原子を有する化合物、例えば、４級ホスホニウム塩、４級アンモニウム塩、イミダゾリウム塩、ピリジニウム塩、ピロリジニウム塩やピぺリジニウム塩などを構成するカチオンと第一のアミノ酸又はペプチドがイオン結合しているものを用いるのが好ましい。具体的には、第一のアミノ酸又はペプチドが、アルキルホスホニウムイオン、アルキルイミダゾリウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルキルピリジニウムイオン、アルキルピロリジニウムイオン及びアルキルピぺリジニウムイオンから選ばれる少なくとも１種であるカチオンと、イオン結合しているものを用いるのが好ましい。ここで用いるアルキルホスホニウムイオンなどにおけるアルキル基の炭素数は１〜１２であるのが好ましく、より好ましくは１〜６であり、最も好ましくは１〜４である。複数あるアルキル基は同一でも異なっていてもよいが、同一であるのが好ましい。より具体的には、テトラブチルフォスフォニウムイオン、テトラエチルフォスフォニウムイオン、テトラメチル４級アンモニウムイオン、テトラエチル４級アンモニウムイオン、テトラブチル４級アンモニウムイオン、ヘキシルトリエチル４級アンモニウムイオン、1-エチル-3-メチルイミダゾリウムイオン、1，3-ジメチルイミダゾリウムイオン、1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムイオン、1-ブチル-3-メチルピリジニウムイオン、1-ブチルピリジニウムイオン、1-メチル-1-ブチルピロリジニウムイオンなどがあげられる。これらは塩酸塩、臭酸塩、水酸化物塩などとして、東京化成工業株式会社、北興化学株式会社や東洋合成株式会社などから容易に入手することができる。
ここで、イオン液体とは、塩融解物ではなくて１００℃以下の低温で融解するイオンからなる塩である。従って、水はイオン液体に該当しない。

本発明において、イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドとしては、プロリン（Pro）、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、ロイシン(leu)、グリシン(Gly)、メチオニン(Met)、セリン(Ser)、アラニン(Ala)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、ヒスチジン(His)、リシン(Lys)やバリン(Val)などの必須アミノ酸、その類縁体及びこれらのオリゴマーや重合体（ポリマー）があげられる。これらのうち、分子中に芳香族環や複素環を有するアミノ酸やこれを構成成分とするオリゴマーが好ましく、特に分子内に２級アミノ基を有するものが好ましい。
これらのアミノ酸又はペプチドにおけるアミノ基は、ホルミル基、ベンジルオキシカルボニル基やブトキシカルボニル基などのアミノ保護基により保護されていてもよいが、本発明では保護されていないものを用いるのが好ましい。
本発明では、上記４級化ヘテロ原子を有する化合物と第一のアミノ酸又はペプチドを略等モルで混合し、非減圧下、もしくは減圧下（好ましくは２０〜１５０mmHg）で加熱し（好ましくは４０〜７０℃）、水を蒸発させて脱水縮合して、イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを調製することができる。
本発明では、(A)イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドが、カルボキシラート、つまり、第一のアミノ酸又はペプチド中のカルボキシル基により、上記４級化ヘテロ原子を有する化合物とイオン結合を形成しているものが好ましい。
４級化ヘテロ原子を有する化合物、アミノ酸及びペプチド、イオン液体化されたアミノ酸又はペプチドについての非特許文献２（Acc. Chem. Res. 2007, 40, 1122-1129）の記載は、本件明細書の記載に含まれるものとする。

