WO2005097171A1 - 抗肥満薬 - Google Patents

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WO2005097171A1
WO2005097171A1 PCT/JP2005/006024 JP2005006024W WO2005097171A1 WO 2005097171 A1 WO2005097171 A1 WO 2005097171A1 JP 2005006024 W JP2005006024 W JP 2005006024W WO 2005097171 A1 WO2005097171 A1 WO 2005097171A1
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WO
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agf
mice
mouse
seq
amino acid
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PCT/JP2005/006024
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English (en)
French (fr)
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Kunio Yasunaga
Noboru Yamaji
Toshio Suda
Yuichi Oike
Original Assignee
Astellas Pharma Inc.
Keio University
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Publication date
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to an Angiopoietin-related growth factor
  • AGF anti-obesity drug
  • AGF a derivative thereof or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • the anti-obesity drug of the present invention can be given in various forms that can be administered as a medicament, for example, in the form of a food or drink as a health food (preferably a functional food) or a feed.
  • Exercise therapy and diet therapy are basic methods for improving obesity, but it is difficult to continuously perform both.
  • sibutramine and orlistat are mainly used worldwide. However, their effectiveness is weak, and both have side effects.
  • Japan only mazindol is approved, but its application is limited to highly obese people, and the administration period is also limited (Non-patent Document 2).
  • Lebutin is well known as a factor involved in the accumulation of adipose tissue that causes obesity and diabetes.
  • Leptin is a weight gain inhibitory hormone, and it is known that deficiency of leptin increases appetite, reduces energy consumption, and leads to obesity.
  • Such discovery of factors involved in adipose tissue accumulation and adipocyte hypertrophy is extremely useful for the development of a therapeutic drug for diseases such as obesity, diabetes, or hyperlipidemia (Non-patent Document 6).
  • Angiopoietin-related growth factor is a secreted protein having a coiled-coil domain on the N-terminal side and a fibrinogen-like domain on the C-terminal side.
  • AGF is the same as NL8 reported in Patent Document 1, and it has been reported that when NL8 is stably expressed in CHO cells and implanted subcutaneously in nude mice, CHO becomes capable of forming tumors.
  • AGF was added to angiogenic activity, epidermal cell proliferating activity, chondrocyte proliferating activity, and wound healing promoting activity using transgenic mice, etc., in which AGF was forcibly expressed in epidermal cells using the K14 promoter. And have tissue regeneration activity (Patent Document 1, Non-Patent Document 7). However, we did not find any knowledge about other physiological functions of AGF.
  • Non-patent document 1 “Metabolism”, (USA), 1987, 36 volumes, p.54_ 59
  • Non-patent document 2 Japanese clinical practice", 2003, 61 volumes, extra number 6, obesity Disease, p.649—654
  • Non-patent document 3 "Japanese clinical practice", 2002, Vol. 60, extra number 9, New Diabetes 3, p.31 0-331
  • Non-Patent Document 4 "The History of Medicine", 2000, vol. 192, p.513-518
  • Non-Patent Document 5 “Ayumi of Medicine”, 2000, vol. 192, p.541-545
  • Non-Patent Document 6 "Trends in Molecular Medicine"
  • Non-Patent Document 7 “Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America” J, (Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America) United States), 2003, vol. 100, p. 9494-9499
  • Patent document 1 International publication W099 / 15653 pamphlet
  • Patent document 2 International publication WO03 / 083114 pamphlet
  • An object of the present invention is to provide a novel anti-obesity drug.
  • AGF knock-out mice and AGF transgenic (Tg) mice have been produced and analyzed to show that AGF has anti-obesity, anti-diabetic, and anti-hyperlipidemic effects. Clarified to have. That is, it was found that AGF knockout mice showed remarkable fattening (Example 3). Furthermore, AGF knockout mice have increased fat tissue weight associated with obesity (Example 4), enlarged fat cells (Example 5), and skeletal muscle, which is known to increase in obesity. In addition, it was found that the amount of triglyceride in liver tissue increased (Example 6).
  • mice to which the AGF-expressing adenovirus was administered weight gain was suppressed and glucose tolerance was improved (Examples 15 and 20), and another AGF transgenic mouse (K14-AGF Tg mouse; (Mice expressing AGF in the epidermis forcibly) have an antiobesity effect, an adipose tissue reducing effect, and an insulin sensitivity enhancing effect (Examples 18 and 19).
  • AGF is an effective component of a therapeutic agent for anti-obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia, and completed the present invention.
  • An antiobesity agent a therapeutic agent for diabetes, and / or hyperlipidemia, comprising a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d) or a polynucleotide encoding the polypeptide as an active ingredient:
  • Therapeutic agent :
  • a method for treating or preventing obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia comprising administering an effective amount to a subject in need of treatment or prevention of Z or hyperlipidemia, and
  • polypeptide or a polynucleotide encoding the same for producing an antiobesity agent, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for Z or hyperlipidemia.
  • transgenic animal refers to an animal in which a promoter and a gene have been introduced into a chromosome, and the gene has been forcibly expressed at a desired location. It is used to mean an animal in which the expression of a specific gene has been deleted by genetic manipulation.
  • AGF is useful as an active ingredient of an antiobesity agent, a therapeutic agent for diabetes, and / or a therapeutic agent for hyperlipidemia.
  • FIG. 1 is a drawing schematically showing the structure of plasmid pBS-loxP-lox71-mAGF-iS geo.
  • the symbols “pro.” And “pri.” Mean the promoter and primer, respectively.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in body weight of AGF K ⁇ mice.
  • the horizontal axis indicates the age (week), and the vertical axis indicates the body weight (g).
  • the symbols “WT”, “HTR”, and “HM” mean WT mouse, heterozygous KO mouse, and homozygous KO mouse, respectively.
  • FIG. 3 is a graph showing the change in genital fat (white adipose tissue) weight of CAG-AGF Tg mice (standard diet).
  • the vertical axis indicates white adipose tissue weight (g) / body weight (g). Also, the symbol "W
  • T and Tg mean WT and Tg mice, respectively.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in the weight of genital fat (white adipose tissue) in CAG—AGF Tg mice (high fat diet load).
