JP6059859B2 - Stimulation of synthesis and activity of LOXL (lysyl oxidase-like) isoforms to stimulate the formation of elastic fibers - Google Patents
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Description
本発明は、リシルオキシダーゼのアイソフォームの、特にLOXL(リシルオキシダーゼ類似)アイソフォームの活性の刺激に関する。 The present invention relates to stimulating the activity of lysyl oxidase isoforms, in particular LOXL (lysyl oxidase-like) isoforms.
皮膚や粘膜の抵抗力や弾力性といった特性は、真皮の膠原繊維及びエラスチン繊維によって本質的に決まる。エラスチンは、フィブリリンやMAGP(ミクロフィブリル結合糖タンパク質(Microfibrillar Associated Glycoprotein))等の他の分子と結合することによって弾性繊維を構成するタンパク質である。 Properties of skin and mucous membranes such as resistance and elasticity are essentially determined by dermal collagen fibers and elastin fibers. Elastin is a protein that constitutes an elastic fiber by binding with other molecules such as fibrillin and MAGP (Microfibrillated Glycoprotein).
「弾性繊維」は、ミクロフィブリル上に沈着したエラスチンから構成される。エラスチンは、可溶性のトロポエラスチンとして合成され、トロポエラスチンは、リシルオキシダーゼによって分子内及び分子間で架橋してミクロフィブリル上に沈着すると、その物理化学特性(不溶性、弾力性)を呈する。弾性繊維は、これを含む器官(管、肺柔組織、弾性軟骨、皮膚等)に収縮性を与える。弾性繊維は、ミクロフィブリル上に沈着したエラスチンから主に構成される。「エラスチン」の名称は、弾性繊維の無定形の部分を構成し、弾性繊維に弾力性を与えるタンパク質について用いられる。最近、弾性繊維を構成するこの成分が表皮中に存在することが分かった。 “Elastic fibers” are composed of elastin deposited on microfibrils. Elastin is synthesized as soluble tropoelastin, and tropoelastin exhibits its physicochemical properties (insoluble and elastic) when deposited on microfibrils by cross-linking between molecules and molecules with lysyl oxidase. The elastic fiber imparts contractility to an organ (tube, lung soft tissue, elastic cartilage, skin, etc.) containing the elastic fiber. Elastic fibers are mainly composed of elastin deposited on microfibrils. The name “elastin” is used for a protein that forms an amorphous part of an elastic fiber and gives elasticity to the elastic fiber. Recently, it has been found that this component constituting the elastic fiber is present in the epidermis.
「コラーゲン細繊維」は、コラーゲンの三本鎖から構成される。このコラーゲンの繊維もまたリシルオキシダーゼによって架橋している。 “Collagen fine fibers” are composed of three chains of collagen. The collagen fibers are also cross-linked by lysyl oxidase.
皮膚や粘膜の加齢は、上記小繊維の網状組織の変性、特に劣化して正確に再生しない弾性繊維の変性と関係がある。同様に、瘢痕の弾性繊維の網状組織も正確な形ではない。LOX、LOXL、LOXL2、LOXL3及びLOXL4の5種のアイソフォームがリシルオキシダーゼ(LO)ファミリーにおいて知られている(非特許文献1)。LOXは膠原繊維の架橋に関与していることが分かっている(非特許文献2)。 The aging of the skin and mucous membrane is related to the denaturation of the fibrillar network, particularly the denaturation of elastic fibers that deteriorate and do not regenerate correctly. Similarly, the network of scar elastic fibers is not accurate. Five isoforms of LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3 and LOXL4 are known in the lysyl oxidase (LO) family (Non-patent Document 1). It has been found that LOX is involved in the crosslinking of collagen fibers (Non-patent Document 2).
機能性弾性繊維(主に皮膚、管、網膜の黄斑及び椎間板に存在する)は、胎児成長期及び出生直後に形成される。上記弾性繊維は皮膚中で真皮の繊維芽細胞によって形成されるが、上記弾性繊維の形成に不可欠なある化合物が表皮細胞内にも発見されている。膠原繊維は一生を通して結合組織で合成される。 Functional elastic fibers (mainly in the skin, ducts, retinal macular and intervertebral disc) are formed during the fetal growth phase and immediately after birth. The elastic fibers are formed by dermal fibroblasts in the skin, but certain compounds essential for the formation of the elastic fibers have also been found in epidermal cells. Collagen fibers are synthesized in connective tissue throughout life.
弾性繊維の交換速度は成人では非常に遅いが、皮膚中の全エラスチン量は増加することがある(非特許文献3)。ミクロフィブリルは新生児においてエラスチンで完全に覆われているわけではなく、思春期頃には完全に覆われるようになる。40代で繊維において封入体が(特に女性で多く)形成され、その後、真皮と表皮の境界部(DEJ)において弾性繊維の断裂及び消失がみられる。このようなDEJにおける断裂及び/又は消失は、皮膚の弾力性がなくなって皺ができることから分かる。非機能性弾性繊維は光老化の過程で合成されるが、この増加に伴ってDEJにおける弾性繊維の消失が加速する(非特許文献4)。 The exchange rate of elastic fibers is very slow in adults, but the total amount of elastin in the skin may increase (Non-patent Document 3). Microfibrils are not completely covered with elastin in newborns, but become completely covered around puberty. In the 40s, inclusions are formed in the fibers (especially in women), and then the elastic fibers are ruptured and lost at the boundary between the dermis and the epidermis (DEJ). Such tearing and / or disappearance in DEJ can be seen from the loss of skin elasticity and wrinkling. Non-functional elastic fibers are synthesized in the process of photoaging, but with this increase, the disappearance of elastic fibers in DEJ accelerates (Non-patent Document 4).
また、弾性繊維は、成人の瘢痕では新たに合成されることはほとんどないが、逆に、生成する弾性繊維が著しく断裂しているような高齢者(70歳以上)において新たに合成される場合がある。この場合、弾性繊維の最終的な組成における主要な構成成分(エラスチン、ミクロフィブリル)も存在しており、またリシルオキシダーゼの活性も全体的に維持されている(非特許文献5)。このことから、本発明者らは、機能性弾性繊維を形成できる1種以上の要素が成人では欠損しているが、胎児成長期から1歳の時点では存在していると考えた。 In addition, elastic fibers are rarely synthesized in adult scars, but conversely, they are newly synthesized in elderly people (70 years old or older) whose generated elastic fibers are severely torn. There is. In this case, main components (elastin and microfibrils) in the final composition of the elastic fiber are also present, and the activity of lysyl oxidase is generally maintained (Non-patent Document 5). From this, the present inventors considered that one or more elements capable of forming a functional elastic fiber are deficient in adults, but existed at the age of 1 year after fetal growth.
従来の技術では、皮膚・化粧品学上の活性成分が機能性弾性繊維の新たな形成に与える影響を評価できる基準を定められていない。この状況では、調査すべき上記活性成分の与える影響を評価できるような所望の基準を定めることもまた難しい。実際の活性成分のスクリーニング方法は、エラスチンやフィブリリン等の弾性繊維の形成に関与する遺伝子の発現の評価に影響を与える。 In the prior art, there is no standard that can evaluate the influence of an active ingredient in skin / cosmetics on the new formation of functional elastic fibers. In this situation, it is also difficult to define a desired standard that can evaluate the effect of the active ingredient to be investigated. The actual screening method for active ingredients affects the evaluation of the expression of genes involved in the formation of elastic fibers such as elastin and fibrillin.
また、現在、動物実験は化粧品においてヨーロッパでは禁止されており、人体実験は倫理上異論が唱えられている。このため、本発明者らは、動物や人間を用いたスクリーニングを化粧品の用途に実施できない。 Currently, animal experiments are prohibited in cosmetics in Europe, and human experiments are ethically challenged. For this reason, the present inventors cannot carry out screening using animals or humans for cosmetic applications.
Mimeskin(R)(Coletica社、リヨン、フランス)等の三次元モデルにおいて、角質細胞はトロポエラスチンの合成及びトロポエラスチンのミクロフィブリル上への沈着を誘導する(非特許文献6)。Mimeskin(R)モデルにおいて、細胞外マトリックスは、放射状のコラーゲンとミクロフィブリル上に沈着したエラスチンからなる弾性繊維とを有し、皮膚の超微細構造に似た超微細構造を呈した。このモデルは、リシルオキシダーゼ阻害剤等の特定分子の有効性を試験するためにも使用されている。このモデルを用いることにより、リシルオキシダーゼを阻害すると膠原繊維及びエラスチン繊維の断裂が誘導されるが、最終分化の標識(フィラグリン等)の発現量も減少することから、角質細胞の分化プログラムからの逸脱もまた誘導されることが証明された(特許文献1)。この特許文献においては、異種のLOアイソフォーム間の識別はされていない。 In a three-dimensional model such as Mimeskin® (Coletica, Lyon, France), keratinocytes induce the synthesis of tropoelastin and the deposition of tropoelastin on microfibrils (Non-Patent Document 6). In the Mimeskin® model, the extracellular matrix had radial collagen and elastic fibers made of elastin deposited on microfibrils, and exhibited an ultrastructure similar to the ultrastructure of the skin. This model has also been used to test the effectiveness of certain molecules such as lysyl oxidase inhibitors. Using this model, inhibition of lysyl oxidase induces collagen fiber and elastin fiber rupture, but the expression level of terminal differentiation markers (filaggrin, etc.) is also reduced, so deviation from the keratinocyte differentiation program Has also been demonstrated to be induced (Patent Document 1). In this patent document, no distinction is made between different LO isoforms.
しかしながら、上記の研究では、機能性弾性繊維の形成を刺激できる活性成分の同定方法を明らかにできなかった。 However, the above study has failed to reveal a method for identifying an active ingredient that can stimulate the formation of functional elastic fibers.
そのため、機能性弾性繊維の形成を刺激できる活性成分は今までのところ明らかにされていない。 Therefore, an active ingredient that can stimulate the formation of functional elastic fibers has not been clarified so far.
また、これまでは、特に従来の方法は不明確であるため、リシルオキシダーゼアイソフォームLOXLの発現領域を精力的に追跡できなかった。 In addition, until now, since the conventional method is unclear, the expression region of lysyl oxidase isoform LOXL could not be traced vigorously.
本発明の目的は、主として、上記の技術的な問題、特に機能性弾性繊維の形成を刺激する活性成分の同定方法を提供するための技術的な問題を解決することである。「機能性弾性繊維」という語は、上述した従来の技術においては通常の意味で用いるが、特に本発明においては、三次元構造に由来する収縮性を持つ弾性繊維を意味する。 The object of the present invention is mainly to solve the technical problems mentioned above, in particular the technical problems for providing a method for identifying active ingredients that stimulate the formation of functional elastic fibers. The term “functional elastic fiber” is used in the usual sense in the above-described conventional technology, but particularly in the present invention, it means an elastic fiber having contractility derived from a three-dimensional structure.
本発明は、特に機能性弾性繊維の形成を刺激するための、リシルオキシダーゼのL型のアイソフォームの使用、又は、リシルオキシダーゼのL型のアイソフォーム(LOXL)の酵素活性若しくは発現を刺激する活性成分の使用に関する。 The present invention particularly relates to the use of L-form isoforms of lysyl oxidase to stimulate the formation of functional elastic fibers, or the activity to stimulate enzymatic activity or expression of L-form isoforms of lysyl oxidase (LOXL). Concerning the use of ingredients.
本発明によれば、LOXLの発現箇所を確認してこの発現を追跡する方法を提供することからなる技術的な問題を解決できる。 According to the present invention, it is possible to solve the technical problem of providing a method for confirming the location of LOXL and tracking this expression.
本記載中、本発明者らは、「LOXL」又は「hLOXL」の語が、ヒトリシルオキシダーゼタンパク質のL型のアイソフォームLOXLを意味するものとする。 In the present description, we mean that the term “LOXL” or “hLOXL” refers to the L-form isoform LOXL of human lysyl oxidase protein.
本記載中、本発明者らは、「LOX」又は「hLOX」の語が、ヒトリシルオキシダーゼタンパク質の第一のアイソフォーム(initial isoform)LOXを意味するものとする。 In the present description, we mean that the term “LOX” or “hLOX” means the first isoform of human lysyl oxidase protein LOX.
本発明者らは、「リシルオキシダーゼアイソフォームLOXLの発現を刺激する」という語が、LOXLをコードする遺伝子の発現又はそのプロモーターを刺激すること、特にLOXLをコードするメッセンジャーRNAの合成を刺激すること、更には、このメッセンジャーRNA由来のLOXLの合成を刺激することを意味するものとする。 The inventors say that the term “stimulates the expression of lysyl oxidase isoform LOXL” stimulates the expression of the gene encoding LOXL or its promoter, in particular the synthesis of messenger RNA encoding LOXL. Furthermore, it is meant to stimulate the synthesis of LOXL derived from this messenger RNA.
本発明者らは、「エラスチンの発現を刺激する」という語が、エラスチンタンパク質をコードする遺伝子の発現又はそのプロモーターを刺激すること、特にエラスチンタンパク質をコードするメッセンジャーRNAの合成を刺激すること、更には、エラスチンタンパク質又はその前駆体トロポエラスチンタンパク質の上記メッセンジャーRNA由来の合成を刺激することを意味するものとする。 We mean that the term “stimulates the expression of elastin” stimulates the expression of the gene encoding the elastin protein or its promoter, in particular the synthesis of the messenger RNA encoding the elastin protein, Is meant to stimulate the synthesis of elastin protein or its precursor tropoelastin protein from the above messenger RNA.
このように、本発明において本発明者らは、上記のLOXLの発現又はLOXLの酵素活性のどちらかを主として刺激することを目的とする。 Thus, in the present invention, the present inventors aim to mainly stimulate either the above-mentioned LOXL expression or LOXL enzymatic activity.
この刺激は、機能性弾性繊維の形成を刺激できる程十分な効果がなくてはならない。 This stimulation must be effective enough to stimulate the formation of functional elastic fibers.
LOXLの発現及び/又は活性を示す少なくとも1種の細胞を有するモデルにおけるLOXLの発現及び/又は活性を、活性成分と接触させた状態で、対照とするモデル(活性成分を接触させない)におけるLOXLの発現量及び/又は活性に対して約1.5倍活性化又は増加させることができる場合に、その活性成分は有効であると考える。 LOXL expression and / or activity in a model having at least one cell exhibiting LOXL expression and / or activity, in contact with the active ingredient, in a control model (no active ingredient contact) An active ingredient is considered effective if it can be activated or increased about 1.5-fold with respect to expression level and / or activity.
本発明は、本発明の第一の態様から、配列番号1に記載のリシルオキシダーゼ類似アイソフォーム(LOXLとも称される)、又は、その相同体若しくは本質的な相同体、又は、LOXLの活性及び/又は発現を促進する成分の、弾性繊維の形成を刺激する組成物を製造するための使用に関する。 The present invention provides, from the first aspect of the present invention, a lysyl oxidase-like isoform set forth in SEQ ID NO: 1 (also referred to as LOXL), or a homologue or essential homologue thereof, or the activity of LOXL and The present invention relates to the use of an ingredient that promotes expression for producing a composition that stimulates the formation of elastic fibers.
「その相同体若しくは本質的な相同体」という語は、本明細書に記載のLOXLと同じ又は類似の活性を有する、リシルオキシダーゼアイソフォームLOXLの相同体を意味する。 The term “homolog or essential homolog thereof” means a homolog of lysyl oxidase isoform LOXL having the same or similar activity as LOXL described herein.
有利には、LOXLの発現は、LOXLをコードするヌクレオチド配列の発現か、又は、タンパク質LOXLの一部を構成するペプチド配列の発現のどちらかである。このペプチド配列は、配列番号1から選択されることが好ましい。 Advantageously, the expression of LOXL is either the expression of a nucleotide sequence encoding LOXL or the expression of a peptide sequence that forms part of the protein LOXL. This peptide sequence is preferably selected from SEQ ID NO: 1.
有利には、上記組成物は、化粧組成物、栄養補助組成物、医療組成物又は医薬組成物である。 Advantageously, the composition is a cosmetic composition, a nutritional supplement composition, a medical composition or a pharmaceutical composition.
有利には、上記組成物は、タンパク質エラスチンの発現を刺激する第二の物質を、特に弾性繊維の形成を刺激するために更に含む。上記第二の物質は、LOXLの活性及び/又は発現を促進する物質であることが好ましい。 Advantageously, the composition further comprises a second substance that stimulates the expression of the protein elastin, in particular for stimulating the formation of elastic fibers. The second substance is preferably a substance that promotes the activity and / or expression of LOXL.
有利には、上記の活性成分は、ヒトLOXL遺伝子のプロモーター(Pr)のヌクレオチド配列(配列番号3)又はその相同体若しくは本質的な相同体のプロモーターのヌクレオチド配列の少なくとも一部に結合する領域、又は、ヒトLOXL遺伝子のプロモーター(Pr)のヌクレオチド配列(配列番号3)又はその相同体若しくは本質的な相同体のプロモーターのヌクレオチド配列の少なくとも一部に結合するタンパク質の発現を変化させる領域を含む。この配列はATGコドンの前のヌクレオチド−2630に由来するものであり、−2172から−1のヌクレオチドについては詳細に研究した。 Advantageously, the active ingredient is a region that binds to at least part of the nucleotide sequence of the promoter (Pr) of the human LOXL gene promoter (Pr) or a homologue or essential homologue promoter thereof, Alternatively, it includes a region that alters the expression of a protein that binds to at least part of the nucleotide sequence of the promoter of the human LOXL gene promoter (Pr) (SEQ ID NO: 3) or a homologue or essential homologue thereof. This sequence is derived from nucleotide -2630 before the ATG codon, and nucleotides from -2172 to -1 were studied in detail.
有利には、上記活性成分は、イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ(box holly)、桂皮、乳酸菌発酵物、エンバク、ジャガイモ、生糸、アサフェティーダガム(Asa foetida gum)、ヘキセン酸エチル及びその誘導体、酪酸メチル及びその誘導体、並びに、デカジエン酸エチル及びその誘導体からなる群より選択される。 Advantageously, the active ingredients are inondo, currant, cardamom, black radish, box holly, cinnamon bark, lactic acid bacteria fermentation, oats, potatoes, raw silk, asa fetida gum, ethyl hexenoate and It is selected from the group consisting of its derivatives, methyl butyrate and its derivatives, and ethyl decadienoate and its derivatives.
有利には、上記使用は、組織における弾性繊維の新たな形成を誘導するために、特にその結果として得られた組織の弾力性を刺激するために、かつ、皮膚の皺を減らすために行う。 Advantageously, the use is made to induce new formation of elastic fibers in the tissue, in particular to stimulate the elasticity of the resulting tissue and to reduce skin wrinkles.
有利には、上記使用は、特に組織のたるみが加齢又は太陽暴露の過程で観察される場合、組織のたるみに抵抗するために、又は、細胞外マトリックスの密度を高めるために、又は、皮下組織を引き締めるために、又は、皮膚の皺を減らすために、又は、抗皺効果を発揮させるために、又は、特に栄養失調による瘢痕やケロイド傷の、瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観を改善するために、又は、伸展線に抵抗するために行う。 Advantageously, the use may be used to resist tissue sagging, or to increase the density of the extracellular matrix, or subcutaneously, particularly when tissue sagging is observed during aging or sun exposure. Improves the quality of the scar tissue and the appearance of the scar, to tighten the tissue, to reduce skin wrinkles, to exert an anti-wrinkle effect, or in particular due to malnutrition scars and keloid scars Or to resist stretch lines.
第二の態様によると、本発明は、上記活性成分を、必要に応じて化粧品に許容される賦形剤との混合物として含む化粧組成物に関する。 According to a second aspect, the present invention relates to a cosmetic composition comprising the active ingredient as a mixture with cosmetically acceptable excipients as required.
第三の態様によると、本発明は、上記活性成分を、必要に応じて食品に許容される賦形剤との混合物として含む栄養補助組成物に関する。 According to a third aspect, the present invention relates to a nutritional supplement composition comprising the active ingredient as a mixture with a food acceptable excipient as required.
第四の態様によると、本発明は、上記活性成分を、必要に応じて薬学的に許容される賦形剤との混合物として含む医薬組成物に関する。 According to a fourth aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the active ingredient as a mixture with pharmaceutically acceptable excipients as required.
