JP6024104B2 - 求心性迷走神経活性化剤、食欲抑制剤、脂肪消費促進剤、脂肪肝治療剤、糖尿病治療剤、及びヒトを除く家畜動物種及び野生動物の求心性迷走神経活性化方法 - Google Patents

Description

本発明は、求心性迷走神経活性化剤、食欲抑制剤、脂肪消費促進剤、脂肪肝治療剤、糖尿病治療剤、及びヒトを除く家畜動物種及び野生動物の求心性迷走神経活性化方法に係り、特にペプチドホルモンを用いた求心性迷走神経活性化剤、食欲抑制剤、脂肪消費促進剤、脂肪肝治療剤、糖尿病治療剤、及びヒトを除く家畜動物種及び野生動物の求心性迷走神経活性化方法に関する。

近年、摂食とエネルギー代謝の調節メカニズムの研究が国内外で盛んに行われている。これは、世界的な肥満の増加と、肥満が多くの生活習慣病、メタボリックシンドローム、及び動脈硬化性疾患の起点になることが明らかにされたためであった。

ここで、特許文献１を参照すると、従来の肥満治療のための薬学的組成物として、食事行動を修正する化合物、そのプロドラッグまたは前記化合物または前記プロドラッグの薬学的に許容可能な塩、及びβ−アドレナリン作働剤と前記プロドラッグの薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物が記載されている（以下、従来技術１とする。）。
従来技術１の薬学的組成物は、神経伝達物質とそのシグナル伝達系に働きかけること、及びホルモンやアディポカインを利用して、動物、特にヒトの肥満症を処置するのに有用性を有する薬学的組成物および方法を提供していた。

一方、オキシトシン（Ｏｘｔ）は、９個のアミノ酸からなる小分子ペプチドであり、哺乳類の分娩及び乳汁分泌に不可欠な役割を果たすことが、よく知られている。オキシトシンは脳視床下部の神経細胞で産生され、神経軸索で脳下垂体後葉に輸送され、血中に放出されるホルモンである。
これに加え、非特許文献１を参照すると、近年、オキシトシンがエネルギー代謝に重要な役割を果たすことを示唆されている。非特許文献１は、末梢オキシトシン投与により、ラットの食欲低下が誘発されることを最初に示した文献である。

ここで、特許文献２を参照すると、対象における満腹因子の望ましくないレベルに関連する障害又は状態を治療又は予防する治療薬として、前記障害又は状態を治療又は予防するのに有効な量の前記飽食因子のアゴニスト又はアンタゴニストを前記対象に投与する治療薬が記載されている（以下、従来技術２とする。）。
従来技術２の治療薬は、摂食・代謝調節に関するペプチドを導入した遺伝子改変酵母および／または乳酸菌を投与することによって、患者集団、例えば、飽食因子の望ましくないレベルを有する患者を治療することができる。

特開平１１−２２８４４７号公報 特表２００９−５４２８１３号公報

Ａｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｏｘｙｔｏｃｉｎ ｏｎ Ｆｅｅｄｉｎｇ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ Ｒａｔ」、Ｐｅｐｔｉｄｅ、米国、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ ｐｌｃ、１９８９、１０、、ｐ．８９−９３

しかしながら、従来技術１は、脳内神経伝達物質でもあるセロトニンやドーパミンの作働薬を用いていた。従来技術１のように、代表的な中枢神経伝達物質に働きかけることにより「脳の様々な部位に作用する」可能性がある薬学的組成物を用いると、食欲／摂食量やエネルギー代謝を特異的、選択的に変化させることができないため、副作用が大きいという問題があった。
これに対して、オキシトシンの脳内神経伝達物質としての機能と役割は極めて限局されており、又、既に陣痛促進剤等として医療用に用いられており、副作用の少ない肥満・メタボリックシンドローム治療薬として期待できる。
ここで、従来技術２のペプチドは、段落［００１０］を参照すると、「３８）オキシトシン」なる記載があり、段落［００１４］に「食物摂取および／または体重を低下させることが目的である場合、」投与される肥満関連ペプチドは、「〜、３７）〜４３）」とあり、オキシトシンが体重減少に用いられるように記載されていた。
しかしながら、従来技術２の実施例においては、ヒトＰＹＹを酵母に組み込み、乳酸菌には合成したエキセンディン−４を組み込んで実験しており、オキシトシンについて裏付けがなかった。
また、従来、オキシトシンの食欲減退作用並びに脂肪分解を含む異化作用、それらの作用機序、及び期間についての詳細は不明だった。
実際のところ、末梢オキシトシン投与による根本的な食欲減退及び異化作用の機序の大部分は未知であり、オキシトシンを肥満・メタボリックシンドロームの治療薬として用いるための、好適な投与量、投与期間、投与方法も不明であった。このため、未知の副作用を鑑みると、オキシトシンを治療薬として用いることはできなかった。
よって、オキシトシンを用いた、作用機構の明らかな肥満・メタボリックシンドローム治療薬が求められていた。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。

本発明の求心性迷走神経活性化剤は、所定投与量の末梢投与用のオキシトシンにより、血液脳関門−視床下部弓状核経由及び／又は求心性迷走神経経由で所定期間、刺激して摂食抑制させるよう構成され、前記血液脳関門−視床下部弓状核経由では、視床下部の弓状核及び室傍核を活性化し、前記求心性迷走神経経由では、オキシトシン受容体を介して前記求心性迷走神経を直接活性化し、当該求心性迷走神経経由の情報伝達の結果により、脳幹の孤束核、迷走神経背側核複合体、及び青斑核におけるｃ−Ｆｏｓ発現を誘発し、前記所定投与量は、４００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日であることを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化剤は、前記所定投与量は、８００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日であることを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化剤は、前記所定投与量は、１６００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日であることを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化剤は、収縮期血圧の正常レベルに影響を与えないことを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化剤は、前記所定期間の投与後にも１ヶ月〜数ヶ月間、摂食抑制の効果を持続させることを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化剤は、精神活動に悪影響を及ぼさないことを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化剤は、浸透性ミニポンプ又は皮下投与を用いることを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化剤は、前記所定期間は、前記所定投与量を１０日〜１ヶ月間維持することを特徴とする。
本発明の食欲抑制剤は、前記求心性迷走神経活性化剤を用いることを特徴とする。
本発明の脂肪消費促進剤は、前記求心性迷走神経活性化剤を用い、呼吸商の低下、及び脂肪細胞肥大化抑制を含む機構により、内蔵脂肪量を減らすことを特徴とする。
本発明の脂肪肝治療剤は、前記求心性迷走神経活性化剤を用い、呼吸商の低下、及び脂肪細胞肥大化抑制を含む機構により、内蔵脂肪量を減らすことを特徴とする。
本発明の糖尿病治療剤は、前記求心性迷走神経活性化剤を用い、インスリン分泌を促進することを特徴とする。
本発明の求心性迷走神経活性化方法は、ヒトを除く家畜動物種及び野生動物の求心性迷走神経活性化方法であって、所定投与量と所定期間でオキシトシンを末梢投与し、血液脳関門−視床下部弓状核経由及び／又は求心性迷走神経経由で、前記血液脳関門−視床下部弓状核経由では、視床下部の弓状核及び室傍核を活性化し、前記求心性迷走神経経由では、オキシトシン受容体を介して前記求心性迷走神経を直接活性化し、当該求心性迷走神経経由の情報伝達の結果により、脳幹の孤束核、迷走神経背側核複合体、及び青斑核におけるｃ−Ｆｏｓ発現を誘発することで摂食抑制させ、前記所定投与量は、４００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日であることを特徴とする。

本発明によれば、所定投与量と所定期間でオキシトシンを末梢投与することで、副作用が少なく、作用機構が明らかで安心な肥満・メタボリックシンドローム治療薬を提供することができる。