  • the vertical axis indicates white adipose tissue weight (g) / body weight (g).
  • the symbols “WT” and “Tg” mean WT mouse and Tg mouse, respectively.
  • FIG. The vertical axis indicates white adipose tissue weight (g). Also, the symbols “WT”, ⁇ TRJ and “HM” mean WT mouse, AGF heterozygous K ⁇ mouse, and AGF homozygous K ⁇ mouse, respectively.
  • Garden 6 is a graph showing changes in genital fat (white adipose tissue) weight (white adipose tissue weight ⁇ body weight) of AGF K ⁇ mice.
  • the vertical axis indicates white adipose tissue weight (g) / body weight (g).
  • the symbols “WT”, “HTR”, and “HM” mean WT mice, AGF heterozygous KO mice, and AGF homozygous K ⁇ mice, respectively.
  • FIG. 7 is a drawing showing the morphology of adipocytes in CAG_AGF Tg mice. The symbol "TG
  • FIG. 10 is a graph showing the TG content in the tissue (liver) of CAG—AGF Tg mice.
  • the horizontal axis shows the high fat diet load (for months), and the vertical axis shows the TG content (mg / g tissue).
  • the symbols “WT” and “Tg” mean WT mouse and Tg mouse, respectively.
  • FIG. 11 is a graph showing the TG content in the tissue (skeletal muscle) of CAG—AGF Tg mice.
  • the horizontal axis shows the high fat diet load (for months), and the vertical axis shows the TG content (mg / g tissue). Also, the symbol "W
  • T and Tg mean WT and Tg mice, respectively.
  • FIG. 12 is a graph showing the TG content in tissues of AGF KO mice. The vertical axis shows the TG content (mg
  • the symbols “L” and “SM” on the horizontal axis represent liver and skeletal muscle, respectively, and the symbols “WT”, “HTR” and “HM” represent WT mouse and heterozygous mouse, respectively. , And homozygous mice.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of a glucose tolerance test (blood glucose level) of AGF K ⁇ mice.
  • the horizontal axis indicates time (minutes), and the vertical axis indicates blood glucose level (mgZdL).
  • the symbols "WT” and “HM” mean WT mouse and homozygous mouse, respectively.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of a glucose tolerance test (plasma insulin) in AGF K ⁇ mice.
  • the horizontal axis represents time (minutes), and the vertical axis represents plasma insulin (ngZmL).
  • WT and HM mean a WT mouse and a homo KO mouse, respectively.
  • FIG. 15 is a graph showing oxygen consumption of CAG_AGF Tg mice.
  • lane 1 is “light period”
  • lane 2 is “period”
  • lane 3 is “24 hours”
  • the vertical axis is VO (mL / mL). kg / min).
  • WT and Tg mean WT mouse and Tg mouse, respectively.
  • Mouse is a graph showing the results of a glucose metabolism test in mice administered with AGF-expressing adenovirus. Closed circles are the results of mice administered with mAGF-Adeno, and open circles are the results of mice administered with Cont-Adeno. The horizontal axis is the elapsed time (minutes), and the vertical axis is the blood glucose level (mgZd L).
  • FIG. 17 is a graph showing plasma insulin levels (vertical axis; ng / mL) of CAG-AGF Tg mice and Ritamate WT mice bred on a high fat diet.
  • the symbols "TG” and "NTG” are a graph showing plasma insulin levels (vertical axis; ng / mL) of CAG-AGF Tg mice and Ritamate WT mice bred on a high fat diet. The symbols "TG” and "NTG"
  • FIG. 19 is a graph showing serum free fatty acid concentrations (vertical axis; ⁇ Eq / L) of CAG-AGF Tg mice and Ritamate WT mice bred on a high fat diet.
  • the symbols "TG” and "NTG” are a graph showing serum free fatty acid concentrations (vertical axis; ⁇ Eq / L) of CAG-AGF Tg mice and Ritamate WT mice bred on a high fat diet.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of a glucose metabolism test of CAG—AGF Tg mice and Rita-Mate WT mice.
  • the symbols "TG” and “NTG” mean CAG-AGF Tg mouse and Ritamate WT mouse, respectively.
  • the horizontal axis is elapsed time (minutes), and the vertical axis is blood glucose level (mg / dL).
  • FIG. 21 is a graph showing the results of an insulin sensitivity test of CAG_AGF Tg mice and Rita-mate WT mice.
  • the symbols "TG” and “NTG” mean CAG-AGF Tg mouse and Ritamate WT mouse, respectively.
  • the horizontal axis is the elapsed time (minutes), and the vertical axis is the ratio (%) of the blood glucose level after administration to the blood glucose level before insulin administration.
  • FIG. 22 is a graph showing visceral adipose tissue weights in K14_AGF Tg mice and Rita-Mate WT mice.
  • the symbols "K14_AGF” and “NTG” mean K14-AGF Tg mouse and Ritamate WT mouse, respectively.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of visceral fat tissue weight per body weight.
  • FIG. 23 Subcutaneous adipose tissue weight in K14-AGF Tg mice and Ritamate WT mice
  • K14_AGF and NG mean K14-AGF Tg mouse and Ritamate WT mouse, respectively.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of subcutaneous adipose tissue weight per body weight.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of an insulin sensitivity test on K14_AGF Tg mice and Rita-mate WT mice.
  • the symbols "K14_AGF” and “NTG” mean K14-AGF Tg mouse and Ritamate WT mouse, respectively.
  • the horizontal axis indicates elapsed time (minutes), and the vertical axis indicates the ratio (%) of the blood glucose level after administration to the blood glucose level before insulin administration.
  • FIG. 25 is a graph showing the results of a glucose metabolism test in mice administered with human AGF-expressing adenovirus. Closed circles are the results for hAGF-Adeno-administered mice, and open circles are for Cont-Adeno-administered mice. The horizontal axis indicates elapsed time (minutes), and the vertical axis indicates blood glucose level (mg / dL).
