JP6074561B2 - 真菌の存在量の鑑別方法並びにそれに用いられるプライマー - Google Patents

Description

本発明は、抗真菌剤の評価などに有用な真菌の存在量の鑑別方法及び該鑑別方法に用いられるプライマーに関する。

皮膚糸状菌（白癬菌）などによる真菌症においては、組織中において菌が耐久型細胞を作りうるため、治療などによって、完治したようにみえても、再発することが多い。患部における菌の存在は通常は、患部の一部を採取して、これをアルカリ処理した後、形態を観察し、糸状の菌要素の有無で判断するのが一般的な方法であった。当然この様な方法では、菌糸型以外の菌要素はなかなか検出できない。特に、爪白癬においては、アルカリでの組織処理に時間がかかりまた判定も難しいため、ＰＡＳ染色のような糖鎖を染める組織染色法が採用されたり、爪よりＤＮＡを抽出し、真菌に特異的な部分をＰＣＲで増幅し、これを検出する方法などが検討されている。（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照）しかしながら、これらにおいてはいずれも感度の問題が存している。ＤＮＡを用いた方法については、トリコフィトン・メンタグロフィテスとトリコフィトン・ルブルムでは異なったプライマーを用いなければならず、迅速な検出は難しいと言わざるを得ない。即ち、爪などアルカリでの溶解に難渋する組織においても、迅速に、より感度高く真菌の存在の状況を鑑別出来る手段の開発が望まれていた。

また、配列番号２のオリゴヌクレオチドと類似したオリゴヌクレオチドとしては、ＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＴＧＧＴＡＴＴなる配列のものが開示されている（例えば、特許文献４）が、真菌との関係は全く開示も示唆もされていない。

特開２００８−２７８８８６号公報 特開２００８−６７６０５号公報 特開２００７−２３６３３８号公報 ＷＯ０１／１８５４２

本発明は、この様な状況下為されたものであり、爪白癬の診断などに有用な、より迅速に、より感度高く真菌の存在の状況を鑑別出来る手段を提供することを課題とする。

この様な実情に鑑みて、本発明者らは、より迅速に、より感度高く真菌の存在の状況を鑑別出来る手段を求めて、鋭意研究を重ねた結果、Ｄ１／Ｄ２領域の約１００塩基の配列部分をＰＣＲ法にて増幅し、これを検出することにより、この様な鑑別がなし得ることを見出し、発明を完成させた。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞真菌の存在量の鑑別方法であって、トリコフィトン属の真菌のＤＮＡの内、配列番号１に示す塩基配列及び／またはそれと相同的な塩基配列を選択的にＰＣＲ反応によって増幅し、産生された核酸量を比較して、存在する菌量の多少を推定することを特徴とする、真菌の存在量の鑑別方法。
＜２＞前記核酸はＤＮＡであることを特徴とする、＜１＞に記載の真菌の存在量の鑑別方法。
＜３＞＜１＞又は＜２＞に記載の鑑別方法において、ＰＣＲ反応による増幅に用いられるプライマーが、配列番号２及び／又は配列番号３に示されるオリゴヌクレオチド乃至はそれらと相同的な配列のものであることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の鑑別方法。
＜４＞既知の菌量のサンプルを、同じＰＣＲ条件で処理し、産生されたＤＮＡ量を比較対象にして、産生量を推定することを特徴とする、＜１＞〜＜３＞いずれか１項に記載の鑑別方法。
＜５＞存在量を鑑別すべきサンプルは、動物より分離された皮膚乃至は爪であることを特徴とする、＜１＞〜＜４＞いずれか１項に記載の鑑別方法。
＜６＞動物は、真菌症の患者であることを特徴とする、＜５＞に記載の鑑別方法。
＜７＞真菌はトリコフィトン・メンタグロファイテス又はトリコフィトン・ルブルムであることを特徴とする、＜１＞〜＜６＞いずれか１項に記載の鑑別方法。
＜８＞配列番号２又は配列番号３に表される塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド及び／又はそれらと相同性を有するオリゴヌクレオチド。