本発明の実施の形態に係る実施例に係る、標準食を与えたマウスにおけるオキシトシンの腹腔内投与の後の摂食量を示す図である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、ＰＶＮのｃ−Ｆｏｓの発現を示す写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、ＡＲＣのｃ−Ｆｏｓの発現を示す写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、ＬＣのｃ−Ｆｏｓの発現を示す写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、迷走神経背側核複合体（ＮＴＳ／ＤＭＸ／ＡＰ）のｃ−Ｆｏｓの発現を示す写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、視床下部および脳幹の摂食関連の領域のｃ−Ｆｏｓ陽性のニューロンの数を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシンを単回末梢投与した際の、標準食マウスの２４時間の累積的な摂食量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシンを単回末梢投与した際の、高脂肪食（ＨＦＤ）誘発肥満マウスの２４時間の累積的な摂食量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシンを毎日末梢投与した際の、ＨＦＤ誘発肥満マウスの日々の摂食量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシンを毎日末梢投与した際の、ＨＦＤ誘発肥満マウスの日々の体重変化量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、体重変化量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、日々の摂食量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、図３Ｂから計算された累積的な１〜６日の摂食量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、腸間膜脂肪組織の湿重量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、腸間膜脂肪組織の相対面積（断面積）を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによる生理的食塩水長期投与の際の、腸間膜脂肪組織の顕微鏡写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、腸間膜脂肪組織の顕微鏡写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、精巣周囲脂肪組織の湿重量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、精巣周囲脂肪組織の相対面積（断面積）を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによる生理的食塩水長期投与の際の、精巣周囲脂肪組織の顕微鏡写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、精巣周囲脂肪組織の顕微鏡写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、肝臓湿重量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによる生理的食塩水長期投与の際の、肝臓組織の顕微鏡写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際の、肝臓組織の顕微鏡写真である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、呼吸商のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、呼吸商の平均を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、エネルギー消費量のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、エネルギー消費量の平均値を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、累積的な自発運動量のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、累積的な自発運動量を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、糖負荷試験の血糖値のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、インスリン負荷試験の血糖値のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、長期オキシトシン投与における、血圧測定の結果のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン投与後の摂食量の測定結果のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン投与後のカプサイシン感受性感覚神経障害マウスの摂食量の測定結果のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン投与後の横隔膜下迷走神経切断の疑手術群（Ｓｈａｍ群）の摂食量の測定結果のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン投与後の迷走神経切断マウス（Ｖａｇｏｔｏｍｙ群）の摂食量の測定結果のグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、求心性単迷走神経から単離した単一ニューロンにおける［Ｃａ²⁺］_i変化を示す代表例である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、単離ニューロンにおける［Ｃａ²⁺］_i変化を示す代表例である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシンの濃度と［Ｃａ²⁺］_iを増加応答を示す単離ニューロンの割合の関係を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシンの濃度と各単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化量（振幅）を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、１０^-8Ｍのオキシトシンの２回連続投与における、単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化の代表例である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、１０^-8Ｍのオキシトシンの２回連続投与において、最初の投与時に、オキシトシン受容体アンタゴニスト（Ｈ４９２８）で前処理した際の単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化の代表例である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、図７Ａと図７Ｂに示した実験結果を基に、２回目刺激による［Ｃａ²⁺］_i変化量を１００％としたときの１回目刺激による［Ｃａ²⁺］_i変化量を示した図である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン、Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎ−８（ＣＣＫ−８）、及びカプサイシン（ＣＡＰ）に反応する単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化を示す代表例である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン、ＣＣＫ−８、カプサイシン投与により応答した各単離ニューロンの割合を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン、ＣＣＫ−８、カプサイシン投与により応答した単離ニューロンの割合を、各試薬に対する応答パターンで区分した図である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン、Ｎｅｓｆａｔｉｎ−１（Ｎｅｓｆ−１）、カプサイシンに反応する単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化を示す代表例である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン、Ｎｅｓｆ−１、カプサイシン投与により応答した各単離ニューロンの割合を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、オキシトシン、Ｎｅｓｆ−１、カプサイシン投与により応答した単離ニューロンの割合を、各試薬に対する応答パターンで区分した図である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、血液脳関門−視床下部弓状核に加え、求心性迷走神経ルートで食欲が抑制されることを示す概念図である。 本発明の実施の形態に係る実施例に係る、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン長期投与の際、オキシトシン投与濃度を変えた際の体重の増加を示すグラフである。

＜実施の形態＞
本発明者らは、副作用の少ない肥満症・メタボリック症候群治療剤を開発することを目的としていた。このため、既に陣痛促進剤として臨床使用されているペプチドホルモンであるオキシトシンの、主に末梢投与に注目した。
具体的には、本発明者らは、鋭意実験と研究を行い、摂食量とエネルギー収支に対する末梢オキシトシンの長期投与の影響、及び作用機序と投与量等を明確にし、末梢オキシトシン投与によって刺激された脳領域を同定した。実際に、本発明者らは、末梢オキシトシン投与に応じて、摂食・代謝に関与する視床下部と脳幹の多くで明白なｃ−Ｆｏｓ発現があることを示した。
これにより、本発明者らは、腹腔内・皮下オキシトシン投与の好適な濃度や期間等を求めることができ、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬及び治療方法を完成させた。
本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、皮下注入された浸透性ミニポンプによる長期オキシトシン投与で、効率的に摂食量を抑えることができる。また、高脂肪食（ＨＦＤ）により誘発された肥満マウスの体重減少、特に内臓脂肪量の低下を観察し、同時に、脂肪細胞サイズの縮小、脂肪肝並びに耐糖能障害改善の効果があることを見いだした。
したがって、本発明者らは、解明した長期の末梢オキシトシン投与による摂食調節の機構を基に、体重及び脂肪質量を確実に減少させられる肥満・メタボリックシンドローム治療薬を完成させた。本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、肥満を始めとする肥満・メタボリックシンドロームの主要な症状を改善するため、好適に用いられる。

より具体的に説明すると、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、主にオキシトシンを毎日投与／又は皮下注入された浸透性ミニポンプを用いて、長期間、所定投与量で、末梢投与される。これにより、オキシトシン受容体を介して求心性迷走神経を直接活性化し、肥満・メタボリックシンドロームを改善することができる。
本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬に用いられる浸透性ミニポンプとしては例えば、Ａｌｚｅｔ社製のｍｉｎｉ−ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｕｍｐ、Ｍｏｄｅｌ ２００２等と同様に、所定期間、浸透圧等により所定投与量の薬剤を放出するものが望ましい。この浸透性ミニポンプは、例えば、あらかじめカプセル内に入れた薬液を、浸透圧により体内に注入する。この際に、所定期間、所定流量で本実施形態のオキシトシンを動物の体内に連続注入できる。このような浸透性ミニポンプは、例えば、非透過性のリザーバーと、リザーバーを包む浸透剤を含むシール膜及び半透過膜外筒メンブランと、薬液排出用のフローモデレーターより構成される。本実施形態のオキシトシンが充てんされた浸透性ミニポンプが体液に接すると、浸透剤が半透過性膜で、所定レートで水分を吸収する。吸収された水分は、リザーバーに対して水圧として働き、この水圧によりフローモデレーターを介してリザーバー内のオキシトシンを所定流速で放出させる。浸透性ミニポンプの流速は、例えば固定されており、製造する際に決定できる。また、数時間の始動時間の後の流速は、ポンプ機能が止まるまで所定量で放出させる。
また、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬が注射液である場合、所定投与量、投与時間、投与回数により、血中オキシトシンの濃度が平均して所定濃度となるように調整された注射液を用いる。

本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬に用いられる注射薬又は浸透性ミニポンプで末梢投与されるオキシトシンの所定投与量としては、４００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日程度になるような高濃度が好ましい。この際、血中濃度は、５０００ｐＭ（５ｎＭ＝５×１０^-9Ｍ）程度になることが推測される。この濃度により、好適に食欲を抑制し、脂質消費を増加させ、脂肪肝及び耐糖能を改善できる。
ここで、本実施形態のオキシトシンの所定投与量としては、腹腔内に４００μｇ／ｋｇ単回投与すると、摂食量が６時間は確実に抑制されることが分かっている（図１Ａ参照）ため、下限として好適である。また、１日２４時間としたときに、４００μｇ／ｋｇの４倍のｄｏｓｅの所定投与量として、１６００μｇ／ｋｇ／日に設定することが好適である。また、後述する実施例のように、８００μｇ／ｋｇ／日でも、充分な体重抑制効果が得られる。
さらに、後述する実施例のように、１６００μｇ／ｋｇ／日の投与を１４日続けることで１０％前後の体重減少が肥満動物で充分見られる。このため、２０００μｇ／ｋｇ／日が程度を所定投与量の上限とすることが好適である。

また、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬を投与する所定期間としては、所定投与量を１０日〜数ヶ月間持続するように長期（長期の期間）投与することが望ましい。しかしながら、下記実施例のように、投与時にすぐに効果が現れる。また、マウスの代謝とヒトの代謝に係る従来の治験から類推すると、投与を中止しても、少なくともヒトで、１ヶ月〜数ヶ月程度は効果が持続することが期待できる。

また、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、オキシトシン及びオキシトシンの化学的なアナログを用いて、室傍核、視床下部弓状核、青斑核、及び迷走神経背側核複合体（ＮＴＳ、ＤＭＸ、ＡＰ）において、ｃ−Ｆｏｓ発現を誘発する濃度を用いることが好ましい。
実際のところ、オキシトシンの腹腔内投与が濃度依存性に摂食抑制を誘発するためには、２つの経路を推測することができる。この２つの経路としては、（１）視床下部弓状核の血液脳関門（ＢＢＢ）経路、及び（２）迷走神経の求心経路が考えられる。視床下部弓状核は、血液脳関門に入り込むホルモンを含む末梢信号を感じる一次センターと考えられている。実際、末梢投与されたペプチドの０．００２％が中枢神経系に達することが知られている（Ｍｅｎｓ ＷＢ， Ｗｉｔｔｅｒ Ａ， Ｖａｎ Ｗｉｓｍｅｒｓｍａ Ｇｒａｉｄａｎｕｓ ＴＢ、「Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｅａｌ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｉｎｔｏ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ （ＣＳＦ）： ｈａｌｆ−ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ＣＳＦ．」、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、、、１９８３、２６２、、ｐ．１４３−１４９、を参照）。
本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬に上述の腹腔内オキシトシン投与において、上述の所定投与量を用いることで、求心性迷走神経軸索が投射する孤束核のｃ−Ｆｏｓの顕著な発現を誘発することができる。