  • the antiobesity agent, antidiabetic agent, and Z or hyperlipidemia agent of the present invention are selected from the group consisting of the following (a) to (d):
  • the polypeptide, or at least one of the polynucleotides encoding said polypeptide, can be included as an active ingredient:
  • the "anti-obesity drug” in the present specification includes both drugs used for treating obese patients and drugs used prophylactically for obese subjects.
  • the term “diabetic drug” in this specification includes both drugs used for treating patients with diabetes and drugs used prophylactically for subjects prone to diabetes.
  • the term "agent for treating hyperlipidemia” herein includes a drug used for treating a patient having hyperlipidemia and a drug used prophylactically for a subject having a tendency to hyperlipidemia. And both are included.
  • the polypeptide as an active ingredient of the medicament of the present invention includes human AGF comprising a sequence consisting of amino acids 1 to 450 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a polypeptide represented by SEQ ID NO: 5.
  • Mouse AGF consisting of a sequence consisting of amino acids 1 to 433 in the amino acid sequence shown is preferred.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of human AGF precursor.
  • Human AGF has a signal sequence (120-1) at the N-terminus, and the signal sequence is cleaved when secreted and expressed outside the cell. It has a human mature AGF force physiological activity consisting of a sequence consisting of amino acids 1 to 450 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in which the signal sequence is cleaved.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of mouse AGF precursor.
  • Mouse AGF has a signal sequence (-24 to -1) at the N-terminus, and the signal sequence is cleaved when secreted and expressed outside the cell.
  • Mature mouse AGF consisting of a sequence consisting of amino acids 1 to 433 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 from which the signal sequence has been cleaved has biological activity.
  • the polypeptide (b) that can be used as an active ingredient of the medicament of the present invention that is, a sequence consisting of amino acids 1 to 450 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, Alternatively, in the sequence consisting of amino acids 1 to 433 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 1 to 10 (for example, 1 to several) amino acid residues are substituted, deleted, and Z or ⁇
  • the polypeptide having the inserted amino acid sequence and having the activity of suppressing weight gain preferably, in each of the above sequences, 1 to 7, more preferably 1 to 5 amino acid residues are substituted, deleted, and And / or a polypeptide containing the inserted amino acid sequence and having an activity of suppressing weight gain.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution.
  • amino acids belonging to each group as shown below are amino acids having properties similar to each other within the group. Substitution of these amino acids for other amino acids in gnorape often does not impair the essential function of the protein. Such amino acid substitution is called a conservative substitution and is known as a technique for converting an amino acid sequence while maintaining the function of a polypeptide.
  • Non-polar amino acids Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and TYp
  • Uncharged amino acids Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin
  • Acidic amino acids Asp and Glu
  • the method for determining whether or not a certain polypeptide has a weight-gain-inhibiting activity is not particularly limited, and can be confirmed, for example, by the method described in Example 3. That is, a transgenic animal produced using the gene encoding the polypeptide can be bred on a standard diet or a high-fat diet, and the change in body weight can be confirmed by comparing with a wild-type animal. In addition, it can be confirmed by the method described in Example 15 or Example 20. That is, it can be confirmed by administering an adenovirus expressing the polypeptide to a mouse bred on a standard diet or a high fat diet, and comparing the change in body weight with that of a control adenovirus.
  • the “stringent conditions” in the polypeptide (c) that can be used as an active ingredient of the medicament of the present invention include “5xSS PE, 5xDenhard's” as conditions for hybridization. ) Solution, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 40% formamide, 200 ⁇ g / mL salmon sperm DNA, 37 ° C overnight. The stricter conditions were about 5xSSPE, 5xdenopate night, 0.5% SDS, 50% honolemamide, 200 ⁇ g ZmL salmon sperm DNA, overnight at 42 ° C.
  • loose conditions for washing are ⁇ 5xSSC, 1% SDS, 42 ° C '', and normal conditions are about ⁇ 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C ''. , and the more severe conditions as ⁇ or a "0. 2xSSC, 0. 1 0/0 SDS, 65 ° C " about the conditions.
  • the 5XSSPE is composed of 50 mmol ZL sodium phosphate (pH 7.4), 0.75 mol / L NaCl, and 5 mmol / LE DTA.
  • the composition of 5XSSC is 0.75 mol / L NaCl and 75 mmol / L. It is sodium taenoate ( ⁇ 70).
  • the identity of the polypeptide (d) that can be used as an active ingredient of the medicament of the present invention preferably shows an identity of at least 95% or more and a power of 97% or more.
  • the amino acid sequence identity can be determined using the BLAST search algorithm. Specifically, the bl2seq program of the BLAST package (sg 2bit version, version 2.0.12; obtained from NCBI) [Tatiana A. Tatusova,
  • polypeptide that can be used as an active ingredient of the medicament of the present invention those containing a signal sequence on the N-terminal side of the polypeptides (a) to (d) are preferable.
  • the signal sequence is not limited as long as it is a sequence leading the polypeptide through the membrane.
  • the signal sequence described in Biochemistry, 28 (3), 923-930, 1989 can be used.
  • the signal sequence IK_20 to 11) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid represented by SEQ ID NO: 5 A sequence containing the signal system (24 - ⁇ - 1) in the sequence is preferred.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is most preferred.
  • the origin of the polypeptide that can be used as an active ingredient of the medicament of the present invention is not limited to humans or mice.
  • polypeptides derived from organisms other than human or mouse may also be used as long as they fall under any of the above polypeptides (a) to (d).
  • the modified polypeptide can also be used as an active ingredient of the medicament of the present invention.
  • polypeptide is preferably a recombinant.
  • Polynucleotides encoding the polypeptides (a) to (d), that is, polynucleotides that can be used as an active ingredient of the medicament of the present invention include DNA and RNA, and may be DNA. I like it.
  • the polynucleotide for example, a sequence consisting of bases 61 to 1410 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or bases 73 to 1371 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 And a polynucleotide encoding a polypeptide having the activity of inhibiting weight gain.
  • At least one of the polypeptides (a) to (d) or a polynucleotide encoding the polypeptide is used for treating or preventing obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia.