本発明によれば、従来に比して、より迅速に、より感度高く真菌の存在の状況を鑑別出来る手段を提供することができる。

実施例１の感度の差を示す図である。 実施例２の電気泳動を示す図である。 実施３の結果を示す図である。

本発明の鑑別方法は、生体組織中の真菌の存在量の鑑別方法であって、トリコフィトン属の真菌のＤＮＡの内、配列番号１に示す塩基配列及び／またはそれと相同的な塩基配列を選択的にＰＣＲ反応によって増幅し、産生されたＤＮＡ量を比較して、存在する菌量の多少を推定することを特徴とする。配列番号１に示される塩基配列は、リボソームＲＮＡのラージサブユニットである２８ｓ ｒＲＮＡのＤ１／Ｄ２領域に含まれ、この領域の塩基配列は既に公知のものとなっている。この領域は菌種間、また属間で塩基配列の相同性が低い部分として知られているが、近縁種であるトリコフィトン属、エピデルモフィトン属、ミクロスポルム属の諸菌種においては、塩基配列の相同性が高い部分である。従って、この領域の共通配列の中からプライマーを設計し、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅し、定量し、標準検体と比較することにより、菌量を定量することが出来る。定量法は増幅した後、プローブを用いて、サザンブロットで検出することも出来るし、増幅をリアルタイム−ＰＣＲで行えば、増幅産物を蛍光強度で定量化できる。

この様なＰＣＲを行う為のプライマーとしては、配列番号２及び配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを用いることが出来る。この様なオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡシンセサイザーを用いて、作成することが出来るし、この様な製造を受託する会社も存し、その入手に障害は存しない。

ＰＣＲを行うに際しては、まずは検体よりＤＮＡを抽出する。抽出は、常法に従って行えば良く、検体を粉砕又は細切し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させること等が例示できるが、「キアゲン」社等から販売されている抽出キットを用いることも出来る。ＰＣＲは、プライマーとなる１組のオリゴヌクレオチドと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、旧来のＰＣＲ法に従って増幅し、プローブなどで検出することも出来るが、リアルタイムＰＣＲによって、増幅と同時に増幅量を蛍光強度として検出することも可能であり、リアルタイムＰＣＲ法に従って増幅、検出することが好ましい。

かかる操作において、検体として爪を取り扱う場合には、破砕に大きな応力と、処理回数が必要になるため、局部発熱により核酸が変性されることがままあることから、予め液体窒素、液体ヘリウム、アセトン・ドライアイス混合物などの極冷媒体中で検体を凍結させ、組織結合力を弱めた上で、マルチビーズショッカーなどの媒体ミルを用いて破砕することが好ましい。この様な処理により、容易に、細かく、変性なく検体を破砕することが出来る。勿論、皮膚などの軟組織にこの様な破砕処理を行うことも可能である。

鑑別に用いる核酸をＲＮＡとする場合には、前記と同様の抽出を行った後にＤＮＡｓｅＩ等のＤＮＡｓｅでＤＮＡを水壊し、トランスクリプターゼでｃＤＮＡとし、これを増幅検出すればよい。この様なＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ化についても、キアゲンなどがから販売されている抽出キットを用いて行うことが出来る。

前記ＰＣＲ反応は９５℃付近の温度で１０〜２０分変性後、９５℃付近の温度で１０秒、５０〜６０℃３０秒、７２℃付近で１０秒のサイクルを１０〜７０サイクルで増幅させることが好ましい。迅速に且つより確実に検出を行うには、３０〜６０サイクルで行うことが再現性に優れ好ましい。

かかる、ＰＣＲに用いるプライマーとしては、配列番号２のもの乃至は配列番号２と相同性を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号３のもの乃至は配列番号３と相同性を有するオリゴヌクレオチドを、フォワード用のプライマーとリバース用のプライマーとして使用することが好ましい。ここで相同性を有するとは、塩基鎖長で１０％程度の違いを、塩基配列における相違点が５％以内程度のものを意味する。この様なプライマーによって増幅されるべき、塩基鎖の位置は、トリコフィトン属のＤＮＡの２８ｓ ｒＲＮＡのＤ１／Ｄ２領域となる。