本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、オキシトシンの末梢投与後に視床下部弓状核のｃ−Ｆｏｓの発現も亢進することから、視床下部弓状核の食欲抑制ニューロンの活性化により、食欲抑制を引き起こす経路の関与が考えられる。候補としてＰＯＭＣニューロンが推定される。
したがって、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、オキシトシンの末梢投与により、血液脳関門−視床下部弓状核及び／又は求心性迷走神経ルートを経由して、食欲抑制を誘発するよう構成する。

以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
まず、従来より、中枢セロトニン・ノルアドレナリン・カンナビノイド系に作動する食欲抑制薬が開発され臨床使用されている。
その多くが、肺高血圧症、心弁膜症等などの循環系の障害、うつ病や自殺者の増加を起したために中止されている。実際、日本で唯一、臨床使用可能な食欲抑制薬であるマジンドールは、ノルアドレナリン系作動薬であるため副作用があり、重度肥満に短期間使用が許可されているのみで、抗肥満効果は限定的であった。
このように、脳の神経伝達に作用する物質は重篤な副作用を伴っており、これは従来技術１の薬学的組成物も同様であった。

これに対して、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、既に分娩促進剤として実用化されているオキシトシンを肥満・メタボリックシンドロームの治療薬とすることで、副作用の少ない抗肥満薬として応用できる。
実際に、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、後述する実施例を所定投与量でオキシトシンを投与することで、マウスの自発運動量に変化が見られなかった。これにより、精神活動に悪影響を及ぼす可能性が低いと考えられる。つまり、鬱状態や吐き気等の副作用もないことが推測される。実際に、近年、オキシトシンの中枢作用として、信頼形成・自閉症改善作用が明らかになっており、本実施形態の所定投与量で所定期間投与しても、鬱や自殺を引き起こす可能性は考えにくい。

また、後述する実施例を参照すると、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、マウスにおいて、１３日間の浸透性ミニポンプによる長期皮下オキシトシン投与で、ＨＦＤ誘発肥満のマウスの体重を−１３％引き下げることを示した。これは、抗肥満剤として通常、必要とされる水準（−１０％）より大きい体重減少効果である。
さらに、オキシトシンの日々の皮下注射で体重を低減させる効果は、オキシトシン注射の終了の後に９日〜２週間程度続いており、投与後も継続する効果があることを示唆している。

また、オキシトシンは、交感神経性の緊張により、血圧を上昇させる作用があることが以前に報告されている（Ｐｙｎｅｒ Ｓ．、「Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．」、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．、、、２００９、３８、、ｐ．１９７−２０８、を参照）。
これに対して、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、浸透圧ミニポンプ等を用いた皮下投与で時間をかけて拡散させることにより、急激に高濃度に達することを避けることができる。
実際に、下記の実施例によると、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、副作用として問題となる血圧に変化を及ぼさなかった。つまり、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、抗肥満結果が得られた１，６００μｇ／ｋｇ／日のオキシトシン投与においては、安全性の指標である、収縮期血圧の正常レベルに影響を与えなかった。
さらに、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬による、所定投与量のオキシトシン投与は、交感神経性活動、心不全、心筋梗塞、狭心症、ストレスレベル等に関連する尿中カテコールアミン（図示せず）のレベルも有意に変化させなかった。
これにより、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、急性の有害な副作用を避けることができ、さらに安全性が高まる。よって、安全な食欲抑制剤として用いることが可能である。また、皮下投与はドラッグデリバリーのための有用な方法であり、患者の負担が少ないという効果も得られる。

また、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、浸透性ミニポンプによる長期オキシトシン注入により、脂肪分解（脂肪消費）促進作用も得られる。これにより、効果的に体重及び腹部脂肪質量を減少させることができる。
具体的には、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、自発運動量（後述する実施例の図４ＥおよびＦ）を著しく変えずに、特にマウスで明期（図４ＡおよびＢ）の呼吸商（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｑｕｏｔｉｅｎｔ、ＲＱ）を減少させ、脂肪消費亢進を示した。この際、コントロール群とオキシトシン投与群（図示せず）間で明期の摂食量は異なっていなかったことから呼吸商の低下は、摂食量の変化に起因しないことが示唆されている。
これらの結果は、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬が、浸透圧ミニポンプ等を用いて所定投与量で皮下投与することで、エネルギー基質として脂肪の消費を促進することを示す。
つまり、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、中枢神経系の食欲抑制効果に加え、脂肪組織に分布した交感神経を賦活する効果、及び脂肪細胞に対する直接の刺激等を含む多数の機構により、末梢オキシトシン投与により、脂肪量を減らすことができる。

また、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、肥満と肥満・メタボリックシンドロームを治療するための薬剤としてのオキシトシンを末梢投与することで、脂肪肝を改善、治療することができるという更なる効果が得られる。
脂肪肝はグルコースと脂質代謝を阻害し、それによって、２型糖尿病、メタボリック症候群及び心疾患を促進し、また肝硬変及び肝癌のリスクを増加させる。
このため、肝臓での脂肪蓄積の抑制は肥満・メタボリックシンドロームの治療において、重要である。末梢オキシトシン投与は肝細胞への直接または中枢を介した間接的作用により肝臓脂肪を分解または蓄積阻害すると考えられる。

また、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、糖負荷試験において耐糖能を改善したが、インスリン負荷試験では変化がなかった。すなわち、所定投与量でオキシトシンを投与することで、血中グルコース濃度に応じたインスリン分泌を刺激する可能性がある。
これにより、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、糖尿病等の治療剤にも用いることができる。
実際、迷走神経のコリン作動性ニューロンは、インスリン分泌を促進することが知られている。このため、オキシトシンは、後述した実施例に示したように、膵β細胞に神経を分布させる迷走神経のコリン作動性ニューロンを活性化させることで、マウスの膵β細胞からのインスリン放出を刺激すると考えられる。

以上をまとめると、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、長期の末梢オキシトシン投与により、摂食抑制、内臓脂肪質量減少、及びエネルギー基質として脂肪消費を促進することにより、ＨＦＤ誘発肥満のマウスの肥満を改善する
しかも、これらの変化は、このモデルマウスの正常血圧レベルを変えずに、脂肪肝の改善及び耐糖能障害の改善を行うことができる。
すなわち、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、充分安定した抗肥満効果があり、肥満・メタボリックシンドロームに関わる摂食亢進症、内臓の肥満、脂肪肝及び耐糖能障害のすべてを改善することができる。

加えて、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、副作用が少ないため、健康食品や動物用飼料としても健康被害がなく用いることが期待できる。
また、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、長期末梢オキシトシン投与により、肥満、摂食亢進症及び２型糖尿病の患者自体を治療することもできる。

また、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、任意の製剤上許容しうる担体（例えば、生理的食塩水、補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等を挙げることができるが、それらに限定されない）と共に投与することができる。また、適切な賦形剤等を含んでもよい。

また、本発明の実施の形態に係る本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。
このキャリアとしては、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。あるいはまた、種々の乳濁液であってもよい。
さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。

本発明の実施の形態に係る本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、経口投与のための投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。
非経口投与としては、例えば、経皮、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。この際、１日〜数日毎の末梢／脳内注射、又は皮下投与を用いることが好適である。特に、上述したような浸透圧ミニポンプのインプラントを用いることが好適である。

本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、注射を行う場合に、１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、さらに患者の年齢、体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
投与回数および期間は、１日１回約２〜４週間程度投与して状態をモニターし、その状態により再度あるいは繰り返し投与を行う。

本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、ヒトを含む脊椎動物（動物）を治療対象とすることができる。
この脊椎動物は特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物を含む。
このため、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、広く動物の治療、家畜の発育等の対象とすることができる。
また、疾病の予防や健康増進のため、健康食品のような食物、動物用の飼料、又は食餌に含ませることもできる。

また、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬の治療対象としては、肥満・メタボリックシンドロームの他に、摂食変調を伴う疾病、糖尿病、高血圧等の症状自体を治療するものであってもよい。

また、本発明の実施の形態に係る治療用組成物を上述の治療に用いるために、投与間隔および投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。