  • Methods for treating or preventing obesity, diabetes, and Z or hyperlipidemia including administering to a subject in need thereof an effective amount.
  • the present invention provides a method for producing an anti-obesity agent, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for Z or hyperlipidemia of the polypeptides (a) to (d) or the polynucleotide encoding the polypeptide. Including the use of
  • the method of administering the polypeptide that is the medicament of the present invention includes, for example, oral administration using tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, or oral solutions, or intravenous injection.
  • parenteral administration by injection such as intramuscular injection, suppository, transdermal drug, or transmucosal drug.
  • parenteral administration such as transdermal administration or intravenous injection, or the lower part of the gastrointestinal tract that is less affected by digestive enzymes (e.g., jejunum, ileum, colon,
  • a preparation containing the polypeptides (a) to (d) as an active ingredient is prepared by using a pharmacologically acceptable carrier, an excipient, and other additives usually used for preparing a polypeptide. It can be prepared as a composition.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • Aqueous solutions and suspensions include, for example, distilled water for injection or physiological saline as a diluent.
  • the diluent for the water-insoluble solution or suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80, and the like.
  • the composition may further contain wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizing or solubilizing agents, or preservatives.
  • composition is sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation.
  • a sterile solid composition can be produced and dissolved in sterile water or another sterile injectable medium before use.
  • the medicament of the present invention contains a therapeutically effective amount or a pharmacologically effective amount sufficient to produce the intended effect in the treatment or prevention of obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia.
  • Confirmation of the effective amount in actual administration can be performed, for example, by measuring the degree of recovery of the target disease.
  • the actual amount to be administered depends on various factors, such as the condition, age, and weight of the individual to be treated, and is preferably the amount at which the desired effect is produced without significant side effects. Administered. Those skilled in the art can easily determine such an effective amount, toxicity and the like using a known model animal.
  • the amount of the active ingredient is preferably 1 ⁇ g to 2 g per day. More preferably, it is 1 ⁇ g to 200 mg per day.
  • a polynucleotide encoding the same may be administered as an antiobesity agent, a therapeutic agent for diabetes, and / or a therapeutic agent for hyperlipidemia in gene therapy.
  • dosage forms in gene therapy are classified into two types: non-viral vectors and viral vectors.
  • Examples of the method using a non-viral vector include a method using an encapsulated ribosome, a method using an electrostatic ribosome, and a method using HVJ-ribosome [J. Clin. Invest. 93: 1458-1464 (1994) and the like].
  • Examples of the method for introducing a gene into a tissue include a receptor-mediated introduction method, a method of introducing into a cell with a carrier such as metal particles by a particle gun, a method of directly introducing a plasmid, and a method of introducing a positively charged polymer.
  • Known methods for introducing genes into cells include, for example, lipofection, co-precipitation with phosphate, DEAE-dextran, and direct injection of DNA using a micro glass tube.
  • a retrovirus vector As the virus vector, a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector is known.
  • DNA or RNA such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, poliovirus, simvis virus, SV40, HIV, or Sendai virus
  • a gene encoding the polypeptides (a) to (d) can be introduced into a virus, and the gene can be introduced into the cell by infecting the cell with the virus.
  • An anti-obesity agent, a therapeutic agent for diabetes, or a therapeutic agent for hyperlipidemia containing a polynucleotide encoding the polypeptides (a) to (d) is used to directly introduce a gene into the body.
  • a liquid preparation that can be used for injection or infusion can be mentioned.
  • the liquid preparation is prepared, for example, by dissolving in a buffer such as phosphate buffered saline (PBS) or a solvent such as physiological saline or sterilized water, and then, if necessary, by filtration with a filter. Sterilize and fill in sterile containers. If necessary, it can be in the form of a suspension, a cryoprotectant, or a centrifugal concentrated cryoprotectant.
  • PBS phosphate buffered saline
  • a solvent such as physiological saline or sterilized water
  • the polynucleotide may be, for example, a half containing fat, fatty oil, lanolin, petrolatum, wax, liquid paraffin, plaster, plastic, darcols, higher alcohol, resin, glycerin, emulsifier, or suspending agent. It can be administered topically to the affected area as a solid ointment. Such an ointment is necessary Alternatively, it can be mixed with a hydrophilic polymer, molded into a sheet, and adhered to the affected area.
  • an anti-obesity agent, a therapeutic agent for diabetes, or a therapeutic agent for hyperlipidemia containing the polynucleotide is performed by selecting an appropriate method and site depending on the type and symptom of the disease.
  • Parenteral administration is preferred as the administration method. Specifically, for example, administration to the surface layer by subcutaneous, intradermal, intravascular, intramuscular, or ointment is possible. Administration to subcutaneous, intradermal, blood vessels, muscles, etc. can be performed by injection or catheter.
  • the medicament of the present invention comprises a therapeutically effective amount or a pharmacologically effective amount sufficient to produce the intended effect in the treatment or prevention of obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia.
  • Confirmation of the effective amount in actual administration can be performed, for example, by measuring the degree of recovery of the target disease.
  • the actual amount to be administered depends on various factors such as the condition, age, and weight of the individual to be treated, and is preferably determined such that the desired effect is exhibited without significant side effects. Is done. Those skilled in the art can easily determine such an effective amount, toxicity, and the like using known model animals.
  • the amount of the active ingredient is usually preferably 0.1 ⁇ g to 200 mg per day in an adult. More preferably, it is 0 • 1 ⁇ g to 20 mg per day.
  • polypeptides (a) to (d), which are the active ingredients in the present invention can be administered in various forms that can be administered as pharmaceuticals, such as health foods (preferably functional foods) or foods and drinks. It is also possible to give in the form.
  • the food includes a beverage.
  • health food means a food capable of exerting some effect on health, or a food which can be expected to have an effect
  • functional food means the “healthy food”.
  • bioregulatory functions eg, the functions of regulating the physiological systems such as the digestive system, circulatory system, endocrine system, immune system, and nervous system. And processed food.
  • the health food of the present invention has a function of treating obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia. Are preferred.