上記化粧組成物又は医薬組成物について、賦形剤は、例えば、防腐剤、皮膚軟化剤、乳化剤、界面活性剤、保湿剤、濃化剤、調整剤、つや消し剤、安定剤、抗酸化剤、質感調整剤、増白剤、フィルム化剤(filmogenic agent)、可溶化剤、顔料、色素、香料及びソーラーフィルターからなる群より選択される少なくとも1種の化合物を含む。上記賦形剤は、好ましくは、アミノ酸及びその誘導体、ポリグリセリン、セルロースのエステル、ポリマー及び誘導体、ラノリン誘導体、リン脂質、ラクトフェリン、乳過酸化酵素、スクロース型安定剤、ビタミンE及びその誘導体、天然及び合成ワックス、植物油、トリグリセリド、不鹸化物、植物ステロール、植物エステル、シリコーン及びその誘導体、タンパク質加水分解物、ホホバ油及びその誘導体、脂溶性/水溶性エステル、ベタイン、アミン酸化物、植物抽出物、スクロースエステル、二酸化チタン、グリシン、並びに、パラベンからなる群より選択される。より好ましくは、ブチレングリコール、ステアレス−2、ステアレス−21、グリコール−15ステアリルエーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセリン、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピルヒドロキシセチルエーテル、ステアリン酸グリコール、トリイソノナオイン(triisononaoine)、ヤシ油脂肪酸オクチル、 ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−7、カルボマー、 プロピレングリコール、グリセリン、ビサボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、PEG30−ジポリヒドロキシステアリン酸塩、トリ(カプリル/カプリン酸)グリセリル、オクタン酸セテアリル、アジピン酸ジブチル、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、EDTA、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックス及び鉱物油、イソステアリン酸イソステアリル、プロピレングリコールジペラルゴン(propylene glycol dipelargonate)、イソステアリン酸プロピレングリコール、PEG−8ミツロウ、水添パーム核脂肪酸グリセリド、水添パーム油脂肪酸グリセリド、ラノリン油、 ゴマ油、乳酸セチル、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、ラクトース、スクロース、低密度ポリエチレン及び等張食塩水からなる群より選択される。 For the above cosmetic composition or pharmaceutical composition, excipients include, for example, preservatives, emollients, emulsifiers, surfactants, moisturizers, thickeners, regulators, matting agents, stabilizers, antioxidants, It includes at least one compound selected from the group consisting of texture modifiers, brighteners, filmogenic agents, solubilizers, pigments, dyes, fragrances and solar filters. The excipient is preferably an amino acid and derivatives thereof, polyglycerin, cellulose esters, polymers and derivatives, lanolin derivatives, phospholipids, lactoferrin, milk peroxidase, sucrose stabilizer, vitamin E and derivatives thereof, natural And synthetic waxes, vegetable oils, triglycerides, unsaponifiables, plant sterols, plant esters, silicones and derivatives thereof, protein hydrolysates, jojoba oil and derivatives thereof, fat-soluble / water-soluble esters, betaines, amine oxides, plant extracts , Sucrose ester, titanium dioxide, glycine, and paraben. More preferably, butylene glycol, steareth-2, steareth-21, glycol-15 stearyl ether, cetearyl alcohol, phenoxyethanol, methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben, butylene glycol, natural tocopherol, glycerin, dihydroxycetyl sodium, Isopropyl hydroxycetyl ether, glycol stearate, triisononaoine, coconut oil fatty acid octyl, polyacrylamide, isoparaffin, laureth-7, carbomer, propylene glycol, glycerin, bisabolol, dimethicone, sodium hydroxide, PEG30-dipoly Hydroxy stearate, tri (capryl / capric) glyceryl, octa Cetearyl acid, dibutyl adipate, grape seed oil, jojoba oil, magnesium sulfate, EDTA, cyclomethicone, xanthan gum, citric acid, sodium lauryl sulfate, mineral wax and mineral oil, isostearyl isostearate, propylene glycol dipelargonate ), Propylene glycol isostearate, PEG-8 beeswax, hydrogenated palm kernel fatty acid glyceride, hydrogenated palm oil fatty acid glyceride, lanolin oil, sesame oil, cetyl lactate, lanolin alcohol, castor oil, titanium dioxide, lactose, sucrose, low density polyethylene And isotonic saline.
有利には、上記組成物は、特にビン又はチューブに入れた形での、水性若しくは油性の溶液、水性クリーム、水性ゲル又は油性ゲル、特にボディソープ、シャンプー;乳液;エマルション、マイクロエマルション又はナノエマルション、特に水中油又は油中水又は多相又はシリコーン含有マイクロエマルション又はナノエマルション;ローション、特にガラスビン、プラスチックビン若しくは計量ビンに入れた形の、又は、エアゾール状のローション;アンプル;液体セッケン;皮膚科学的な棒(dermatological bar);軟膏;フォーム;無水製品、好ましくは液体、糊状又は固体の無水製品、例えばスティック状、特に口紅;からなる群より選択される形態で処方される。 Advantageously, the composition is an aqueous or oily solution, aqueous cream, aqueous gel or oily gel, in particular body soap, shampoo; emulsion, emulsion, microemulsion or nanoemulsion, especially in bottles or tubes. , Especially oil-in-water or water-in-oil or multiphase or silicone-containing microemulsions or nanoemulsions; lotions, especially in glass bottles, plastic bottles or measuring bottles; or aerosol-like lotions; ampoules; liquid soaps; dermatology Formulated in a form selected from the group consisting of dermatologic bars; ointments; foams; anhydrous products, preferably liquid, pasty or solid anhydrous products such as sticks, in particular lipsticks.
有利には、上記組成物は十分に液状であれば、特に皮下、目、肺、口又は鼻から投与できる。 Advantageously, if the composition is sufficiently liquid, it can be administered, especially subcutaneously, in the eyes, lungs, mouth or nose.
有利には、上記糊状又は固体の組成物(ペースト、粉末、タブレット、カプセル、顆粒、坐薬等)は、特に口、舌、鼻又は直腸から体内に導入できる。 Advantageously, the pasty or solid composition (paste, powder, tablet, capsule, granule, suppository, etc.) can be introduced into the body, especially from the mouth, tongue, nose or rectum.
有利には、上記組成物の処方において可能であれば、上記組成物は皮膚又は粘膜を通して、特に皮膚又は粘膜に塗布することによって投与する。 Advantageously, if possible in the formulation of the composition, the composition is administered through the skin or mucosa, in particular by application to the skin or mucosa.
有利には、当業者は様々な処方及び投与経路の中から所望の効果に適したものを選択できる。 Advantageously, one skilled in the art can select from a variety of formulations and routes of administration that are suitable for the desired effect.
第五の態様によると、本発明は、上記組成物の使用を含むことを特徴とする美容処置の方法に関する。 According to a fifth aspect, the present invention relates to a method for cosmetic treatment, characterized in that it comprises the use of the above composition.
有利には、上記美容処置は、特に組織のたるみが加齢又は太陽暴露の過程で観察される場合、組織のたるみへの抵抗、及び、細胞外マトリックスの高密度化、及び、皮下組織の引き締め、及び、皮膚の皺の低減、及び、抗皺効果、及び、特に栄養失調による瘢痕やケロイド傷の、瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観の改善、及び、伸展線への抵抗からなる群より選択される。 Advantageously, the cosmetic procedure provides resistance to tissue sagging and densification of the extracellular matrix and tightening of the subcutaneous tissue, especially when tissue sagging is observed during aging or sun exposure. Selected from the group consisting of: reduction of skin wrinkles and anti-wrinkle effects, and improvement of scar tissue and appearance of scars, especially scarring due to malnutrition, and resistance to stretch marks Is done.
第六の態様によると、本発明は、LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を促進して弾性繊維の形成を刺激する成分のスクリーニング方法であって、
−潜在的活性成分を、アイソフォームLOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体を発現できる細胞のうち少なくとも1種と接触させること、
−(a)特に上記潜在的活性成分がLOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を刺激するかどうかを明らかにする目的で、LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を調べること、又は
−(b)特に上記潜在的活性成分がLOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現を刺激するかどうかを明らかにする目的で、LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現を調べること
を含むことを特徴とするスクリーニング方法に関する。
According to a sixth aspect, the present invention is a screening method for a component that promotes the activity of LOXL, or a homologue or essential homologue thereof, and stimulates the formation of elastic fibers.
Contacting the potential active ingredient with at least one of the cells capable of expressing isoform LOXL, or a homologue or essential homologue thereof,
-(A) LOXL or its homologue or essential homology, in particular for the purpose of clarifying whether the potential active ingredient stimulates the activity of LOXL or its homologue or essential homologue. For the purpose of examining the activity of the body, or-(b) in particular whether the potential active ingredient stimulates the expression of LOXL or its homologues or essential homologues, LOXL, or The present invention relates to a screening method comprising examining the expression of homologues or essential homologues.
LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現の調査について、
有利には、上記潜在的活性成分が、
−タンパク質LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも1種の発現、及び/又は、
−タンパク質LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体のペプチド断片を本質上構成するペプチド配列の発現
を刺激するかどうかを調べる。
Regarding the investigation of the expression of LOXL or its homologues or essential homologues,
Advantageously, the potential active ingredient is
The expression of at least one nucleotide sequence encoding the protein LOXL, or a homologue or essential homologue thereof, and / or
Whether it stimulates the expression of the protein sequence that essentially constitutes the protein LOXL, or a homologue or a peptide fragment of an essential homologue thereof.
有利には、LOXLの発現の調査は、LOXLをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の発現の定性及び/又は定量分析によって行う。 Advantageously, the investigation of LOXL expression is performed by qualitative and / or quantitative analysis of the expression of at least a portion of the nucleotide sequence encoding LOXL.
有利には、上記ヌクレオチド配列は、LOXLをコードするmRNAと相補的なcDNAであり、このLOXLのcDNAは配列番号2に記載される。 Advantageously, the nucleotide sequence is a cDNA complementary to the mRNA encoding LOXL, which is described in SEQ ID NO: 2.
有利には、LOXLの発現の調査において、LOXLをコードする相補的DNAのヌクレオチド配列(配列番号2)の少なくとも一部とハイブリダイズするプライマーの使用を含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を用いて、LOXLをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅する。 Advantageously, in examining the expression of LOXL, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) comprising the use of a primer that hybridizes with at least part of the nucleotide sequence of complementary DNA encoding LOXL (SEQ ID NO: 2). Used to amplify at least a portion of the nucleotide sequence encoding LOXL.
有利には、上記方法はまた、再生皮膚モデル又は生検に基づくモデルにおいて、
−特にLOXLをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を、例えばLOXLをコードする相補的DNAのヌクレオチド配列(配列番号2)の少なくとも一部とハイブリダイズするDNAプローブを少なくとも1種用いて、in situハイブリダイゼーションすることによって、又は、
−特にLOXLの特異的抗体を少なくとも1種用いた免疫検出によって
LOXLの発現の位置を確認する段階も含む。
Advantageously, the method is also used in regenerative skin models or biopsy based models,
In particular using at least one DNA probe that hybridizes at least part of the nucleotide sequence encoding LOXL, for example with at least part of the nucleotide sequence of complementary DNA encoding LOXL (SEQ ID NO: 2), By hybridization, or
-Including the step of confirming the location of the expression of LOXL, particularly by immunodetection using at least one LOXL specific antibody.
上記特異的抗体は実施例1に詳細に示す。 Such specific antibodies are shown in detail in Example 1.
有利には、上記スクリーニング方法は、LOXLの発現を、上記潜在的活性物質を含んでいない対照におけるLOXLの発現と比較することを含む。 Advantageously, the screening method comprises comparing the expression of LOXL to the expression of LOXL in a control that does not contain the potential active agent.
有利には、生細胞は、繊維芽細胞、特に正常な人間の皮膚に由来する繊維芽細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する繊維芽細胞等を含む。 Advantageously, the living cells comprise fibroblasts, in particular fibroblasts derived from normal human skin, such as fibroblasts derived from foreskin or adult subject skin.
有利には、上記生細胞は、例えば角質細胞のような、上皮細胞、特に正常な人間の皮膚に由来する上皮細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する上皮細胞等を含む。 Advantageously, the living cells comprise epithelial cells, such as keratinocytes, in particular epithelial cells derived from normal human skin, such as foreskin or epithelial cells derived from the skin of an adult subject.
有利には、上記生細胞は、顔、腹部又は胸部等の特定の部位に由来し、かつ、「老化」又は日光等に「暴露」されたとみなすことができる少なくとも1種の皮膚、又は、瘢痕若しくは伸展線のある部分由来の皮膚から採取する。 Advantageously, the living cells are derived from a specific site such as the face, abdomen or chest and are at least one skin or scar that can be considered “exposed” to “aging” or sunlight, etc. Alternatively, it is collected from the skin derived from the stretched part.
有利には、上記スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは繊維芽細胞を含む真皮モデルの少なくとも1種、又は、生検に基づくモデルを使用する。 Advantageously, the screening method uses a regenerated skin model, preferably at least one dermis model comprising fibroblasts, or a model based on biopsy.
有利には、上記スクリーニング方法は、再生皮膚モデル又は生検に基づくモデルを使用する。使用する再生皮膚モデルは、有利にはMimeskin(R)再生皮膚モデルであるが、結合性マトリックス、表皮、上皮、再生皮膚又は再生粘膜のモデルであってもよい。 Advantageously, the screening method uses a regenerative skin model or a biopsy based model. The regenerated skin model used is advantageously the Mimeskin® regenerated skin model, but it can also be a model of a binding matrix, epidermis, epithelium, regenerated skin or regenerated mucosa.
(1)<三次元結合性マトリックス(真皮又は絨毛膜)培養モデル>
は、再生真皮又は再生絨毛膜を形成するために、間質細胞を播種した担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンTM膜若しくはテフロンTMスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、AnoporeTM無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CMTM半透膜、ポリエステル半透膜又はポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体(上記群において、例えば、真皮モデルであるSkin2TMmodel ZK1100、Dermagraft(R)及びTranscyte(R)(Advanced Tissue Sciences社)が挙げられる)
−細胞培養処理した樹脂(葉状真皮(a dermal leaf)の構造:Michel M.ら、In Vitro Cell.Dev Biol.−Animal(1999)35:318−326)
−ヒアルロン酸(Hyalograft(R) 3D−Fidia Advanced Biopolymers社)及び/又はコラーゲン及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とするゲル又は膜(上記群において、例えば、真皮モデルであるVitrix(R)(オルガノジェネシス社)が挙げられる)
−1種以上のグリコサミノグリカン類及び/又は最終的にはキトサン(CNRSのEP0296078 A1、Coletica社のWO01/911821及びWO01/92322)を含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス
から選択される。
(1) <Three-dimensional binding matrix (dermis or chorion) culture model>
Includes a carrier seeded with stromal cells to form regenerated dermis or regenerated chorion. This carrier is preferably
-Synthetic semipermeable membrane, specifically nitrocellulose semipermeable membrane, nylon semipermeable membrane, Teflon TM membrane or Teflon TM sponge, polycarbonate or polyethylene, polypropylene or polyethylene terephthalate (PET) semipermeable membrane, Anopore TM inorganic semipermeable membrane An inert carrier selected from the group consisting of a membrane, a cellulose acetate or cellulose ester (HATF) membrane, a Biopore-CM TM semipermeable membrane, a polyester semipermeable membrane or a polyglycolic acid membrane or thin film (in the above group, for example, a dermal model Skin 2TM model ZK1100, Dermagraft (R ) and Transcyte (R) (Advanced Tissue Sciences Inc.) is exemplified)
-Cell culture treated resin (Structure of a dermal leaf: Michel M. et al., In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal (1999) 35: 318-326)
-Hyaluronic acid (Hyalogft (R) 3D-Fidia Advanced Biopolymers) and / or collagen and / or fibronectin and / or fibrin-based gels or membranes (in the above group, for example Vitrix (R) which is a dermis model) (Organogenesis)
-Made from collagen that can contain one or more glycosaminoglycans and / or finally chitosan (CNRS EP0296078 A1, Coletica WO01 / 911821 and WO01 / 92322) Selected from a porous matrix that is or has not floated.
(2)<三次元表皮又は上皮培養モデル>
は、再生上皮又は再生表皮を得るために、まず間質細胞、特に繊維芽細胞を、次に上皮細胞、特に角質細胞を播種した、又は、播種していない担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンTM膜若しくはテフロンTMスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、Anopore無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CM半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体(上記群において、再生表皮及び上皮のモデル(Skinethic(R))、並びに、EpiDerm(R)、EpiAirway(R)、EpiOccular(R)(Mattek Corporation社)といったモデルが挙げられる)
−ヒアルロン酸及び/又はコラーゲン及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とする薄膜又は膜(上記群において、特に、Episkin(R)(ロレアル社)及びLaserskin(R)(Fidia advanced Biopolymers社)といったモデルが挙げられる)
から選択される。
(2) <Three-dimensional epidermis or epithelial culture model>
Comprises a carrier that is seeded with stromal cells, in particular fibroblasts and then with epithelial cells, in particular keratinocytes, or has not been seeded in order to obtain a regenerated epithelium or regenerated epidermis. This carrier is preferably
-Synthetic semipermeable membrane, specifically nitrocellulose semipermeable membrane, nylon semipermeable membrane, Teflon TM membrane or Teflon TM sponge, polycarbonate or polyethylene, polypropylene or polyethylene terephthalate (PET) semipermeable membrane, Anopore inorganic semipermeable membrane An inert carrier selected from the group consisting of a cellulose acetate or cellulose ester (HATF) membrane, a Biopore-CM semipermeable membrane or a polyester semipermeable membrane (in the above group, a model of regenerated epidermis and epithelium (Skinetic®) And models such as EpiDerm (R), EpiAirway (R), EpiOccular (R) (Mattek Corporation))
-Thin films or membranes based on hyaluronic acid and / or collagen and / or fibronectin and / or fibrin (in the above group, in particular, Episkin (R) (Loreal) and Laserskin (R) (Fidia advanced Biopolymers) Model)
Selected from.
(3)<三次元再生皮膚又は粘膜培養モデル>
は、再生粘膜を得るために上皮細胞を、又は、再生皮膚を得るために角質細胞を播種した(真皮の又は絨毛膜の)マトリックス担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンTM膜若しくはテフロンTMスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、Anopore無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CM半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体(上記不活性な担体は間質細胞、特に繊維芽細胞を含む)
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲン及び/又はヒアルロン酸及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とするゲル
−1種以上のグリコサミノグリカン類及び/又は最終的にはキトサンを含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス(上記多孔性マトリックスは間質細胞、特に繊維芽細胞を統合したものである)
−人間又は動物の、上皮を剥がした真皮又は死んだ真皮
から選択される。
(3) <Three-dimensional regenerated skin or mucosal culture model>
Comprises a matrix carrier (dermal or chorionic) seeded with epithelial cells to obtain regenerated mucosa or keratinocytes to obtain regenerated skin. This carrier is preferably
-Synthetic semipermeable membrane, specifically nitrocellulose semipermeable membrane, nylon semipermeable membrane, Teflon TM membrane or Teflon TM sponge, polycarbonate or polyethylene, polypropylene or polyethylene terephthalate (PET) semipermeable membrane, Anopore inorganic semipermeable membrane An inert carrier selected from the group consisting of a cellulose acetate or cellulose ester (HATF) membrane, a Biopore-CM semipermeable membrane or a polyester semipermeable membrane (the inactive carrier is a stromal cell, particularly a fibroblast). Including)
-Gels based on collagen and / or hyaluronic acid and / or fibronectin and / or fibrin, including stromal cells, in particular fibroblasts-one or more glycosaminoglycans and / or finally chitosan A porous matrix that is made of collagen that is capable of containing, is floating or not floating (the porous matrix is an integral of stromal cells, especially fibroblasts)
-Selected from the peeled or dead dermis of humans or animals.
上記群において、Apligraf(R)(オルガノジェネシス社)、ATS−2000(CellSystems(R) Biotechnologie Vertrieb社)、特にはSkin2TM(ZK1200−1300−2000、Advanced Tissue Science社)といったモデルを挙げることができる。 In the above group, models such as Aplygraf® (organogenesis), ATS-2000 (CellSystems® Biotechnology Vertrieb), particularly Skin 2TM (ZK1200-1300-2000, Advanced Tissue Science) can be mentioned. .
また、組織治療に使用できて、本研究の対象ともなり得るモデルもある。上記モデルとしては、EpidexTM(Modex Therapeutiques社)、Epibase(R)(Laboratoire Genevrier)、EpicellTM(ジェンザイム社)、AutodermTM及びTransdermTM(イノジェネティックス社)を挙げることができる。 There are also models that can be used for tissue treatment and can be the subject of this study. Examples of the model include Epidex ™ (Model Therapeutiques), Epibase® (Laboratoire Genevrier), Epicell ™ (Genzyme), Autoderm ™ and Transderm ™ (Inogenetics).
有利には、上記スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは角質細胞を含む表皮モデルの少なくとも1種を使用する。 Advantageously, the screening method uses at least one regenerative skin model, preferably an epidermis model containing keratinocytes.
有利には、上記方法は、タンパク質エラスチン及び/若しくはトロポエラスチンのうち少なくとも1種の配列、又は、タンパク質エラスチンをコードするヌクレオチド配列の発現を、特に上記活性成分が上記生細胞と接触しているとタンパク質エラスチンの発現が最終的に刺激されることを明らかにするために、調べる段階を含む。 Advantageously, the method comprises the expression of at least one sequence of the protein elastin and / or tropoelastin, or the nucleotide sequence encoding the protein elastin, in particular the active ingredient is in contact with the living cell. And investigating to reveal that the expression of the protein elastin is ultimately stimulated.
有利には、上記方法は、特に弾性繊維の新たな形成を追跡できるかどうかを調べる目的で、特に上皮組織及び/又は結合組織において、タンパク質LOXLの発現を免疫検出する段階を含む。上記組織は、再生皮膚モデル又は生検に基づくモデルのうちの少なくとも1種に由来するものである。 Advantageously, the method comprises the step of immunodetecting the expression of the protein LOXL, particularly in epithelial and / or connective tissues, in particular for the purpose of examining whether new formation of elastic fibers can be followed. The tissue is derived from at least one of a regenerated skin model or a biopsy-based model.
有利には、上記活性成分は、イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ(box holly)、桂皮、乳酸菌発酵物、エンバク、ジャガイモ、生糸、アサフェティーダガム(Asa foetida gum)、ヘキセン酸エチル及びその誘導体、酪酸メチル及びその誘導体、並びに、デカジエン酸エチル及びその誘導体からなる群より選択される。 Advantageously, the active ingredients are inondo, currant, cardamom, black radish, box holly, cinnamon bark, lactic acid bacteria fermentation, oats, potatoes, raw silk, asa fetida gum, ethyl hexenoate and It is selected from the group consisting of its derivatives, methyl butyrate and its derivatives, and ethyl decadienoate and its derivatives.
