JP6055777B2

JP6055777B2 - クレアチン組成物水溶液の製造方法

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Inventors: 広久西澤; 治彦末岡
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Description

本発明は、クレアチン組成物水溶液の製造方法に関する。

クレアチン（１−メチルグアニジノ酢酸）若しくはクレアチン類似体（以下、これらを総称して「クレアチン組成物」と称する。）は、ＩＯＣ（国際オリンピック委員会）で使用禁止薬物に入っておらず、１９９２年のバルセロナオリンピックで公式に主に経口摂取にて使用され、服用したスポーツ選手が好成績を収めたことで、運動パフォーマンスの向上に効果的なアミノ酸組成物として知られるようになった。また、近年ではＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）等の難病疾患の治療を目的とした希少医薬品としての治験も実施されている。

更に、１９９８年には、筑波大学の呼吸器内科グループが、実験用モルモットを使用したクレアチン組成物による喘息抑制試験の有効性を発表した（非特許文献１参照）。翌１９９９年には、同グループが、日本の気道過敏性研究会にて、喘息罹患モルモットの実験の他にステップ２以上の喘息患者７例に、クレアチンを使用することにより、ヒトに対する喘息抑制の有効性を確認している（非特許文献２参照）。また、２００３年にノムラ他が発表したブリティッシュジャーナルオブファーマコロジー，２００３年，１３９巻，７１５−７２０頁（非特許文献３）には、クレアチンに抗炎症作用があることを見出し、喘息に有効であることが確認されている。非特許文献１乃至３に記載の喘息抑制実験では、本願出願人らが開発したクレアチン含有飲料（例えば、特許第３５９５３７３号公報。該公報を特許文献１とする。）が使用されている。そしてまた、米国特許第６０９３７４６号明細書（特許文献２）でもクレアチン含有喘息抑制剤が開示されている。

ここで、クレアチン組成物の製品剤型は、粉末、錠剤、カプセル、懸濁液及び水溶液等があり、中でもクレアチン組成物の販売市場においては、クレアチン粉末が最も多く使用され、該粉末を直接摂取するか、水やジュースに該組成物を溶解して摂取する方法が実施されている。このような摂取方法が一般化している中で、ブラジルのサンパウロ大学のグループによって、クレアチン摂取により、実験用マウスの喘息を悪化させるという報告が発表された（非特許文献４参照）。

クレアチンという同一物質を使用して、非特許文献１乃至３並びに特許文献２に記載されているような喘息を抑制するということ、もう一方で、非特許文献４に記載されているような喘息を悪化させるということが公式に論文として発表されている。

元来、クレアチンは、肉類や魚類に含有されている物質であり、肉や魚を大量に摂取した場合に、グラム単位のクレアチンを摂取することは可能である。しかしながら、食生活にて摂取したクレアチンが原因で、喘息が悪化したという報告は無いので、クレアチン自体が喘息誘発若しくは悪化の原因だとは考えにくい。

そして、市販されているクレアチンは、化学合成品が主であり、クレアチンを製造するまでの合成過程においては、クレアチンの他に、微量ではあるが、クレアニチン、ナトリウム塩、シアン化合物（ジヒドロトリアジン、ジシアンジアミド等）等の不純物が含有されている。ここで、これらの不純物が喘息を誘発若しくは悪化させる原因を引き起こしているのではないかということが推測された。そして、更に前記シアン化合物が、生体内の胃酸等の酸性物質と反応して、シアン化水素ガスが発生しているのではないかということが懸念されたが、クレアチン組成物の販売メーカーからは、クレアチンを摂取する際の注意においてこの点については全く指摘若しくは示唆がされていない。