  • the polypeptide-containing food composition of the polypeptides (a) to (d), which has an effect of improving obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia” and “Obesity, diabetes, and / or Polypeptide-containing functional food materials of the polypeptides (a) to (d), which have an effect of improving hyperlipidemia, are also included in the present invention.
  • the polypeptide-containing food composition of the polypeptides (a) to (d) can contain a carrier that can be used for food and other additives.
  • the health food of the present invention can be prepared in the same manner as a general health food, except that it contains the polypeptides (a) to (d) as an active ingredient.
  • the health food of the present invention can be prepared by adding an effective amount of the active ingredient to a substance that can be ingested as a food.
  • the effective amount can be appropriately determined according to various factors such as the shape or type of the food, or the symptoms, age, and weight of the individual who takes the food.
  • the amount of the active ingredient is usually preferably 1 ⁇ g to 2 g per day for an adult. More preferably, it is 1 ⁇ g to 200 mg per day.
  • a targeting vector having an HSV_tk gene in order were prepared by the following method.
  • mice AGF protein produced in the same manner as in Example 1 of WO03 / 083114
  • the mouse-pub-genome sequence (including 90664-96900 of AC073775.2) was cut out. Further, the plasmid PBN2 was transformed into type III, and SEQ ID NO: 6 (
  • PCR was performed using a primer set consisting of CTAGACTAGTTGCAAAGGCGTGCGGCGG artificial sequence IJ) and SEQ ID NO: 7 (about 2 Okbp 3 'short arm (mouse-pub-genome sequence 5. The long arm and the 3 'short arm were transferred to plasmid pPNT (Cell,
  • the obtained targeting vector was cut with a restriction enzyme Notl, and ES cell line R1 (Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 90, 8424-8428,
  • SEQ ID NO: 8 (including AGF exon 4 and exon 5)
  • the obtained ES cell line was microinjected into blastocysts obtained from BDF 2 mice, the second generation of C57BL / 6 mouse and DBAZ2 mouse crosses, and the engineered embryos were implanted into the uterus.
  • Procedure Chimera mice were born from mice that had received embryos and were pregnant.
  • a heterozygous mouse hereinafter, referred to as an AGF heterozygous mouse
  • AGF homozygous mice Homozygous mice (hereinafter referred to as AGF homozygous mice) were obtained by crossing AGF heterozygous mice.
  • PCR was performed using the genomic DNA isolated from the tail of the offspring mouse as type I, and the genotype of the mouse was confirmed by the size of the DNA fragment generated by the PCR. That is, the tail was treated with proteinase II, and the DNA was extracted with phenol 'black mouth form. The extracted DNA was recovered by isopropanol precipitation and ethanol precipitation, and tris-EDTA buffer (Hereinafter referred to as TE solution). Based on the neomycin resistance gene sequence and the genomic sequence deleted by targeting, a primer consisting of the following nucleotide sequence was designed.
  • Reverse primer SEQ ID NO: 12 (5'-ctacctacatccactcctac-3, mouse)
  • PCR was performed on the obtained genomic DNA derived from pup mice. PCR was performed using DNA polymerase (ExTaq; Takara) at 95 ° C (5 minutes), followed by heat denaturation at 95 ° C (1 minute), 60 ° C (1 minute), and 72 ° C (1 minute). (1 minute) for 30 cycles, followed by an extension reaction at 72 ° C (7 minutes), and the size of the amplified fragment was examined. If a mutant allele is present, a 545 bp band is detected in the PCR for detecting the neomycin resistance gene.If a wild-type allele is present, a 322 bp band is detected in the PCR for detecting genomic DNA containing mouse AGF exon 1. You.
  • the genotype of the mouse was determined.
  • the band of the mutant allele was detected and the band of the wild type allele was not detected
  • the AGF heterozygous KO mouse both the band of the mutant allele and the band of the wild type allele were detected.
  • no band of the mutant allele was detected, and a band of the wild-type allele was detected.
  • the genotype of the mouse was also examined by performing the Southern blot analysis of Reference Example 1 (2).
  • a 6.5 kbp band of the mutant allele was detected, and in the AGF heterozygous K ⁇ mouse, both the 6.5 kbp of the mutant allele and the 4.6 kbp band of the wild-type arenole were detected.
  • a 4.6 kbp band of the wild-type allele was detected.
  • Tris-HCl pH 7.5
  • 150 mmol / L NaCl 150 mmol / L NaCl, 0.05% (w / v) Tween20]
  • an anti-mouse AGF antibody WO03 / 083114
  • an anti-rabbit antibody WO03 / 083114
  • CAG modified chicken beta-actin promoter with CMV-IE enhancer
  • AGF transgenic mice (hereinafter referred to as CAG-AGF Tg mice) in which mouse AGF was forcibly expressed throughout the body under control were prepared.
  • CAG-AGF Tg mice AGF transgenic mice in which mouse AGF was forcibly expressed throughout the body under control were prepared.
  • mouse AGF full-length cDNA (WO03 / 083114) was transformed into type III,
  • AGAAGCTTCACCATGGGGACCGCCAGGCTAC Artificial Rooster IJ DNA consisting of a base sequence as a primer set PCR (After reaction at 95 ° C for 10 minutes, 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C 45 cycles of a 2 minute reaction at C)
  • the resulting PCR product was subcloned into a pZErO_2 cloning vector (Invitrogen).
  • the obtained plasmid was digested with the restriction enzymes Hindlll and Sail, and inserted into Hindlll and Sail sites of the plasmid pBluescriptn SK (Stratagene) to prepare a plasmid pBS_mAGF having a full-length mouse AGF gene.
  • the plasmid pU_San Hum
  • Plasmid loxP_1_1 was introduced into plasmid pCAGlox71bsr treated with alkaline phosphatase.
  • sequencing was performed using a T3 primer (SEQ ID NO: 16: AATTAACCCTCACTAAAGGG), and the nucleotide sequence of the region containing the inserted loxP sequence was examined.