第七の態様によると、本発明は、弾性繊維の新たな形成を追跡できるかどうかを調べる目的で、LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の組織における発現の位置を特に結合組織において確認する方法に関し、上記組織は再生皮膚モデルの少なくとも1種又は生検に由来し、上記方法は、タンパク質LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体を免疫検出する段階、又は、LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部をin situハイブリダイゼーションする段階を含む。 According to a seventh aspect, the present invention relates to the position of expression in LOXL or its homologous or essential homologous tissues, in particular connective tissue, for the purpose of investigating whether new formation of elastic fibers can be traced. The tissue is derived from at least one regenerative skin model or biopsy, wherein the method comprises immunodetecting the protein LOXL, or a homologue or essential homologue thereof, or LOXL Or in situ hybridization of at least a portion of the nucleotide sequence encoding the homologue or essential homologue thereof.
本発明はまた、組織におけるLOXLの発現の位置を、弾性繊維の新たな形成を追跡できるかどうかを調べる目的で、特に上皮組織及び/又は結合組織において確認する方法にも関し、上記方法は、タンパク質LOXLを免疫検出する段階又はLOXLをコードする遺伝子をin situハイブリダイゼーションする段階を含む。 The present invention also relates to a method for confirming the location of LOXL expression in a tissue, particularly in epithelial tissue and / or connective tissue, for the purpose of examining whether the formation of elastic fibers can be followed. Immunodetection of the protein LOXL or in situ hybridization of a gene encoding LOXL.
本発明はまた、タンパク質LOXLの酵素活性又は発現を変化させて弾性繊維の形成を刺激する活性成分の使用にも関する。 The present invention also relates to the use of active ingredients that alter the enzymatic activity or expression of the protein LOXL to stimulate the formation of elastic fibers.
本発明はまた、タンパク質リシルオキシダーゼアイソフォームLOXLの酵素活性に関与する欠乏症の治療方法にも関し、上記方法は、患者に、タンパク質リシルオキシダーゼLOXL、又は、「その相同体若しくは本質的な相同体」、又は、タンパク質リシルオキシダーゼLOXLの酵素活性若しくは発現を刺激する化合物を含む組成物を治療効果のある量投与することを含む。 The present invention also relates to a method of treating a deficiency involving the enzymatic activity of the protein lysyl oxidase isoform LOXL, said method comprising asking the patient for the protein lysyl oxidase LOXL or “a homologue or essential homologue thereof”. Or administering a therapeutically effective amount of a composition comprising a compound that stimulates the enzymatic activity or expression of the protein lysyl oxidase LOXL.
有利には、上記治療方法によって、特に組織のたるみが加齢又は太陽暴露の過程で観察される場合、組織のたるみへの抵抗、及び、細胞外マトリックスの高密度化、及び、皮下組織の引き締め、及び、皮膚の皺の低減、及び、抗皺効果、及び、特に栄養失調による瘢痕やケロイド傷の、瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観の改善、及び、伸展線への抵抗から選択される治療を行うことができる。 Advantageously, the treatment method allows resistance to tissue sag and densification of extracellular matrix and tightening of subcutaneous tissue, especially when tissue sag is observed during aging or sun exposure. Treatments selected from reduction of skin wrinkles and anti-wrinkle effects, and particularly improved scar tissue and keloid wounds due to malnutrition, improvement of scar tissue quality and appearance of scars, and resistance to stretch marks It can be performed.
本発明者らは、LOXLの活性が成人における弾性繊維の形成に主として欠けていたこと、そして、このリシルオキシダーゼアイソフォームの合成を再度活性化すると弾性繊維の形成に対する刺激効果が得られることを予想外にも明らかにした。 We anticipate that the activity of LOXL was largely lacking in the formation of elastic fibers in adults, and that reactivating the synthesis of this lysyl oxidase isoform would have a stimulating effect on the formation of elastic fibers. Also revealed outside.
本発明者らは実際に、リシルオキシダーゼ(LO)ファミリーのこのアイソフォームが、弾性繊維を生成する再生皮膚モデルにおける弾性繊維の形成に関与していることを明らかにした。年齢の異なる被験者の皮膚中に、皮膚の変化の過程でこのアイソフォームが存在するかどうかを調べたところ、本発明者らは、このアイソフォームと弾性繊維形成とが同時に存在するかどうかということに着目した。そして、成人における弾性繊維の形成時にこのLOアイソフォームの活性が欠損しており、機能性弾性繊維の形成を調節するためにはこのLOアイソフォームの合成を変化させる必要があることが分かる。 The inventors have shown that this isoform of the lysyl oxidase (LO) family is actually involved in the formation of elastic fibers in regenerative skin models that produce elastic fibers. When we examined whether this isoform is present in the skin of subjects of different ages during the course of skin changes, we have determined whether this isoform and elastic fiber formation are present simultaneously. Focused on. It can be seen that the activity of this LO isoform is deficient during the formation of elastic fibers in adults, and that the synthesis of this LO isoform needs to be changed in order to regulate the formation of functional elastic fibers.
このようにして本発明者らは、このLOアイソフォーム(LOXL)の発現における増加を視覚化する方法を見い出し、特に植物抽出物又は化学物質の中から、(特にLOXLをコードするmRNAの発現を刺激する)活性成分を探した。そして活性成分を選択し、これを、特に化粧組成物、皮膚医薬組成物及び医薬組成物中に、加齢による組織のたるみに抵抗し、かつ、瘢痕の組織の質並びに瘢痕及び伸展線の外観を改善するために配合した。 In this way, the inventors have found a way to visualize this increase in the expression of LO isoform (LOXL), particularly from plant extracts or chemicals (especially the expression of mRNA encoding LOXL). Looked for active ingredients to stimulate. The active ingredient is then selected, especially in cosmetic, dermopharmaceutical and pharmaceutical compositions, which resists tissue sagging due to aging and the scar tissue quality and the appearance of scars and stretch marks. In order to improve.
本発明者らは、LOXLの成熟形(実施例1及び2参照)に対する特異的抗体を作り、上記のようにして、このリシルオキシダーゼアイソフォームが存在しないことと機能性弾性繊維の合成における問題とが、特に皮膚組織の加齢の過程で、その加齢が自然なものであるか太陽暴露に誘導されるものであるかに関わらず、相互に関係していることを明らかにした。 We made specific antibodies against the mature form of LOXL (see Examples 1 and 2) and, as described above, the absence of this lysyl oxidase isoform and problems in the synthesis of functional elastic fibers. However, it was revealed that the aging of the skin tissue was interrelated regardless of whether the aging was natural or induced by sun exposure.
アイソフォームLOXL2、LOXL3及びLOXL4は、真皮において全く又はほとんど発現しておらず、弾性繊維の形成に関与していない(実施例4参照)。アイソフォームLOXは真皮中に存在していてミクロフィブリルに結合でき、機能性膠原繊維の形成に関与しており、成人の皮膚中に存在する。これより、LOXが存在しないことと、加齢による弾性繊維の弾力性の消失との間に相互関係はない(実施例3参照)。 Isoforms LOXL2, LOXL3 and LOXL4 are not or hardly expressed in the dermis and are not involved in the formation of elastic fibers (see Example 4). Isoform LOX is present in the dermis and can bind to microfibrils, is involved in the formation of functional collagen fibers and is present in adult skin. Thus, there is no correlation between the absence of LOX and the loss of elasticity of the elastic fiber due to aging (see Example 3).
従って、弾性繊維の形成におけるLOXLの作用を明らかにすることは、本発明を完成するために重要であった(実施例5参照)。 Therefore, clarifying the action of LOXL in the formation of elastic fibers was important for completing the present invention (see Example 5).
LOXLと弾性繊維又はミクロフィブリルとが結合していることを、電子顕微鏡検査によって本発明を完成する過程で明らかに示した。ミクロフィブリルに結合したLOXLは、エラスチンが沈着する足場を構成する。 The binding of LOXL and elastic fibers or microfibrils was clearly shown in the process of completing the present invention by electron microscopy. LOXL bound to microfibrils constitutes a scaffold on which elastin is deposited.
LOXLはエラスチンを架橋して成熟させる酵素であり、機能性弾性繊維を形成できる。 LOXL is an enzyme that crosslinks and matures elastin and can form functional elastic fibers.
本発明において、本発明者らはLOXLの発現の位置を確認する方法を完成した。 In the present invention, the present inventors have completed a method for confirming the location of LOXL expression.
上記位置確認方法は特にLOXLの免疫検出を含む。この方法を用いてタンパク質エラスチンの発現を明らかにすることもできる。本発明者らの研究から、LOXLはミクロフィブリル上の高密度の沈着物には結合しているが、膠原繊維には結合していないことが分かった。エラスチンは、上記の高密度の沈着物及びミクロフィブリル中に認められた。この現象は、再生皮膚モデルにおいて、特に再生皮膚モデルにおいて角質細胞を添加して30日後に認められた(実施例5参照)。 The localization method particularly includes LOXL immunodetection. This method can also be used to reveal the expression of the protein elastin. Our studies have shown that LOXL is bound to dense deposits on microfibrils but not to collagen fibers. Elastin was found in the dense deposits and microfibrils described above. This phenomenon was observed 30 days after the addition of keratinocytes in the regenerated skin model, particularly in the regenerated skin model (see Example 5).
LOXLとミクロフィブリル及び弾性繊維とが結合していることは、包皮の皮膚中でも、特に免疫検出に続いて透過型電子顕微鏡検査を行って確認した。 The binding of LOXL to microfibrils and elastic fibers was confirmed in the foreskin skin, especially by transmission electron microscopy following immunodetection.
LOXLは、まだ高いエラスチン合成力を持つ幼い患者(数か月児)から採取した包皮皮膚の真皮中に発現している。しかしながら、LOXLは成人の首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中には発現していない。このような、首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中にLOXLが認められないという現象は、成人の場合には年齢を問わず確認された。人間の皮膚の表皮中にもLOXLが多く発現していることが(皮膚を約80歳以上の患者から採取した場合にはその発現が徐々に消失するが)観察された(実施例6参照)。 LOXL is expressed in the dermis of foreskin skin collected from a young patient (a few months old) who still has high elastin synthesis. However, LOXL is not expressed in the dermis of adult neck, chest, abdomen or facial skin. Such a phenomenon that LOXL is not observed in the dermis of the neck, chest, abdomen or facial skin has been confirmed for adults regardless of age. It was observed that a lot of LOXL was also expressed in the epidermis of human skin (although the expression gradually disappears when the skin was collected from a patient over 80 years old) (see Example 6). .
瘢痕に関しては、LOXLは3か月及び5年経過後の瘢痕においても真皮中で観察されなかった。 Regarding scarring, LOXL was not observed in the dermis even in scars after 3 months and 5 years.
これに関して、瘢痕ができて3カ月経過後の瘢痕に存在していたエラスチンが、5年後にはこの瘢痕組織に存在していないことは留意すべきである。 In this regard, it should be noted that the elastin that was present in the scar after 3 months had passed is not present in the scar tissue after 5 years.
このようにして、本発明者らは、弾性繊維の形成におけるLOXLの作用を、特に再生皮膚モデル又は幼い患者の包皮の真皮を用いて明らかにした。 In this way, the inventors have clarified the action of LOXL in the formation of elastic fibers, particularly using the regenerated skin model or the dermis of the foreskin of young patients.
本発明者らはまた、瘢痕の組織部分及び年齢の異なる人間の皮膚の真皮中に(すなわち加齢の過程において)LOXLが発現していないことも明らかにした。 The inventors have also revealed that LOXL is not expressed in the tissue part of the scar and in the dermis of human skin of different ages (ie during aging).
リシルオキシダーゼのアイソフォームのうち、LOXLは、弾性繊維を架橋できるアイソフォームの1種である。しかしながら、このアイソフォームLOXLのみが欠損しているため、成人において、弾性繊維を架橋して機能性繊維を形成することができない。 Among isoforms of lysyl oxidase, LOXL is one of isoforms that can crosslink elastic fibers. However, since only this isoform LOXL is deficient, it is impossible to form functional fibers by crosslinking elastic fibers in adults.
本発明者らは、上記の予想外の発見により、機能性弾性繊維の形成を刺激する活性成分のスクリーニングを、化粧組成物又は医薬組成物をつくるために活性成分を特定する目的で行った。 Based on the above unexpected discovery, the present inventors conducted a screening for active ingredients that stimulate the formation of functional elastic fibers for the purpose of identifying active ingredients in order to produce cosmetic or pharmaceutical compositions.
本発明はまた、LOXLをコードするヒト遺伝子のプロモーターの活性化にも関する(実施例7参照)。 The present invention also relates to activation of the promoter of the human gene encoding LOXL (see Example 7).
上記プロモーターの様々な活性を明らかにした。このプロモーターの配列を本明細書に添付しており、PrhLOXLについての下記の記載に具体的に示す。 Various activities of the promoter were revealed. The sequence of this promoter is attached to this specification and is specifically shown in the description below for PrhLOXL.
このプロモーターについて、ヌクレオチド−712/−391(hLOXL遺伝子の翻訳を+1から始めるとした場合の番号)の領域は、人間の包皮皮膚の繊維芽細胞において移行型トランスフェクションを行った後などに発現するレポーター遺伝子ルシフェラーゼに対しての上方制御活性を有する領域である。 Regarding this promoter, the region of nucleotides -712 / -391 (the number when the translation of the hLOXL gene starts from +1) is expressed after migration transfection in human foreskin skin fibroblasts, etc. This is a region having an up-regulating activity on the reporter gene luciferase.
本発明者らは、核因子の制御を受けると推定される部位を特定できた。この因子は、サイトカイン、又は、特定遺伝子の転写に作用することが知られている他の因子と相互に関係があった。 The present inventors have been able to identify a site presumed to be controlled by a nuclear factor. This factor was correlated with cytokines or other factors known to affect transcription of specific genes.
また、PrhLOXLの領域のいくつかが、活性化領域又は阻害領域であることが分かった。 In addition, it was found that some of the regions of PrhLOXL are activation regions or inhibition regions.
特に、−2172/−2002、−1438/−968及び−712/−391の領域が活性化領域で、−2002/−1438及び−968/−712の領域が阻害領域であることが確認された。−80/−1の領域は活性化領域ではなく、転写された領域の+1より下流に位置している。この番号において、転写された領域の+1は、翻訳開始位置から−342の位置に相当すると推定される。従って、上記領域のうちいくつかの部位は、hLOXL遺伝子を制御している可能性があることが分かった。これらの部位とは特に、レチノイン酸応答部位と推定される部位2種、TGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)応答部位と推定される部位2種、EGF(上皮増殖因子)応答部位と推定される部位1種、エストロゲン応答部位と推定される部位3種及びグルココルチコイド応答部位(GRE)と推定される部位2種である。 In particular, it was confirmed that the regions -1722 / -2002, -1438 / -968, and -712 / -391 were active regions, and the regions -2002 / -1438 and -968 / -712 were inhibitory regions. . The region of -80 / -1 is not an activation region, but is located downstream from +1 of the transcribed region. In this number, +1 of the transcribed region is estimated to correspond to a position of −342 from the translation start position. Therefore, it was found that some of the above regions may regulate the hLOXL gene. In particular, these sites are presumed to be two sites presumed to be retinoic acid response sites, two sites presumed to be TGF-β (transforming growth factor β) response sites, and EGF (epidermal growth factor) response sites. 1 type of site, 3 types of site presumed to be estrogen response sites, and 2 types of site presumed to be glucocorticoid response sites (GRE).
このことは、hLOXLの新規合成及び/又は活性を刺激して弾性繊維の形成を刺激する活性成分が、上記部位に結合しているタンパク質の発現を変化させる際に、特に上記の領域において、直接又は間接的にhLOXL遺伝子のプロモーターに作用することを意味する。これより、PrhLOXLのヌクレオチド配列の少なくとも一部、特には上述の推定部位、に結合できる領域、又は、その部位に結合できるタンパク質の発現を変化させることができる領域を含む物質が活性を有すると考えることができるだろう。 This means that the active ingredient that stimulates the novel synthesis and / or activity of hLOXL and stimulates the formation of elastic fibers alters the expression of the protein bound to the site, particularly in the region described above. Or indirectly means acting on the promoter of the hLOXL gene. From this, it is considered that a substance containing a region capable of binding to at least a part of the nucleotide sequence of PrhLOXL, particularly the above-mentioned putative site, or a region capable of changing the expression of a protein capable of binding to the site has activity. Will be able to.
本発明者らの研究全般によって、弾性繊維の形成を刺激する活性成分の同定方法を明らかにできた。 Through our research, we have clarified a method for identifying active ingredients that stimulate the formation of elastic fibers.
本発明において、本発明者らは、in situハイブリダイゼーションを行い、特にLOXLをコードするメッセンジャーRNAの発現の位置を確認して証明できた。このin situハイブリダイゼーションは特に、ジゴキシゲニン標識二本鎖DNAプローブを用いて、角質細胞を添加して30日後の、パラフィンで包埋した再生皮膚モデルの断面において行う。同様のin situハイブリダイゼーションにより、トロポエラスチン及びコラーゲンα1(I)のメッセンジャーRNAの発現についても証明した(実施例8参照)。 In the present invention, the present inventors have been able to prove by performing in situ hybridization and particularly confirming the position of expression of messenger RNA encoding LOXL. This in situ hybridization is performed in particular on a cross-section of a regenerated skin model embedded with paraffin, 30 days after adding keratinocytes, using a digoxigenin-labeled double-stranded DNA probe. Similar in situ hybridization also demonstrated the expression of tropoelastin and collagen α1 (I) messenger RNA (see Example 8).
LOXLmRNAは、真皮深層及び表皮全体に発現している。トロポエラスチンmRNAは、真皮の繊維芽細胞の付近及び表皮中に発現している。コラーゲンIα1のmRNAは、真皮中には発現しているが、表皮中には発現していない。このことから、本発明において、LOXLmRNAの、特に再生皮膚モデルにおける、例えば機能性弾性繊維の形成を刺激する活性成分を塗布した後での発現位置が確認され、証明される。 LOXL mRNA is expressed throughout the dermis and throughout the epidermis. Tropoelastin mRNA is expressed in the vicinity of the dermal fibroblasts and in the epidermis. Collagen Iα1 mRNA is expressed in the dermis but not in the epidermis. From this, in the present invention, the expression position of LOXL mRNA, in particular in the regenerated skin model, for example, after applying an active ingredient that stimulates the formation of functional elastic fibers is confirmed and proved.
本発明において、hLOXL遺伝子は、再生皮膚モデルに、特に、再生皮膚モデルMimeskin(R)(Coletica社、リヨン、フランス)に角質細胞を添加することによって活性化された。LOXLmRNAの合成は、特にトロポエラスチンの合成に付随して、特に真皮と同等のものに角質細胞を添加して約6日後に誘導される。 In the present invention, the hLOXL gene was activated by adding keratinocytes to the regenerated skin model, in particular to the regenerated skin model Mimeskin® (Coletica, Lyon, France). The synthesis of LOXL mRNA is specifically associated with the synthesis of tropoelastin and is induced about 6 days after the addition of keratinocytes, especially to the equivalent of the dermis.
更に本発明によって、特にhLOXL遺伝子及びヒトエラスチン遺伝子の発現量の減少を、高齢者由来の繊維芽細胞において明らかにすることも可能になった。 Furthermore, the present invention has made it possible to clarify the decrease in the expression levels of hLOXL gene and human elastin gene in fibroblasts derived from the elderly.
これに当たって、本発明者らは、包皮由来の繊維芽細胞(FF)(幼児由来)5株、及び、腹部の形成外科手術の際に採取した成人の繊維芽細胞(AF)6株(このうち3人の平均年齢は20歳で、残りの3人の平均年齢は60歳である)を用いた。また、タンパク質LOXをコードする遺伝子の発現についても調べた(実施例9参照)。 In this regard, the present inventors have included 5 strains of fibroblasts derived from foreskin (FF) (derived from infants) and 6 strains of adult fibroblasts (AF) collected during plastic surgery of the abdomen (of which The average age of 3 people was 20 years old, and the average age of the remaining 3 people was 60 years old). In addition, the expression of the gene encoding the protein LOX was also examined (see Example 9).
目的の上記3種の遺伝子及びアクチンの発現を、リアルタイムRT−PCRによって調べた。本発明はこの種の調査に限定されない。この方法によれば、一定とされるアクチンの発現と比較して遺伝子の発現を正確に定量できる。これによって、この遺伝子の発現量の制御を定量できる。 The above three genes of interest and actin expression were examined by real-time RT-PCR. The present invention is not limited to this type of investigation. According to this method, gene expression can be accurately quantified as compared to constant actin expression. Thereby, the control of the expression level of this gene can be quantified.
図12に示す結果はまず、LOXLmRNAの合成は、成人の繊維芽細胞において著しくかつ統計上有意に、包皮の繊維芽細胞と比較して70%近く減少しているが、エラスチンmRNAの合成は年齢によって有意な差がないことを示す。弾性組織が劣化して交換されないのであれば、この結果がエラスチン遺伝子の活性の阻害によるものとは思われないので、このデータはエラスチンに関する従来の報告と一致する。 The results shown in FIG. 12 show that LOXL mRNA synthesis is markedly and statistically significantly reduced in adult fibroblasts by nearly 70% compared to foreskin fibroblasts, but elastin mRNA synthesis is Indicates that there is no significant difference. This data is consistent with previous reports on elastin since this result does not appear to be due to inhibition of the activity of the elastin gene if the elastic tissue is degraded and not exchanged.
AFにおけるLOXmRNAの合成はFFに対して平均40%減少するが、この酵素は正常な人間の皮膚中に常に発現しているわけではないため、この変化がin vivoにおける現象を非常によく示しているとはいえない。 Although the synthesis of LOX mRNA in AF is reduced by an average of 40% relative to FF, this change is a very good indication of the phenomenon in vivo because this enzyme is not always expressed in normal human skin. I can't say.