ところで、特許文献１に記載されているようなクレアチン含有飲料を製造する場合、最終工程においては１００℃以上の高温殺菌が実施されている。一方、通常の場合、上述したようにクレアチン粉末は、直接経口摂取して、常温（１０〜３５℃程度）若しくは冷温（１０℃以下）の水やジュースなどと一緒に摂取する、又は常温（１０〜３５℃程度）若しくは冷温（１０℃以下）の水やジュースなどに該クレアチン粉末を溶解させて摂取している。上述したように、特許文献１に記載のクレアチン飲料を使用した場合には、非特許文献１乃至３に記載されているような喘息抑制効果が現れていること、逆に非特許文献４の報告では、クレアチンを常温の水などで摂取していることを考慮すると、クレアチンを一緒に摂取する若しくは溶解させるときの水若しくはジュースなどの温度により、シアン化水素ガスの発生の有無が関係しているのではないかと推測された。

特許第３５９５３７３号公報米国特許第６０９３７４６号明細書

ワイ．ウチダ他（Y.Uchida et al），アメリカンジャーナルオブレスピラトリーアンドクリティカルケアメディシン（American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine），１５７巻（Vol.37），３号（Number 3），Ａ８２７頁，１９９８年．野村他，"モルモット喘息モデルにおけるクレアチン有効性についての検討"，第３５回気道過敏性研究会予稿集，２９頁，１９９９年３月６日．ノムラ，エー他（Nomura,A et al），ブリティッシュジャーナルオブファーマコロジー（Br. J. Pharmacol.），２００３年，１３９巻，７１５−７２０頁．ホドルフォピー．ヴィエイラ他（RodlfoP. Vieira et al），アメリカンジャーナルオブレスピラトリーセルアンドモレキュラーバイオロジー（American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology），３７巻（Vol.37），６６０−６６７頁，２００７年．

以上の事情に鑑み、本発明の目的は、クレアチン組成物水溶液の製造方法を提供することにある。

本発明に係るクレアチン組成物水溶液の製造方法の上記目的は、常温若しくは冷温の飲料と混合させて経口摂取するクレアチン組成物水溶液の製造方法であって、水を８０〜１００℃に加温する段階と、製品状態のクレアチン組成物を１秒〜１０分かけて、前記加温した水に溶解させてクレアチン組成物水溶液を調製する段階とを備え、前記クレアチン組成物が、クレアチン一水和物、クレアチン無水物、クレアチンリン酸塩、クレアチンピルビン酸塩、クレアチンクエン酸塩のうちいずれか１つの結晶体粉末又はそれらを２つ以上組み合わせて成るものであり、前記クレアチン組成物水溶液を常温若しくは冷温の前記飲料と混合させて経口摂取したときの、シアン化合物系の不純物と、胃酸の主成分である塩酸との反応によるシアン化水素ガスの発生が抑えられたことにより、効果的に達成される。

更に、本発明に係るクレアチン組成物水溶液の製造方法は、前記飲料が、前記クレアチン組成物水溶液を調製する際に用いた水と同じ、若しくは異なる水であることにより、或いは前記水が、水道水、蒸留水、ミネラルウォータ類から選択されることにより、或いは前記飲料がジュース、スポーツドリンク、牛乳若しくは乳製品類、お茶類、コーヒー、炭酸飲料、又は清涼飲料水のうちいずれかから選択されることにより、より効果的に達成される。

本クレアチン組成物水溶液の製造方法により、クレアチンの有効成分を損なうことなく、また、シアン化水素ガスの発生の懸念を考慮することなく、安全且つ簡便にクレアチン組成物を摂取することが可能になった。

更に、本発明のクレアチン組成物によりシアン化合物系の不純物の懸念が無くなった。

本発明のクレアチン組成物水溶液の製造方法に係る実施形態を示すフローチャートである。本発明の摂取方法にて使用するクレアチン組成物に係るフローチャートである。本願実施例におけるシアン化水素ガス検知管の様子を示す画像である。