本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
このような他の組成物として、例えば、Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ（ＣＣＫ）やＣＣＫの部分ペプチドで活性領域であるＣＣＫ−８や、これのアゴニスト／アンタゴニストを用いることができる。
ＣＣＫ／ＣＣＫ−８の末梢投与も、求心性迷走神経を介して食欲抑制を誘発することが可能である。後述する実施例で示すように、ＣＣＫ−８投与は、本発明の末梢のオキシトシン注射によって活性化された脳領域と同じ孤束核、最後野、青斑核、及び室傍核のｃ−Ｆｏｓ発現を誘発するため、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬の効果を増強するのに用いることが可能である。
また、ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１）は、食後に腸から分泌されインスリン分泌促進作用を持つインクレチンホルモンの代表であり、そのアゴニスト及び分解酵素阻害剤が最近２型糖尿病治療薬として発売され、体重増加を起さない糖尿病治療薬として注目されている。その背後に摂食抑制作用があると推察されている。さらにその作用が迷走神経求心路を介することも明らかにされている。このため、ＧＬＰ−１のアゴニスト及び分解酵素阻害剤を他の組成物として用いることもできる。
さらに、末梢投与Ｎｅｓｆａｔｉｎ−１も迷走神経求心路を介して摂食を抑制することを本発明者らは明らかにしているため、これも他の組成物として用いることもできる。
オキシトシンと、これらの他の組成物を同時に投与することで、使用濃度を低下させることができ、副作用を起こさない投与量で有効な摂食抑制効果を得ることが可能になると期待される。

また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。

なお、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、血液脳関門−視床下部弓状核及び／又は求心性迷走神経ルートを活性化させる物質であれば、オキシトシン又はオキシトシン受容体を活性化する安定長期持続型の小分子アゴニストも用いることができる。
つまり、求心性迷走神経オキシトシン受容体に対する高感受性アゴニストを開発し、より副作用の少ない安全な肥満・メタボリックシンドローム治療薬として用いることができる。

また、本発明の実施の形態に係る肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、鼻から吸入したり、脳内に直接注射等で投与するような形態であってもよい。

また、本実施形態の肥満・メタボリックシンドローム治療薬は、抗体を含むリポカプセル等の各種ＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）を用いて、血液脳関門−視床下部弓状核及び／又は求心性迷走神経ルートを、上記の所定投与量より少ない濃度で活性化することもできる。

〈本発明の実施の形態に係る実施例〉
以下で、本発明の実施の形態に係る治療用組成物について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。

〔実験方法〕
（動物）
６週齢オスマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：日本エスエルシー株式会社）を使用し、これらのマウスを１２時間の明期／暗期周期で飼育した。
マウスは、８週間、水、及び標準食（Ｓｒａｎｄａｒｄ Ｄｉｅｔ）若しくは高脂肪食（Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ： ＨＦＤ）を自由摂取条件下で飼育した。標準食は、ＣＥ−２（日本クレア株式会社製）を用いた。また、高脂肪食は、ＨＦＤ３２（食餌中脂肪重量３２％：日本クレア株式会社製）を用いた。
また、動物の実験手順及び処理は、自治医科大学の動物倫理委員会の規定に従って実行した。

（単回オキシトシン投与の摂食量の測定）
動物は暗期の２時間前から絶食し、暗期の始めに、オキシトシンを２００若しくは４００μｇ／１０ｍｌ／ｋｇを腹腔内（ＩＰ）、又は１，６００μｇ／５ｍｌ／ｋｇを皮下投与した。この投与用オキシトシンは、株式会社ペプチド研究所製のオキシトシンを用いた。
その際、０．５時間、１時間、２時間、３時間、及び６時間経過時の累積摂食量を測定した。
ｖｅｈｉｃｌｅとして、滅菌した生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を使用した。

（連続的オキシトシン投与（１回／日）による摂食量及び体重の測定）
オキシトシン投与群は、ＨＦＤ誘発肥満マウス（ＤＩＯマウス、体重４３．９±０．８ｇ）に、１７日間にわたり、暗期の２時間前に、皮下にｖｅｈｉｃｌｅ又は投与量１，６００μｇ／５ｍｌ／ｋｇのオキシトシンを投与した。１６００μｇ／ｋｇ／ｄａｙに設定した理由としては、４００μｇ／ｋｇの腹腔内単回投与で、摂食量が６時間は確実に抑制されていたため、１日を２４時間としたときにその４倍のｄｏｓｅを設定した。
コントロール群は、１７日間、ｖｅｈｉｃｌｅのみ投与した。
その後１０日間、両群の動物はｖｅｈｉｃｌｅを投与した。体重と摂食量は毎日の皮下投与の際、同時間に測定した。

（浸透圧ミニポンプでの長期オキシトシン投与の際の摂食量、体重、及び脂肪量の測定）
上述したように、ＤＩＯマウス（体重３５．５±０．８ｇ）に、浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ社製、Ａｌｚｅｔ ｍｉｎｉ−ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｕｍｐ モデル２００２）を使用して、１４日間、生理的食塩水又は１，６００μｇ／ｋｇ／日のオキシトシンを皮下投与した。投与開始後１４日目に、コントロール群（Ｃｏｎｔ）及びオキシトシン投与群（Ｏｘｔ）の肝臓、腸間膜、及び精巣周囲脂肪重量を測定した。これらの組織断片を４％のパラホルムアルデヒドに浸漬、固定し、パラフィンに包埋した。
５μｍのパラフィン切片を作成し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。脂肪細胞のサイズ（相対面積）は、ＮＩＨイメージ・ソフトウェア（イメージＪ １．４４ｐ、米国国立保健研究所ＮＩＨ製）によって測定した。

（ｃ−Ｆｏｓ発現の測定）
オキシトシン（４００μｇ／ｋｇ）の腹腔内投与の９０分後に、４％パラホルムアルデヒドにより灌流固定した。
１２０μｍ間隔での前額断切片を作成しｃ−Ｆｏｓ免疫染色に供試した。
抗体はウサギ抗ｃ−Ｆｏｓ （ｓｃ−５２： Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ＣＡ）を１：５０００の希釈倍率で使用した。

（呼吸商、エネルギー消費量、及び自発運動量の測定）
マウスの呼吸商（ＲＱ）及びエネルギー消費量（Ｅｎｅｒｇｙ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ、ＥＥ）は、オキシマックス（Ｃｏｌｏｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を使用して、間接熱量測定法によって測定した。
ＤＩＯマウスを、オキシトシン投与開始９〜１４日目に、ＨＦＤと水に自由摂取の条件下で、アクリル製のカロリーメータチャンバーにそれぞれ入れ、２０〜２４時間チャンバーに馴化させた後測定を開始した。０．６Ｌ／ｍｉｎの空気流量下で、ＶＯ２とＶＣＯ２は１つのチャンバーにつき１分の測定を５分毎、２４時間測定した。呼吸商（ＲＱ）は １分あたりのＶＣＯ₂／Ｏ₂ により計算し、
エネルギー消費量（ＥＥ）は、

ＥＥ ＝ （３．８５ ＋ １．２３２ × ＲＱ） × ＶＯ₂

として計算した。
自発運動量（Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、個々のマウスを入れたカロリーメータチャンバーに設置したマウス用運動量測定装置（ＡＣＴＩＭＯ−１００、株式会社シンファクトリー製）を使用して、ＸおよびＹ方向の両方の赤外線ビームを遮った数によって推定した。

（耐糖試験及びインスリン感受性試験）
糖負荷試験（ＧＴＴ）については、４時間絶食させたＤＩＯマウスに、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。
インスリン負荷試験（ＩＴＴ）については、４時間絶食させたＤＩＯマウスに、ヒトインスリン（１ ＩＵ／ｋｇ）を腹腔内投与した。
血糖値はＧｌｕｃｏｃａｒｄ（アークレイ株式会社製）により測定した。
糖負荷試験は、オキシトシン投与後７日目に、インスリン負荷試験は１１日目に行った。

（収縮期血圧）
収縮期血圧の測定は、ＭＫ−２０００ＳＴ（室町機械株式会社製）を用いて、Ｔａｉｌ−Ｃｕｆｆ法により測定した。マウスを測定に馴化させるために、マウスにオキシトシン投与開始５日前から血圧測定を開始した。
収縮期血圧は、オキシトシン投与手術から完全に回復したと考えられる８日目からデータとした。５回測定した平均値をデータとした。

（統計解析）
２群間の平均値の差の統計解析は、対応のないｔ−検定により行った。多群間の平均値の差の統計解析は一元配置分散分析により行った。

（カプサイシン全身処理によるカプサイシン感受性感覚神経／自律神経障害マウスの作成）
Ａｖｅｒｉｎ麻酔下（ｔｒｉｂｒｏｍｏｅｔｈａｎｏｌ ２００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）のＣ５７ＢＬ６／Ｊ（雄性）に対して、カプサイシン（ｃａｐｓａｉｃｉｎ、５０ｍｇ／ｋｇ ａｎｄ ７５ ｍｇ／ｋｇ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ １０％ Ｔｗｅｅｎ８０ ｉｎ ｓａｌｉｎｅ）を、低用量から順に１日おきに皮下投与した。
さらに１日おいて、カプサイシン（５ｍｇ／ｋｇ）を無麻酔下で腹腔投与した。２日間以上回復させた後、２週間以内に実験を行った。