弾性繊維の形成を更に刺激するために、エラスチンの発現を刺激することもまた有利である。 It is also advantageous to stimulate the expression of elastin to further stimulate the formation of elastic fibers.
本発明は、LOXLの発現を、特に繊維芽細胞において明らかにできる方法を提供する。 The present invention provides a method by which the expression of LOXL can be revealed, particularly in fibroblasts.
本発明は、弾性繊維の形成を刺激する活性成分を同定するようなやり方で上記様々な方法を実施することを目的とする。 The present invention aims to implement the various methods described above in such a way as to identify active ingredients that stimulate the formation of elastic fibers.
通常、本発明の方法は、タンパク質LOXLの発現を探す方法であり、特にはLOXLをコードするメッセンジャーRNAの発現を探す方法である(実施例10参照)。 Usually, the method of the present invention is a method for searching for the expression of the protein LOXL, and in particular, a method for searching for the expression of messenger RNA encoding LOXL (see Example 10).
本発明はまた、弾性繊維の形成を刺激する活性成分にも関する(実施例11及び12参照)。 The invention also relates to active ingredients that stimulate the formation of elastic fibers (see Examples 11 and 12).
本発明はまた、酵素LOXL若しくはその誘導体又は上記活性成分の、化粧組成物又は医薬組成物を製造するための使用にも関する(実施例13〜18参照)。LOXLの刺激は、メッセンジャーRNAの、又は、タンパク質そのものの遺伝子レベルで行うことができる。こうして活性化することによって、特に酵素LOXLによるエラスチンの架橋によって、弾性繊維を形成できる。 The invention also relates to the use of the enzyme LOXL or a derivative thereof or the active ingredient described above for the production of a cosmetic or pharmaceutical composition (see Examples 13-18). LOXL can be stimulated at the gene level of messenger RNA or of the protein itself. By activating in this way, elastic fibers can be formed, in particular by crosslinking elastin with the enzyme LOXL.
当業者には、本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の実施例を参照した説明から明らかであろう。 Other objects, features and advantages of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description with reference to the following examples.
実施例は本発明に不可欠であり、また、実施例を含む本明細書全体の中に記載される従来技術に照らして新規の特徴は全て、その機能、概略共に本発明に不可欠である。 The embodiments are essential to the present invention, and all novel features in light of the prior art described throughout the specification, including the embodiments, are both essential to the present invention, both in function and outline.
上記より、実施例は全て、一般的な範囲を示す。 From the above, all examples show a general range.
また、実施例において、特に指示のない限り、百分率は重量%で、温度は摂氏で、圧力は大気圧で表す。 In the examples, unless otherwise indicated, percentages are by weight, temperatures are in degrees Centigrade, and pressures are in atmospheric pressure.
〔実施例1〕
本発明はまずLOX及びLOXLの特異的抗体を新規に作ったが、この抗体を用いることによってこれらの成熟形を検出できる。この抗体は、LOX及びLOXLの成熟領域に対して作った。抗原領域は、他のリシルオキシダーゼ(LO)アイソフォーム上の対応する領域との類似性が最低限になるように選択した。ペプチドLOXV228−S280の領域に対して得られた抗体を抗LOXmat抗体、同様にペプチドLOXLR231−G368の領域に対して得られた抗体を抗LOXLpro抗体と称した。
[Example 1]
In the present invention, LOX and LOXL specific antibodies were newly produced. By using this antibody, these mature forms can be detected. This antibody was raised against the mature region of LOX and LOXL. The antigenic region was selected to minimize similarity to the corresponding region on other lysyl oxidase (LO) isoforms. The antibody obtained against the region of peptide LOX V228-S280 was referred to as anti-LOXmat antibody, and similarly the antibody obtained against the region of peptide LOXL R231-G368 was referred to as anti-LOXLpro antibody.
図1:特異的抗体を作るために決定したLOの配列の解説:この図は、抗LOX抗体及び抗LOXL抗体を作るために抗原領域を選択する段階を表わす。
図1(A):hLOX(ヒトLOXタンパク質)及びhLOXL(ヒトLOXLタンパク質)の概略図。
FIG. 1: Description of the sequence of LO determined to make a specific antibody: This figure represents the step of selecting antigenic regions to make anti-LOX and anti-LOXL antibodies.
FIG. 1 (A): Schematic of hLOX (human LOX protein) and hLOXL (human LOXL protein).
hLOX及びhLOXLの配列を中抜きの長方形で示し、C末端領域は点を付して類似性の高い領域を強調している。前領域の切断部位、及び、プロコラーゲンCプロテイナーゼ(PCP)による切断部位の位置を、hLOXのA22及びD169残基上にそれぞれ示す。LOXLについては、56kDaの前駆体のN末端成熟部位における前領域の切断部位(Q26残基の前)、及び、56kDaのLOXL前駆体のPCPによる切断部位の位置を、Q135残基の前及びD338残基の前にそれぞれ示す。対応するLOXLタンパク質Q26−S574、D135−S574及びD338−S574の分子量はそれぞれ約63kDa、54.6kDa及び26.7kDaと推定される。抗LOX抗体を作るために用いた組み換えペプチドの位置を、抗LOXpro抗体についてはペプチドG128−L212、抗LOXmat抗体についてはペプチドV228−S280、抗LOXcat抗体についてはペプチドD305−N373のように示す。抗LOXL抗体を作るために用いた組み換えペプチドの位置を、抗LOXLpro抗体についてはペプチドR231−G368、抗LOXLmat抗体についてはペプチドS355−D415のように示す。 The hLOX and hLOXL sequences are shown as outlined rectangles, and the C-terminal region is dotted to highlight regions of high similarity. The position of the cleavage site in the front region and the cleavage site by procollagen C proteinase (PCP) are shown on the A22 and D169 residues of hLOX, respectively. For LOXL, the position of the cleavage site of the previous region at the N-terminal maturation site of the 56 kDa precursor (before Q26 residue) and the cleavage site by the PCP of the 56 kDa LOXL precursor were determined in front of Q135 residue and D338. Each is shown before the residue. The molecular weights of the corresponding LOXL proteins Q 26 -S 574 , D 135 -S 574 and D 338 -S 574 are estimated to be about 63 kDa, 54.6 kDa and 26.7 kDa, respectively. The position of the recombinant peptide used to make the anti-LOX antibody is shown as peptide G128-L212 for the anti-LOXpro antibody, peptide V228-S280 for the anti-LOXmat antibody, and peptide D305-N373 for the anti-LOXcat antibody. The location of the recombinant peptide used to make the anti-LOXL antibody is shown as peptide R231-G368 for the anti-LOXLpro antibody and peptide S355-D415 for the anti-LOXLmat antibody.
図1(B):この表は、LOX及びLOXLの抗原領域と、LOアイソフォーム上の相当する領域との類似率を示す。
図1(B)の表中で、hLOXLはヒトLOXLタンパク質、bLOXLはウシLOXLタンパク質、mLOXLはマウスLOXLタンパク質、hLOXLはヒトLOXタンパク質、bLOXはウシLOXタンパク質、hLOXL2はヒトLOXL2タンパク質、hLOXL3はヒトLOXL3タンパク質、hLOXL4はヒトLOXL4タンパク質を表わす。
長さ(aa)の欄には、対応する領域に含まれるアミノ酸の数を記載する。
FIG. 1 (B): This table shows the similarity between the LOX and LOXL antigenic regions and the corresponding regions on the LO isoform.
In the table of FIG. 1B, hLOXL is human LOXL protein, bLOXL is bovine LOXL protein, mLOXL is mouse LOXL protein, hLOXL is human LOX protein, bLOX is bovine LOX protein, hLOXL2 is human LOXL2 protein, hLOXL3 is human LOXL3 The protein, hLOXL4, represents the human LOXL4 protein.
In the length (aa) column, the number of amino acids contained in the corresponding region is described.
抗体を作るため、決定されているhLOXL又はhLOXの配列をグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)の遺伝子と共に発現プラスミドpGEX−4T−3(アマシャムバイオサイエンス社)のBamHI−XhoI部位に挿入して、キメラ遺伝子を構築した。 To make an antibody, the determined sequence of hLOXL or hLOX is inserted into the BamHI-XhoI site of the expression plasmid pGEX-4T-3 (Amersham Biosciences) together with the gene of glutathione S-transferase (GST), and the chimeric gene Built.
センスプライマー5’−TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC−3’(配列番号16)、及び、アンチセンスプライマー5’−AAACTCGAGCATCGTAGTCGGTGGC−3’(配列番号17)を用いたPCRによって作成したHLOXL(cDNA hLOXL)のcDNA配列を導入することにより、融合遺伝子GST−LOXLS355−D415を構築した。 The cDNA sequence of HLOXL (cDNA hLOXL) prepared by PCR using the sense primer 5′-TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC-3 ′ (SEQ ID NO: 16) and the antisense primer 5′-AAACTCGAGCATCGTAGCGGGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 17) is introduced. Thus, the fusion gene GST-LOXL S355-D415 was constructed.
センスプライマー5’−TCGGATCCGGCTACTCGACATCTAGAGCC−3’(配列番号18)、及び、アンチセンスプライマー5’−GTCCTCGAGACCGTACTGGAAGTAGCC−3’(配列番号19)をそれぞれ用いて増幅したhLOXcDNAを導入することにより、融合遺伝子GST−LOXG128−L212を構築した。 By introducing hLOX cDNA amplified using the sense primer 5′-TCGGATCCGCCTACTGACATCATGAGCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 18) and the antisense primer 5′-GTCCTCGAGACCGTACTGGGAAGTAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 19), respectively, the fusion gene GST-LOX G128-L212 was constructed.
センスプライマー5’−TTGGATCCGTGCAGAAGATGTCCATGTAC−3’(配列番号20)、及び、アンチセンスプライマー5’−TTTCTCGAGGCTGGGTAAGAAATCTGATG−3’(配列番号21)をそれぞれ用いて増幅したhLOX配列を導入することにより、融合遺伝子GST−LOXV228−S279を構築した。 By introducing the hLOX sequence amplified using the sense primer 5′-TTGGATCCGTGCCAGAAGATGCTCGTTAC-3 ′ (SEQ ID NO: 20) and the antisense primer 5′-TTTCTCGAGGCTGGTAAGAAATCTGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 21), respectively, the fusion gene GST- LOX V228-S279 was constructed.
センスプライマー5’−CACTATGGATCCCTTGATGCCAACACCC−3’(配列番号22)、及び、アンチセンスプライマー5’−CACGACCTTTAGGATATCGTTTCCAGG−3’(配列番号23)をそれぞれ用いて増幅したhLOXcDNAを導入することにより、融合遺伝子GST−LOXD306−N373を構築した。 By introducing hLOX cDNA amplified using the sense primer 5′-CACTATGATCCCTGATGCCACAACCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 22) and the antisense primer 5′-CACGACCTTTAGGATATCGTTCCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 23), respectively, the fusion gene GST-LOX D306-N373 was constructed.
これらのPCRによる増幅にはすべて、TaqポリメラーゼHigh Fidelity(ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイマン(Meyman)、フランス)を使用した。 Taq polymerase High Fidelity (Roche Diagnostics, Meyman, France) was used for all these PCR amplifications.
融合タンパク質GST−LOX及びGST−LOXL、並びに、ウサギポリクローナル抗体を得て、上述の方法で融合遺伝子GST−LOXLS355−D415及びGST−LOXG128−L212の発現に由来する融合タンパク質を精製した(Decitreら、Lab Invest、78:143−151、1998年;Borelら、J.Biol.Chem,276:48944−49、2001年)。 The fusion proteins GST-LOX and GST-LOXL and rabbit polyclonal antibody were obtained, and the fusion protein derived from the expression of the fusion genes GST-LOXL S355-D415 and GST-LOX G128-L212 was purified by the method described above (Decitre Lab Invest, 78: 143-151, 1998; Borel et al., J. Biol. Chem, 276: 48944-49, 2001).
吸着実験を、免疫検出に先立ってHybond−ECLニトロセルロース膜(アマシャムバイオサイエンス社)上に吸着させておいた融合タンパク質と共に、抗体を20℃で3時間インキュベートして行った。 The adsorption experiment was performed by incubating the antibody at 20 ° C. for 3 hours together with the fusion protein adsorbed on Hybond-ECL nitrocellulose membrane (Amersham Bioscience) prior to immunodetection.
上記の実験を行って、まず最初に、成熟タンパク質の免疫化学上及び生化学上の特性に基づいて、LOX及びLOXLの成熟形を明らかにすることができた(実施例2(図2)参照)。得られた抗体は、従来LOXLに対して用いられていた、LOXLの成熟形を認識できない抗体とは区別される(Decitreら、Lab Invest、78:143−151、1998年;Borelら、J.Biol.Chem、276:48944−49、2001年)。本発明では抗LOXLmat抗体及び抗LOXmat抗体を用いたが、これらにより、抗LOXLmat抗体には認識されるが、抗LOXmat抗体には認識されない、LOXLの成熟形に相当する31kDaのタンパク質を明らかにすることができた。これより、先行技術、特に、LOファミリーの遺伝子に由来する全てのタンパク質を記載しながらそれらの特徴については定義していないCsiszarらの特許に対して、本発明が事実上進展していることが分かる(WO01/83702A2:アミンオキシダーゼファミリーのうちリシルオキシダーゼファミリーに属する新規酵素に関連する出願)。 Performing the above experiments, it was possible to first elucidate mature forms of LOX and LOXL based on the immunochemical and biochemical properties of the mature protein (see Example 2 (FIG. 2)). ). The resulting antibody is distinct from antibodies that have not been used to recognize the mature form of LOXL previously used for LOXL (Decitre et al., Lab Invest, 78: 143-151, 1998; Borel et al., J. Biol. Biol.Chem, 276: 48944-49, 2001). In the present invention, an anti-LOXLmat antibody and an anti-LOXmat antibody were used, which revealed a 31 kDa protein corresponding to the mature form of LOXL that is recognized by the anti-LOXLmat antibody but not the anti-LOXLmat antibody. I was able to. From this, it can be seen that the present invention has made substantial progress over the prior art, particularly the Csiszar et al. Patent, which describes all proteins derived from the LO family of genes but does not define their characteristics. I understand (WO01 / 83702A2: an application related to a novel enzyme belonging to the lysyl oxidase family in the amine oxidase family).
〔実施例2〕
「新規抗体、抗LOX抗体及び抗LOXL抗体による、筋細胞のLOX及びLOXLの免疫検出」
図2:図2は、下記に示す方法で行った電気泳動の写真である。この電気泳動は、実施例1で明らかにした抗LOX抗体及び抗LOXL抗体を用いることによって、平滑筋細胞(SMC)のLOX及びLOXLの成熟タンパク質の特性を明らかにしている。
[Example 2]
“Immunodetection of LOX and LOXL in myocytes with novel antibodies, anti-LOX and anti-LOXL antibodies”
FIG. 2: FIG. 2 is a photograph of electrophoresis performed by the method described below. This electrophoresis reveals the properties of LOX and LOXL mature proteins in smooth muscle cells (SMC) by using the anti-LOX and anti-LOXL antibodies revealed in Example 1.
ラット平滑筋細胞系(Jean−Marie Daniel Lamaziere(ボルドー)により開発)の細胞株(L)及び細胞培地(M)からタンパク質を抽出し、抗LOXLmat抗体、抗LOXmat抗体、抗LOXLpro抗体及び抗LOXpro抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。細胞は、37℃において5%CO2雰囲気下、10%ウシ胎児血清、グルタミン2mM及びゲンタマイシン50μg/mlを含むDMEM培地(シグマ)中で培養した。 Extract protein from cell line (L) and cell culture medium (M) of rat smooth muscle cell line (developed by Jean-Marie Daniel Lamazeire (Bordeaux)), anti-LOXLmat antibody, anti-LOXmat antibody, anti-LOXLpro antibody and anti-LOXLpro antibody Was detected by Western blotting. Cells were cultured in DMEM medium (Sigma) containing 10% fetal calf serum, glutamine 2 mM and gentamicin 50 μg / ml at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
細胞株タンパク質を、PBSバッファーで2回洗浄し、2時間かけて4℃においてゆっくりと撹拌しながら、溶解バッファー(16mMリン酸バッファー(pH8)、0.5%NP40、プロテアーゼ阻害剤(コンプリートミニ、ロシュ・ダイアグノスティックス社)、及び、尿素6M)中で抽出した。溶解物を、プロテアーゼ阻害剤(コンプリートミニ、ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイラン(Meylan)、フランス)を含む16mMリン酸バッファー(pH8)の2倍量で希釈し、15000gで5分間遠心分離した。可溶性タンパク質を10%のトリクロロ酢酸(TCA)を加えて沈殿させ、電気泳動を行った。 The cell line protein was washed twice with PBS buffer and slowly stirred at 4 ° C. over 2 hours while dissolving the lysis buffer (16 mM phosphate buffer (pH 8), 0.5% NP40, protease inhibitor (complete mini, Roche Diagnostics) and urea 6M). The lysate was diluted with 2 volumes of 16 mM phosphate buffer (pH 8) containing protease inhibitors (Complete Mini, Roche Diagnostics, Meylan, France) and centrifuged at 15000 g for 5 minutes. . Soluble protein was precipitated by adding 10% trichloroacetic acid (TCA) and subjected to electrophoresis.
血清を添加せずに48時間培養した細胞の培地中のタンパク質を、10%TCA又は50%飽和硫酸アンモニウムを加えて回収し、沈殿させた。 Proteins in the medium of cells cultured for 48 hours without adding serum were collected by adding 10% TCA or 50% saturated ammonium sulfate and precipitated.
免疫検出を行うために、10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離した。このタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(イモビロンPSQ、ミリポア社)上に転写し、上述のように免疫検出した(Borelら、2001年)。 Proteins were separated by 10% SDS polyacrylamide gel electrophoresis for immunodetection. The protein polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Immobilon P SQ, Millipore) and transferred onto and immunodetection as described above (Borel et al., 2001).
このように、上記で作った抗体を用いることによって、生体組織中におけるLOX及びLOXLの成熟形及び未成熟形を特徴付けてその位置を確認することができる。 Thus, by using the antibody prepared above, the mature and immature forms of LOX and LOXL in living tissues can be characterized and their positions can be confirmed.
〔実施例3〕
「弾性繊維の形成におけるLOX及びLOXLの作用の実証」
本発明者らは、LOX及びLOXLタンパク質が再生皮膚モデルにおける真皮中の結合組織の形成に関与している可能性があることを、免疫組織化学的手法によって明らかにした(図3)。このことは、2種の酵素(LOX及びLOXL)の酵素前駆体領域及び成熟領域に対する抗LOX抗体及び抗LOXL抗体を用いることによって明瞭となった。
Example 3
"Demonstration of LOX and LOXL action in elastic fiber formation"
The inventors have revealed by immunohistochemical techniques that LOX and LOXL proteins may be involved in the formation of connective tissue in the dermis in a regenerated skin model (FIG. 3). This was clarified by using anti-LOX and anti-LOXL antibodies against the enzyme precursor region and mature region of the two enzymes (LOX and LOXL).
図3:再生皮膚(RS)及び正常な人間の皮膚中におけるLOXL及びLOXの免疫組織学的検出の結果を示すものである。16日後(A)、35日後(C)及び45日後(E)の再生皮膚のLOXL(A、C、E、G)の免疫検出を、抗LOXLR231−G368抗体(A、C、E)、又は、免疫検出する前に対応するペプチドGST−LOXLR231−G368と吸着させた抗LOXLR231−G368抗体(G)を用いて行ったものを示す。16日後(B)、35日後(D)及び45日後(F)におけるLOX(B、D、F、H)の免疫検出を、抗LOXV228−S279抗体(B、D、F)、又は、免疫検出する前に対応するペプチドGST−LOXV228−S279と吸着させた抗LOXV228−S279抗体(H)を用いて行ったものを示す。人間の包皮皮膚中のLOXL(I)及びLOX(J)の免疫検出を、抗LOXLR231−G368抗体(I)及び抗LOXV228−S279抗体(J)を用いて行った。真皮と表皮の境界部を白抜きの矢印で、真皮の基質を矢印で、16日後の角質細胞の位置を矢印の先端で示す。 FIG. 3 shows the results of immunohistological detection of LOXL and LOX in regenerated skin (RS) and normal human skin. Immunodetection of the regenerated skin LOXL (A, C, E, G) after 16 days (A), 35 days (C) and 45 days (E), anti-LOXL R231-G368 antibody (A, C, E), Or what was performed using the corresponding peptide GST-LOXL R231-G368 and the anti- LOXL R231-G368 antibody (G) adsorbed before immunodetection is shown. Immunodetection of LOX (B, D, F, H) at 16 days (B), 35 days (D), and 45 days (F), anti-LOX V228-S279 antibody (B, D, F), or immunization It shows what was performed using the corresponding peptide GST-LOX V228-S279 and the adsorbed anti-LOX V228-S279 antibody (H) before detection. Immunodetection of LOXL (I) and LOX (J) in human foreskin skin was performed using anti-LOXL R231-G368 antibody (I) and anti-LOX V228-S279 antibody (J). The boundary between the dermis and epidermis is indicated by a white arrow, the substrate of the dermis is indicated by an arrow, and the position of the corneocytes after 16 days is indicated by the tip of the arrow.