本発明に係るクレアチン組成物水溶液の製造方法（以下、「本願製造方法」とする。）について、説明する。

先ず、本願製造方法にて使用する飲料は、水、ジュース、市販のスポーツドリンク、牛乳若しくは乳製品類、お茶類、コーヒー類、炭酸飲料、清涼飲料水などあらゆる飲料に適用が可能であるが、水が望ましい。また、水も蒸留水、水道水、ミネラルウォータ類などから選択される。ここで言うミネラルウォータ類とは、農林水産省（日本）が定める「ミネラルウォータ組成物（容器入り飲用水）の品質表示ガイドライン」に則ったもの又は諸外国においては前記ガイドラインのような規定に沿ったものを言う。ちなみに、水の硬度は特に限定は無い。水を使用する場合、そのまま使用しても構わないが、適宜アルカリ規定液などを添加したり、アルカリイオン浄水器などに水を通したものを使用しても良い。

次に、本願製造方法にて使用するクレアチン組成物について、説明する。先ず、本願で言うクレアチン組成物とは、クレアチン結晶体粉末を言う。更に、本願で言うクレアチン結晶体粉末とは、クレアチン無水物、クレアチン一水和物、クレアチン無水物及びクレアチン一水和物の混合物、クレアチンリン酸塩、クレアチンピルビン酸塩、クレアチンクエン酸塩、クレアチンマレイン酸エステル、クレアチンマレイン酸塩、クレアチンメチルエステル、クレアチンエチルエステル、クレアチンリン酸エステル、クレアチン硝酸エステル、クレアチン硫酸エステル、クレアチンロイシナート、グルコン酸クレアチン、シクロクレアチンなどあらゆるクレアチン化合物の結晶体粉末、更にはクレアチン類似体の結晶体粉末などが考えられる。

そして、本発明に係るクレアチン組成物水溶液の製造方法を図１のフローチャートを基に説明する。ここではクレアチン組成物として、クレアチン一水和物のクレアチン結晶体粉末を使用した場合を想定する。

先ず、水を８０〜１００℃（１気圧）に加温する（ステップＳ１）。ここで、水にアルカリ規定液などを添加する場合は加温する前に添加しておく。ここで言うアルカリ規定液とは、クレアチン組成物を溶解させる水若しくは飲料のｐＨ（水素イオン濃度）が、７〜１０にするためのものである。アルカリ規定液の種類は、経口摂取の際、人体に影響の少ない弱塩基性物質（例えば、炭酸ソーダ水溶液等）の水溶液であれば特に限定はなく、濃度も特に限定はない。なお、アルカリ規定液については別に添加しなくても構わない。

加温温度については、溶解度を上げる目的であるならば、水を圧力釜などに入れて圧をかけながら、水の沸点（約１００℃）以上で該組成物を溶解させることも考えられるが、経口摂取をすること、またクレアチン組成物自体が変性（主に、主成分であるクレアチン自体の分解など）を起こす可能性があるので上限を水の沸点である１００℃（１気圧）と設定している。また、加温温度が８０℃以下であると、該組成物が溶解しにくいということも有るが、溶解させたクレアチン組成物を摂取した際、分解除去しきれなかったクレアチン組成物に含まれる微量の不純物（主に、シアン化合物）と、体内の胃酸等の酸性物質とが反応してしまい、背景技術で記したように、喘息症状が悪化してしまう可能性がある。このことについては、後に実施例を挙げて詳細を説明する。

ステップＳ１１の後、１秒以上かけて、クレアチン組成物を溶解させ、クレアチン組成物水溶液を調製する（ステップＳ１２）。

溶解時間に関して、１秒以下であると、クレアチン組成物が十分に溶解せず、且つ、クレアチン組成物に含まれる微量の不純物が分解除去されない。また、溶解時間の上限については特に限定はないが、クレアチン組成物自体の変性などを考慮すると大体１０分（６００秒）くらいまでが望ましい。なお、水の量及びクレアチンの量は、クレアチン組成物を水に溶解させたときに水溶液全体が均一系になれば良いので、特に限定はない。

次に、ステップＳ２の後、常温（１０〜３５℃程度）若しくは冷温（１０℃以下）の飲料に前記クレアチン組成物水溶液を混入させて、摂取する（ステップＳ１３）。この飲料としては、上述したように、水やジュース、市販のスポーツドリンクなどの限定は無いが、この中では水が好ましい。なお、飲料として使用する場合の水は、前記クレアチン組成物水溶液を調製する際に使用した水と、同じ水を用いても違う水を用いてもどちらでも構わない。

