CN105463068B

CN105463068B - 用于鉴定草原血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105463068B
Application number: CN201510155871.5A
Authority: CN
Inventors: 林祥梅; 吕继洲; 张舟; 吴绍强; 王慧煜; 王彩霞
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2015-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2035-04-02
Also published as: CN105463068A

Abstract

本发明提供了用于鉴定草原血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒，属于蜱虫检测与鉴定技术领域。所述靶序列为用于鉴定草原血蜱的特异性DNA序列，如SEQ ID NO.1所示，是首次扩增出的草原血蜱COI全长序列的一段。通过分析草原血蜱的全长序列，确定保守区域设计了可特异性扩增草原血蜱COI部分序列的引物对，序列如SEQ ID No.2和3所示。本发明克服了传统草原血蜱分类鉴定对标本完成性要求高、对鉴定者的专业分类水平要求高等诸多问题，提供的PCR引物及鉴定方法以及试剂盒操作方便，灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低，能够满足草原血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求，具有良好的应用前景。

Description

用于鉴定草原血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及蜱虫检测与鉴定技术领域，具体地涉及用于鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的靶序列、特异性引物对、鉴定方法及试剂盒。

背景技术

草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)属硬蜱科，血蜱属，广泛分布于我国北方草原地区(包括黑龙江、吉林、辽宁、内蒙、河北、宁夏和山西等)以及蒙古国。其寄生对象较多，包括草原黄鼠、长爪沙鼠、黑线仓鼠以及蒙古兔、黄羊、黄牛、麻雀等20多个物种，我国也有其叮咬人的相关报道。草原血蜱作为媒介可传播的病原体包括巴贝斯等血液原虫、螺旋体、细菌、病毒以及立克次氏体等，其属于我国已经发现的30种具有明显医学重要性蜱媒(包括全沟硬蜱、微小扇头蜱、亚洲璃眼蜱等)中的一种。

目前，草原血蜱的物种鉴定主要依靠形态学特征，该鉴定方法对鉴定者的专业知识和蜱虫样本完整性均要求较高，又由于蜱虫易与形态近似种混淆，造成草原血蜱的鉴定结果费时、费力且准确度和重复性都不高。近年来，分子生物学技术已经被广泛应用于物种鉴定，目前在草原血蜱的鉴定方面还没有相关报道，且Genbank数据库中也没有草原血蜱的相关序列信息。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种用于鉴定草原血蜱的特异性靶序列。

本发明的第二个目的在于提供用于扩增特异性靶序列的引物对。

本发明的第三个目的在于提供鉴定草原血蜱的方法及试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先利用自行设计的蜱虫COI全长序列扩增引物对草原血蜱的COI序列进行扩增。

COI-CF：5’-ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3’(SEQ ID NO.4)

COI-CR：5’-TTATTTTAAAATAATRTT-3’(SEQ ID NO.5)。

上述序列中，Y和R分别为兼并引物，Y＝C/T，R＝A/G。

COI-CF与COI-CR扩增出草原血蜱的COI全长序列，长1539bp，其电泳图如图1所示。

本发明根据引物COI-CF和COI-CR扩增的草原血蜱的COI全长序列，通过MEGA软件中CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数据库以及本发明扩增的同属其他血蜱COI序列进行比对分析，筛选出草原血蜱特异性序列并设计扩增引物，共设计正向引物3条，反向引物2条。最终筛选得到一对特异性强、扩增效果好的引物对，命名为HV-F和HV-R。使用草原血蜱特异性引物并进行PCR扩增。草原血蜱获得477bp的DNA特异性条带，对其进行测序、BLAST比对，确定该特异性DNA序列可作为鉴定草原血蜱的特异性DNA序列，用于鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)。

因此，本发明首先提供一种用于鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的靶序列，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了上述靶序列在鉴定草原血蜱中的应用。

用于上述靶序列的特异性引物对属于本发明的保护范围。

本发明提供了特异性扩增上述靶序列的特异性引物对，命名为HV-F和HV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示。

本发明提供了上述特异性引物对在制备鉴定草原血蜱(Haemaphysalisverticalis)试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的方法，以待测昆虫样品总DNA为模板，以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为靶序列，利用本发明提供的特异性引物对进行PCR，根据扩增条带的大小判定结果。

更进一步地，若扩增条带大小为477bp，则待测昆虫样本为草原血蜱。

本发明的鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的方法中，50μl PCR反应体系为：10×PCR buffer 5μl、10mM上、下游引物各2μl、10mM dNTPs2μl、50U的Taq酶1μl，10～20ng DNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl；

PCR反应程序：预热94℃，5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共36个循环；延伸72℃，7min，4℃保存。

本发明还提供一种用于鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的试剂盒，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示的引物对。