（横隔膜下迷走神経切断マウスの作成）
Ａｖｅｒｉｎ麻酔下（ｔｒｉｂｒｏｍｏｅｔｈａｎｏｌ ２００ ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）のＣ５７ＢＬ６／Ｊ（雄性）の腹部を、正中線に沿って開腹した。食道を露出するために臓器を左右に移動させ、食道と平行して走行する迷走神経束を同定し、この周囲の組織から露出後、神経束を切断した。
位置を移動させた臓器を元に位置に戻し、開腹部を縫合した。この迷走神経束を露出までし、切断しなかった動物を偽手術群（Ｓｈａｍ群）とした。
術後は液体食（乳幼児用粉ミルク）と水を自由摂取させ、一週間以上回復期間を与え、その後実験を行った。

（単一Ｎｏｄｏｓｅ Ｇａｎｇｌｉｏｎ（ＮＧ）ニューロンの調製と、細胞内Ｃａ²⁺濃度の測定）
雄性ＩＣＲマウスのＮＧを摘出、酵素処理（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／Ｄｉｓｐａｓｅ）により単一細胞を調製し、ＦＢＳ、抗生物質含有ＭＥＭ培地で一晩培養した。灌流下にｆｕｒａ−２蛍光画像解析により［Ｃａ²⁺］_iをリアルタイム計測し、ホルモン添加の作用を調べた。

［Ｃａ²⁺］_iは、２波長励起ｆｕｒａ−２蛍光顕微測光・画像解析法にて測定された。
蛍光は画像カメラ（ＩＣＣＤ（インテンシファイア付電荷結合素子）カメラ又はＣＣＤカメラ）により検出された。また、レシオ（比）・イメージは、蛍光画像解析装置であるＡＲＧＵＳ−５０システム又はＡｑｕａｃｏｓｍｏｓシステム（浜松ホトニクス社製、浜松、日本）を用いて取得した。

［Ｃａ²⁺］_iの測定は、単一ニューロンの調製後、２〜６時間静置し、Ｃａ²⁺感受性酵素ｆｕｒａ−２を用いたレシオメトリックイメージングにより行った。ｆｕｒａ−２の負荷は、［Ｃａ²⁺］_i測定直前の１時間、２μＭのｆｕｒａ−２／アセトキシメチル・エステル（ＡＭ）（株式会社ケミカル同仁製、熊本、日本）を添加して、室温で培養して行った。その後、細胞は倒立顕微鏡のステージ上の保温装置付チェンバーに取り付けられ、３２℃で１ｍｌ／分でＨＫＲＢにより灌流された。
細胞は、３４０及び３８０ｎｍで交互に１２．０秒ごとに励起され、５１０ｎｍ蛍光はＩＣＣＤカメラ又はＣＣＤカメラにより検出された。
また、レシオ（Ｆ３４０／Ｆ３８０）イメージはＡＲＧＵＳ−５０あるいはＡｑｕａｃｏｓｍｏｓシステムで取得した。
データは従来に報告された手順により、形態学的及び生理学的なニューロン判定基準を満たす細胞から得られた。
薬剤に応じた［Ｃａ²⁺］_i増加のピーク振幅が、自発的な変動の２倍以上だった場合、それらは［Ｃａ²⁺］_i応答であるとした。
薬剤に応じた［Ｃａ²⁺］_i増加の振幅は、ピーク［Ｃａ²⁺］_iレシオから刺激前の基準となる［Ｃａ²⁺］_iレシオを引くことにより計算された。
阻害剤の影響を調査する実験では、刺激性の薬剤に誘発された［Ｃａ²⁺］_i増加の振幅が３０％以上阻害剤で抑えられた場合、抑制と判定した。

〔結果〕
（オキシトシンの腹腔内投与による摂食量抑制及び視床下部のｃ−Ｆｏｓ発現）
まず、図１Ａ〜Ｆを参照して、オキシトシンの腹腔内投与の実験について説明する。
オキシトシンの腹腔内投与は摂食量を抑制し、ｃ−Ｆｏｓを視床下部と脳幹において発現させる。ｃ−Ｆｏｓの発現は、神経興奮のマーカーとしてよく用いられている。つまり、オキシトシンの腹腔内投与は、視床下部および脳幹のニューロンを活性化し、摂食量を抑制する。

図１Ａは、標準食を与えたマウスにおける、オキシトシンの腹腔内投与の後の摂食量を示すグラフである。白いバーは、コントロール群（以下、図中で「Ｃｏｎｔ」として示す。）の生理的食塩水（ｎ＝５）を腹腔内投与した結果を示す。グレーのバーは、オキシトシン群（以下、図中で「Ｏｘｔ」として示す。）であり、２００μｇ／ｋｇの投与量を与えた結果を示す（ｎ＝５）。黒いバーは、４００μｇ／ｋｇの投与量のオキシトシン（ｎ＝５）を与えた結果を示す。横軸は腹腔内投与からの時間、縦軸は摂食量（ｇ）を示す。
オキシトシン（２００μｇ／ｋｇ及び４００μｇ／ｋｇ）の腹腔内投与は、コントロール（図１Ａ）と比較して、１〜６時間の摂食量を有意に抑制した。

図１Ｂ〜図１Ｅは、４００μｇ／ｋｇのオキシトシンの腹腔内投与による、脳内のｃ−Ｆｏｓの発現を示す写真である。それぞれの図において、左図はコントロール右図はオキシトシン投与後の写真を示す。また、図１Ｂは室傍核（ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＰＶＮ）、図１Ｃは弓状核（ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＡＲＣ）、図１Ｄは青斑核（ｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ、ＬＣ）、図１Ｅは孤束核（ｎｕｃｌｅｕｓ ｔｒａｃｔｕｓ ｓｏｌｉｔａｒｉｕｓ、ＮＴＳ）、迷走神経背側運動核（ｄｏｒｓａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｖａｇｕｓ ｎｅｒｖｅ、ＤＭＸ）および最後野（ａｒｅａ ｐｏｓｔｒｅｍａ、ＡＰ）のｃ−Ｆｏｓ発現を示す。オキシトシンの腹腔内投与によりこれらの部位に、ｃ−Ｆｏｓの発現が見られた。つまり、これらの領域のニューロンが活性化した。
なお、図１Ｅにおいて、図中のＣＣは中心管（ｃｅｎｔｒａｌ ｃａｎａｌ）を示す。

図１Ｆのグラフは、４００μｇ／ｋｇのオキシトシン（黒）又は生理的食塩水（白）の投与後の、視床下部および脳幹の摂食関連の領域（横軸）のｃ−Ｆｏｓ陽性のニューロンの数（縦軸）を示す。図１Ｆにおいて、オキシトシン群及びコントロール群はｎ＝５である。また、以降の図面において、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１を示す。
室傍核、青斑核、孤束核、迷走神経背側運動核、最後野において、顕著にｃ−Ｆｏｓの発現が増加していることが分かる。
対照的に、視交叉上核（ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＳＣＮ）、視索上核（ｓｕｐｒａｏｐｔｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＳＯＮ）、背内側核（ｄｏｒｓｏｍｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＤＭＨ）および腹内側核（ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＶＭＨ）にはオキシトシン投与によりｃ−Ｆｏｓ発現は増加しなかった。

（連続的オキシトシン投与（１回／日）による摂食量及び体重の減少）
次に、図２Ａ〜図２Ｄを参照して、オキシトシンを毎日繰り返し皮下投与した際の、摂食量と体重の変化ついて説明する。
図２Ａ及び図２Ｂは、標準食マウス（図２Ａ）及びＤＩＯマウス（図２Ｂ）にオキシトシンを１，６００μｇ／ｋｇの投与量で単回皮下投与した際の、１、２、３、６、２４時間（横軸）の累積的な摂食量（縦軸）を示すグラフである。オキシトシン投与群及びコントロール群はそれぞれｎ＝５である。結論として、単回のオキシトシン（１，６００μｇ／ｋｇ）皮下投与は、標準食を与えたマウス（図２Ａ）及びＨＦＤを与えたマウス（図２Ｂ）の両方の摂食量を有意に抑制した。
図２Ｃ及び図２Ｄは、ＤＩＯマウスにおいて、一日に一回の皮下オキシトシン投与（１，６００μｇ／ｋｇ）した際の、日々の摂食量（図２Ｃ）及び体重変化量（図２Ｄ）を示すグラフである。図２Ｃおよび図２Ｄのそれぞれのグラフで、横軸は投与開始からの日数、縦軸は摂食量（ｇ）を示す。また、灰色のエリアは、投与開始から１日〜１７日目のオキシトシン投与期間を示す。また、オキシトシン皮下投与は１７日目でまでとし１８日目からｖｅｈｉｃｌｅのみを投与した。
図２Ｃによると、オキシトシン（１，６００μｇ／ｋｇ）を、１７日間、毎日、皮下投与したところ、ＤＩＯマウスで最初の６日（図２Ｃ）まで、摂食量を減少させた。６日目以降の摂食量においてコントロールとオキシトシンのグループ間に有意差はなかった。
図２Ｄによると、体重変化量は、オキシトシンを投与開始してから９日目まで減少した。オキシトシン投与を中止した１７日目に、体重変化量は−１．６（±０．４）ｇで、投与日（０日目）の体重の−３．６％に匹敵した。体重変化量の減少は、オキシトシン投与期間には、コントロールのレベルには回復しなかった。体重変化量の顕著な減少は、９日目から２６日目まで継続して観察された。