  • the nucleotide sequence read by the T3 primer was consistent with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, and it was confirmed that loxP and 1 ⁇ 71 were in the same direction.
  • Plasmid 1 ⁇ _1 ⁇ 71 is digested with the restriction enzyme Spe I, and the resulting fragment containing the CAG promoter, 1 ⁇ 71 control system 1J, bsr, poly A signal control system lj, and loxP sequence is ligated into the plasmid pBS—mAGF— ⁇ geo Spel site. Then, the desired plasmid pBS-loxP-lox71-mAGF- ⁇ geo was prepared.
  • FIG. 1 shows the structure of the obtained plasmid pBS-loxP-lox71-mAGF- ⁇ 60.
  • This plasmid After digestion with the restriction enzyme Notl, a linear DNA fragment [CAG promoter (promoter), 1 ⁇ 71 system 1J, bsr, poly A signal sequence (pA), loxP system, mouse AGF cDNA system lj, and IRES- ⁇ — Geo—poly ⁇ sequence (including pA)].
  • CAG promoter promoter
  • 1 ⁇ 71 system 1J 1J
  • bsr poly A signal sequence
  • loxP system poly A signal sequence
  • loxP system mouse AGF cDNA system lj
  • IRES- ⁇ Geo—poly ⁇ sequence (including pA)
  • ES cells in which AGF is constantly expressed under the control of the CAG promoter Using the ES cells of each clone in which the 1 ⁇ 71–1 ⁇ interval before the introduction of the CAG-Cre vector was not removed as a negative control, it was confirmed that AGF was expressed in the ES cells of the selected 15 clones. It was confirmed by Western blotting using the same anti-AGF antibody as in 3). That is, Western blotting was performed using a sample obtained by diluting ES cells with a lysis buffer and 2 ⁇ SDS sample buffer two-fold, and it was confirmed that AGF was expressed.
  • Reverse primer system 1J number 18 (5 agccgggtcaacataacagc_3, mouse)
  • PCR When PCR is performed using these primers, a 325 bp fragment is amplified from the transgene by PCR to detect AGF cDNA, and a 320 bp fragment is amplified by PCR to detect LacZ. Fragments of these sizes should not be amplified from mouse genomic DNA.
  • PCR was performed on the resulting genomic DNA derived from mouse pups. PCR was performed using DNA polymerase (ExTaq; Takara) at 94 ° C (5 minutes), followed by heat denaturation at 94 ° C (1 minute), 62 ° C (1 minute 30 seconds), and 72 ° C. (1 minute 30 seconds), 28 cycles were performed, followed by extension at 72 ° C (7 minutes), and the size of the amplified fragment was examined.
  • SEQ ID NO: 21 TCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGT mouse
  • SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 22
  • PCR was performed using Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems).
  • the PCR reaction is carried out by repeating an initial denaturation reaction at 95 ° C (10 minutes) and then repeating a cycle reaction consisting of 94 ° C (15 seconds) and 60 ° C (60 seconds) 45 times. Carried out.
  • a standard curve for calculating the gene expression level was obtained by performing the same reaction using the above-mentioned cDNA or mouse genomic DNA as type III, and the gene expression level was calculated as a relative value between samples.
  • the expression level of the AGF gene was increased in the tissue of the CAG-AGF Tg mouse as compared with the tissue of the WT mouse.
  • the expression was significantly increased in skeletal muscle, BAT, and heart.
  • the CAG—AGF Tg mouse weighed 19.5 g ⁇ 0.7 g (SD)
  • the WT mouse weighed 23.5 g ⁇ 2.5 g (SD). It was found that the AGF Tg mouse weighed less.
  • AGF homozygous mice, AGF heterozygous mice, and Rita-mate WT mice were normally bred on a standard diet. The weight of each mouse was measured every week until the age of 24 weeks. The result is shown in figure 2. As shown in FIG. 2, it was found that AGF homozygous mice began to gain weight at about 12 weeks of age as compared to WT mice, and thereafter continued to gain weight, resulting in marked obesity. AGF heterozygous K ⁇ mice had an intermediate phenotype between AGF homozygous KO mice and Ritamate WT mice.
  • CAG-AGF Tg mice showed that weight gain was suppressed. To clarify the cause, organ weights were measured.
  • the genital fat (WAT), brown fat (BAT), liver, heart, kidney, and spleen tissues of the CAG-AGF Tg mouse and Rita-Mate WT mouse were collected, and the tissue weight per body weight was measured.
  • the study was conducted on 12-week-old mice bred on a standard diet and 12-week-old to 24-week-old mice bred on a high fat diet for 12 weeks. As a result, brown fat, liver, heart, kidney, and spleen were fed on a standard diet and a high fat diet. During growth, there was no change in tissue weight between CAG-AGF Tg mice and WT mice.
  • the CAG-AGF Tg mouse had a lower tissue weight per body weight than the WT mouse in both the standard diet and the high fat diet. That is, it was shown that the weight increase was suppressed in the CAG-AGF Tg mice because the weight increase of white adipose tissue was suppressed. In other words, it was found that AGF had no effect on the weight of other organs and had an effect of suppressing an increase in adipose tissue weight due to obesity and the like.
  • the results for white adipose tissue are shown in FIG. 3 (standard diet) and FIG. 4 (high fat diet load).
  • the weight S was found to be increasing, and the organ weight was measured to clarify the cause.
  • Reproductive fat (WAT), brown fat (BAT), liver, heart, kidney, and spleen of AGF homo KO mice, AGF hetero KO mice, and Ritamate WT mice of 20-week-old females fed a standard diet Each tissue was collected, and the tissue weight per body weight was measured. As a result, the tissue weight of brown fat, liver, heart, kidney, and spleen did not change in AGF homozygous KO mice, AGF heterozygous mice, and WT mice.
  • the genital fat increased the tissue weight per mouse individual and per body weight of AGF homozygous mice compared to the WT mice.
  • AGF heterozygous mice had an intermediate tissue weight between AGF homozygous mice and WT mice. That is, it was shown that the body weight increased in the AGF KO mice due to the increase in the weight of white adipose tissue such as genital adipose tissue.