本发明提供了该试剂盒在鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)中的用途。

本发明的优点在于，本发明填补了目前GenBank中没有草原血蜱COI特异性DNA序列的空白，提供了用于鉴定草原血蜱的靶序列。本发明还克服了传统草原血蜱鉴定对标本完整性要求高、需要专业分类专家、鉴定成本高等问题，提供的鉴定草原血蜱的PCR引物及鉴定方法弥补现有检测技术的不足，操作简便快捷，灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低，提高了草原血蜱鉴定的效率和准确性，能够满足草原血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求。适用于草原血蜱分布调查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作，具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1本发明设计的蜱虫COI全长序列扩增引物对COI-CF/COI-CR，并用引物对扩增草原血蜱的COI全长序列。PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳图；其中M：DL2000Marker；1：1#草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)

图2为本发明设计的草原血蜱正向扩增引物HV-F序列与Genbank数据库以及本发明扩增的同属其他血蜱COI序列进行BLAST比对分析的结果；其中1：HV-F引物序列；2：本发明扩增的1#草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)COI序列；3：本发明扩增的1#日本血蜱(Haemaphysalis japonica)COI序列；4：本发明扩增的1#长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)COI序列；5：本发明扩增的1#嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)COI序列；6：Genbank数据库中的褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)COI序列；7：Genbank数据库中的硕鼠血蜱(Haemaphysalis humerosa)COI序列；8：Genbank数据库中的狐猴血蜱(Haemaphysalis lemuris)COI序列；9：Genbank数据库中的长棘血蜱(Haemaphysalispunctata)COI序列；

图3为本发明设计的草原血蜱反向扩增引物HV-R序列与Genbank数据库以及本发明扩增的同属其他血蜱COI序列进行BLAST比对分析的结果；其中1：HV-R引物序列；2：本发明扩增的1#草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)COI序列；3：本发明扩增的1#日本血蜱(Haemaphysalis japonica)COI序列；4：本发明扩增的1#长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)COI序列；5：本发明扩增的1#嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)COI序列；6：Genbank数据库中的褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)COI序列；7：Genbank数据库中的硕鼠血蜱(Haemaphysalis humerosa)COI序列；8：Genbank数据库中的狐猴血蜱(Haemaphysalis lemuris)COI序列；9：Genbank数据库中的长棘血蜱(Haemaphysalispunctata)COI序列；

图4为用本发明设计的特异性引物对蜱虫DNA样本进行PCR检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；其中M：DL2000Marker；1：1#草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)；2:2#草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)；3：阴性对照；4：1#嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)；5:2#嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)；6:1#日本血蜱(Haemaphysalis japonica)；7:2#日本血蜱(Haemaphysalis japonica)；8：1#长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)；9:2#长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)；10：草原革蜱(Dermacentor nuttalli)；11：亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)；12：全沟硬蜱(Ixodes persuleatus)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明的长角血蜱采自北京，全沟硬蜱、嗜群血蜱、草原血蜱、日本血蜱采自黑龙江，亚洲璃眼蜱采自内蒙古，草原革蜱采自新疆。所有样品均保存于中国检检验检疫科学研究院。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1 草原血蜱特异性靶序列的确定与扩增其的引物设计

利用发明者设计的蜱虫COI全长序列扩增引物COI-CF/COI-CR对草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)COI的全长序列进行PCR扩增并测序，首次扩增出草原血蜱的COI序列中的一段，长1539bp，其电泳图如图1所示。采用的引物序列如下：

COI-CF：5’-ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3’；(SEQ ID NO.4)

COI-CR：5’-TTATTTTAAAATAATRTT-3’(SEQ ID NO.5)。

本发明根据COI-CF/COI-CR扩增的草原血蜱的COI序列，通过MEGA软件中CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数据库中同属其他血蜱COI序列进行比对分析，确定草原血蜱COI高度保守序列。设计草原血蜱特异性引物。共设计正向引物3条，反向引物2条。最终筛选得到一对特异性强、扩增效果好的引物对，命名为HV-F和HV-R。

另外3条引物序列分别如下：

HV-F1：5’-TAATGTAATTGTAACCGCA-3’

HV-F2：5’-CATTTCCTCGTATAAATAAC-3’

HV-R1：5’-TAAGTGTTGATATAAAATC-3’

经实际PCR扩增验证，HV-F1、HV-F2以及HV-R1等引物扩增特异性较差，除了可扩增出草原血蜱的相应序列，部分嗜群血蜱及长角血蜱样品也有相应大小扩增条带出现。因此确定正向引物HV-F以及反向引物HV-R扩增效果良好，特异性强。引物设计BLAST比对结果如图2，图3所示。

本发明经过反复筛选获得的特异性扩增该靶序列的特异性引物对，正向引物HV-F：5'CAACCTGGTACTTTAATTGGTAAC3'(如SEQ ID NO.2所示)