以下に、実施例を示し、本発明について更に詳細に説明を加える。

予め培養して増やした２種のトリコフィトン・メンタグロフィテスを用いて、検出試験を行った。
ＲＮＡ、ＤＮＡの抽出にはＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。
乾熱滅菌処理した３ｇメタルコーンを各１つ入れた３ｍＬチューブに、約２週間ＰＤＡ平板培地、３０℃で培養したＴ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ｖａｒ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）のコロニーを約１０ｍｇ精秤して入れた。これを液体窒素で凍結後、マルチビーズショッカーＲ（安井器械）を用いて破砕した。破砕後、２−メルカプトエタノールを１／１００量添加したＲＬＴ Ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒを６００μｌずつ加えた。再度１５００ｒｐｍで破砕した後、６５００ｒｐｍで遠沈した。上澄み約５００μｌを１．５ｍＬチューブに移し、１５０００ｒｐｍで遠沈した。この上澄み４７０ｕｌをまずＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに移し、１２５００ｒｐｍで遠沈してＤＮＡをカラムに吸着させた。ここで得られたＲＮＡを含んだ濾液は等量（４７０μｌ）の２−プロパノールを加え、懸濁した後ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに移し、１２５００ｒｐｍで遠沈してＲＮＡをカラムに吸着させた。ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎはＡＷ１、ＡＷ２で洗浄後、ＤＮＡを１００μｌのＥＢ ｂｕｆｆｅｒで溶出し、ＤＮＡ抽出液とした。 得られたＤＮＡ液１００μｌはそのうち２μｌを鋳型としてｑＰＣＲに用いた。ｑＰＣＲはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。機器は７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）反応は９５度１５分で変性後、９５℃１０秒→５５℃で３０秒→７２℃で１０秒→のサイクルで５５サイクル増幅させた。増幅産物が検出されたサイクル数を表１及び図１に示す。比較としては、特許文献２に記載のプライマーセットを用いた。ＰＣＲは前記の条件で行った。この図より、本発明のプライマーを使用することにより、１回のＰＣＲで菌を検出でき、しかもその感度も高いことが判る。

各種の菌を用いて、本発明のプライマーである配列番号２及び配列番号３のヌクレオチドを用いてリアルタイムＰＣＲを行って、配列番号１の部分を増幅し、電気泳動して、配列の特異性とノイズの増幅の有無を調べた。結果を図２に示す。本発明のプライマーは皮膚糸状菌とエピデルムフィトンのみを増幅し、しかもノイズのバンドもないことが判る。これより、本発明のプライマーは実際の白癬病巣からのサンプルに対して汎用できることも判る。

実施例１と同様に、トリコフィトン・ルブルムについても、検出感度を検討した。
結果を表２及び図３に示す。ルブルムに対しても高感度に検出できることが判る。

本発明は、ヒト・動物の真菌症の診断や治癒判定など、医療・獣医領域での応用が可能である。

Claims (7)

1. 検体中の真菌の存在量の鑑別方法であって、
   前記検体中の核酸を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、配列番号１に示す塩基配列及び／またはそれと相同的な塩基配列を含む核酸を選択的に増幅する工程、及び
   前記工程で産生された核酸量に基づいて、前記検体中に存在する菌量の多少を推定する工程を含み、
   前記真菌はトリコフィトン属、エピデルモフィトン属、又はミクロスポルム属に属する真菌であり、
   前記ＰＣＲ反応に用いられるプライマーが、配列番号２に示される塩基配列又はそれと相同的な配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号３に示される塩基配列又はそれと相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする鑑別方法。
2. 前記核酸はＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の鑑別方法。
3. 既知の菌量の標準検体中の核酸を鋳型として検体と同条件でＰＣＲ反応を行って産生された核酸量を比較対象にして、前記推定する工程を行うことを特徴とする、請求項１又は２に記載の鑑別方法。
4. 真菌の存在量を鑑別すべき検体は、動物より分離された皮膚乃至は爪であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の鑑別方法。
5. 前記動物は、真菌症の患者であることを特徴とする、請求項４に記載の鑑別方法。
6. 前記真菌はトリコフィトン・メンタグロファイテス又はトリコフィトン・ルブルムであることを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項に記載の鑑別方法。
7. 配列番号２もしくは配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又はそれらと相同的な配列を有するオリゴヌクレオチド。

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