再生皮膚(Mimeskin(R)、Coletica社、リヨン、フランス)を、ブアン固定液(LOX、LOXL、エラスチン)、又は、10%ホルマリン溶液(エラスチン用)中で調製し、その後パラフィンで包埋した。厚さ6μmの断面からパラフィンを除去し、グリシンの塩酸溶液(100mmol/L)中で漂白した。抗LOX抗体及び抗LOXL抗体は上記のものである。 Regenerated skin (Mimeskin®, Coletica, Lyon, France) was prepared in bouin fixative (LOX, LOXL, elastin) or 10% formalin solution (for elastin) and then embedded in paraffin. Paraffin was removed from a 6 μm thick section and bleached in a hydrochloric acid solution of glycine (100 mmol / L). Anti-LOX and anti-LOXL antibodies are as described above.
抗体は次のように希釈して使用した:500倍(抗LOXLR231−G368抗体)、100倍(抗LOXV228−S279抗体、抗LOXLS355−D416抗体)。免疫複合体を、ペルオキシダーゼ標識抗IgGウサギ(ヤギ)抗体(ダコ社、トラップ、フランス)により、基質としてジアミノベンジジン(ダコ社)を用いて検出した。 The antibodies were used diluted as follows: 500-fold (anti-LOXL R231-G368 antibody), 100-fold (anti-LOX V228-S279 antibody, anti-LOXL S355-D416 antibody). The immune complex was detected with a peroxidase-labeled anti-IgG rabbit (goat) antibody (Dako, Trap, France) using diaminobenzidine (Dako) as a substrate.
上記より、LOXLは、再生皮膚モデル(特にMimeskin(R)等)における弾性繊維の形成に関与している可能性が高い。 From the above, it is highly possible that LOXL is involved in the formation of elastic fibers in regenerative skin models (especially Mimeskin®).
〔実施例4〕
「弾性繊維の形成におけるLOXL2、LOXL3及びLOXL4の作用の実証」
本発明はまた、新規の抗LOXL2抗体2種も作ったが、これらのうち1種は、理論上はLOXL3及びLOXL4も認識する。これを用いることによって、これらの酵素が、再生皮膚モデルにおける真皮中でエラスチンと共に発現するかどうかを明らかにすることができた。上記2種の抗LOXL2抗体を用いて免疫組織化学的に調べたところ、これらの抗原、並びに、抗原性の関連する2種のタンパク質LOXL3及びLOXL4が真皮中に全くあるいはほとんど発現せず、従って弾性繊維の形成に関与していないことが実際に分かった。
Example 4
“Demonstration of the effects of LOXL2, LOXL3 and LOXL4 in the formation of elastic fibers”
The present invention also created two new anti-LOXL2 antibodies, one of which also theoretically recognizes LOXL3 and LOXL4. Using this, it was possible to determine whether these enzymes are expressed with elastin in the dermis in a regenerated skin model. As a result of immunohistochemical examination using the above-mentioned two types of anti-LOXL2 antibodies, these antigens and two antigenic related proteins, LOXL3 and LOXL4, were not expressed at all or hardly in the dermis, and therefore elastic. It was actually found that it was not involved in fiber formation.
図4:再生皮膚(16、35及び45日後)及び人間の包皮皮膚の断面における、抗LOXL2517−581抗体(左欄)、及び、理論的にLOXL2、LOXL3及びLOXL4を認識する抗LOXL2664−720抗体(右欄)を用いて行った免疫検出の結果を示す。 Figure 4: in reconstructed skin (16 and 35, and 45 days later) and human foreskin skin section, anti LOXL2 517-581 antibody (left column), and, theoretically LOXL2, LOXL3 and recognizes LOXL4 anti LOXL2 664- The result of the immunodetection performed using 720 antibody (right column) is shown.
抗LOXL2抗体を、融合ペプチドGST−LOXL2に対して上述のようにして得た(Decitreら、Lab.Invest.、78、143−151、1998年)。融合遺伝子GST−LOXL2517−581を、ヒトLOXL2遺伝子(hLOXL2)配列の1543〜1747をプラスミドに導入して、上述のように構築した。 Anti-LOXL2 antibody was obtained as described above for the fusion peptide GST-LOXL2 (Decitre et al., Lab. Invest., 78, 143-151, 1998). The fusion gene GST- LOXL2 517-581 was constructed as described above with the human LOXL2 gene (hLOXL2) sequence 1543-1747 introduced into the plasmid.
この断片は、PCRにより、センスプライマー5−GAGCTGGGATCCGCGCACTGCC−3’(配列番号32)、及び、アンチセンスプライマー5’−GGCTGAGTCGACGAGGCAGTTCTCC−3’(配列番号33)を用いて作成した。 This fragment was prepared by PCR using the sense primer 5-GAGCTGGGATCCGCGCACTGCCC-3 '(SEQ ID NO: 32) and the antisense primer 5'-GGCTGAGGTCGACGAGGCAGTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 33).
センスプライマー5’−CACAGGATCCGAAGGAGACATCCAGAAG−3’(配列番号34)、及び、アンチセンスプライマー5’−TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG−3’(配列番号35)を用いて、対応するhLOXL2配列を導入することにより、融合遺伝子GST−LOXL2664−720を構築した。 By introducing the corresponding hLOXL2 sequence using the sense primer 5′-CACAGGATCCGAAGGAGACATCATGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 34) and the antisense primer 5′-TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 35), the fusion gene GST- LOXL2 664-720 was constructed.
上記タンパク質に対して作成した融合タンパク質及び抗ウサギ抗体を、上述のようにして作った。517−580ペプチドに対する抗体を、この領域がLOXL2に特有の領域であることから抗LOXL2抗体と称した。 The fusion protein and anti-rabbit antibody prepared against the above protein were prepared as described above. The antibody against the 517-580 peptide was called anti-LOXL2 antibody because this region is unique to LOXL2.
664−734ペプチドに対する抗体を、LOXL2のこの領域がLOXL3及びLOXL4と高い類似性を持つことから(それぞれ、約74.6%及び60.5%)、抗LOXL−R(「関連する」の意)抗体と称した。 Antibodies against the 664-734 peptide were identified as anti-LOXL-R (“relevant”) because this region of LOXL2 is highly similar to LOXL3 and LOXL4 (approximately 74.6% and 60.5%, respectively). ) Antibody.
16日後(RS−D16)、35日後(RS−D35)及び45日後(RS−D45)の再生皮膚(Mimeskin(R)、Coletica社、リヨン、フランス)、及び、人間の包皮皮膚について、上述のように免疫組織化学的手法により、抗LOXL2−R抗体及び抗LOXL2抗体を用いて調べた。抗LOXL2抗体により、LOXL2が表皮中に発現していて真皮中には発現していないことが分かった。一方、LOXL2、LOXL3及びLOXL4に共通するC末端領域に対する抗体により、これらの酵素が表皮中に発現していることが確認でき、またこれらの酵素が、真皮中に少し発現しているが、弾性繊維を形成する部位に相当する部分には発現していないことが分かった。 Regenerated skin after 16 days (RS-D16), 35 days (RS-D35) and 45 days (RS-D45) (Mimeskin®, Coletica, Lyon, France) and human foreskin skin As described above, the anti-LOXL2-R antibody and the anti-LOXL2 antibody were examined by immunohistochemical technique. It was found by anti-LOXL2 antibody that LOXL2 was expressed in the epidermis but not in the dermis. On the other hand, antibodies against the C-terminal region common to LOXL2, LOXL3 and LOXL4 can confirm that these enzymes are expressed in the epidermis, and these enzymes are slightly expressed in the dermis. It was found that it was not expressed in the part corresponding to the part forming the fiber.
従って、LOXL2、LOXL3及びLOXL4は、弾性繊維の形成には関与していない。 Therefore, LOXL2, LOXL3 and LOXL4 are not involved in the formation of elastic fibers.
〔実施例5〕
「弾性繊維の形成におけるLOXLの作用の実証」
LOXL及びLOXと、弾性繊維又はミクロフィブリルとの結合が、透過型電子顕微鏡を用いて本発明により明らかに示された。
Example 5
"Demonstration of the action of LOXL in the formation of elastic fibers"
The binding of LOXL and LOX to elastic fibers or microfibrils was clearly demonstrated by the present invention using a transmission electron microscope.
ミクロフィブリルに結合したLOXL及びLOXは、エラスチンが沈着する足場を構成するが、LOXのみが膠原繊維の形成と関連している(図5参照)。 LOXL and LOX bound to microfibrils constitute a scaffold on which elastin is deposited, but only LOX is associated with collagen fiber formation (see FIG. 5).
図5:角質細胞を添加して30日後の再生皮膚、及び、正常な人間の皮膚の真皮部分において透過型電子顕微鏡検査を用いて行ったLOXL、LOX及びエラスチンの免疫検出の結果を示す。 FIG. 5 shows the results of immunodetection of LOXL, LOX and elastin performed using transmission electron microscopy on the regenerated skin 30 days after the addition of corneocytes and the dermis of normal human skin.
組織を4℃において3時間、PBSバッファー(0.1%グルタルアルデヒド含有)に溶解した4%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、リン酸バッファー(0.4Mスクロース−カコジル酸、及び、0.2Mリシン含有)中で洗浄した後、エタノール溶液中で脱水し、LRホワイト(Euromedex社、フランス)で包埋した。検出は、トリス−塩酸バッファー(pH8.2)で50倍に希釈した一次抗体に1%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えたものを用いて行った。40倍に希釈した金コロイド粒子(10〜20nm)標識抗IgGウサギ抗体(Biocell社、トゥブュ(Tebu)、フランス)を用いて、免疫複合体を検出した。試料を酢酸ウラニルとクエン酸鉛の3%水溶液で染色して、日本電子製1200EX透過型電子顕微鏡で調べた。この免疫検出は再生皮膚(A〜D)及び人間の包皮皮膚(F〜I)について行った。 Tissue was fixed with 4% paraformaldehyde dissolved in PBS buffer (containing 0.1% glutaraldehyde) for 3 hours at 4 ° C., and phosphate buffer (0.4 M sucrose-cacodylic acid and 0.2 M lysine). And then dehydrated in an ethanol solution and embedded in LR White (Euromedex, France). Detection was carried out using a primary antibody diluted 1/50 with Tris-HCl buffer (pH 8.2) and 1% bovine serum albumin (BSA). Immunocomplexes were detected using colloidal gold particle (10-20 nm) labeled anti-IgG rabbit antibody (Biocell, Tebu, France) diluted 40-fold. The sample was stained with a 3% aqueous solution of uranyl acetate and lead citrate and examined with a 1200EX transmission electron microscope manufactured by JEOL. This immunodetection was performed on regenerated skin (AD) and human foreskin skin (FI).
再生皮膚においては以下の抗体を用いて行った:抗LOXL抗体(A、B)、抗LOX抗体(C)、抗エラスチン抗体(Elm)(D)、市販の抗エラスチンヒト抗体(シグマ社、アメリカ)を50倍に希釈したもの、及び、ネガティブコントロールとして、真皮中の一次抗体を含まないもの(Control)(E)。人間の包皮皮膚においては二重標識を行った(F〜I)。 In the regenerated skin, the following antibodies were used: anti-LOXL antibody (A, B), anti-LOX antibody (C), anti-elastin antibody (Elm) (D), commercially available anti-elastin human antibody (Sigma, USA) ) Diluted 50 times and, as a negative control, no primary antibody in the dermis (Control) (E). Double labeling was performed on human foreskin skin (FI).
「A〜D」:LOXL、LOX及びエラスチンの、45日後の再生皮膚の真皮部分における電子顕微鏡を用いた免疫検出。
「E」:45日後、すなわち角質細胞を添加して30日後の再生皮膚の真皮中における、抗エラスチン抗体及び抗コラーゲンI抗体を用いたポジティブコントロール。
「F及びI」:LOXL、LOX、エラスチン及びコラーゲンの、人間の包皮の真皮部分における電子顕微鏡を用いた二重免疫検出。
「G及びH」:抗LOXLウサギ抗体(抗IgGウサギ抗体は10nmの金粒子で標識)、及び、抗エラスチンマウス抗体(抗IgGマウス抗体は20nmの金粒子で標識)を用いた、人間の包皮の真皮部分における二重標識。
図中の記号:m;ミクロフィブリル、c;膠原繊維、e;無定形のエラスチン。
縮尺の棒:500nm。
“AD”: immunodetection of LOXL, LOX and elastin using electron microscopy in the dermis of regenerated skin after 45 days.
“E”: Positive control using anti-elastin antibody and anti-collagen I antibody in the dermis of regenerated skin 45 days later, ie 30 days after addition of corneocytes.
“F and I”: Double immunodetection of LOXL, LOX, elastin and collagen using electron microscopy in the dermis part of human foreskin.
“G and H”: human foreskin using anti-LOXL rabbit antibody (anti-IgG rabbit antibody labeled with 10 nm gold particles) and anti-elastin mouse antibody (anti-IgG mouse antibody labeled with 20 nm gold particles) Double label in the dermis of
Symbols in the figure: m: microfibril, c: collagen fiber, e: amorphous elastin.
Scale bar: 500 nm.
LOXL(A、B)は、高密度の沈着物と結合して、又は、ミクロフィブリル上に検出されたが、上記断面上に白色で現れている膠原繊維と結合しては検出されなかった。LOX(C)の標識については、金粒子が高密度の沈着物、ミクロフィブリル及びコラーゲンと結合してわずかに観察されたが、標識は薄かった。抗エラスチン抗体によって同様に、高密度の沈着物及びミクロフィブリルが検出された(D)。LOXL及びLOXと、ミクロフィブリル及び弾性繊維との結合を、人間の包皮皮膚中において、免疫検出した後で電子顕微鏡を用いて確認した(G、H)。再生皮膚モデルにおける観察と同様に、LOXLは膠原繊維とは結合しておらず、LOX(膠原繊維と共に多く存在し、ミクロフィブリル上にはほとんど存在しない)とは正反対である。抗原LOXLは、ミクロフィブリルと結合していて、人間の包皮皮膚の弾性繊維周辺で検出された。LOXLは、ミクロフィブリルの周りに広がる無定形のエラスチンとは結合していないが、ミクロフィブリルの周囲で主に観察され、膠原繊維とも結合していない。 LOXL (A, B) was detected in association with dense deposits or on microfibrils but not with collagen fibers appearing in white on the cross section. For LOX (C) labeling, gold particles were observed slightly associated with dense deposits, microfibrils and collagen, but the labeling was thin. Similarly, dense deposits and microfibrils were detected by anti-elastin antibody (D). Binding of LOXL and LOX to microfibrils and elastic fibers was confirmed using electron microscopy after immunodetection in human foreskin skin (G, H). Similar to the observations in the regenerated skin model, LOXL is not associated with collagen fibers and is the opposite of LOX (which is abundant with collagen fibers and rarely present on microfibrils). The antigen LOXL was bound to microfibrils and was detected around elastic fibers in human foreskin skin. LOXL is not associated with amorphous elastin that extends around microfibrils, but is mainly observed around microfibrils and is not associated with collagen fibers.
LOXLは、再生皮膚モデル及び人間の包皮皮膚中において弾性繊維と結合している。 LOXL is bound to elastic fibers in regenerative skin models and human foreskin skin.
〔実施例6〕
「LOXLの発現と弾性繊維形成との関係の実証」
LOXL及びLOXは、まだ高いエラスチン合成力を持つ幼い患者(数か月児)から採取した包皮皮膚の真皮中に発現している。LOXLは成人の首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中には発現していないのに対して、LOXはいずれの年齢においても真皮中に発現している(図6)。
Example 6
“Demonstration of the relationship between the expression of LOXL and elastic fiber formation”
LOXL and LOX are expressed in the dermis of foreskin skin taken from a young patient (a few months old) who still has high elastin synthesis. LOXL is not expressed in the dermis of adult neck, chest, abdomen or facial skin, whereas LOX is expressed in the dermis at any age (FIG. 6).
図6:LOX及びLOXLの人間の皮膚中における免疫検出の結果を示す。
抗LOX抗体(A、C、E、G)及び抗LOXL抗体(B、D、F、H)を用いて、エドアール・エリオ病院(リヨン、フランス)の組織バンク提供の包皮(A、B)、首(C、D)、胸(E、F)及び腹(G、H)の皮膚の試料中におけるLOX及びLOXLの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。
FIG. 6 shows the results of immunodetection in human skin of LOX and LOXL.
Foreskin (A, B) provided by tissue bank of Ed Earl Hospital (Lyon, France) using anti-LOX antibody (A, C, E, G) and anti-LOXL antibody (B, D, F, H), LOX and LOXL expression was detected in skin samples from the neck (C, D), breast (E, F) and abdomen (G, H). These tissues were fixed with a Buan reagent, embedded in paraffin, and immunodetection was performed in the same manner as described above.
首、胸、腹及び顔の皮膚真皮中にLOXLが検出されないことを、幼児及び成人において確認した(図7:腹)。 It was confirmed in infants and adults that LOXL was not detected in the skin dermis of the neck, chest, abdomen and face (FIG. 7: belly).
図7:年齢の異なる人間から採取した腹の皮膚におけるLOX及びLOXLの免疫検出の結果を示す。
抗LOX抗体(A、C、E、G)及び抗LOXL抗体(B、D、F、H)を用いて、エドアール・エリオ病院の組織バンク提供の1.5歳(A、B)、35歳(C、D)、60歳(E、F)及び91歳(G、H)の人から採取した腹の皮膚の試料中におけるLOX及びLOXLの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。
FIG. 7 shows the results of immunodetection of LOX and LOXL in abdominal skin collected from people of different ages.
1.5 years old (A, B), 35 years old, provided by the tissue bank of Ed Earlier Hospital using anti-LOX antibodies (A, C, E, G) and anti-LOXL antibodies (B, D, F, H) Expression of LOX and LOXL was detected in samples of abdominal skin taken from (C, D), 60 years old (E, F) and 91 years old (G, H). These tissues were fixed with a Buan reagent, embedded in paraffin, and immunodetection was performed in the same manner as described above.
この実験において、人間の皮膚表皮中にLOX及びLOXLが多く発現していること、これら2種の酵素の発現は非常に長く続くことが観察された(91歳)(図7)。 In this experiment, it was observed that LOX and LOXL were highly expressed in human skin epidermis, and the expression of these two enzymes lasted very long (91 years) (FIG. 7).
瘢痕については、3か月経過後にも5年経過後にも、瘢痕組織においてLOXL及びLOXは観察されなかった。3か月経過後の瘢痕ではエラスチンが免疫検出され、5年経過後の瘢痕では検出されなかったことは留意すべきである(図8)。 For scars, LOXL and LOX were not observed in scar tissue after 3 months and 5 years. It should be noted that elastin was immunodetected in the scar after 3 months and not detected in the scar after 5 years (FIG. 8).
図8:LOX及びLOXLの、治療後の経過期間の異なる瘢痕組織の皮膚中における免疫検出の結果を示す。
抗LOX抗体(A、D、G)、抗エラスチン抗体(B、E、H)及び抗LOXL抗体(C、F、I)を用いて、17歳患者の首皮膚の瘢痕周辺(「正常な」部分、A〜C)、治療から3か月経過後(D〜F)及び5年経過後(G、H)の試料におけるLOX、エラスチン及びLOXLの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。エラスチンの標識には、0.2%ヒアルロニダーゼ(シグマ社)を用いて遮蔽除去(demasking)することが必要である。
FIG. 8: LOX and LOXL show the results of immunodetection in the skin of scar tissue with different elapsed time after treatment.
Using anti-LOX antibodies (A, D, G), anti-elastin antibodies (B, E, H) and anti-LOXL antibodies (C, F, I), around the scar on the neck skin of a 17-year-old patient (“normal” Part, A to C), the expression of LOX, elastin and LOXL in samples after 3 months (DF) and 5 years (G, H) after treatment was detected. These tissues were fixed with a Buan reagent, embedded in paraffin, and immunodetection was performed in the same manner as described above. The labeling of elastin requires demasking with 0.2% hyaluronidase (Sigma).
上記実施例によって、本発明は以下のことを明らかにした:(i)再生皮膚モデル、及び、幼い患者の包皮真皮中において、LOXLが弾性繊維の形成に間違いなく関与していること、及び、(ii)年齢の異なる人間の皮膚真皮、及び、瘢痕において、LOXLが本当に発現していないこと。従って、LOXLは実際、機能性弾性繊維を架橋することができ、また、機能性繊維を形成するために弾性繊維の架橋が必要な場合において欠損している唯一のリシルオキシダーゼアイソフォームである。また、弾性繊維の形成に関与している可能性のあるLOXについては、成人の皮膚に欠損していない。 By means of the above examples, the present invention has revealed that: (i) LOXL is definitely involved in the formation of elastic fibers in the regenerated skin model and in the foreskin of young patients, and (Ii) LOXL is not really expressed in human dermis and scar of different ages. Thus, LOXL is actually the only lysyl oxidase isoform that can crosslink functional elastic fibers and is missing when elastic fiber crosslinking is required to form functional fibers. In addition, LOX that may be involved in the formation of elastic fibers is not deficient in adult skin.