本発明では、上記(A)成分と反応させる第２の成分として、(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルを用いる。ここで用いるアミノ酸エステル又はペプチドのエステルは、プロリン（Pro）、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、ロイシン(leu)、グリシン(Gly)、メチオニン(Met)、セリン(Ser)、アラニン(Ala)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、ヒスチジン(His)、リシン(Lys)やバリン(Val)などの必須アミノ酸、その類縁体及びこれらのオリゴマーや重合体（ポリマー）が有するカルボキシル基がアルキル基などによりエステル化されているものである。アルキル基としては、炭素数１〜１２のものが好ましく、より好ましくは炭素数１〜６、特に好ましくは炭素数１〜４である。これらのエステルは１種又は複数の混合物として用いてもよい。又、(B)成分としては、塩酸塩などの無機酸が付加した酸付加塩を用いてもよい。
これらのうち、特にアラニン(Ala)メチルエステル、グリシン(Gly)メチルエステル、アルギニン（Arg）メチルエステルなどが好ましく、なかでも、これらの塩酸塩などの無機酸が付加した酸付加塩が好ましい。
本発明では、第二のアミノ酸又はペプチドのアミノ基が保護されていないものを用いるのが好ましいが、第二のアミノ酸又はペプチドのアミノ基が保護されているものを用いることもできる。

本発明では、上記(A)イオン結合によりイオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを反応溶媒でかつ反応原料として用いて、(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルと反応させることを特徴とする。すなわち、本発明では、本質的に、イオン液体化した(A)成分以外の成分を反応溶媒としてもちいない。換言すると、本発明では、イオン液体化した(A)成分に、(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルが溶解して、反応が行われる。従って、本発明では、イオン液体化(A)成分を、(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルに対して等当モル以上の量で、好ましくは、第一のアミノ酸：第二のアミノ酸のモル比が、２０：１〜１：１で、より好ましくは１０：１〜２：１で使用する。しかしながら、(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルのイオン液体化した(A)成分への溶解性が低い場合には、溶解している部分の反応の進行により、順次、未溶解の(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルがイオン液体化した(A)成分に溶解していくので、量の過剰の程度は、(A)成分と(B)成分の特性によって決定されるものである。
本発明では、上記反応において、イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを反応溶媒かつ基質として用いることにより、第一のアミノ酸又はペプチドが大過剰である環境下で、添加する第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルと第一のアミノ酸またはペプチドのアミノ基とを反応させることにより、第二のアミノ酸に保護基を導入しなくとも、選択的に目標とするペプチドを生成する。また、当該反応場において、酵素あるいはペプチド縮合剤といったペプチド生成を促す添加剤あるいは触媒を添加することなく反応が進行する点も本発明の特徴である。
本発明では、上記反応により、当該第一のアミノ酸又はペプチドのアミノ基と当該第二のアミノ酸又はペプチドのカルボキシル基との間にペプチド結合を形成させるのがよい。この際、当該第二のアミノ酸又はペプチドのエステルが開裂して、エステルを構成しているアルコール残基からアルコールも生成する。

本発明では、ペプチド加水分解酵素又は縮合剤の不存在下、反応系の全質量に対して２０質量％以下（好ましくは１０質量％以下）の水の存在下で(A)成分と(B)成分を反応させて、当該第一のアミノ酸又はペプチドと当該第二のアミノ酸又はペプチド間にペプチド結合を形成させることを特徴とする。従来技術においては、ペプチド加水分解酵素の使用が必須となっているが、本発明では、ペプチド加水分解酵素を使用しないので、製造コストが低いだけではなくて、ペプチド加水分解酵素を分離する工程を省略できるという工業上の大きな利点がある。
本発明では、反応系の水は、(A)イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドである反応溶媒中に溶解しており、(B)第二のアミノ酸又はペプチドの少なくとも一部が該反応溶媒中に溶解した状態で、(A)イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと(B)第二のアミノ酸又はペプチドが反応するのが好ましい。
水の量は、反応系の全質量に対して２０質量％以下であることが必要であるが、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは０〜５質量％であり、実質的に水が存在しない状態であるのが好ましい。
本発明では、反応系に水が少なく、好ましくはほとんど存在しないか、全く存在しないので、ｐＨ調製することなく、反応を行うことができる。
ペプチド加水分解酵素としては、プロテアーゼ、ペプチダーゼ及びヒドロラーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種である場合が多く、特にサーモライシンであるのが好ましい。このような酵素は、Sigma-Aldrich Corporationから容易に入手することができる。
化学合成における縮合剤としては、N,N’-Carbonyldiimidazole、N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide及び1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochlorideなどが汎用的に使用されており、このような縮合剤は、関東化学（株）、和光純薬工業（株）などから容易に入手することができる。