なお、本願製造方法にて使用する飲料やクレアチン組成物に関して、クレアチン組成物としてクレアチン結晶体粉末（主にクレアチン一水和物）を用いた場合について説明したが、この限りではなく、上述したような条件を満たせば、クレアチンを溶かし込むのに種々の飲料を用いたり、クレアチン組成物として、クレアチン一水和物の代わりに、上述したクレアチン化合物又はクレアチン類似体の結晶体粉末を使用することが可能である。また、胃酸等の酸性物質を抑制する食品、食品添加物、医薬品と同時にクレアチン組成物を摂取しても良い。

次に、主に本願摂取方法にて使用するクレアチン組成物について説明する。なお、本実施形態では、クレアチン組成物としてクレアチン一水和物の結晶体粉末（以下、単に「クレアチン結晶体粉末」とする。）を想定して説明する。

一般的に、先に述べたように、クレアチン結晶体粉末（従来の市販品）結晶体粉末にはナトリウム塩やシアン化合物等といった不純物が微量ではあるが含まれている。例えば、再結晶法を使用して、不純物を除去することが考えられるが、再結晶法を使用する場合、使用する溶媒の選択を検討しなくてはならないこと、また使用する溶媒によっては、溶媒成分の完全な除去が困難であることから、経口摂取をする場合は、注意しなくてはならない。

また、本願摂取方法を用いることにより、市販品の状態でも十分に不純物（主にシアン化合物）の除去も可能ではあるが、不純物の量によっては本願摂取方法でも完全に除去できるとは言い切れない。

ここで、クレアチン組成物（本実施形態ではクレアチン一水和物の結晶体粉末を想定する）について、本願摂取方法にて使用する前段階、即ち製品の段階で、より不純物を除去したクレアチン組成物を検討した。以下、図２のフローチャートを基に説明する。

製品としてのクレアチン組成物（ここではクレアチン一水和物の結晶体粉末を言う。）について、常法に従い、クレアチン組成物の合成反応を行う（ステップＳ２１）。なお、ここで言う常法とは、例えば特表２００９−５３２４０６号公報（若しくは対応する国際特許公開第２００７／１１５７９９号パンフレット）を参照のこと。ちなみに特表２００９−５３２４０６号公報の記載の方法は、銅／ニッケルベースのラネーニッケル触媒存在下で、Ｎ−メタノールアミンと水酸化ナトリウム水溶液とをオートクレーブ中で反応させて、ナトリウムサルコシナート溶液を得た後、ｐＨ９．６に調整して、前記ナトリウムサルコシナート溶液と、シアナミドとを反応させてクレアチン一水和物を得るというものである（特表２００９−５３２４０６号公報実施例１及び３参照。）。

ステップＳ２１にて得られたクレアチン組成物を、８０〜１００℃に加温した水で、１秒以上かけて洗浄する（ステップＳ２２）。この場合、水は純水であることが好ましいが、水道水でも構わない。なお、水の加温温度が、８０℃以下であると、不純物の分解除去が十分ではなく、１００℃以上であると、クレアチン組成物の主成分であるクレアチン自体が分解をしてしまう可能性がある。また洗浄回数であるが、１回以上であれば、回数に限定はないが、１０回くらいまでが好ましい。

次にステップＳ２２にて洗浄し、精製されたクレアチン組成物を、バキュームオーブン等を用いて、減圧乾燥し、所望のクレアチン組成物を得る（ステップＳ２３）。減圧乾燥時の圧には特に限定はない。また、減圧乾燥時の温度については４０〜１００℃くらいが望ましい。即ち、水を除くための減圧乾燥であるので、適宜調節可能である。