（浸透圧ミニポンプによる長期オキシトシン投与）
次に、図３Ａ〜図３Ｎを参照して、浸透圧ミニポンプによって長期オキシトシン投与（１，６００μｇ／ｋｇ／日）をした際の、ＤＩＯマウスの、体重および摂食量と内臓脂肪の測定について説明する。
図３Ａは、浸透圧ミニポンプによるオキシトシン（１，６００μｇ／ｋｇ／日）投与後の体重変化量を示す。横軸はオキシトシン投与開始からの日数、縦軸は体重変化量（ｇ）を示す。結論として、浸透圧ミニポンプによる長期オキシトシン投与（１，６００μｇ／ｋｇ／日）は、ＤＩＯマウスで、有意な体重変化量の減少につながった。また、浸透圧ミニポンプをインプラントした最初の２日間に、体重変化量の急激な低下が検出された。オキシトシン投与群の１３日目の体重変化量は−４．６（±１．２）ｇであり、これはオキシトシン投与群の０日目の体重の−１３％に匹敵した。
図３Ｂは、図３Ａにおける日々の摂食量を示すグラフである。横軸はオキシトシン投与開始からの日数、縦軸は摂食量（ｇ）を示す。
図３Ｃは、図３Ｂから計算された累積的な１〜６日の摂食量である。白いバーはコントロール群、黒いバーはオキシトシン投与群を示す。縦軸は、累積的な１〜６日の摂食量（ｇ）を示す。最初の６日間の摂食量は、有意に減少した。
結論として、長期にわたるオキシトシン投与は、体重変化量、摂食量、を有意に減少させた。

図３Ｄ〜図３Ｅは、コントロール群及び浸透圧ミニポンプによるオキシトシン投与マウス群における、腸間膜脂肪の湿重量（ｇ）（図３Ｄ）、脂肪組織の切片から計算された脂肪細胞の相対面積（％）（図３Ｅ）である。また、図３Ｆ〜図３Ｇは、コントロール群のマウス（図３Ｆ）およびオキシトシン投与群のマウスの腸間膜脂肪組織の顕微鏡写真（図３Ｇ）である。
図３Ｈ〜図３Ｉは、各群のマウスの、精巣周囲脂肪の湿重量（ｇ）（図３Ｈ）、脂肪細胞の相対面積（％）（図３Ｉ）を示す。また、図３Ｊ〜図３Ｋは、コントロール群（図３Ｊ）および、オキシトシン投与群の精巣周囲脂肪組織の顕微鏡写真（図３Ｋ）である。
図３Ｌは、各群のマウスの肝臓の脂肪の湿重量（図３Ｌ）を示す。また、図３Ｍ〜図３Ｎは、コントロール群（図３Ｍ）および、オキシトシン投与群の肝臓組織の顕微鏡写真（図３Ｎ）を示す。
図３Ａ〜図３Ｎのそれぞれのグラフで、白いバーはコントロール群、黒いバーはオキシトシン投与群を示す。
図３Ａ〜図３Ｎの顕微鏡写真の目盛バーは５０μｍを示す。これらの結果によると、オキシトシン投与により腸間膜脂肪（図３Ｄ〜図３Ｇ）及び精巣周囲脂肪（図３Ｈ〜図３Ｋ）の湿重量及び脂肪組織の相対面積、脂肪細胞サイズが有意に減少した。さらに、肝臓細胞に蓄積する脂肪含量が有意に減少し、脂肪肝の顕著な改善が観察された（図３Ｌ〜図３Ｎ）。

（長期オキシトシン投与における、脂肪の消費と耐糖能）
次に、図４Ａ〜図４Ｉを参照して、浸透圧ミニポンプによる長期オキシトシン投与時の脂肪の消費と耐糖能への影響について説明する。
エネルギー消費およびその基質利用に対するオキシトシンの影響を同定するため、投与後７〜１１日目における、呼吸商（図４Ａ、図４Ｂ）、エネルギー消費量（図４Ｃ、図４Ｄ）および自発運動量（図４Ｅ、図４Ｆ）を調べた。結論として、長期オキシトシン投与は、脂肪の消費を促進することが明らかになった。

より詳しく説明すると、図４Ａは、オキシトシン投与における、呼吸商（ＲＱ）の経時的変化を示す。白はコントロール群を示し、黒はオキシトシン投与群を示す。グラフの横軸は時間（ｈｒ）を示す。また、グラフの「Ｌｉｇｈｔ」は明期を示し、「Ｄａｒｋ」は暗期を示す。
図４Ｂは、図４Ａの明期と暗期における呼吸商の平均を示す。白いバーはコントロール群、黒いバーはオキシトシン投与群を示す。また、「Ｌｉｇｈｔ」は明期を示し、「Ｄａｒｋ」は暗期を示す。
結果として、呼吸商は、オキシトシン投与グループ（図４Ａ、図４Ｂ）で、明期特異的に有意に減少した。つまりオキシトシン投与によりエネルギー基質として脂肪の利用が増加した。

図４Ｃは、図４Ａと同様に、長期的なオキシトシン投与によるエネルギー消費量（ｋｃａｌ／ｇ／ｈｒ）の経時的変化示している。グラフの横軸は時間（ｈｒ）を示す。また、グラフの「Ｌｉｇｈｔ」は明期を示し、「Ｄａｒｋ」は暗期を示す。
図４Ｄは、図４Ｃにおいて、明期と暗期のエネルギー消費量の平均を示す。白いバーはコントロール群、黒いバーはオキシトシン投与群を示す。また、「Ｌｉｇｈｔ」は明期を示し、「Ｄａｒｋ」は暗期を示す。
コントロールとオキシトシン投与グループ間のエネルギー消費量の平均値に明期、暗期ともに有意な差はなかった（図４Ｄ）が、オキシトシン投与グループのいくつかの測定ポイントでわずかに増加した（図４Ｃ）。

図４Ｅは、長期的なオキシトシン投与による、自発運動量への経時的変化を０．５時間の累積（ｃｏｕｎｔ ／ ０．５ｈｒ）で示したグラフである。グラフの横軸は時間（ｈｒ）を示す。また、グラフの「Ｌｉｇｈｔ」は明期を示し「Ｄａｒｋ」は暗期を示す。
図４Ｆは、明期と暗期の累積自発運動量（ｃｏｕｎｔ）の平均を示す。白いバーはコントロール群、黒いバーはオキシトシン投与群を示す。また、「Ｌｉｇｈｔ」は明期を示し、「Ｄａｒｋ」は暗期を示す。
コントロールとオキシトシンの投与グループ間の自発運動量に差異はなかった（図４Ｅ、図４Ｆ）。

図４Ｇは、グルコース代謝を評価するため、４時間絶食させたマウスで糖負荷試験を行った際の血糖値（ｍｇ／ｄｌ）示す。図４Ｇでは、２ｇ／ｋｇのブドウ糖を腹腔内投与した。グラフの横軸は、投与後の時間（分）である。
空腹時血糖はコントロールとオキシトシンの投与グループ間で差はなかった。しかしながら、オキシトシン投与群のマウスは、ブドウ糖腹腔内投与１５分後の血糖上昇が、コントロール群と比較して抑制されており、耐糖能改善作用を示した。

図４Ｈは、４時間絶食させたマウスでインスリン負荷試験をした結果を示す。図４Ｈでは、１ＩＵ／ｋｇのヒトインスリンを投与した。縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ），横軸はインスリン投与後の時間（分）である。
図４Ｈの各計測点で、血糖値は、コントロール群とオキシトシンの投与群間で差はなかった。

（ＤＩＯマウスの血圧）
図４Ｉは、この正常血圧に対する持続的なオキシトシン投与の影響を検討するために、オキシトシン投与後８〜１２日間の５日間の収縮期血圧を測定した結果を示す。横軸は、オキシトシン投与後の日数（日）、縦軸は血圧（ｍｍＨｇ）である。
ＤＩＯマウスの血圧は正常値を示した。
これら５日間の測定において、コントロールとオキシトシンの投与グループの間で、血圧（図４Ｉ）レベルと心拍数（図示せず）の差はなかった。