本発明では、(A)イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと(B)第二のアミノ酸又はペプチドの反応は、両者を混合し、０〜１００℃の温度、好ましくは、室温（２０℃）〜７０℃の温度に保持して行うのが好ましい。反応の終了はHPLCによるペプチド生成反応の停止により確認するのが好ましく、最終反応生成物は、樹脂、有機溶媒、および晶析の方法により単離するのがよく、その同定はＨＰＬＣにより行うのがよい。
ＨＰＬＣは、常法により行うことができるが、以下の条件で行うのがよい。
columnとして、GL Sciences Inertsil ODS-3:4.6mm I.D.×250mmを用いるのがよい。そして、温度４０℃、Flow rate １.５ml/min、Mobile Phase Ａ: KH2PO4 100mM, 1−オクタンスルホン酸ナトリウム 5mM: Ｂ: acetonitrile 100%: Isocratic, Ａ：Ｂ = 200:1、ｐＨ２.２、Detection ２１０nm、Stop Time ３９min.、Injection Volume １０.０μlの条件で行うのがよい（条件１）。又は、条件１において、Ａ：Ｂ = 200:1の代わりに、Ａ：Ｂ = 90:10に代えた条件で行うのがよい（条件２）。さらに、温度４０℃、Flow rate １.５ml/min、Mobile Phase Ａ: NaH2PO4 50mM, 1−オクタンスルホン酸ナトリウム 5mM: Ｂ: MetOH 100%: Isocratic, Ａ：Ｂ = 5:1、ｐＨ２.１、Detection ２１０nm、Stop Time ３９min.、Injection Volume １０.０μlの条件（条件３）で行うこともできる。
尚、アミノ基又はカルボキシル基が保護されている第一や第二のアミノ酸又はペプチドを反応原料として用いた場合には、これらの保護基を、常法により、例えば、接触還元法等により、脱離（脱保護）させることができる。
本発明の合成方法により得られたペプチド（オリゴペプチドやポリペプチド）は、機能性食品や調味料などを含む食品、輸液などの栄養組成物や飼料などの有効成分として、医薬品の活性成分として、又、各種試薬の有効成分などとして、幅広く使用することができる。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ ジペプチド生成反応におよぼすアミノ酸基質プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）のイオン液体化による基質アミノ酸の高濃度化および反応溶媒化の影響
市販のＬ−Ｐｒｏと４０質量％水酸化テトラブチルフォスフォニウム（以下ＴＢＰ−ＯＨ）を等モル（Ｌ−Ｐｒｏ：ＴＢＰ−ＯＨ＝１：１）で混合し（合計５０ｇ）、５０ｍｍＨｇに減圧しながら６０℃に加温した水浴中で攪拌し、水を蒸発させることで脱水縮合を行った（水分含量２質量％）。このようにして調製したＬ−プロリン−テトラブチルフォスフォニウム（以下Ｌ−Ｐｒｏ−ＴＢＰ）は無色透明の液体であった。
このようにしてイオン液体化したＬ−Ｐｒｏ−ＴＢＰに対し１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＴＢＰとなるようＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させた（反応系全体に対する水の量２質量％）。Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌを添加し、よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら３７℃に加温して反応を開始した。反応開始後７２時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｌ−アラニルプロリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）の生成確認を行った。
上記で使用したアミノ酸Ｌ−ＰｒｏおよびＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、Ｓｉｇｍａより購入した。また、ＴＢＰ−ＯＨは北興化学より購入した。
７２時間後のＬ−Ａｌａ−Ｐｒｏ収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で３１．０モル％となった。

実施例２ Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ反応におよぼす反応温度の影響
実施例１に記載のＬ−Ｐｒｏのイオン液体化により調製したＬ−Ｐｒｏ−ＴＢＰに対し、１０００ｍｍｏｌ／ｋｇとなるようＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌを加えた（反応系全体に対する水の量２質量％）。その後、よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら３７℃あるいは５０℃に加温して、反応を開始した。反応開始後７２時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏの生成確認を行った。結果を表１に示す。
表１