〔実施例7〕
「LOXL遺伝子の転写前制御に関する研究」
さらに本発明は、ヒトLOXL遺伝子(hLOXL)がプロモーターレベルで活性化される可能性があることを明らかにした(図9)。配列番号3は、このプロモーターの配列の−2730から−1のヌクレオチドを記載している。hLOXLプロモーターの活性化領域がいくつか明らかになった。特に、ヌクレオチド−712/−391(LOXL遺伝子の翻訳を+1から始めるとした場合の番号)の領域は、人間の包皮皮膚の繊維芽細胞において移行型トランスフェクションを行った後に発現するレポーター遺伝子ルシフェラーゼに対しての上方制御活性を有する領域である。
Example 7
"Research on pre-transcriptional control of LOXL gene"
Furthermore, the present invention revealed that the human LOXL gene (hLOXL) may be activated at the promoter level (FIG. 9). SEQ ID NO: 3 describes the nucleotide from −2730 to −1 of the sequence of this promoter. Several activation regions of the hLOXL promoter were revealed. In particular, the region of nucleotides -712 / -391 (the number when the translation of the LOXL gene starts from +1) is the reporter gene luciferase expressed after transfer-type transfection in human foreskin skin fibroblasts. This is a region having up-regulating activity.
hLOXLの発現の変化を遺伝子レベル及び/又はタンパク質レベルで同時に追跡できることを本発明者らが以前明らかにしたので、LOXL遺伝子の転写前上方制御によって、この遺伝子の合成を活性化でき、従ってこの遺伝子に相当するhLOXLタンパク質の合成を活性化できることが示される。このことはまた、LOXについても明らかにされた(Decitreら、Lab.Invest.、78、143−151、1998年)。 Since we previously demonstrated that changes in the expression of hLOXL can be tracked simultaneously at the gene and / or protein level, pre-transcriptional up-regulation of the LOXL gene can activate the synthesis of this gene and thus this gene It can be shown that the synthesis of hLOXL protein corresponding to can be activated. This has also been demonstrated for LOX (Decitre et al., Lab. Invest., 78, 143-151, 1998).
インターネット上のソフトウェアTransfac(R)を用いて核配列PrLOXLについて研究した結果、本発明者らは、核因子の制御を受けると推定される部位を特定できた。これらの因子は、サイトカイン、又は、これらの転写因子を経由して特定遺伝子の転写に作用することが知られている他のエフェクターと相互に関係があった。最も興味深い部位を図10中に示す。このスキームはこの研究をまとめたもので、レチノイン酸応答部位と推定される部位2種、TGF−β応答部位と推定される部位2種、EGF応答部位と推定される部位1種、エストロゲン応答部位と推定される部位3種及びグルココルチコイド応答部位と推定される部位2種を示す。制御領域については研究されていたため、本発明者らはLOXL遺伝子の転写を制御できる可能性のある部位をいくつか特定できた。これらは、レチノイン酸、TGF―β、EGF及びグルココルチコイドに応答する要素であると推定される。これらの要素がない場合にはプロモーターの活性がそれぞれ約50%及び60%減少することから、レチノイン酸及びエストロゲンの制御を受けると推定される部位に対応する領域は、転写を実際に活性化する効果があると思われる。TGF−βによる制御部位は、プロモーター活性を低下させると思われる。 As a result of studying the nuclear sequence PrLOXL using the software Transfac (R) on the Internet, the present inventors were able to identify a site presumed to be controlled by a nuclear factor. These factors have been correlated with cytokines or other effectors known to act on the transcription of specific genes via these transcription factors. The most interesting sites are shown in FIG. This scheme summarizes this study: two sites presumed to be retinoic acid response sites, two sites presumed to be TGF-β response sites, one site presumed to be EGF response sites, and estrogen response sites 3 sites presumed to be and 2 sites presumed to be glucocorticoid response sites. Since the control region has been studied, the present inventors have identified several sites that may be able to control the transcription of the LOXL gene. These are presumed to be elements that respond to retinoic acid, TGF-β, EGF and glucocorticoids. In the absence of these elements, the promoter activity is reduced by about 50% and 60%, respectively, so that the region corresponding to the site presumed to be controlled by retinoic acid and estrogen actually activates transcription. It seems to be effective. The regulatory site by TGF-β appears to reduce promoter activity.
上記に記載したツールは、hLOXLのプロモーターに対して、特に認識部位と推定される部位に対してアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用を有する活性成分のスクリーニングに用いることができる。 The tool described above can be used for screening for an active ingredient having an agonistic action or an antagonistic action on the hLOXL promoter, particularly on a site presumed to be a recognition site.
それゆえ、hLOXLのプロモーターのヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズする領域か、又は、この特性を有するエフェクタータンパク質を誘導する領域を有する活性成分を探すのが有利である。 Therefore, it is advantageous to look for an active ingredient that has a region that hybridizes to at least a portion of the nucleotide sequence of the hLOXL promoter or a region that induces an effector protein having this property.
「hLOXL遺伝子のプロモーターの機能分析」
ヒトLOXL遺伝子のプロモーター(PrhLOXL)を、データベースの配列により特定した。転写開始位置は知られていなかったので、本発明者らは翻訳される+1からその番号をつけた。しかしながら、この領域に相当するEST(発現配列タグ)cDNAを検索したが−342から上流の配列が得られなかったことから、hLOXL遺伝子の転写がこの領域(TATAボックスを含まない)から開始されると仮定できる。特異的プライマーは、この配列上の−2172〜+189の位置に示されている(エクソン1)。このプライマーを用いることにより、皮膚繊維芽細胞由来のヒトゲノムDNAからPrhLOXLを増幅及び単離できた。これをクローニングして配列を決定したところ、その配列が予想したものと一致することが分かった。その後、−2172〜−1に位置する(完全長であることが分かっている)プロモーターをpGL3−basic vector(プロメガ社、シャルボニエール、フランス)にサブクローニングし、真核細胞における研究に用いることができた。このプロモーターはレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだ。これにより、トランスフェクションさせた細胞によるルシフェラーゼの生産はPrhLOXLに制御され、その活性に比例する。細胞には、結果の標準とするために、強度に再現性よくβ−ガラクトシダーゼ(β−Gal)を発現するプロモーターを同時にトランスフェクションした。同様の条件でルシフェラーゼ及びβ―Gal酵素活性を測定した。
"Functional analysis of hLOXL gene promoter"
The promoter of the human LOXL gene (PrhLOXL) was identified by the sequence of the database. Since the transcription start position was not known, we assigned the number from +1 to be translated. However, the EST (expression sequence tag) cDNA corresponding to this region was searched, but no upstream sequence was obtained from -342, so that transcription of the hLOXL gene is started from this region (not including the TATA box). Can be assumed. Specific primers are shown at positions -1722 to +189 on this sequence (exon 1). By using this primer, PrhLOXL could be amplified and isolated from human genomic DNA derived from dermal fibroblasts. When this was cloned and sequenced, it was found that the sequence matched that expected. Subsequently, the promoter located at -1722-1 (which is known to be full-length) can be subcloned into pGL3-basic vector (Promega, Charbonnier, France) for use in eukaryotic studies. did it. This promoter was incorporated upstream of the luciferase gene, which is a reporter gene. Thereby, the production of luciferase by the transfected cells is controlled by PrhLOXL and is proportional to its activity. Cells were co-transfected with a promoter that expresses β-galactosidase (β-Gal) with high reproducibility to provide a standard for results. Luciferase and β-Gal enzyme activities were measured under the same conditions.
PrhLOXLを徐々に短くしていき(5’欠失)、取り出した領域の作用を調べた。人間の皮膚の繊維芽細胞におけるPrhLOXLの制御を調べるため、この細胞のトランスフェクションを行った。細胞系のトランスフェクションは容易だが、正常な繊維芽細胞のトランスフェクションは非常に難しい。そのため、約40%の培養繊維芽細胞をトランスフェクションできるSuperfect(R)(キアゲン社、クルタブーフ(Courtaboeuf)、フランス)を用いた。 PrhLOXL was gradually shortened (5 'deletion), and the action of the extracted region was examined. To examine the regulation of PrhLOXL in human skin fibroblasts, the cells were transfected. Transfection of cell lines is easy but transfection of normal fibroblasts is very difficult. Therefore, Superfect (R) (Qiagen, Courtaboeuf, France) capable of transfecting about 40% of cultured fibroblasts was used.
その構築物及び包皮繊維芽細胞における活性を図9に示す。本発明者らは、大きな転写活性化領域3つと阻害領域2つの位置を特定した。例えば、−712→−391領域は、これを取り除くとプロモーターの活性が顕著に減少するので、活性化効果が非常に高い(−391→−1の構築物)。この研究により、PrhLOXLの転写を刺激するために調べる領域を特定できた。 The activity in the construct and foreskin fibroblasts is shown in FIG. We identified the location of three large transcriptional activation regions and two inhibition regions. For example, the -712 → −391 region has a very high activation effect (construct of −391 → −1) since the promoter activity is markedly reduced when the region is removed. This study allowed us to identify areas to investigate to stimulate PrhLOXL transcription.
特に図9は、プロモーターPrhLOXLの配列とルシフェラーゼ/β−ガラクトシダーゼ活性との相関を示す。この図から、人間の包皮皮膚の繊維芽細胞におけるプロモーターの活性化領域及び阻害領域の定義を容易に理解できる。 In particular, FIG. 9 shows the correlation between the sequence of the promoter PrhLOXL and the luciferase / β-galactosidase activity. From this figure, the definition of promoter activation region and inhibition region in human foreskin skin fibroblasts can be easily understood.
PrhLOXLの5’末端を次々に短くしていくことにより、レポーター遺伝子ルシフェラーゼの上流に位置するプロモーターの配列が短くなっていく構築物が7種得られた:pLL−2172、pLL−2002、pLL−1438、pLL−712、pLL−391、pLL−81。これらの構築物を人間の包皮皮膚の繊維芽細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した。並行して、β―ガラクトシダーゼ遺伝子(プロモーターSV40の制御を受ける)を有するプラスミドを細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション効果のコントロールとした。β―ガラクトシダーゼ活性(トランスフェクション効果を示す)に対するルシフェラーゼ活性(hLOXLプロモーターの配列の活性を示す)を最終的な値として示す。こうした活性の評価により、+(−2172→−2002;−1438→−968;−712→−391)で表わされる活性化領域3つ、及び、−(−2002→−1438;−968→−712)で表わされる阻害領域2つを含むプロモーターの制御領域をいくつか特定できた。−80→−1のプロモーターには活性がなく、転写された領域の+1より下流に位置している。転写された領域の+1は、翻訳開始位置から−342の位置に相当すると推定される。 By shortening the 5 ′ end of PrhLOXL one after another, seven constructs were obtained in which the sequence of the promoter located upstream of the reporter gene luciferase was shortened: pLL-2172, pLL-2002, pLL-1438. PLL-712, pLL-391, pLL-81. These constructs were transfected into human foreskin skin fibroblasts and luciferase activity was measured. In parallel, a plasmid having a β-galactosidase gene (under the control of the promoter SV40) was transfected into the cells and used as a control for the transfection effect. The luciferase activity (indicating the activity of the hLOXL promoter sequence) relative to β-galactosidase activity (indicating transfection effect) is shown as the final value. Based on the evaluation of these activities, three activation regions represented by + (− 2172 → −2002; −1438 → −968; −712 → −391) and − (− 2002 → −1438; −968 → −712) are obtained. Several control regions of the promoter including two inhibitory regions represented by) were identified. The promoter of -80 → -1 has no activity and is located downstream from +1 of the transcribed region. +1 of the transcribed region is estimated to correspond to a position of −342 from the translation start position.
図10は、hLOXL遺伝子のプロモーターの概略図であり、特にhLOXL遺伝子の転写制御位置と推定される位置を示す。「+」で示す領域は、遺伝子の発現を活性化する領域に相当し、「−」で示す領域はこの発現を阻害する領域に相当する。 FIG. 10 is a schematic diagram of a promoter of the hLOXL gene, and particularly shows a position presumed to be a transcriptional control position of the hLOXL gene. A region indicated by “+” corresponds to a region that activates gene expression, and a region indicated by “−” corresponds to a region that inhibits this expression.
〔実施例8〕
「再生皮膚モデルにおける角質細胞の導入によるLOXLの活性化の実証」
LOXLをコードする遺伝子の発現を、LOXLをコードするメッセンジャーRNAとジゴキシゲニン標識二本鎖DNAプローブとのin situハイブリダイゼーションをパラフィンで包埋した断面において行うことによって検出した。
35日後の皮膚モデル断面(Mimeskin(R))を示す図11において、
(A)LOXLの発現は、真皮深層及び表皮全体に渉って陽性である。
(B)LOXの発現は、真皮全体及び表皮基底層上部において陽性である。
(C)トロポエラスチン(TE)の発現は、真皮の繊維芽細胞及び表皮において見られる。
(D)遺伝子COL1A1(コラーゲンα1(I))の発現は、真皮で検出され、表皮では検出されていない。
(E)プローブのないコントロール。
DEJを白抜きの矢印で、多孔性の真皮基質を矢印で、陽性細胞を矢印の先端で示す。
Example 8
"Demonstration of LOXL activation by introduction of corneocytes in regenerative skin model"
Expression of the gene encoding LOXL was detected by performing in situ hybridization between a messenger RNA encoding LOXL and a digoxigenin-labeled double-stranded DNA probe in a paraffin-embedded section.
In FIG. 11 showing the skin model cross section (Mimeskin®) after 35 days,
(A) LOXL expression is positive across the deep dermis and the entire epidermis.
(B) LOX expression is positive throughout the dermis and in the upper epidermis.
(C) Expression of tropoelastin (TE) is found in dermal fibroblasts and epidermis.
(D) Expression of the gene COL1A1 (collagen α1 (I)) is detected in the dermis but not in the epidermis.
(E) Control without probe.
DEJ is indicated by an open arrow, porous dermal matrix is indicated by an arrow, and positive cells are indicated by an arrow tip.
二本鎖DNAプローブはPCRによって作成した。以下のプライマーをそれぞれ使用した。
Iα1コラーゲンの遺伝子にはセンス5’−GTGGAGAGTACTGGATTG−3’(配列番号14)及びアンチセンス5’−TCGTGCAGCCATCGACAG−3’(配列番号15)を、トロポエラスチンにはセンス5’−GTATATACCCAGGTGGCGTG−3’(配列番号10)及びアンチセンス5’−CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG−3’(配列番号11)を、hLOXにはセンス5’−GGTGGCCGACCCCTACTACATCC−3’(配列番号12)及びアンチセンス5’−GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC−3’(配列番号13)を、hLOXLにはセンス5’−GACATAACCGACGTGCAGCC−3’(配列番号8)及びアンチセンス5’−ATCCACGTTCGCTCCCTGAG−3’(配列番号9)を用いた。
Double stranded DNA probes were made by PCR. The following primers were used respectively.
Sense 5'-GTGGAGAGTACACTGGATTG-3 '(SEQ ID NO: 14) and antisense 5'-TCGTGCAGCCATCGACAG-3' (SEQ ID NO: 15) are included in the gene for Iα1 collagen, and sense 5'-GTATATACCCAGTGGGCGTG-3 '(in the tropoelastin). SEQ ID NO: 10) and antisense 5′-CGAACTTTGCTGGCTGCTTTTAG-3 ′ (SEQ ID NO: 11), hLOX is sense 5′-GGTGGGCCGACCCCTACTACCATCC-3 ′ (SEQ ID NO: 12) and antisense 5′-GCAAATCGCCCTCTGGTAGCCATAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11) 13), hLOXL includes sense 5′-GACATACACCGACGTGAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) and antisense 5′-ATCCACGTTC CTCCCTGAG-3 'was used (SEQ ID NO: 9).
Taqポリメラーゼ(プロメガ社、シャルボニエール、フランス)、及び、標識ヌクレオチドとしてDig−11−dUTP(ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイラン(Meylan)、フランス)を用いてDNAを増幅した。次にアガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick抽出キット(キアゲン社、クルタブーフ(Courtaboeuf)、フランス)を用いてDNAを精製した。その後、パラフィンで包埋した断面においてin situハイブリダイゼーションを行った。試料からパラフィンを除去し、2μg/mlのプロテイナーゼK(ロシュ社)で15分間20℃において処理した。内因性のペルオキシダーゼを、TSA+増幅キット(NEN社、ボストン、アメリカ)の指示通りに阻害した。プレハイブリダイゼーションを、37℃において2時間、20mMリン酸バッファー(pH7.4)(50%脱イオン化ホルムアミド、2×SSC(クエン酸ナトリウム)、EDTA(5mM)、2.5×デンハート溶液、200μg/ml変性ニシンDNA、1mg/mlサケ精液DNA、及び、tRNA(10mg/ml)を含む)中で行った。ハイブリダイゼーションを、37℃において16時間、20mMリン酸バッファー(50%脱イオン化ホルムアミド、2×SSC、EDTA(5mM)、2.5×デンハート溶液、200μg/ml変性ニシン精液DNA、及び、10%硫酸デキストランを含む)中で行った。上記変性プローブは、沸騰湯浴中で5分間処理したものと処理しないものを用いた。ハイブリダイゼーション後、20℃(コラーゲンについては37℃)において、2×SSC/50%ホルムアミド、1×SSC/50%ホルムアミド、1×SSC、及び、0.5×SSC中で断面を洗浄した。乾燥させた後、ジゴキシゲニン標識ハイブリッドを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗DIG抗体(ロシュ社)を用いて検出した。そしてこの複合体をTSA+増幅キット(NEN社)を用いて最終的に検出した。陽性シグナルは、アルカリホスファターゼの活性に相当する。この活性は、TSAキットの増幅手順に基づいて室温において2時間経過後の活性とし、テトラゾリウム塩(ニトロブルーテトラゾリウム/ブロモクロロインドリルリン酸(NBT/BCIP)を基質として使用)の沈殿によって分かる。 DNA was amplified using Taq polymerase (Promega, Charbonnier, France) and Dig-11-dUTP (Roche Diagnostics, Meylan, France) as the labeled nucleotide. Agarose gel electrophoresis was then performed and the DNA was purified using a QIAquick extraction kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Thereafter, in situ hybridization was performed on the section embedded in paraffin. Paraffin was removed from the sample and treated with 2 μg / ml proteinase K (Roche) at 20 ° C. for 15 minutes. Endogenous peroxidase was inhibited as directed by the TSA + amplification kit (NEN, Boston, USA). Prehybridization was performed at 37 ° C. for 2 hours with 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) (50% deionized formamide, 2 × SSC (sodium citrate), EDTA (5 mM), 2.5 × Denhart solution, 200 μg / in denatured herring DNA, 1 mg / ml salmon semen DNA, and tRNA (10 mg / ml). Hybridization was performed at 37 ° C. for 16 hours with 20 mM phosphate buffer (50% deionized formamide, 2 × SSC, EDTA (5 mM), 2.5 × Denhart solution, 200 μg / ml denatured herring semen DNA, and 10% sulfuric acid. (Including dextran). As the modified probe, those treated for 5 minutes in a boiling water bath and those not treated were used. After hybridization, the sections were washed in 2 × SSC / 50% formamide, 1 × SSC / 50% formamide, 1 × SSC, and 0.5 × SSC at 20 ° C. (37 ° C. for collagen). After drying, digoxigenin labeled hybrids were detected using horseradish peroxidase labeled anti-DIG antibody (Roche). This complex was finally detected using a TSA + amplification kit (NEN). A positive signal corresponds to the activity of alkaline phosphatase. This activity is defined as the activity after 2 hours at room temperature based on the amplification procedure of the TSA kit, and can be seen by precipitation of a tetrazolium salt (using nitroblue tetrazolium / bromochloroindolyl phosphate (NBT / BCIP) as a substrate).
本発明において、mRNAの発現をin situハイブリダイゼーションによって追跡した結果、LOXL遺伝子とLOX遺伝子が、再生皮膚モデル(Mimeskin(R)、Coletica社、リヨン、フランス)中に角質細胞を添加することによって活性化される可能性があることが分かる。(図11)。 In the present invention, as a result of tracing mRNA expression by in situ hybridization, LOXL gene and LOX gene were activated by adding keratinocytes to a regenerated skin model (Mimeskin®, Coleta, Lyon, France). It can be seen that there is a possibility that. (FIG. 11).
LOXLの合成は、トロポエラスチンの合成に付随して(真皮と同等のものに角質細胞を添加して6日後)誘導されている。 The synthesis of LOXL is induced in association with the synthesis of tropoelastin (6 days after adding keratinocytes to the equivalent of the dermis).
またLOX遺伝子も、角質細胞を添加した後、コラーゲンIα1遺伝子(Col1A1)と同時に活性化されている。 The LOX gene is also activated simultaneously with the collagen Iα1 gene (Col1A1) after the addition of keratinocytes.
〔実施例9〕
「成人の繊維芽細胞中におけるLOX遺伝子の発現量低下の実証」
本発明者らは、包皮由来の繊維芽細胞(FF)(幼児由来)5株、及び、腹部の形成外科手術の際に採取した成人の繊維芽細胞(AF)6株(このうち3人の平均年齢は20歳で、残りの3人の平均年齢は60歳である)を用いた。目的の上記3種の遺伝子及びアクチンの発現を、リアルタイムRT−PCR(定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、図12)によって調べた。この方法によれば、(一定とされる)アクチンの発現と比較して遺伝子の発現を正確に定量できる。従って、この遺伝子の発現量の制御を定量できる。
Example 9
“Demonstration of LOX gene expression reduction in adult fibroblasts”
We have 5 strains of fibroblasts derived from foreskin (FF) (from infants) and 6 strains of adult fibroblasts (AF) collected during abdominal plastic surgery (of which 3 The average age is 20 years old, and the average age of the remaining 3 people is 60 years old). The expression of the above three genes of interest and actin were examined by real-time RT-PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, FIG. 12). According to this method, the expression of a gene can be accurately quantified in comparison with the expression of actin (which is assumed to be constant). Therefore, control of the expression level of this gene can be quantified.
図12に示す結果はまず、LOXLmRNAの合成は、成人の繊維芽細胞、特に20歳代の成人の繊維芽細胞において著しくかつ統計上有意に、包皮の繊維芽細胞と比較して70%近く減少しているが、エラスチンmRNAの合成は年齢によって有意な差がないことを示す。弾性組織が劣化して交換されないのであれば、この結果がエラスチン遺伝子の活性の阻害によるものとは思われないので、このデータはエラスチンに関する従来の報告と一致する。 First, the results shown in FIG. 12 show that LOXL mRNA synthesis is significantly and statistically significantly reduced in adult fibroblasts, particularly adult fibroblasts in the 20s, by nearly 70% compared to foreskin fibroblasts. However, the synthesis of elastin mRNA shows no significant difference with age. This data is consistent with previous reports on elastin since this result does not appear to be due to inhibition of the activity of the elastin gene if the elastic tissue is degraded and not exchanged.