なお、前記クレアチン組成物については、クレアチン一水和物の結晶体粉末を例に実施形態を説明したが、その他クレアチン無水物、クレアチン無水物及びクレアチン一水和物の混合物、クレアチンリン酸塩、クレアチンピルビン酸塩、クレアチンクエン酸塩、クレアチン無水物、クレアチン一水和物、クレアチン無水物及びクレアチン一水和物の混合物、クレアチンマレイン酸エステル、クレアチンマレイン酸塩、クレアチンメチルエステル、クレアチンエチルエステル、クレアチンリン酸エステル、クレアチン硝酸エステル、クレアチン硫酸エステル、クレアチンロイシナート、グルコン酸クレアチン、シクロクレアチンなどあらゆるクレアチン化合物の結晶体粉末、更にはクレアチン類似体の結晶体粉末などに適用が可能である。

また、ステップＳ２３にて得られたクレアチン組成物を基に、粉末、錠剤型、顆粒状、懸濁液状又はカプセル若しくは腸溶剤でコーティングしたもののいずれかの食品、又は粉末、顆粒状、錠剤型、カプセル若しくは腸溶剤でコーティングしたもののいずれかであるクレアチン含有薬剤にも応用が可能である。なお、前記カプセル及び腸溶剤であるが、胃酸とクレアチン成分が反応するのを抑制できれば良いので材質は特に問わない。

以上、本発明に係るクレアチン組成物水溶液の製造方法について説明したが、本発明の実施形態はこの限りではない。

本発明のクレアチン組成物水溶液の製造方法に係る実施例を次に説明する。

［実施例１］種々の温度下のクレアチン水溶液と塩酸との反応によるシアン化水素ガス発生の有無
先にも述べたが、体内に摂取するクレアチン組成物と体内の胃酸が反応し、シアン化水素ガスが発生することが推測され、更に、クレアチン組成物を溶解させる水の温度とも何かしらの関連があることが推測される。

そこで、上記推測を検証すべく、種々の温度の水にクレアチン組成物を溶解させ、クレアチンと塩酸との反応実験を行った。

先ず、ビーカ内で、常温の純水（以下、単に「水」とする。）５ｍＬに対し、クレアチン組成物としてクレアチン一水和物（以下、本実施例１では「クレアチン」とする。）２ｇを加え、攪拌した。ここで言う常温とは、１０〜３５℃程度のものを言う。前記攪拌の後、該水溶液を三角フラスコに入れ替え、塩酸１０ｍＬを加え、三角フラスコに栓をして攪拌しながら溶解させ、溶解から３分後にシアン化水素ガス検知管（ガステック社製ＧＶ−１００Ｓ。測定範囲０．２〜７ｐｐｍ）を用いて測定した。この時、該検知管は、ピンク色を呈して、０．２ｐｐｍのシアン化水素ガスが検出された（図３（ａ）参照）。

同様に、純水を６０℃、７０℃、８０℃、１００℃にそれぞれ調整し、上記手順と同様の手順により、随時実験した。その結果、純水の温度が６０℃及び７０℃の場合は、常温の純水を使用した場合同様、検知管がピンク色を呈し、０．２ｐｐｍのシアン化水素ガスが検出された（図３（ｂ）及び図３（ｃ）参照）。また、純水の温度が８０℃の場合には、０．２ｐｐｍ未満（図３（ｄ）参照）、即ち図３（ａ）乃至（ｃ）に示されているようなピンク色を呈さず、純水の温度が１００℃の場合には、検知管は呈色せず、シアン化水素ガスは検出されないという結果が得られた。なお、純水の温度と、シアン化水素ガス濃度との関係を次の表１に示す。

上記の結果から、クレアチンに常温の水を使用する場合はもちろんのこと、６０℃及び７０℃の水を使用する場合でも、シアン化水素ガスが発生する危険性があることが確認された。一方、８０℃の温水では、０．２ｐｐｍ未満となり、１００℃の水ではシアン化水素ガスが発生しないことが確認された。このことから、クレアチン一水和物に微量含有されているシアン化合物を８０℃以上の温水で分解処理しないと、シアン化水素ガスが発生する危険性があることが示唆された。