実施例３ Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ反応におよぼすＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ濃度の影響
実施例１に記載のＬ−Ｐｒｏのイオン液体化により調製したＬ−Ｐｒｏ−ＴＢＰに対し、５００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｐｒｏ−ＴＢＰあるいは１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｐｒｏ−ＴＢＰとなるようＬ−Ａｌａ−ＯＭｅを溶解させた（反応系全体に対する水の量２質量％）。その後、水浴中で攪拌しながら５０℃に加温して反応を開始した。反応開始後７２時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏの生成確認を行った。結果を表２に示す。
表２

実施例４ ジペプチド生成反応におよぼすアミノ酸基質チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）のイオン液体化による基質アミノ酸の高濃度化および反応溶媒化の影響
市販のＬ−ＴｙｒとＴＢＰ−ＯＨをＬ−Ｔｙｒ：ＴＢＰ−ＯＨ＝１：１．２（モル比）の割合で混合し、５０ｍｍＨｇに減圧しながら６０℃に加温した水浴中で攪拌し、水を蒸発させることで脱水縮合を行った。このようにして調製したＬ−チロシン−テトラブチルフォスフォニウム（以下Ｌ−Ｔｙｒ−ＴＢＰ）は無色透明の液体であった（水分含量２質量％）。
上記の方法でイオン液体化したＬ−Ｔｙｒ−ＴＢＰに対し１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＴＢＰとなるようグリシンメチルエステル塩酸塩（以下Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を加えた。Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌを添加し、よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら３７℃に加温して反応を開始した（反応系全体に対する水の量２質量％）。反応開始後４８時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、グリシルチロシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ）の生成確認を行った。
上記で使用したアミノ酸Ｌ−ＴｙｒおよびＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、Ｓｉｇｍａより購入した。
４８時間後のＧｌｙ−Ｔｙｒ収率は反応開始時に添加したＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で３.９％となった。

実施例５ Ｇｌｙ−Ｔｙｒ反応におよぼす反応温度の影響
実施例４に記載のＬ−Ｔｙｒのイオン液体化により調製したＬ−Ｔｙｒ−ＴＢＰに対し、１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＴＢＰとなるようＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌを加えた（反応系全体に対する水の量２質量％）。その後、よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら３７℃あるいは６０℃に加温した。反応開始後４８時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒの生成確認を行った。結果を表３に示す。
表３

表１及び３の結果から、温度が３０〜７０℃の範囲内であれば、収率に差違が無いことがわかる。

実施例６ Ｇｌｙ−Ｔｙｒ反応におよぼすＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ濃度の影響
実施例４に記載のＬ−Ｔｙｒのイオン液体化により調製したＬ−Ｔｙｒ−ＴＢＰに対し、５００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＴＢＰあるいは１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＴＢＰとなるようＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌを加えた（反応系全体に対する水の量２質量％）。よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら３７℃あるいは６０℃に加温した。反応開始後４８時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｇｌｙ−Ｔｙｒの生成確認を行った。３７℃の結果を表４、６０℃の結果を表５にそれぞれ示す。
表４

表５

表２、表４及び表５の結果から、第一のアミノ酸：第二のアミノ酸のモル比が、
２：１〜１：１であるのが好ましいことがわかる。

実施例７ ジペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙの合成
市販のＧｌｙと４０質量％ＴＢＰ−ＯＨを等モル（Ｇｌｙ：ＴＢＰ−ＯＨ＝１：１）で混合し（合計５０ｇ）、５０ｍｍＨｇに減圧しながら６０℃に加温した水浴中で攪拌し、水を蒸発させることで脱水縮合を行った（水分含量１６質量％）。このようにして調製したグリシン−テトラブチルフォスフォニウム（以下Ｇｌｙ−ＴＢＰ）は無色透明の液体であった。
このようにしてイオン液体化したＧｌｙ−ＴＢＰに対し１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｇｌｙ−ＴＢＰとなるようグリシンメチルエステル塩酸塩（以下Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させた（反応系全体に対する水の量１６質量％）。Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌを添加し、よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら６０℃に加温して反応を開始した。反応開始後３時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、グリシジルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）の生成確認を行った。
又、６０℃に加温及び３時間反応の代わりに、３７℃に加温及び１７時間反応の条件を採用した以外は、同様にして、Ｇｌｙ−Ｇｌｙの生成確認を行った。
上記で使用したアミノ酸ＧｌｙおよびＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、それぞれＳｉｇｍａ及び渡辺化学工業（株）より購入した。また、ＴＢＰ−ＯＨは北興化学（株）より購入した。
６０℃に加温及び３時間反応におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ収率は反応開始時に添加したＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で７３．０モル％となった。
又、３７℃に加温及び１７時間反応におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ収率は反応開始時に添加したＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で５８．０モル％となった。