AFにおけるLOXmRNAの合成はFFに対して平均40%減少するが、個体差があるため、この変化はあまり重要ではない。 The synthesis of LOX mRNA in AF is reduced by an average of 40% relative to FF, but this change is less important due to individual differences.
全RNAを「SV96 Total RNA Isolation System」キット(プロメガ社、シャルボニエール、フランス)を用いて精製した。精製したRNAをRNase−free water(プロメガ社、シャルボニエール、フランス)100μl中に溶解して測定後、プレートに分注した(96ウェル、各10μl(PCRによる全RNA:5ng/μl))。この実験に用いたプライマーは下記表Iの通りである。 Total RNA was purified using the “SV96 Total RNA Isolation System” kit (Promega, Charbonnier, France). The purified RNA was dissolved in 100 μl of RNase-free water (Promega, Charbonnier, France) and measured, and then dispensed into plates (96 wells, 10 μl each (total RNA by PCR: 5 ng / μl)). The primers used in this experiment are as shown in Table I below.
リアルタイムRT−PCRを、mRNAを含むウェルに対し「Quanti Tect SYBR Green RT−PCR」キット(キアゲン社、フランス)を用いて、増幅サイクルを行うOPTICON社製サーマルサイクラー内で行った。50℃において30分間逆転写(RT)反応を行った後、95℃において15分間保つことによって、逆転写酵素を阻害し、ポリメラーゼを活性化して、得られた相補的DNA(cDNA)を変性させた。その後、連鎖重合(PCR)を50サイクル行った(94℃で15秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間)。1サイクル終了毎に、増幅断片数に比例する蛍光量を読み取った。発現量は、アクチンに対する各遺伝子の発現量の比率で示した。 Real-time RT-PCR was performed on wells containing mRNA in a thermal cycler manufactured by OPTICON using the “Quant Tect SYBR Green RT-PCR” kit (Qiagen, France) for amplification cycles. After carrying out a reverse transcription (RT) reaction at 50 ° C. for 30 minutes and then maintaining at 95 ° C. for 15 minutes, the reverse transcriptase is inhibited, the polymerase is activated, and the resulting complementary DNA (cDNA) is denatured. It was. Thereafter, 50 cycles of chain polymerization (PCR) were carried out (94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds). At the end of each cycle, the amount of fluorescence proportional to the number of amplified fragments was read. The expression level was expressed as the ratio of the expression level of each gene to actin.
前述の研究は弾性繊維の形成におけるLOXLの関与、及び、成人の皮膚におけるその消滅を明らかにするものであるが、本発明の以下の点は、年齢の異なる繊維芽細胞におけるLOXL遺伝子、LOX遺伝子及びエラスチン遺伝子の発現量に関連するものである。 Although the above study reveals the involvement of LOXL in the formation of elastic fibers and its disappearance in adult skin, the following points of the present invention are the LOXL gene and LOX gene in fibroblasts of different ages. And the expression level of the elastin gene.
上記実施例は、LOXL遺伝子及びLOX遺伝子による生成物の合成が、遺伝子レベルで活性化される可能性があることを示すものである。LOXL及びトロポエラスチンのmRNAの合成は、再生皮膚においても同時に活性化されている。LOXL遺伝子及びトロポエラスチン遺伝子を活性化すると、弾性繊維を形成できる。活性成分をスクリーニングすることによって、エラスチン遺伝子及びLOXL遺伝子の発現を同時に再度誘導できる分子を同定し、弾性繊維の形成を刺激できる。 The above examples show that LOXL gene and product synthesis by LOX gene may be activated at the gene level. The synthesis of LOXL and tropoelastin mRNA is simultaneously activated in regenerated skin. When the LOXL gene and the tropoelastin gene are activated, elastic fibers can be formed. By screening active ingredients, it is possible to identify molecules capable of reinducing the expression of the elastin gene and the LOXL gene at the same time, and to stimulate the formation of elastic fibers.
結論として、本発明により、LOXLと弾性繊維とが直接関係していること、再生皮膚における弾性繊維の形成にLOXLが重要であること、及び、機能性弾性繊維が合成されない組織(成人組織、瘢痕)にLOXLが存在しないことが分かる。本発明は特に、再生皮膚、皮膚生検及び人間の皮膚中における機能性弾性繊維の発現を再度誘導することを目的とした、LOXLとエラスチンの合成を同時に誘導できる新規分子を検出するためのスクリーニング方法に関する。 In conclusion, according to the present invention, LOXL and elastic fibers are directly related to each other, LOXL is important for the formation of elastic fibers in regenerated skin, and tissues in which functional elastic fibers are not synthesized (adult tissues, scars). ) Shows that there is no LOXL. The present invention specifically screens for the detection of novel molecules capable of simultaneously inducing the synthesis of LOXL and elastin with the aim of reinducing the expression of functional elastic fibers in regenerated skin, skin biopsy and human skin. Regarding the method.
〔実施例10〕
「LOXL及び/又はエラスチンのメッセンジャーRNAの発現の(例えば、活性を試験する活性成分と接触させて、又は、接触させずに行う定性RT−PCRによる)分析」
活性成分を、1%(v/v)の濃度で、正常な人間の皮膚(幼児の包皮又は成人由来)の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、24ウェル培養プレート中に単層で、既知組成無血清培地(Fibroblast Basal Medium)中で行った。細胞を、例えば1cm2当たり40,000個播種した。コンフルエントになった時点で、細胞を活性成分と有利には24時間接触させた。有利には、並行して、無処理コントロール1種(培地のみ)及びポジティブコントロール3種(1ng/mlのTGF−β、50pg/mlのIL−1α、及び、2%(v/v)のPhytokine(R)(Coletica社、リヨン、フランス))についても、例えば同一の培養プレート中で試験した。
Example 10
"Analysis of LOXL and / or elastin messenger RNA expression (eg, by qualitative RT-PCR, with or without contact with an active ingredient to be tested for activity)"
The active ingredient was tested against fibroblasts from normal human skin (from infant foreskin or adults) at a concentration of 1% (v / v). The culture was performed, for example, in a well-known serum-free medium (Fibroblast Basal Medium) in a single layer in a 24-well culture plate. For example, 40,000 cells were seeded per cm 2 . When confluent, the cells were contacted with the active ingredient, preferably for 24 hours. Advantageously, in parallel, one untreated control (medium only) and three positive controls (1 ng / ml TGF-β, 50 pg / ml IL-1α, and 2% (v / v) Phytokine. (R) (Coretica, Lyon, France) was also tested, for example, in the same culture plate.
あらかじめ1ng/mlのTGF−β、及び、50pg/mlのIL−1αについて試験し、エラスチンmRNA合成の刺激がこの濃度の2種のサイトカインに誘導されることを、mRNA解析、例えば定量RT−PCR(TGF−βについて10回、IL−1αについて6回)によって確認した。活性成分を細胞と接触させた後(例えばその24時間後)に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー(pH7.4)中で洗浄して−80℃において凍結乾燥して保存した。全RNAを(例えばシリカカラムを有する96ウェル抽出キットを用いて)抽出し、96ウェル分光光度計で260nmにおいて測定した(純度の指標:280nmにおけるタンパク質の測定)。RNAを、例えば5ng/μlに希釈する。ワンステップ定性RT−PCRを、アクチン遺伝子、エラスチン遺伝子、LOX遺伝子及びLOXL遺伝子について、例えば初期RNA50ngを用いて96ウェルプレート中で行った。各遺伝子の特異的プライマーは、例えば0.5μMで用いた。 Pre-tested for 1 ng / ml of TGF-β and 50 pg / ml of IL-1α, it was shown that stimulation of elastin mRNA synthesis was induced by two cytokines at this concentration, mRNA analysis, eg quantitative RT-PCR (10 times for TGF-β, 6 times for IL-1α). After contacting the active ingredient with the cells (for example, 24 hours later), the medium was removed, and the cells were washed, for example, in phosphate buffer (pH 7.4) and lyophilized at −80 ° C. and stored. Total RNA was extracted (eg, using a 96-well extraction kit with a silica column) and measured with a 96-well spectrophotometer at 260 nm (purity indicator: protein measurement at 280 nm). The RNA is diluted, for example to 5 ng / μl. One-step qualitative RT-PCR was performed in 96-well plates using, for example, 50 ng of initial RNA for the actin gene, elastin gene, LOX gene and LOXL gene. Specific primers for each gene were used at 0.5 μM, for example.
−センスエラスチン遺伝子:1Ela 5’−GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG−3’(配列番号24);
−アンチセンスエラスチン遺伝子:2Ela 5’−CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG−3’(配列番号25);
−センスLOXL遺伝子:30L1 5’−GAC TTC GGC AAC CTC AAG C−3’(配列番号26);
−アンチセンスLOXL遺伝子:31L1 5’−TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC−3’(配列番号27);
−センスLOX遺伝子:Ox64 5’−ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC−3’(配列番号28);
−アンチセンスLOX遺伝子:Ox65 5’−GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG−3’(配列番号29);
−センスアクチン遺伝子:アクチン U 5’−GTGGGGCGCCCCAGGCACCA−3(配列番号30);
−アンチセンスアクチン遺伝子:D 5’−CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC−3’(配列番号31)
-Sense elastin gene: 1Ela 5'-GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG-3 '(SEQ ID NO: 24);
-Antisense elastin gene: 2Ela 5'-CGA ACT TTG CTG CTG CTG CTT TAG-3 '(SEQ ID NO: 25);
-Sense LOXL gene: 30L1 5'-GAC TTC GGC AAC CTC AAG C-3 '(SEQ ID NO: 26);
-Antisense LOXL gene: 31L1 5'-TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC-3 '(SEQ ID NO: 27);
-Sense LOX gene: Ox64 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3 '(SEQ ID NO: 28);
-Antisense LOX gene: Ox65 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3 '(SEQ ID NO: 29);
-Sense actin gene: actin U 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 (SEQ ID NO: 30);
-Antisense actin gene: D 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 '(SEQ ID NO: 31)
有利には、増幅パラメーターは下記の通りであった。48℃、30分間:94℃、2分間:(94℃、30秒間;60℃、30秒間;68℃、30秒間)をアクチンについて28サイクル、LOXLについて30サイクル、LOXについて32サイクル、及び、エラスチンについて34サイクル:68℃、10分間:14℃、無限。増幅後、産物を、例えば(アクチン増幅産物3μl+エラスチン遺伝子増幅産物5μl+LOX遺伝子増幅産物5μl+LOXL遺伝子増幅産物5μl)の割合で混合した。ローディングバッファー(2μl)を加え、全量(20μl)を、あらかじめ充填しておいたアガロースゲル(インビトロジェン社、フランス)(例えば2%)に載せた。本発明者らは、当業者に公知の方法で発現量を可視化した(例えば、泳動後の試料のバンドを暗室において紫外線下で視覚化し(15分間)、デジタル撮影した)。ゲルの写真を画像解析し、バンドの濃さを定量した(Phoretix1D、フランス)。エラスチン遺伝子、LOX遺伝子及びLOXL遺伝子の発現量を、ネガティブコントロール(無処理)における値に対する百分率で示した。 Advantageously, the amplification parameters were as follows: 48 ° C., 30 minutes: 94 ° C., 2 minutes: (94 ° C., 30 seconds; 60 ° C., 30 seconds; 68 ° C., 30 seconds) 28 cycles for actin, 30 cycles for LOXL, 32 cycles for LOX, and elastin 34 cycles: 68 ° C, 10 minutes: 14 ° C, infinite. After amplification, the products were mixed at a ratio of, for example, (actin amplification product 3 μl + elastin gene amplification product 5 μl + LOX gene amplification product 5 μl + LOXL gene amplification product 5 μl). Loading buffer (2 μl) was added and the entire volume (20 μl) was loaded onto a pre-filled agarose gel (Invitrogen, France) (eg 2%). The present inventors visualized the expression level by a method known to those skilled in the art (for example, the band of the sample after electrophoresis was visualized under ultraviolet light in a dark room (15 minutes) and digitally photographed). Gel photographs were image-analyzed and the intensity of the bands was quantified (Phoretrix 1D, France). The expression levels of elastin gene, LOX gene and LOXL gene are shown as a percentage of the value in the negative control (no treatment).
<結果の解釈>
『「若い」細胞及び「成熟」細胞』
包皮の細胞は、エラスチンをコードするmRNAを成人における平均量と同じレベルの量発現しているが、LOXLをコードするmRNA及びLOXをコードするmRNAの発現量の場合には、包皮における発現量は非常に多いことが分かる。従って、老齢細胞におけるLOXLの発現の減少(その結果としてLOXの発現の減少)を逆に上昇させることができるため、このような活性を有する成分をスクリーニングした。
<Interpretation of results>
"Young" and "mature" cells
Foreskin cells express elastin-encoding mRNA at the same level as the average amount in adults, but in the case of the expression level of mRNA encoding LOXL and mRNA encoding LOX, the expression level in foreskin is You can see that there are so many. Therefore, since the decrease in the expression of LOXL in the aged cells (and consequently the decrease in the expression of LOX) can be increased, the component having such activity was screened.
『活性成分のスクリーニング』
各試験におけるcDNA量をアクチンのcDNA量と比較し、続いてネガティブコントロール(活性成分を含まない)と比較した。予備実験から、エラスチン(Eln)mRNAを約1.3倍増加させ、LOXLのmRNAを約2倍増加させるものが重要であると考えられた。試験した900種以上の分子又は活性抽出物のうち、13種の活性成分が試験した濃度において、かつ、規定した条件下でこの基準を満たしていた。これらの活性成分は、下記表IIの通りである。
"Screening of active ingredients"
The amount of cDNA in each test was compared with the amount of actin cDNA, followed by comparison with a negative control (no active ingredient). From preliminary experiments, it was considered important to increase elastin (Eln) mRNA by about 1.3-fold and increase LOXL mRNA by about 2-fold. Of over 900 molecules or active extracts tested, 13 active ingredients met this criterion at the concentrations tested and under the conditions specified. These active ingredients are as shown in Table II below.
植物を2〜5%(w/w)の割合で、濃度100/0〜0/100の水/(アルコール、グリコール又はポリオール)混合物(エタノール、グリセリン、ブチレングリコール等のグリコール類、キシリトール等)に浸漬して植物抽出物を得た。得られた抽出物をろ過又は蒸留して可溶性画分を回収し、さらに無菌状態でろ過した。化学物質はシグマ社(セントルイス、アメリカ)提供のもので、アルコール又はグリコールで濃度1%に希釈又は分散させて用いた。 Plants in water / (alcohol, glycol or polyol) mixtures (glycols such as ethanol, glycerin and butylene glycol, xylitol, etc.) at a concentration of 2 to 5% (w / w) at a concentration of 100/0 to 0/100 A plant extract was obtained by soaking. The obtained extract was filtered or distilled to recover the soluble fraction, and further filtered under aseptic conditions. The chemical substance was provided by Sigma (St. Louis, USA), and was used after diluting or dispersing to a concentration of 1% with alcohol or glycol.
<結論>
活性成分バンクの活性成分960種のうち13種が、試験条件下で、成熟年齢の成人(この場合のドナーは63歳)の腹部の繊維芽細胞において、LOXL、LOX及びエラスチンをコードする遺伝子のmRNAの合成量を著しく活性化できた。
<Conclusion>
Of the 960 active ingredients in the active ingredient bank, 13 of the genes encoding LOXL, LOX and elastin in the abdominal fibroblasts of mature adults (in this case the donor is 63 years old) under the test conditions The synthesis amount of mRNA could be remarkably activated.
〔実施例11〕
「化粧品用又は皮膚医薬用活性成分の有効性に関する(例えばリアルタイムRT−PCRによる)研究」
スクリーニングの第一段階で選択した活性成分を、0.1%〜5%(v/v)の範囲で濃度を変えて、正常な人間(成人)の皮膚の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、24ウェルプレート中に単層で、既知組成無血清培地(Fibroblast Basal Medium)中で行った。細胞を、例えば1cm2当たり40,000個播種した。活性成分を細胞と接触させた後(24時間後)に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー(pH7.4)中で洗浄して−80℃において凍結乾燥して保存した。試験後、エラスチン、LOXL及びアクチンのmRNA量をmRNA解析、例えばリアルタイムRT−PCRによって評価した。この評価を行うために、これら遺伝子に特有の断片を増幅できるプライマー対として上記のものを用いた(実施例10)。
Example 11
“Research on the effectiveness of cosmetic or dermatological active ingredients (eg by real-time RT-PCR)”
The active ingredients selected in the first stage of the screening were tested against normal human (adult) skin fibroblasts at varying concentrations ranging from 0.1% to 5% (v / v). Culturing was performed, for example, in a well-known serum-free medium (Fibroblast Basal Medium) in a single layer in a 24-well plate. For example, 40,000 cells were seeded per cm 2 . After contacting the active ingredient with the cells (after 24 hours), the medium was removed, and the cells were washed, for example, in phosphate buffer (pH 7.4) and lyophilized at -80 ° C and stored. After the test, the amounts of elastin, LOXL and actin mRNA were evaluated by mRNA analysis, for example, real-time RT-PCR. In order to perform this evaluation, the above-mentioned primer pairs that can amplify fragments specific to these genes were used (Example 10).
RNAは、(例えばシリカカラムを有する96ウェル抽出キットを用いて)抽出して96ウェル分光光度計で260nmにおいて測定した後、希釈した(例えば5ng/μl)。RT−PCR反応(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)を、「Opticon」システム(MJ Research社)を用いた定量リアルタイムRT−PCRによって行った。有利には、ウェルに添加した反応混合液(50μl)は、各試料について下記の通りであった:
−濃度5ng/μlのRNA 10μl、
−様々に標識した所望の特異的プライマー、
−反応混合液(キアゲン社、2×「QuantiTect SYBR Green RT−PCR master mix」(MgCl25mM含有)25μl+「QuantiTect RTmix」0.5μl)、標識SYBR Green Iを伸長過程においてDNA2本鎖に挿入した。
RNA was extracted (eg, using a 96-well extraction kit with a silica column), measured with a 96-well spectrophotometer at 260 nm, and then diluted (eg, 5 ng / μl). RT-PCR reaction (reverse transcription polymerase chain reaction) was performed by quantitative real-time RT-PCR using the “Opticon” system (MJ Research). Advantageously, the reaction mixture (50 μl) added to the wells was as follows for each sample:
-10 μl of RNA at a concentration of 5 ng / μl,
Various desired labeled specific primers,
-Reaction mixture (Qiagen, 2 x "QuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix" (containing 5 mM MgCl 2 ) 25 μl + “QuantiTect RTmix” 0.5 μl), labeled SYBR Green I was inserted into the DNA double strand during the extension process .
「有利には、RT−PCRは下記の条件で行った」
逆転写:50℃で30分間、その後、95℃で15分間。
PCR反応:(94℃、15秒間;60℃、30秒間;72℃、30秒間)を50サイクル。
コンタミネーションがないことの確認、及び、増幅産物の純度の確認は、例えば、増幅PCR産物の融解曲線によって行った。ダブルピーク又は異常な融解温度を示す産物は除去した。
“Advantageously, RT-PCR was performed under the following conditions”
Reverse transcription: 30 minutes at 50 ° C, then 15 minutes at 95 ° C.
PCR reaction: 50 cycles of (94 ° C., 15 seconds; 60 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 30 seconds).
Confirmation of the absence of contamination and confirmation of the purity of the amplified product were performed by, for example, a melting curve of the amplified PCR product. Products showing double peaks or unusual melting temperatures were removed.
「分析及び計算方法」
増幅されたDNAの中に組み込まれた蛍光の量を、PCRサイクルを行う間連続的に測定した。これにより、PCRサイクル数に対する蛍光量の曲線が得られ、増幅されたDNAの相対量を調べることができた。
“Analysis and Calculation Methods”
The amount of fluorescence incorporated into the amplified DNA was measured continuously during the PCR cycle. Thereby, a curve of the fluorescence amount with respect to the number of PCR cycles was obtained, and the relative amount of the amplified DNA could be examined.
細胞数を考慮するために、上記の結果を全て、ハウスキーピング遺伝子として用いた≪アクチン≫シグナルと比較した。実験から、C(T)の測定閾値(=サイクル閾値)はT=0.05〜0.01の間に固定され、任意の測定単位は、各遺伝子について以下の式により計算した。
Sgene≪x≫=107×(1/2)C(T)gene≪x≫
C(T)gene≪x≫は、gene≪x≫のサイクル閾値が0.01〜0.05となるために必要なサイクル数を表わす。
調べたい遺伝子についてのこの値を、以下の比率により≪アクチン≫シグナルと比較した。
R=Sgene≪x≫/Sアクチン
この比率を、処理した試料と未処理の試料とで比較した。≪x≫はLOXL遺伝子又はエラスチン遺伝子である。
All of the above results were compared to the << actin >> signal used as a housekeeping gene to take into account the cell number. From the experiment, the measurement threshold value (= cycle threshold value) of C (T) was fixed between T = 0.05 and 0.01, and an arbitrary measurement unit was calculated by the following formula for each gene.
Sgene << x >> = 10 7 × (1/2) C (T) gene << x >>
C (T) gene << x >> represents the number of cycles necessary for the cycle threshold of gene << x >> to be 0.01 to 0.05.
This value for the gene to be examined was compared to the << actin >> signal by the following ratio.
R = Sgene << x >> / S actin This ratio was compared between the treated and untreated samples. << x >> is a LOXL gene or an elastin gene.