以上のように、オキシトシンの腹腔内投与及び浸透圧ミニポンプによる投与により、マウスで摂食量を濃度依存的に減少させることができた。
また、オキシトシンの腹腔内投与の後にｃ−Ｆｏｓタンパク質は、室傍核（ＰＶＮ）、孤束核（ＮＴＳ）及び弓状核を含むいくつかの脳領域に分布した。
このように、オキシトシンの腹腔内投与により、正常又は食物誘発された食餌性肥満（Ｄｉｅｔ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ）マウスの摂食行動が抑制された。具体的には、１７日間、食餌性肥満マウスのオキシトシンを皮下投与したところ、摂食量と体重を減少させた。浸透圧ミニポンプによる１３日の長期オキシトシン処理では、摂食量を減少させ、体重を１３％減少させた。
さらに、オキシトシンは腸間膜及び精巣周囲脂肪の組織量及びサイズを減少させた。
その上に、オキシトシンは、食餌性肥満マウスの脂肪肝及び耐糖能を改善した。また、オキシトシンは呼吸商を減少させて、わずかにエネルギー消費を増加させた。
しかし、オキシトシン処理は自発運動と血圧には、影響しなかった。
これらの結果は、オキシトシン処理されたマウスの腹部脂肪量の減少は、摂食量の減少とエネルギー基質としての脂肪消費の亢進に起因すると考えられる。
よって、末梢のオキシトシン治療はヒト肥満の治療のための有用な治療の手法でありえる。

（オキシトシンの摂食への影響）
次に、図５Ａ〜図５Ｄを参照して、オキシトシン投与マウスの摂食量に関する影響の結果について説明する。
図５Ａは、オキシトシン投与後の摂食量の測定を示すグラフである。図５Ａの実験では、標準食で飼育し、実験当日１７：３０から絶食させた正常マウスに対して、２００又は４００μｇ／ｋｇのオキシトシンを、暗期開始時の１９：３０に末梢（腹腔内）投与し、その後の摂食量を測定した。白いバーは、コントロール（生理的食塩水）投与群の結果を示す。灰色のバーは、２００μｇ／ｋｇのオキシトシン投与群の結果を示す。黒色のバーは、４００μｇ／ｋｇのオキシトシン投与群を示す。図５Ａでは、０．５、１、３、６、２４時間後の節食量（ｇ）を測定した。
結果として、オキシトシンの末梢投与は、２００又は４００μｇ／ｋｇの両容量に対して、６時間まで有意に摂食量を抑制させた。

図５Ｂは、カプサイシン全身処理によるカプサイシン感受性感覚神経障害マウスの摂食量の測定を示すグラフである。標準食で飼育し、実験当日１７：３０から絶食させたマウスに対して、２００又は４００μｇ／ｋｇのオキシトシンを、暗期開始時の１９：３０に末梢（腹腔内）投与し、その後の摂食量を測定した。白いバーは、コントロール（生理的食塩水）投与群の結果を示す。灰色のバーは、２００μｇ／ｋｇのオキシトシン投与群の結果を示す。黒色のバーは、４００μｇ／ｋｇのオキシトシン投与群を示す。図５Ｂでも、図５Ａと同様に、０．５、１、３、６、２４時間後の節食量（ｇ）を測定した。
結果として、カプサイシン全身処理によるカプサイシン感受性感覚神経障害マウスに対しては、２００μｇ／ｋｇの腹腔内投与群で、オキシトシン末梢投与による摂食抑制効果は完全に消失した。４００μｇ／ｋｇオキシトシン腹腔内投与群の摂食抑制効果については、１時間までは完全に消失したが、投与後３時間、６時間の摂食抑制効果は観察された。
従って、末梢オキシトシン投与により、求心性迷走神経が含まれるカプサイシン感受性感覚神経を介して摂食を抑制可能であることが示唆された。

図５Ｃと図５Ｄは、それぞれ、横隔膜下迷走神経切断の偽手術群（Ｓｈａｍ群）と、迷走神経切断マウス（Ｖａｇｏｔｏｍｙ群）の液体食摂食量の測定を示すグラフである。術後から液体食で飼育し、実験前日１８：００から絶食させたマウスに対して、２００μｇ／ｋｇのオキシトシンを、明期時の１０：００に末梢（腹腔内）投与し、その後の摂食量を測定した。それぞれ白いバーは、コントロール（生理的食塩水）投与後の摂食量を示す。灰色のバーは、オキシトシン２００μｇ／ｋｇ腹腔内投与後の摂食量を示す。図５Ｃ及び図５Ｄでは、０．５、１、３、６時間後の節食量（ｇ）を測定した。
図５ＣのＳｈａｍ群は、実験前日の１８：００から１６時間絶食させた条件下においても、２００μｇ／ｋｇのオキシトシンの末梢投与によって１時間まで強い摂食抑制効果が観察された。
一方で、図５Ｄの迷走神経切断マウスでは、オキシトシン投与による摂食抑制効果は消失した。
従って、末梢オキシトシンは迷走神経を介して摂食を抑制することが示された。

（単離ニューロンにおける細胞内Ｃａ²⁺濃度）
次に、図６Ａ〜図６Ｄを参照して、オキシトシン末梢投与による摂食抑制効果に対する作用機構について説明する。
ここでは、末梢オキシトシンの摂食抑制に求心性迷走神経が関与することから、オキシトシンの求心性迷走神経への直接作用を検証した。

図６Ａと図６Ｂは、求心性迷走神経の細胞体であるＮｏｄｏｓｅ Ｇａｎｇｌｉｏｎから単離されたニューロン（以下、単に「単離ニューロン」という。）の細胞内Ｃａ²⁺濃度（［Ｃａ²⁺］_i）の変化を示す図である。上部に示す化合物名とバーが、投与している試薬と投与時間を示す。図６Ａは、１０^-11Ｍ、１０^-10Ｍ、１０^-7Ｍのオキシトシンと、神経を脱分極させる高濃度（５５ｍＭ）のＫＣｌを投与した際の［Ｃａ²⁺］_i変化のグラフである。
図６Ｂは、同様に、１０^-9Ｍ、１０^-8Ｍ、１０^-7Ｍのオキシトシンと、５５ｍＭのＫＣｌを投与した際の［Ｃａ²⁺］_iのグラフである。
図６Ａ、図６Ｂとも、横軸は時間（分）を示し、縦軸は［Ｃａ²⁺］_i変化を示す。
オキシトシンは単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_iを濃度依存的に増加させた。

図６Ｃは、オキシトシンの濃度と［Ｃａ²⁺］_iを増加させる単離ニューロンの割合（％）を示すグラフである。横軸は、オキシトシンの対数濃度（Ｍ）を示す。結果として、オキシトシンは、濃度依存的に、［Ｃａ²⁺］_iを増加させるニューロンの割合を増加させた。
図６Ｄは、オキシトシンの濃度と各単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化量（振幅）を示すグラフである。横軸は、オキシトシンの対数濃度（Ｍ）を示す。結果として、オキシトシンは、濃度依存的に、［Ｃａ²⁺］_iの変化量（振幅）も増加させた。
従って、オキシトシンは、直接迷走神経細胞に作用し、神経活性化の指標である［Ｃａ²⁺］_iを濃度依存的に上昇させることが明らかとなった。

（オキシトシンによる単離ニューロン［Ｃａ²⁺］_i上昇作用におけるオキシトシン受容体の関与）
次に、図７Ａ〜図７Ｃを参照して、オキシトシンによる単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i上昇における、オキシトシン受容体の関与を調べた。近年、単離ニューロンにはオキシトシン受容体が発現していることが報告された（Ｍ．Ｇ．Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．、、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．、、、２００９、ｖｏｌ．５１２、ｐ．２５６〜を参照）。
図７Ａは、１０^-8Ｍのオキシトシンの２回連続投与における、［Ｃａ²⁺］_i変化のグラフである。Ｓ１は最初の投与を示し、Ｓ２は２回目の投与を示す。また、横軸は時間（分）を示す。
結果として、オキシトシンの２回連続投与では、ほぼ等しい［Ｃａ²⁺］_i上昇が生じた。

図７Ｂは、図７Ａと同様のオキシトシンの２回連続投与において、最初の投与の際、オキシトシン受容体アンタゴニストであるＨ４９２８で前処理した際の［Ｃａ²⁺］_i変化のグラフである。Ｓ１は最初の投与を示し、Ｓ２は２回目の投与を示す。また、横軸は時間（分）を示す。
具体的に、最初の１０^-8Ｍのオキシトシン投与による刺激の際だけ、１０^-7ＭのＨ４９２８を前投与した。この結果、オキシトシン受容体アンタゴニストＨ４９２８存在下でのオキシトシン誘発［Ｃａ²⁺］_i上昇は、アンタゴニスト非存在下での［Ｃａ²⁺］_i上昇と比較して顕著に抑制された。

図７Ｃは、図７Ａと図７Ｂの結果をまとめた結果を示した。
縦軸は、２回目のオキシトシン誘発の［Ｃａ²⁺］_i増加量を１００％としたときの、１回目のオキシトシン誘発［Ｃａ²⁺］_i増加量を％で示した。また、図７Ａの結果を左側のグラフに、図７Ｂの結果を右側のグラフに示した。
オキシトシン受容体アンタゴニスト存在下のオキシトシン誘発［Ｃａ²⁺］_i上昇は、非存在下と比較して統計的に有意に減少した。
従って、単離ニューロンにおけるオキシトシン誘発［Ｃａ²⁺］_i上昇は、オキシトシン受容体を介していることが明らかとなった。