実施例８ ジペプチドL-Ａｌａ−Ｇｌｎの合成
市販のＬ−Ｇｌｎと４０質量％ＴＢＰ−ＯＨを等モル（Ｌ−Ｇｌｎ：ＴＢＰ−ＯＨ＝１：１）で混合し（合計５０ｇ）、５０ｍｍＨｇに減圧しながら６０℃に加温した水浴中で攪拌し、水を蒸発させることで脱水縮合を行った（水分含量７質量％）。このようにして調製したＬ−グルタミン−テトラブチルフォスフォニウム（以下Ｌ−Ｇｌｎ−ＴＢＰ）は無色透明の液体であった。
このようにしてイオン液体化したＬ−Ｇｌｎ−ＴＢＰに対し２００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＴＢＰとなるようＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させた（反応系全体に対する水の量７質量％）。Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌを添加し、よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら６０℃に加温して反応を開始した。反応開始後２３時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｌ−アラニルグルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ）の生成確認を行った。
又、６０℃に加温及び２３時間反応の代わりに、３７℃に加温及び３時間反応の条件を採用した以外は、同様にして、Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎの生成確認を行った。
上記で使用したアミノ酸Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、それぞれＳｉｇｍａ及び東京化成工業（株）より購入した。また、ＴＢＰ−ＯＨは北興化学（株）より購入した。
６０℃に加温及び２３時間反応におけるＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で２．０モル％となった。
又、３７℃に加温及び３時間反応におけるＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で３.８モル％となった。

実施例９ ジペプチドＬ−Ａｒｇ−Ｇｌｎの合成
市販のＬ−Ｇｌｎと４０質量％ＴＢＰ−ＯＨをＬ−Ｇｌｎ：ＴＢＰ−ＯＨ＝１：１.２で混合し（合計５０ｇ）、５０ｍｍＨｇに減圧しながら６０℃に加温した水浴中で攪拌し、水を蒸発させることで脱水縮合を行った（水分含量１４質量％）。このようにして調製したＬ−グルタミン−テトラブチルフォスフォニウム（以下Ｌ−Ｇｌｎ−ＴＢＰ）は無色透明の液体であった。
このようにしてイオン液体化したＬ−Ｇｌｎ−ＴＢＰに対し８００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＴＢＰとなるようＬ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させた（反応系全体に対する水の量１４質量％）。Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌを添加し、よく攪拌して均一になったことを確認後、水浴中で攪拌しながら６０℃に加温して反応を開始した。反応開始後２０時間で反応を終了し、各経時サンプルをＨＰＬＣで分析し、Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎの生成確認を行った。
上記で使用したアミノ酸Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、それぞれＳｉｇｍａ及びＢＡＣＨＥＭより購入した。また、ＴＢＰ−ＯＨは北興化学（株）より購入した。
６０℃に加温及び２０時間反応におけるＬ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で１．０モル％となった。

実施例１０ ジペプチドＧｌｙ−Ｇｌｎの合成
実施例９と同様にしてイオン液体化したＬ−Ｇｌｎ−ＴＢＰに対し９００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＴＢＰとなるようグリシンメチルエステル塩酸塩（以下Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させ（反応系全体に対する水の量１４質量％）、反応時間を２０時間から２３時間に変更した以外は、実施例９と同様にして、グリシジルグルタミン（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）を合成し、ＨＰＬＣで分析し、Ｇｌｙ−Ｇｌｎの生成確認を行った。
上記で使用したアミノ酸Ｌ−ＧｌｎおよびＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、それぞれＳｉｇｍａ及び渡辺化学工業（株）より購入した。
６０℃に加温及び２３時間反応におけるＧｌｙ−Ｇｌｎの収率は反応開始時に添加したＬ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で２．０モル％となった。