次に、本発明のクレアチン水溶液の製造方法において、クレアチン（クレアチン一水和物）を常温（１０〜３５℃程度）の水（媒体）に溶解させて当該摂取方法に使用した場合の効果を確認すべく、モルモットを使用して動物実験を行った。以下、実施例２乃至８として、順次説明する。

［実施例２］クレアチン被験物質溶液及び対照実験用溶液の調製
（１）クレアチン被験物質溶液の調製
先ず、本実施例２では、クレアチン被験物質溶液及び対照実験用溶液を調製した。クレアチン被験物質溶液を調製する際に使用したクレアチン組成物及び媒体は次に示す表２の通りである。

クレアチン被験物質溶液の調製は、必要量のクレアチン一水和物（以下、「クレアチンパウダー」とする。）を秤量した後、該クレアチンパウダーをメノウ乳鉢で磨砕し、適量の媒体を加えて懸濁させた。ここで言う必要量とは、モルモット１ｋｇあたり、３０００ｍｇのクレアチンパウダーを投与するという意味である。

次に、得られたクレアチンパウダー懸濁液を、メスシリンダ又はメスフラスコに移し、更に媒体を加え、３００ｍｇ／ｍＬとなるように、クレアチンパウダー懸濁液を調製した。なお、クレアチン被験物質溶液の調製は用時調製、即ち、後述する経口投与実験（実施例５及び６）毎に随時調製するものとする。

（２）対照実験用溶液の調製
対照実験用溶液については、表２に示した０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース４００溶液（常温）をそのまま使用した。

［実施例３］実施例５及び６で使用する試薬の調製
後述する実施例５及び６にて使用する抗原含有生理食塩水溶液（１ｗ／ｖ％及び２ｗ／ｖ％）、メチラポン生理食塩水溶液及びピリラミンマレイン酸生理食塩水溶液の調製について次に説明する。

（１）抗原含有生理食塩水溶液（１ｗ／ｖ％及び２ｗ／ｖ％）の調製
先ず、抗原としては、シグマアルドリッチ社のオボ（卵白）アルブミン（以下、「ＯＶＡ」とする。）を使用した。調製は、ＯＶＡを秤量した後、生理食塩水（大塚製薬製）を使用して、１ｗ／ｖ％及び２ｗ／ｖ％のＯＶＡ含有生理食塩水溶液となるように調製した。調製については、用時調製、即ち、後述する経口投与実験（実施例５及び６参照）毎に随時調製するものとする。

（２）メチラポン生理食塩水溶液
使用するメチラポンは、シグマアルドリッチ社のものを使用した。調製は、メチラポンを秤量した後、生理食塩水（大塚製薬製）を使用して、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメチラポン生理食塩水溶液を調製した。なお、調製については、上記ＯＶＡ含有生理食塩水溶液同様用時調製とした。

（３）ピリラミンマレイン酸生理食塩水溶液の調製
使用するピリラミンマレイン酸塩は、シグマアルドリッチ社のものを使用した。調製は、ピリラミンマレイン酸塩を秤量した後、生理食塩水（大塚製薬製）を使用して、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメチラポン生理食塩水溶液を調製した。なお、調製については、上記ＯＶＡ含有生理食塩水溶液同様、用時調製とした。

［実施例４］実施例２にて調製したクレアチン被験物質溶液及び対照実験用溶液の投与
後述の実施例５及び６に係る試験の前に、実施例２にて調製したクレアチン被験物質溶液及び対照試験用溶液を、２匹のモルモット（九動株式会社より提供）にそれぞれ経口投与した。以下、クレアチン被験物質溶液を投与したモルモットを「クレアチン喘息モデルモルモット」と称し、対照試験用溶液を投与したモルモットを「対照喘息モデルモルモット」と称する。

使用したモルモットは、２匹のモルモットともにオスで５週齢のものを使用した。なお、モルモットは後述の実施例５及び６に係る実験の回数に応じてその都度他のモルモットを使用する。経口投与については、先ず投与前にモルモットの体重測定を行った。次に、該クレアチン被験物質溶液及び対照実験用溶液の投与量は、モルモット１ｋｇあたり１０ｍＬとし、予め測定した体重に基づいて０．１ｍＬ単位で算出した。