（オキシトシン、ＣＣＫ、カプサイシン、及びＮｅｓｆａｔｉｎ−１によって活性化される単離ニューロンが重複するのか、別々で異なるのか、その反応性と反応ニューロンの関係）
次に、図８Ａ〜図８Ｃを参照して、オキシトシン、Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ（ＣＣＫ）、及びカプサイシン（ｃａｐｓａｉｃｉｎ、ＣＡＰ）反応ニューロンとの関係を調べた。
従来の研究より、求心性迷走神経に作用して摂食を抑制する末梢因子としてＣｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎが明らかとなっている。また、上述の結果から、オキシトシン誘発摂食抑制効果はカプサイシン全身処理マウスで消失したことより、カプサイシン感受性感覚神経の関与が示唆された。さらに、近年、本発明者らは、新規摂食抑制ペプチドＮｅｓｆａｔｉｎ−１の末梢投与が摂食を抑制し、この効果はカプサイシン全身処置マウスで完全に消失することを報告している（Ｈ． Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．、、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、、２００９、Ｖｏｌ３０、、ｐ．９９５−９９８を参照）。また、本発明者らは、Ｎｅｓｆａｔｉｎ−１が求心性迷走神経の単離ニューロンを直接活性化することを報告している（Ｙ． Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、、２００９、Ｖｏｌ３９０、、ｐ．９５８−９６２を参照）。従って、オキシトシンによって活性化する求心性迷走神経の単離ニューロンと、ＣＣＫの部分ペプチドで活性領域であるＣＣＫ−８、カプサイシン、Ｎｅｓｆａｔｉｎ−１によって活性化される単離ニューロンが重複するのか、別々で異なるのか、その反応性の分布を検証した。

図８Ａは、１０^-7Ｍのオキシトシン（Ｏｘｔ）、１０^-8ＭのＣＣＫ−８（ＣＣＫ）、及び１０^-7Ｍのカプサイシン（ＣＡＰ）、及び神経の脱分極刺激となる５５ｍＭのＫＣｌを、それぞれの順番で投与した時の単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化を示す代表例である。横軸は時間を示す。この単離ニューロンは、オキシトシン、ＣＣＫ−８、及びカプサイシンの全てにおいて［Ｃａ²⁺］_i上昇を引き起こした。
図８Ｂは、図８Ａと同様の濃度と順番でオキシトシン（Ｏｘｔ）、ＣＣＫ−８、カプサイシン（ＣＡＰ）投与により応答した各単離ニューロンの割合（％）を示したグラフである。
図８Ｃは、オキシトシン、ＣＣＫ−８、カプサイシンで応答する単離ニューロンの反応の組み合わせを図で示した。オキシトシンに応答する単離ニューロンの９３％がＣＣＫ−８に応答し、９８％がカプサイシンに応答することが明らかとなった。
従って、オキシトシン誘発の摂食抑制機構は、ＣＣＫ誘発摂食抑制機構と一部共通している可能性が示された。

図９Ａは、１０^-8ＭのＮｅｓｆａｔｉｎ−１（Ｎｅｓｆ−１）、１０^-7Ｍのオキシトシン（Ｏｘｔ）、及び神経の脱分極刺激となる５５ｍＭのＫＣｌを、この順番で投与した時、全ての刺激に応答した単離ニューロンの［Ｃａ²⁺］_i変化を示す代表例である。横軸は時間を示す。
図９Ｂは、Ｎｅｓｆ−１及びオキシトシン（Ｏｘｔ）投与により応答した各単離ニューロンの割合（％）を示すグラフである。
図９Ｃは、Ｎｅｓｆ−１及びオキシトシン（Ｏｘｔ）で応答する単離ニューロンの反応組み合わせを図で示した。Ｎｅｓｆ−１に応答する単離ニューロンは全てオキシトシンに応答することが明らかとなった。
現在、Ｎｅｓｆ−１の迷走神経求心路を介した摂食抑制の神経科学的機構も不明である段階であるが、Ｎｅｓｆ−１応答単離ニューロンの全てがオキシトシンによっても活性化することより、オキシトシン誘発摂食抑制機構と、Ｎｅｓｆ−１誘発摂食抑制機構は一部共通している可能性が示唆された。

以上によると、本発明の実施例において、オキシトシンがオキシトシン受容体を介して求心性迷走神経を直接活性化すること明らかとした。
さらに、末梢オキシトシンは、求心性迷走神経を介して摂食を抑制することを明らかとした。
また、末梢オキシトシンは、求心性迷走神経の投射先である延髄弧束核に、神経活性化マーカータンパクのｃ−Ｆｏｓの発現を誘導することを明らかとした。
また、オキシトシンによって活性化される単離ニューロンは、ＣＣＫやＮｅｓｆ−１によっても活性化されることより、求心性迷走神経を介したオキシトシン誘発摂食抑制機構は、ＣＣＫやＮｅｓｆ−１の摂食抑制機構と共通である可能性が示唆された。
図１０を参照すると、結論として、血液脳関門−視床下部弓状核経由に加え、求心性迷走神経経由でオキシトシンの末梢投与が食欲抑制を誘発すると考えられる。

（オキシトシン投与濃度と体重の関係）
図１１を参照して、上述の実施例と同様に、連続的オキシトシン投与（１回／日）による体重の測定の際、濃度を変化させた結果について説明する。図１１では、８００μｇ／ｋｇ／日のオキシトシン（ｎ＝３）、１６００μｇ／ｋｇ／日（ｎ＝３）、及びｖｅｈｉｃｌｅのみ与えたコントロール（ｎ＝４）のデータを示す。横軸は、２０１０／０７／０９を浸透性ミニポンプの埋め込み日とした測定日を示し、縦軸は体重（ｇ）を示す。なお、左端の体重は、浸透性ミニポンプの埋め込み前の体重である。
このように、８００μｇ／ｋｇ／ｄａｙでも同等の体重減少作用はあった。

なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。

本発明によれば、従来から分娩促進剤として市販されているオキシトシンを肥満・メタボリックシンドローム治療薬として長期末梢投与するため、抗肥満薬として応用の障壁は比較的少なく、産業上利用可能である。

Claims (13)

1. 所定投与量の末梢投与用のオキシトシンにより、血液脳関門−視床下部弓状核経由及び／又は求心性迷走神経経由で所定期間、刺激して摂食抑制させるよう構成され、
   前記血液脳関門−視床下部弓状核経由では、視床下部の弓状核及び室傍核を活性化し、
   前記求心性迷走神経経由では、オキシトシン受容体を介して前記求心性迷走神経を直接活性化し、当該求心性迷走神経経由の情報伝達の結果により、脳幹の孤束核、迷走神経背側核複合体、及び青斑核におけるｃ−Ｆｏｓ発現を誘発し、
   前記所定投与量は、４００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日である
   ことを特徴とする求心性迷走神経活性化剤。
2. 前記所定投与量は、８００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日である
   ことを特徴とする請求項１に記載の求心性迷走神経活性化剤。
3. 前記所定投与量は、１６００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日である
   ことを特徴とする請求項１に記載の求心性迷走神経活性化剤。
4. 収縮期血圧の正常レベルに影響を与えない
   ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤。
5. 前記所定期間の投与後にも１ヶ月〜数ヶ月間、摂食抑制の効果を持続させる
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤。
6. 精神活動に悪影響を及ぼさない
   ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤。
7. 浸透性ミニポンプ又は皮下投与を用いる
   ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤。
8. 前記所定期間は、前記所定投与量を１０日〜１ヶ月間維持する
   ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤。
9. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤を用いる
   ことを特徴とする食欲抑制剤。
10. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤を用い、
    呼吸商の低下、及び脂肪細胞肥大化抑制を含む機構により、内蔵脂肪量を減らす
    ことを特徴とする脂肪消費促進剤。
11. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤を用い、
    呼吸商の低下、及び脂肪細胞肥大化抑制を含む機構により、内蔵脂肪量を減らす
    ことを特徴とする脂肪肝治療剤。
12. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の求心性迷走神経活性化剤を用い、
    インスリン分泌を促進する
    ことを特徴とする糖尿病治療剤。
13. 所定投与量と所定期間でオキシトシンを末梢投与し、血液脳関門−視床下部弓状核経由及び／又は求心性迷走神経経由で、
    前記血液脳関門−視床下部弓状核経由では、視床下部の弓状核及び室傍核を活性化し、
    前記求心性迷走神経経由では、オキシトシン受容体を介して前記求心性迷走神経を直接活性化し、当該求心性迷走神経経由の情報伝達の結果により、脳幹の孤束核、迷走神経背側核複合体、及び青斑核におけるｃ−Ｆｏｓ発現を誘発することで摂食抑制させ、
    前記所定投与量は、４００μｇ／ｋｇ／日〜２０００μｇ／ｋｇ／日である
    ことを特徴とするヒトを除く家畜動物種及び野生動物の求心性迷走神経活性化方法。

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