実施例１１ ジペプチドL-Ａｒｇ−Ａｌａの合成
Ｌ−Ｇｌｎ−ＴＢＰの代わりに、片山製薬所から購入したイオン液体化したＬ−Ａｌａ−ＴＢＰを用い、イオン液体化したＬ−Ａｌａ−ＴＢＰに対し２００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ａｌａ−ＴＢＰとなるようＬ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させ（反応系全体に対する水の量１質量％未満）、反応時間を２０時間から５０時間に変更した以外は、実施例９と同様にして、Ｌ−アルギニルアラニン（Ｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ）を合成し、ＨＰＬＣで分析し、Ｌ−Ａｒｇ−Ａｌａの生成確認を行った。
上記で使用したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、ＢＡＣＨＥＭより購入した。
６０℃に加温及び５０時間反応におけるＬ−Ａｒｇ−Ａｌａの収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で８０．０モル％となった。

実施例１２ ジペプチドL-Ａｌａ−Ｈｉｓの合成
Ｌ−Ｇｌｎ−ＴＢＰの代わりに、片山製薬所から購入したイオン液体化したＬ−Ｈｉｓ−ＴＢＰを用い、イオン液体化したＬ−Ｈｉｓ−ＴＢＰに対し２００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｈｉｓ−ＴＢＰとなるようＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させた（反応系全体に対する水の量１質量％未満）以外は、実施例９と同様にして、Ｌ−アラニルヒスチジン（Ｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ）を合成し、ＨＰＬＣで分析し、Ｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓの生成確認を行った。
上記で使用したＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、東京化成工業（株）より購入した。
６０℃に加温及び２０時間反応におけるＬ−Ａｌａ−Ｈｉｓの収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で３．３モル％となった。

実施例１３ ジペプチドL-Ａｒｇ−Ｇｌｙの合成
Ｌ−Ａｌａの代わりにＬ−Ｇｌｙを用いた以外は実施例８と同様にして脱水縮合を行い（水分含量１６質量％）、グリシン−テトラブチルフォスフォニウム（以下Ｇｌｙ−ＴＢＰ）の無色透明の液体を得た。
このようにしてイオン液体化したＧｌｙ−ＴＢＰに対し２００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｇｌｙ−ＴＢＰとなるようＬ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させ（反応系全体に対する水の量１６質量％）、反応時間を２３時間から２４時間に変更した以外は、実施例８と同様にして、Ｌ−アルギニルグリシン（Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）を合成し、ＨＰＬＣで分析して、Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの生成を確認した。
上記で使用したアミノ酸Ｌ−ＧｌｙおよびＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、それぞれＳｉｇｍａ及びＢＡＣＨＥＭより購入した。
６０℃に加温及び２４時間反応におけるＬ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で９４．０モル％となった。

実施例１４ ジペプチドＧｌｙ−Ｃｙｓの合成
Ｇｌｙ−ＴＢＰの代わりに、片山製薬所から購入したイオン液体化したＬ−シスチン−テトラブチルフォスフォニウム（以下Ｌ−Ｃｙｓ−ＴＢＰ）を用い、イオン液体化したＬ−Ｃｙｓ−ＴＢＰに対し２００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＴＢＰとなるようグリシンメチルエステル塩酸塩（以下Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させ（反応系全体に対する水の量１質量％未満）、反応時間を２３時間から２時間に変更した以外は、実施例８と同様にして、グリシルシステイン（Ｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）を合成し、ＨＰＬＣで分析して、Ｇｌｙ−Ｃｙｓの生成を確認した。
上記で使用したＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、渡辺化学工業（株）より購入した。
６０℃に加温及び２時間反応におけるＧｌｙ−Ｃｙｓの収率は反応開始時に添加したＧｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で９０．０モル％となった。