<結果>
選択した活性成分のうち2種についての結果を例として表IIIに示す。
<Result>
The results for two of the selected active ingredients are shown in Table III as examples.
<結論>
選択した活性成分は、成熟年齢の成人(この場合のドナーは63歳)の腹部の繊維芽細胞において、LOXL、LOX及びエラスチンをコードする遺伝子のmRNAの合成量を活性化できた。この研究によって、選択した各活性成分の最適な使用濃度を決定することができた。
<Conclusion>
The selected active ingredient was able to activate the synthesis amount of mRNA of genes encoding LOXL, LOX and elastin in the abdominal fibroblasts of adults of mature age (in this case, the donor was 63 years old). This study allowed us to determine the optimal use concentration for each selected active ingredient.
実施例1〜11について:当業者は、本明細書に記載した組成物(処方)を変化させた組成物を作る際に、これらの実施例を見れば適切な方法が分かるであろう。 For Examples 1-11: Those skilled in the art will know suitable methods for making compositions in which the compositions (formulations) described herein are varied.
〔実施例12〕
「水中油エマルション型の化粧品又は医薬品の処方における本発明の生成物の使用」
<処方12a>
A 水 qsp100
ブチレングリコール 2
グリセリン 3
ジヒドロキシセチルリン酸ナトリウム、 2
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル
B ステアリン酸グリコールSE 14
トリイソノナオイン 5
(triisononaoine)
ヤシ油脂肪酸オクチル 6
C pH5.5に調節した 2
ブチレングリコール、
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
D 本発明の生成物 0.01〜10%
Example 12
"Use of the product of the invention in the formulation of an oil-in-water emulsion type cosmetic or pharmaceutical"
<Prescription 12a>
A water qsp100
Butylene glycol 2
Glycerin 3
Sodium dihydroxycetyl phosphate, 2
Isopropyl hydroxycetyl ether B glycol stearate SE 14
Triisononaoin 5
(Triisononaoine)
Palm oil fatty acid octyl 6
C adjusted to pH 5.5 2
Butylene glycol,
Methylparaben,
Ethylparaben, propylparaben D Product of the invention 0.01-10%
<処方12b>
A 水 qsp100
ブチレングリコール 2
グリセリン 3
ポリアクリルアミド、 2.8
イソパラフィン、ラウレス−7
B ブチレングリコール、 2
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン;
2
フェノキシエタノール、
メチルパラベン、
プロピルパラベン、
ブチルパラベン、
エチルパラベン 0.5
ブチレングリコール
D 本発明の生成物 0.01〜10%
<Prescription 12b>
A water qsp100
Butylene glycol 2
Glycerin 3
Polyacrylamide, 2.8
Isoparaffin, Laureth-7
B Butylene glycol, 2
Methylparaben,
Ethylparaben, propylparaben;
2
Phenoxyethanol,
Methylparaben,
Propylparaben,
Butyl paraben,
Ethylparaben 0.5
Butylene glycol D Product of the invention 0.01-10%
<処方12c>
A カルボマー 0.50
プロピレングリコール 3
グリセリン 5
水 qsp100
B ヤシ油脂肪酸オクチル 5
ビサボロール 0.30
ジメチコン 0.30
C 水酸化ナトリウム 1.60
D フェノキシエタノール、 0.50
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
E 香料 0.30
F 本発明の生成物 0.01〜10%
<Prescription 12c>
A Carbomer 0.50
Propylene glycol 3
Glycerin 5
Water qsp100
B Palm oil fatty acid octyl 5
Bisabolol 0.30
Dimethicone 0.30
C Sodium hydroxide 1.60
D Phenoxyethanol, 0.50
Methylparaben,
Propylparaben, butylparaben,
Ethylparaben E Fragrance 0.30
F Product of the invention 0.01-10%
〔実施例13〕
「油中水型の処方における本発明の生成物の使用」
A PEG30−ジポリヒドロキシステアリン酸 3
カプリン酸トリグリセリド 3
オクタン酸セテアリル 4
アジピン酸ジブチル 3
ブドウ種子油 1.5
ホホバ油 1.5
フェノキシエタノール、 0.5
メチルパラベン、プロピルパラベン、
ブチルパラベン、エチルパラベン
B グリセリン 3
ブチレングリコール 3
硫酸マグネシウム 0.5
EDTA 0.05
水 qsp100
C シクロメチコン 1
ジメチコン 1
D 香料 0.3
E 本発明の生成物 0.01〜10%
Example 13
"Use of products of the invention in water-in-oil formulations"
A PEG30-dipolyhydroxystearic acid 3
Capric acid triglyceride 3
Cetearyl octoate 4
Dibutyl adipate 3
Grape seed oil 1.5
Jojoba oil 1.5
Phenoxyethanol, 0.5
Methylparaben, propylparaben,
Butylparaben, ethylparaben B Glycerin 3
Butylene glycol 3
Magnesium sulfate 0.5
EDTA 0.05
Water qsp100
C Cyclomethicone 1
Dimethicone 1
D Fragrance 0.3
E Product of the invention 0.01-10%
〔実施例14〕
「シャンプー又はボディソープ状の処方における本発明の生成物の使用」
A キサンタンガム 0.8
水 qsp100
B ブチレングリコール、 0.5
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、 0.5
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
C クエン酸 0.8
D ラウレス硫酸ナトリウム 40.0
E 本発明の生成物 0.01〜10%
Example 14
"Use of the products of the invention in shampoo or body soap formulations"
A Xanthan gum 0.8
Water qsp100
B Butylene glycol, 0.5
Methylparaben,
Ethylparaben, propylparaben phenoxyethanol, 0.5
Methylparaben,
Propylparaben, butylparaben,
Ethylparaben C citric acid 0.8
D Sodium laureth sulfate 40.0
E Product of the invention 0.01-10%
〔実施例15〕
「口紅等の無水製品状の処方における本発明の生成物の使用」
A ミネラルワックス 17.0
イソステアリン酸イソステアリル 31.5
プロピレングリコールジペラルゴン 2.6
(propylene glycol dipelargonate)
イソステアリン酸プロピレングリコール 1.7
PEG−8ミツロウ 3.0
水添パーム核脂肪酸グリセリド、 3.4
水添パーム油脂肪酸グリセリド
ラノリン油 3.4
ゴマ油 1.7
乳酸セチル 1.7
鉱物油、ラノリンアルコール 3.0
B ヒマシ油 qsp100
二酸化チタン 3.9
CI 15850:1 0.616
CI 45410:1 0.256
CI 19140:1 0.048
CI 77491 2.048
C 本発明の生成物 0.01〜5%
Example 15
"Use of products of the present invention in formulations of anhydrous products such as lipsticks"
A mineral wax 17.0
Isostearyl isostearate 31.5
Propylene glycol dipelargon 2.6
(Propylene glycol dipelargonate)
Propylene glycol isostearate 1.7
PEG-8 beeswax 3.0
Hydrogenated palm kernel fatty acid glycerides, 3.4
Hydrogenated palm oil fatty acid glyceride Lanolin oil 3.4
Sesame oil 1.7
Cetyl lactate 1.7
Mineral oil, lanolin alcohol 3.0
B castor oil qsp100
Titanium dioxide 3.9
CI 15850: 1 0.616
CI 45410: 1 0.256
CI 19140: 1 0.048
CI 77491 2.048
C Product of the invention 0.01-5%
〔実施例16〕
「水性ゲル(アイライナー、痩身剤等)の処方における本発明の生成物の使用」
A 水 qsp100
カルボマー 0.5
ブチレングリコール 15
フェノキシエタノール、 0.5
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
B 本発明の生成物 0.01〜10%
Example 16
“Use of products of the present invention in the formulation of aqueous gels (eyeliners, slimming agents, etc.)”
A water qsp100
Carbomer 0.5
Butylene glycol 15
Phenoxyethanol, 0.5
Methylparaben,
Propylparaben, butylparaben,
Ethylparaben B Product of the invention 0.01-10%
〔実施例17〕
「LOXLを含有する医薬品の処方の調製」
<処方17a>錠剤の調製
A 賦形剤 g単位、1錠あたり
乳糖 0.359
スクロース 0.240
B LOXL抽出物* 0.001〜0.1
(LOXL抽出物*は、例えば実施例2に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。)
Example 17
“Preparation of prescriptions for pharmaceuticals containing LOXL”
<Prescription 17a> Preparation of tablets A excipient g unit, 1 tablet Lactose 0.359
Sucrose 0.240
B LOXL extract * 0.001-0.1
(LOXL extract * is obtained, for example, by extraction as described in Example 2 and then drying.)
<処方17b>軟膏の調製
A 賦形剤
低密度ポリエチレン 5.5
流動パラフィン qsp100
B LOXL抽出物* 0.001〜0.1
(LOXL抽出物*は、例えば実施例2に記載したように抽出し、その後必要に応じて乾燥させることによって得られる。)
<Prescription 17b> Preparation of ointment A Excipient Low density polyethylene 5.5
Liquid paraffin qsp100
B LOXL extract * 0.001-0.1
(The LOXL extract * is obtained, for example, by extracting as described in Example 2 and then drying if necessary.)
<処方17c>注射剤の処方の調製
A 賦形剤
等張食塩水 5ml
B LOXL抽出物* 0.001〜0.1g
(LOXL抽出物*は、例えば実施例2に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。)
A相とB相は別々にアンプルで包み、使用前に混合する。
<Prescription 17c> Preparation of injection formulation A excipient isotonic saline 5 ml
B LOXL extract * 0.001-0.1g
(LOXL extract * is obtained, for example, by extraction as described in Example 2 and then drying.)
Wrap Phase A and Phase B separately in ampoules and mix before use.
〔実施例18〕
「本発明の生成物を含む製剤の化粧品としての許容性の評価」
実施例10及び11で得られた化合物を10%の割合で0.5%キサンタンガムに混合したものの毒性を、ウサギにおける眼刺激試験、ラットに1回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験、及び、モルモットにおける感作性試験によって調べた。
Example 18
"Evaluation of cosmetic acceptability of the preparation containing the product of the present invention"
The toxicity of the compound obtained in Examples 10 and 11 mixed with 0.5% xanthan gum at a rate of 10% was confirmed to be abnormal when an oral irritation test was conducted in a rabbit and once administered orally to a rat. It was examined by a test and a sensitization test in a guinea pig.
『ウサギの皮膚における一次刺激の評価』
上記製剤を、ウサギ3匹の皮膚に、≪皮膚に対する急性刺激/腐食性≫の研究に関するOECD推奨の方法に従って、希釈せずに0.5mlずつ投与した。
“Evaluation of primary irritation in rabbit skin”
The above formulations were administered in 0.5 ml aliquots to the skin of 3 rabbits according to the OECD recommended method for the study of “Acute Irritation / Corrosion to Skin”.
生成物を、1982年2月21日のフランス共和国の公式機関紙(“JORF”)で公表された、1982年2月1日の決議の中で定義された基準に従って分類した。 The products were classified according to the criteria defined in the February 1, 1982 resolution published in the official newspaper of the French Republic on February 21, 1982 ("JORF").
上記試験結果から、実施例11で得られた物質を含有する製剤は、皮膚に対して刺激がないものとして分類されることが分かる。 From the above test results, it can be seen that the preparation containing the substance obtained in Example 11 is classified as having no irritation to the skin.
「ウサギにおける眼刺激試験」
上記製剤を純粋な状態で、≪眼に対する急性刺激/腐食性≫の研究に関して1987年2月24日にOECD指令書405番によって公式に推奨されている方法に従い、0.1mlを1回でウサギ3匹の眼中に滴下した。
この試験の結果から、これらの製剤は、純粋な状態で又は希釈せずに使用した場合、91/326のEECの意味において、眼に対して刺激がないものとして考えられる。
"Eye irritation test in rabbits"
In the pure state of the above formulation according to the method officially recommended by the OECD Directive 405 on February 24, 1987 for the study of << acute eye irritation / corrosion >> It was dripped in 3 eyes.
From the results of this study, these formulations are considered non-irritating to the eye in the sense of EEC 91/326 when used in the pure state or undiluted.
「ラットに1回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験」
上記製剤を、1987年2月24日のOECD指令書401番から着想して化粧品に適用したプロトコールに従って、雄ラット5匹及び雌ラット5匹に、5g/体重1kgの量を1回で経口投与した。
LD0及びLD50は、5000mg/kg以上であることが分かっている。従って、試験した製剤は、経口摂取が危険な製剤には分類されない。
"Confirmation test that there is no abnormal toxicity after single oral administration to rats"
The above formulation was orally administered in a single dose of 5 g / kg body weight to 5 male rats and 5 female rats according to the protocol applied to cosmetics inspired by OECD Directive No. 401 of February 24, 1987 did.
LD0 and LD50 have been found to be 5000 mg / kg or higher. Therefore, the tested formulations are not classified as formulations that are dangerous for oral consumption.
『モルモットにおける潜在的皮膚感作性試験』
上記製剤に対して、OECD406番の指令書に従ったプロトコールであるMagnusson−Kligmann極大試験を行った。
これらの製剤は、皮膚との接触において感作性がないものとして分類される。
"Potential skin sensitization test in guinea pigs"
The above-mentioned preparation was subjected to a Magnusson-Kligmann maximum test, which is a protocol according to the OECD No. 406 directive.
These formulations are classified as non-sensitizing on contact with the skin.
記載した配列の解説
配列番号1:ヒトタンパク質LOXLのペプチド配列である。
配列番号2:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
配列番号3:配列番号1に記載したタンパク質LOXLをコードするヒト遺伝子のプロモーターをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
配列番号4:ヒトタンパク質トロポエラスチンのペプチド配列である。
配列番号5:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
配列番号6:ヒトタンパク質LOXのペプチド配列である。
配列番号7:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
Description of described sequences SEQ ID NO: 1: Peptide sequence of human protein LOXL.
SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of cDNA encoding the human protein LOXL described in SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 is the nucleotide sequence of cDNA encoding the promoter of the human gene encoding the protein LOXL described in SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 4: Peptide sequence of human protein tropoelastin.
SEQ ID NO: 5: nucleotide sequence of cDNA encoding the human protein tropoelastin described in SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 6 is the peptide sequence of human protein LOX.
SEQ ID NO: 7: nucleotide sequence of cDNA encoding the human protein LOX described in SEQ ID NO: 6.
二本鎖DNAプローブに関しては
配列番号8:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号9:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号10:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号11:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号12:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号13:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号14:ヒトタンパク質コラーゲンIα1LをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号15:ヒトタンパク質コラーゲンIα1LをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
Regarding the double-stranded DNA probe, it is a sense primer for DNA encoding human protein LOXL described in SEQ ID NO: 8: SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 9: antisense primer of DNA encoding human protein LOXL described in SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 10: sense primer for DNA encoding the human protein tropoelastin described in SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 11: antisense primer of DNA encoding human protein tropoelastin described in SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 12: sense primer for DNA encoding human protein LOX set forth in SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 13: antisense primer of DNA encoding human protein LOX described in SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 14: sense primer for DNA encoding human protein collagen Iα1L
SEQ ID NO: 15: antisense primer for DNA encoding human protein collagen Iα1L
融合遺伝子GSTに関しては
配列番号16:融合遺伝子GST S355−D415のDNAのセンスプライマーである。
配列番号17:融合遺伝子GST S355−D415のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号18:融合遺伝子GST G128−L212のDNAのセンスプライマーである。
配列番号19:融合遺伝子GST G128−L212のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号20:融合遺伝子GST V228−S279のDNAのセンスプライマーである。
配列番号21:融合遺伝子GST V228−S279のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号22:融合遺伝子GST D306−N373のDNAのセンスプライマーである。
配列番号23:融合遺伝子GST D306−N373のDNAのアンチセンスプライマーである。
Regarding the fusion gene GST, it is a sense primer of DNA of SEQ ID NO: 16: fusion gene GST S355-D415.
Sequence number 17: It is an antisense primer of DNA of fusion gene GST S355-D415.
SEQ ID NO: 18: sense primer for DNA of fusion gene GST G128-L212
Sequence number 19: It is an antisense primer of DNA of fusion gene GST G128-L212.
SEQ ID NO: 20: sense primer for DNA of fusion gene GST V228-S279
SEQ ID NO: 21: antisense primer for DNA of fusion gene GST V228-S279
SEQ ID NO: 22: sense primer for DNA of fusion gene GST D306-N373
Sequence number 23: It is an antisense primer of DNA of fusion gene GST D306-N373.
PCRプライマーに関しては
配列番号24:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号25:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするmRNAのRT−PCRアンチセンスプライマーである。
配列番号26:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号27:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするmRNAの配列のアンチセンスプライマーである。
配列番号28:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号29:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするmRNAのRT−PCRアンチセンスプライマーである。
配列番号30:ヒトタンパク質アクチンをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号31:ヒトタンパク質アクチンをコードするmRNAのRT−PCRアンチセンスプライマーである。
The PCR primer is an RT-PCR sense primer for mRNA encoding the human protein tropoelastin described in SEQ ID NO: 24: SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 25: RT-PCR antisense primer for mRNA encoding the human protein tropoelastin described in SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 26: RT-PCR sense primer for mRNA encoding human protein LOXL described in SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 27: antisense primer for mRNA sequence encoding human protein LOXL described in SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 28: RT-PCR sense primer for mRNA encoding human protein LOX described in SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 29: RT-PCR antisense primer for mRNA encoding the human protein LOX described in SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 30: RT-PCR sense primer for mRNA encoding human protein actin.
SEQ ID NO: 31: RT-PCR antisense primer for mRNA encoding human protein actin.
融合遺伝子GSTに関しては
配列番号32:融合遺伝子GST 517−581のDNAのセンスプライマーである。
配列番号33:融合遺伝子GST 517−581のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号34:融合遺伝子GST 664−720のDNAのセンスプライマーである。
配列番号35:融合遺伝子GST 664−720のDNAのアンチセンスプライマーである。
Regarding the fusion gene GST, it is a sense primer of DNA of SEQ ID NO: 32: fusion gene GST 517-581.
Sequence number 33: It is an antisense primer of DNA of fusion gene GST 517-581.
SEQ ID NO: 34: sense primer for DNA of fusion gene GST 664-720
SEQ ID NO: 35: antisense primer for DNA of fusion gene GST 664-720
Claims (12)
機能的弾性繊維の形成を刺激するための化粧組成物。 That promotes the activity or expression of lysyl oxidase similar isoform (LOXL), a dill fruit concentration 100 / 0-0 / 100 water / (alcohol, glycol or polyol) extract obtained by immersing the mixture extracted cardamom A substance selected from the group consisting of a product, asafetida gum, and ethyl decadienoate,
A cosmetic composition for stimulating the formation of functional elastic fibers.
請求項1に記載の化粧組成物。 The extract of Inondo fruit is an extract obtained by immersing Inondo fruit in a water / (alcohol, glycol or polyol) mixture having a concentration of 100/0 to 0/100 at a rate of 2 to 5% (w / w). is there,
The cosmetic composition according to claim 1.
請求項1または2に記載の化粧組成物。 The concentration of the extract of Inondo fruit is 0.01% to 10% (v / v) in the total composition;
The cosmetic composition according to claim 1 or 2.
請求項3に記載の化粧組成物。 The concentration of the extract of Inondo fruit is 0.1% to 5% (v / v) in the total composition;
The cosmetic composition according to claim 3.
請求項1〜4のいずれか1項に記載の化粧組成物。 The expression of LOXL is either the expression of a nucleotide sequence encoding LOXL or the expression of a peptide sequence that forms part of the protein LOXL, said peptide sequence being selected from SEQ ID NO: 1.
Cosmetic composition of any one of Claims 1-4.
請求項1〜5のいずれか1項に記載の化粧組成物。 The substance is combined with a substance that stimulates the expression of the protein elastin to stimulate the expression of the protein elastin or to stimulate the formation of elastic fibers.
The cosmetic composition according to any one of claims 1 to 5.
請求項1〜6のいずれか1項に記載の化粧組成物。 The substance is a region that binds to at least a part of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of the promoter (Pr) of the human LOXL gene, or at least one of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of the promoter (Pr) of the human LOXL gene. Including regions that alter the expression of proteins that bind to the region,
The cosmetic composition according to any one of claims 1 to 6.
請求項1〜7のいずれか1項に記載の化粧組成物。 To induce new formation of elastic fibers in the tissue, to stimulate the elasticity of the resulting tissue, and to reduce skin wrinkles,
The cosmetic composition according to any one of claims 1 to 7.
請求項1〜8のいずれか1項に記載の化粧組成物。 To resist tissue sagging, or to resist tissue sagging observed during aging or sun exposure, or to increase the density of the extracellular matrix, or to tighten subcutaneous tissue To reduce skin wrinkles or to exert an anti-wrinkle effect, to improve scars and keloid wounds due to malnutrition, or to improve the quality of scar tissue and the appearance of scars To resist or to stretch
The cosmetic composition according to any one of claims 1 to 8.
請求項1〜9のいずれか1項に記載の化粧組成物。 In addition, including cosmetically acceptable excipients,
The cosmetic composition according to any one of claims 1 to 9.
機能的弾性繊維の形成を刺激するための医薬組成物。 That promotes the activity or expression of lysyl oxidase similar isoform (LOXL), a dill fruit concentration 100 / 0-0 / 100 water / (alcohol, glycol or polyol) extract obtained by immersing the mixture extracted cardamom A substance selected from the group consisting of a product, asafetida gum, and ethyl decadienoate,
A pharmaceutical composition for stimulating the formation of functional elastic fibers.
請求項11に記載の医薬組成物。
Further comprising a pharmaceutically acceptable excipient,
The pharmaceutical composition according to claim 11.
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