そして、経口投与については、注射筒及び栄養カテーテルを用いて投与し、実施例５及び６に係る試験の１時間前に１回投与した。

［実施例５］喘息モデルモルモット作製
実施例４にてクレアチン被験物質溶液を投与したモルモット（クレアチン喘息モデルモルモット）及び対照実験用溶液を投与したモルモット（対照喘息モデルモルモット）を、それぞれポリプロピレン製コンテナに収容した後、実施例３にて調製した１ｗ／ｖ％のＯＶＡ含有生理食塩水溶液を、超音波ネブライザを用いて霧化させ、前記ＯＶＡ含有生理食塩水溶液を１日あたり１０分間かつ連続８日間吸入させた。このようにして喘息モデルモルモットを作製した。

［実施例６］喘息反応の惹起実験
実施例５にて作製したクレアチン喘息モデルモルモット及び対照喘息モデルモルモットに対して、最終感作の１週間後、呼吸機能測定用チャンバに収容及び保定し、その後、超音波ネブライザを用いて、実施例３にて調製した２ｗ／ｖ％のＯＶＡ含有生理食塩水溶液を霧化させたものを５分間吸入させることにより、抗原抗体反応を惹起させた。該惹起約２４時間（前後１時間）前及び約１時間（前後５分）前に、実施例３で調製したメチラポン生理食塩水溶液を後肢末梢静脈内に、該惹起３０分前に、実施例３で調製したピリラミンマレイン酸生理食塩水溶液を腹腔内にそれぞれの喘息モデルモルモットに投与した。

なお、メチラポン生理食塩水溶液及びピリラミンマレイン酸生理食塩水溶液の投与量は、モルモットの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／ｍＬとし、当該生理食塩水溶液の投与前に予め測定した体重に基づいて、０．１ｍＬ単位で算出した。

［実施例７］気道抵抗の測定
本実施例７においては、クレアチン喘息モデルモルモット及び対照喘息モデルモルモットに対して、総合呼吸機能解析システム（Ｐｕｌｍｏｓ−Ｉ、株式会社エム・アイ・ピー・エス製）を使用して、気道抵抗（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｉｒｗａｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｓＲａｗ）を測定した。ｓＲａｗ値の測定については、実施例６における抗原抗体反応の惹起開始１分後、前記抗体反応の惹起開始約２、４、５、６、７、８及び２２（〜２４）時間後に測定した。各測定時間におけるｓＲａｗは、モルモット１００呼吸分の平均値とした。なお、各モルモットに対して、実施例６におけるメチラポン生理食塩水溶液投与前に、呼吸機能測定用チャンバに収容及び保定する操作を少なくとも１回は行い、前記チャンバに対する馴化を実施した。

次に各測定時間におけるｓＲａｗ値から、総合呼吸機能解析システムの解析ソフト（ＷｉｎＰＵＬ１６Ｖｅｒ．１．２３、株式会社エム・アイ・ピー・エス製）を使用して、各測定時間に対応するｓＲａｗ値に対するｓＲａｗ増加率を算出した。なお、ｓＲａｗ増加率は次に示す式で表される。

また、各測定時間におけるｓＲａｗ増加率は、次の表３に示す通りである。表３に示す結果から、クレアチン喘息モデルモルモット及び対照喘息モデルモルモット共にｓＲａｗ増加率は、抗原抗体反応の惹起開始４時間後に一旦減少ピークを迎え、抗原抗体反応の惹起開始５及び６時間後は増加に転じた。そしてクレアチン喘息モデルモルモットは、抗原抗体反応の惹起開始７時間後のｓＲａｗ増加率は増加したのに対し、対照喘息モデルモルモットにおける抗原抗体反応の惹起開始７時間後のｓＲａｗ増加率は、減少した。抗原抗体反応の惹起開始８時間後並びに２３〜２４時間後については、クレアチン喘息モデルモルモット及び対照喘息モデルモルモット共にｓＲａｗ増加率は減少傾向にあった。なお、全体的にクレアチン喘息モデルモルモットのｓＲａｗ増加率の方（但し、抗原抗体反応の惹起開始１分後は除く。）が、対照喘息モデルモルモットのそれよりも高いことが確認された。