実施例１５ ジペプチドL-Ａｒｇ−Ａｌａの合成
Ｇｌｙ−ＴＢＰの代わりに、片山製薬所から購入したイオン液体化したＬ−アラニン−1-エチル-3-メチルイミダゾリウム（以下Ｌ−Ａｌａ−ＥＭＩＭ）を用い、イオン液体化したＬ−Ａｌａ−ＥＭＩＭに対し２００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｌ−Ａｌａ−ＥＭＩＭとなるようＬ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させ（反応系全体に対する水の量０.１２質量％）、反応時間を２３時間から９５時間に変更した以外は、実施例８と同様にして、Ｌ−アルギニルアラニン（Ｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ）を合成し、ＨＰＬＣで分析して、Ｌ−Ａｒｇ−Ａｌａの生成を確認した。
上記で使用したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、ＢＡＣＨＥＭより購入した。
６０℃に加温及び９５時間反応におけるＬ−Ａｒｇ−Ａｌａの収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で８２．９モル％となった。

実施例１６ ジペプチドL-Ａｒｇ−Ｇｌｙの合成
Ｇｌｙ−ＴＢＰの代わりに、片山製薬所から購入したイオン液体化したグリシン−1-エチル-3-メチルイミダゾリウム（以下Ｇｌｙ−ＥＭＩＭ）を用い、イオン液体化したＧｌｙ−ＥＭＩＭに対し２００ｍｍｏｌ／ｋｇ−Ｇｌｙ−ＥＭＩＭとなるようＬ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）を溶解させ（反応系全体に対する水の量０.５０質量％）、反応時間を２３時間から９５時間に変更した以外は、実施例８と同様にして、Ｌ−アルギニルグリシン（Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）を合成し、ＨＰＬＣで分析して、Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの生成を確認した。
上記で使用したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌは市販品であり、ＢＡＣＨＥＭより購入した。
６０℃に加温及び９５時間反応におけるＬ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの収率は反応開始時に添加したＬ−Ａｒｇ−ＯＭｅ・ＨＣｌ換算で１０２．５モル％となった。

Claims (12)

1. ペプチド加水分解酵素及び縮合剤の不存在下、(A)イオン結合によりイオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドを反応溶媒でかつ反応原料として用い、(B)第二のアミノ酸エステル又はペプチドのエステルと、反応系の全質量に対して２０質量％以下の水の存在下で反応させて、当該第一のアミノ酸又はペプチドと当該第二のアミノ酸又はペプチド間にペプチド結合を形成させることを特徴とするペプチドの製造方法。
2. 前記第一のアミノ酸又はペプチドが、イオン液体を構成するカチオンとイオン結合することによりイオン液体化されている、請求項１に記載の方法。
3. 反応系の水は、(A)イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドである反応溶媒中に溶解しており、(B)第二のアミノ酸又はペプチドの少なくとも一部が該反応溶媒中に溶解した状態で、(A)イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドと(B)第二のアミノ酸又はペプチドが反応する請求項１又は２記載の方法。
4. 第一のアミノ酸：第二のアミノ酸のモル比が、２０：１〜１：１である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 第一のアミノ酸又はペプチドが、分子内に２級アミノ基を有するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 第二のアミノ酸又はペプチドのアミノ基が保護されていないものである請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 第二のアミノ酸又はペプチドのアミノ基が保護されているものである請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
8. 第二のアミノ酸又はペプチドが１種以上の第二のアミノ酸及び/又はペプチドである請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 当該第一のアミノ酸又はペプチドのアミノ基と当該第二のアミノ酸又はペプチドのカルボキシル基との間にペプチド結合を形成させる請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 当該イオン液体化された第一のアミノ酸又はペプチドが、アルキルホスホニウムイオン、アルキルイミダゾリウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルキルピリジニウムイオン、アルキルピロリジニウムイオン及びアルキルピぺリジニウムイオンから選ばれる少なくとも１種であるカチオンとイオン結合している請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. ペプチド結合の形成を０〜１００℃の温度で行う請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 反応系の全質量に対して１０質量％以下の水の存在下で反応させる請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。