  • white adipose tissue such as genital adipose tissue.
  • AGF K ⁇ mice have a phenotype opposite to that of CAG-AGF Tg mice, and suppresses the weight increase of adipose tissue without affecting other organ weights as the physiological activity of AGF. It became clear that it had an effect.
  • the results for genital adipose tissue are shown in FIG. 5 (white adipose tissue weight) and FIG. 6 (white adipose tissue weight Z body weight).
  • TG content in skeletal muscle (gastrocnemius muscle) and liver tissue of AGF KO mice was examined.
  • TG in tissues was extracted from skeletal muscle and liver tissues of AGF KO mice and Rita-Mate WT mice by the method (1) described above.
  • the concentration of the extracted TG was measured using a kit (Triglyceride Test Co .; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to determine the TG content in the tissue.
  • the results are shown in FIG. It was found that the TG content in the skeletal muscle and liver tissues was significantly increased in the AGF ⁇ mice compared to the WT mice.
  • the AGF ⁇ ⁇ ⁇ mice were found to have the opposite phenotype as the CAG-AGF Tg mice, indicating that AGF has an activity of reducing TG content in skeletal muscle and liver as a physiological activity.
  • a glucose tolerance test was performed on AGF homozygous K ⁇ mice and Rita-Mate WT mice, and blood glucose levels and blood insulin levels were examined. After fasting the mice for 16 hours, lg / kg of D-gunolose was administered by intraperitoneal injection (ip), and blood was collected from the ocular vein before administration and at 15, 30, 60, and 120 minutes after administration. The blood glucose level was measured using Daltest Ace (Sanwa Chemical Laboratory), and the blood insulin concentration was measured using the RIA2 antibody method (SRL). The results are shown in FIG. 13 (blood glucose level) and FIG. 14 (plasma insulin).
  • the oxygen consumption of CAG-AGF Tg mice and Ritamate WT mice was measured. Using an oxygen consumption measuring device (OXYMAX; Columbus Instruments), the oxygen consumption of the mice was measured over a 24-hour period under fasting conditions. The measurement method followed the instruction manual attached to the oxygen consumption measuring device. The oxygen consumption of 14 CAG-AGF Tg mice and 14 littermate WT mice was measured, and 12 hours during the light period (7:00 to 19:00) and 12 hours during the ⁇ period (19:00 to 7 : 00), and 24-hour oxygen consumption were determined and compared between CAG-AGF Tg mice and WT mice. The results are shown in FIG. It was found that the CAG-AGF Tg mouse had a higher oxygen consumption (V ⁇ ) than the WT mouse at any time. As a result, AGF
  • the primers shown in Table 1 were used as the primers used in the quantitative PCR of each gene.
  • SYBR is used for / 3-actin.
  • UCP1 was induced in BAT of CAG-AGF Tg mice, and the expression of UCP3, PPAR-a, and PPAR- ⁇ was induced in skeletal muscle of CAG-AGF Tg mice.
  • AGF induced the expression of UCP1 in BAT and induced the expression of UCP3, PPAR-a, and PPAR-5 in skeletal muscle. This indicates that AGF enhances heat consumption and increases expression of UCP, and heat consumption and PPAR that enhances lipid metabolism.AGF increases oxygen consumption, suppresses weight gain, and suppresses adipose tissue weight increase. It is clear that this is one of the mechanisms of action.
  • Human AGF and mouse AGF were expressed and purified according to the method described in WO03 / 083114 (Example 19). That is, an expression plasmid obtained by inserting a DNA fragment of about 1.4 kbp (human) or about 1.3 kbp (mouse) obtained by PCR into plasmid pcDNA-Signal-FLAG was introduced into HEK293 cells. The culture supernatant of the human AGF and mouse AGF expression cell lines was purified using the anti-FLAG-M2 monoclonal antibody agarose affinity gel (ANTI-FLAG).
  • ANTI-FLAG anti-FLAG-M2 monoclonal antibody agarose affinity gel
  • Affinity purification was performed using M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel (Sigma) to obtain recombinant human and mouse AGF proteins.
  • Plasmid pCR2.1-mNew (prepared in Example 1 of WO03 / 083114) containing the full-length mouse AGF cDNA was designated as type ⁇ , and a forward primer (
  • PCR product was subcloned into pCR4Blunt_TOP ⁇ (manufactured by Invitrogen), cleaved with restriction enzymes Xbal and Notl, and C-terminal FLAG-added expression vector pCEP4dE2_FLAG cleaved with Xbal and Notl (Example 2 of WO02 / 42448).
  • pCEPdE2_mAGF_FLAG was prepared by Invitrogen.
  • PCR PyroBest DNA polymerase for PCR, PyroBest DNA polymerase
  • a forward primer GAAGATCTACCATGGGGACCGCCAGGCTACGC; Torigami [J number 42]
  • a reverse primer CCGCTCGAGTGATGGGACAGTCACAAGCGC; SEQ ID NO: 43.
  • virus particles were prepared. Specifically, it was prepared by the following method.
  • E. coli BJ5183 (manufactured by Stratagene) was transformed with plasmid pAdEasy-1 (He T.-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
  • Escherichia coli BJ5183 [hereinafter referred to as Escherichia coli BJ5183 (pAdEasy-1)] containing the plasmid pAdEasy-1.
  • Escherichia coli BJ5183 pAdEasy-1
  • the plasmid pAdTracK-CMV-mAGF or pAdTrack-CMV prepared above was cut with the restriction enzyme Pmel, and used to transform Escherichia coli BJ5183 (pAdEasy-1).
  • Plasmids were prepared from the obtained transformant clones, and the cleavage pattern with the restriction enzyme Pacl was determined. Examined. 3 kb or 4.5 kb extra band
  • the obtained virus particle concentration was determined in the same manner as in Example 15 of WO02 / 42448.