反向引物HV-R：5'AACAGGTAATGA TAAGAGAAG AAG3'(如SEQ ID NO.3所示)并进行PCR扩增，获得477bp的DNA特异性条带，对其进行测序、BLAST比对，确定该特异性DNA序列可作为鉴定草原血蜱的特异性DNA序列(SEQ ID No.1所示)，用于鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)。

实施例2 利用PCR鉴定草原血蜱

1、样品处理及DNA基因组提取

将1#草原血蜱Haemaphysalis verticalis；2#草原血蜱Haemaphysalisverticalis；1#嗜群血蜱Haemaphysalis concinna；2#嗜群血蜱Haemaphysalis concinna；1#日本血蜱Haemaphysalis japonica；2#日本血蜱Haemaphysalis japonica；1#长角血蜱Haemaphysalis longicornis；2#长角血蜱Haemaphysalis longicornis；草原革蜱Dermacentor nuttalli；亚洲璃眼蜱Hyalomma asiaticum；全沟硬蜱Ixodes persuleatus等样本用蒸馏水洗净，分别置于1.5ml离心管中，加入200μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0；50mmol/L NaCl；0.45％Tween20；0.45％NP-40)，用研磨棒将样品研碎，涡旋混匀，再加入10μl蛋白酶K(100μg/ml)，56℃消化过夜。然后95℃处理5分钟，12000rpm离心5分钟，转移上清至新的离心管中，得到基因组DNA，可用于PCR扩增。

2、特异性PCR扩增

反应体系为50μl，加入10×PCR buffer 5μl、上、下游引物对(10mM)各2μl、dNTPs(10mM)2μl、Taq酶(50U)1μl以及10～20ng DNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl。以灭菌双蒸水为阴性对照。

PCR反应程序：预热94℃，5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共36个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，阴性对照为灭菌双蒸水，草原血蜱样品的电泳结果出现清晰且亮度较高的477bp大小的条带，反之，其他泳道无此条带出现或出现拖尾、引物二聚体等非特异性扩增，则为其他蜱虫或非蜱虫样本。进一步说明本发明的方法特异性好，准确度高。

实施例3 鉴定草原血蜱的试剂盒及应用

1、试剂盒的构成：裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0；50mmol/L NaCl；0.45％Tween20；0.45％NP-40)；蛋白酶K(100μg/ml)；

正向引物HV-F：5'CAACCTGGTACTTTAATTGGTAAC3'(10mmol/L)；反向引物HV-R：5'AACAGGTAATGA TAAGAGAAG AAG3'(10mmol/L)；Taq酶(50U/μl)；10×PCR buffer；dNTPs(10mM)；草原血蜱鉴定操作说明书。

2、具体操作步骤：

(1)取疑似草原血蜱样品，用剪刀剖开其几丁质外壳，镊子取出其内部肌肉组织0.1～0.2g，放入1.5ml EP管中，加入500μl裂解缓冲液用研磨棒将样品研碎；再加入500μl裂解缓冲液、10μl蛋白酶K，涡旋混匀；56℃消化过夜；然后95℃处理5分钟；12000rpm离心5分钟；将上清的DNA样品至新的离心管中备用。

(2)配制PCR反应体系：

试剂	体积(μl)
		10×PCR buffer	5
HV-F	2
		HV-R	2
dNTPs	2
		Taq酶	1
DNA模板	2
		双蒸水	补足至50μl

(3)PCR反应程序设置：

预热94℃，5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共36个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。

(4)1.0～1.5％琼脂糖电泳检测，PCR产物及DNA Marker各取出6μl上样，120V电泳30min。

(5)紫外照相。若电泳结果出现清晰且亮度较高的477bp大小的条带，样本为草原血蜱；反之，其他无此条带出现或出现拖尾、引物二聚体等非特异性扩增，则为其他蜱虫或非蜱虫样本。

本发明的试剂盒可用于对草原血蜱进行快速鉴定，具有特异性强、准确率高、低成本的特点，操作简便，适用于草原血蜱分布调查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述靶序列可通过核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示的特异性引物对PCR扩增获得。

2.权利要求1所示的靶序列在非疾病诊断目的的鉴定草原血蜱中的应用。

3.用于扩增权利要求1所示靶序列的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示。

4.权利要求3所述的特异性引物对在制备鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)试剂盒中的应用。

5.非疾病诊断目的的鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的方法，其特征在于，以待测昆虫样品总DNA为模板，以权利要求1所述的靶序列为目标，利用权利要求3所述的特异性引物对进行PCR，根据扩增条带的大小判定结果。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，若扩增条带为477bp，则待测昆虫样本为草原血蜱。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，50μl PCR反应体系为：10×PCR buffer 5μl、10mM上、下游引物各2μl、10mM dNTPs2μl、50U的Taq酶1μl，10～20ng DNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl；

8.一种用于鉴定草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)的试剂盒，其特征在于，含有一对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示。

9.权利要求8所述的试剂盒在非疾病诊断目的的鉴定草原血蜱(Haemaphysalisverticalis)中的用途。