［実施例８］即時型喘息反応（ＩＡＲ）及び遅発型反応（ＬＡＲ）の評価
上記実施例７において算出したｓＲａｗ増加率において、抗原抗体反応の惹起開始１分後のｓＲａｗ増加率を、即時型喘息反応（ＩｍｍｅｄｉａｔｅＡｉｒｗａｙＲｅｓｐｏｎｓｅ。以下「ＩＡＲ」とする。）の評価指標とした。

また、抗原抗体反応の惹起開始４〜８時間後のｓＲａｗ増加率を、遅発型反応（ＬａｔｅＡｉｒｗａｙＲｅｓｐｏｎｓｅ。以下「ＬＡＲ」とする。）の評価指標とした。なお、遅発型反応の評価指標については、抗原抗体反応の惹起開始４〜８時間後のｓＲａｗ増加率を基に算出した曲線下面積であるＡＵＣ４−８ｈを評価指標とした。ＡＵＣ４−８ｈの算出方法は次の数２にて示す式による。また、クレアチン喘息モデルモルモット及び対照喘息モデルモルモットそれぞれのＩＡＲ及びＬＡＲについては、表４として示す。

ＩＡＲ及びＬＡＲを検討した場合、ＬＡＲについて、対照喘息モデルモルモットと比べると、クレアチン喘息モデルモルモットの方が高い数値であることから、クレアチン喘息モデルモルモットの方が強い喘息症状を引き起こしていることが分かった。まだ、本願におけるクレアチン組成物水溶液の製造方法の有効性並びにシアン化水素ガスと喘息症状との因果関係は種々検討の余地はあるが、少なくともクレアチン組成物を常温（１０〜３５℃程度）の媒体に溶解させて摂取した場合に強い喘息症状を引き起こしていることから、実施例１にて記したシアン化水素ガス発生と媒体の温度との関係と、実施例６乃至８に係るモルモット実験の結果から、喘息症状とシアン化水素ガスの因果関係を示唆するものと思われる。

以上、本発明に係るクレアチン組成物水溶液の製造方法に関する実施例を縷々説明したが、本実施例はあくまで一例であり、用いたクレアチン組成物や加温温度、並びにモルモットを使用した動物実験等の種々の条件はこの限りではない。

Claims

常温若しくは冷温の飲料と混合させて経口摂取するクレアチン組成物水溶液の製造方法であって、
水を８０〜１００℃に加温する段階と、
製品状態のクレアチン組成物を１秒〜１０分かけて、前記加温した水に溶解させてクレアチン組成物水溶液を調製する段階とを備え、
前記クレアチン組成物が、クレアチン一水和物、クレアチン無水物、クレアチンリン酸塩、クレアチンピルビン酸塩、クレアチンクエン酸塩のうちいずれか１つの結晶体粉末又はそれらを２つ以上組み合わせて成るものであり、
前記クレアチン組成物水溶液を常温若しくは冷温の前記飲料と混合させて経口摂取したときの、シアン化合物系の不純物と、胃酸の主成分である塩酸との反応によるシアン化水素ガスの発生が抑えられた、クレアチン組成物水溶液の製造方法。
前記飲料が、前記クレアチン組成物水溶液を調製する際に用いた水と同じ、若しくは異なる水である請求項１に記載のクレアチン組成物水溶液の製造方法。
前記水が、水道水、蒸留水、ミネラルウォータ類から選択される請求項２に記載のクレアチン組成物水溶液の製造方法。
前記飲料がジュース、スポーツドリンク、牛乳若しくは乳製品類、お茶類、コーヒー、炭酸飲料、又は清涼飲料水のうちいずれかから選択される請求項１に記載のクレアチン組成物水溶液の製造方法。