  • mice AGF protein-expressing adenovirus and the pAdTrack_CMV control adenovirus prepared in Example 10 were ligated to the human embryonic kidney cell line 293 (ATCC number:
  • CRL-1573 was infected at approximately 100 virus particles per cell. Specifically, 293 cells were seeded at 3 ⁇ 10 5 on a 6-well plate (Asahi Techno Glass) coated with type I collagen, and 2 mL of 10% FBS / penicillin 100 IU / mL, streptomycin 100 ig / mL / DMEM medium After culturing for 1, adenovirus 6 ⁇ 10 7 particles were added, cultivation was performed for 1 ⁇ , and replaced with 2 mL of penicillin 100 IU / mL and streptomycin 100 ⁇ g / mL / DMEM medium.
  • the band was not detected when the supernatant infected with the control adenovirus was used as a sample, and only when the supernatant infected with the mouse AGF protein-expressing adenovirus was used as a sample, the expected mouse AGF molecular weight was increased. It was detected that the mouse AGF protein-expressing adenovirus prepared in Example 10 expressed the mouse AGF protein by the method of Example 11.
  • PCR2.1-hNew a forward primer (reverse primer (AACTCGAGCAGCTTCAGGGGCCGAATGAGCATGGC; SEQ ID NO: 1))
  • reverse primer AACTCGAGCAGCTTCAGGGGCCGAATGAGCATGGC; SEQ ID NO: 1
  • PCR using PyroBest TM DNA polymerase (Takara Shuzo), 35 cycles of 98 ° C for 20 seconds, 64 ° C for 30 seconds and 74 ° C for 3 minutes in the presence of 5% formamide) gave.
  • pCEP-hAGF The resulting PCR product was subcloned into pCR4Blunt-TOP ⁇ (manufactured by Invitrogen), cut with the restriction enzymes Hindlll and Xhol, and inserted into pCEP4 (Invitrogen) cut with Hindlll and Xhol to obtain pCEP-hAGF.
  • pCR4Blunt-TOP ⁇ manufactured by Invitrogen
  • An expression plasmid containing a DNA fragment of about 0.43 kbp and a full-length human AGF cDNA generated by cutting pCEP-hAGF with restriction enzymes Kpnl and Mlul (prepared in Example 19 of WO03 / 083114; hereinafter, pcDNA-SF-h (AGF) was cleaved with restriction enzymes Mlul and Xhol, and the resulting DNA fragment of about 0.98 kbp was transferred to the shuttle vector pAdTrack_CMV (Pro
  • Virus particles were prepared using Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998). The obtained virus particle concentration was determined in the same manner as in Example 15 of WO02 / 42448.
  • Purified full-length human AGF protein (Example 19 in WO03 / 083114) was immunized to Perian Heron to obtain an antibody. Immunizations were performed every two weeks using 500 / ig for the first immunization and 250 xg for the second to fourth immunizations. Two weeks after the final immunization, antiserum was obtained by whole blood collection. The antiserum was purified using a protein A column (manufactured by Amersham Bioscience) to obtain an IgG antibody (hereinafter, anti-SF-YP-030 IgG).
  • Human fetal kidney cell line 293 was infected with the human AGF protein-expressing adenovirus and the pAdTrack_CMV control adenovirus prepared in Examples 10 and 12 in the same manner as in Example 11 to obtain a culture supernatant.
  • Human AGF protein expression in the culture supernatant was detected using the same method as in Example 11, except that the anti-SF-YP-030 IgG prepared in Example 13 was used as the primary antibody.
  • a band was detected in the AGF molecular weight, and it was clarified that the human AGF protein-expressing adenovirus prepared in Example 12 expressed human AGF protein by the method of Example 14.
  • mice Female C57BLZ6 mice (CLEA) were fed a high fat diet (high fat diet 32; CLEA) from the age of 8 weeks. The mice on the high fat diet increased in body weight and became obese at the age of 38 weeks, which was about 54 g at the time of virus administration in this test.
  • high fat diet 32 high fat diet 32
  • mAGF-Adeno mouse AGF-expressing adenovirus
  • Count-Adeno control adenovirus
  • administration of the virus containing the AGF gene resulted in expression of the AGF protein in vivo, and it was found that this AGF protein caused weight loss.
  • mice were fasted for 16 hours, then administered with 0.4 g / kg D-glucose by intraperitoneal injection (ip), and blood was collected from the ocular vein before administration and at 15, 30, 60, and 120 minutes after administration. . Blood glucose was measured using Daltest Ace (Sanwa Chemical Institute). Figure 16 shows the results.
  • mice administered mAGF-Adeno had lower blood glucose levels and improved glucose tolerance than mice administered Cont-Adeno at all times after glucose administration. In other words, it became clear that glucose tolerance was improved by the action of AGF protein highly expressed in mAGF-Adeno-administered mice.
  • a glucose tolerance test was performed on CAG-AGF Tg mice (Example 1) to examine the effect of AGF on improving glucose tolerance.
  • Four-month-old female CAG-AGF Tg mice and ritamate WT mice were fasted for 16 hours, and then lg / kg of D-gunolose was administered by intraperitoneal injection (ip).
  • Blood was collected from the ocular vein at 60, and 120 minutes. Blood glucose was measured using Gnoretest Ace (Sanwa Chemical Laboratory). The results are shown in FIG.
  • CAG-AGF Tg mice showed lower blood glucose levels and improved glucose tolerance than Rita-mate WT mice at all times after glucose administration. That is, it was revealed that the glucose tolerance was improved by the action of the AGF protein highly expressed in the CAG-AGF Tg mouse.
  • FIG. 21 shows the ratio of the blood glucose level after administration to the blood glucose level before insulin administration.
  • CAG-AGF Tg mice had a greater decrease in blood glucose level than the Rita-mate WT mice at all times after insulin administration and had increased insulin sensitivity. That is, it was revealed that insulin sensitivity was enhanced by the action of AGF protein highly expressed in CAG-AGF Tg mice.
  • Example 8 of WO03 / 083114 was produced.
  • This mouse expresses AGF protein at a high level from epidermal cells. It is known that revascularization and tissue regeneration are caused. AGF highly expressed in epidermal cells exhibits anti-obesity and anti-diabetic effects as shown in Examples 3, 4, and 17 using mice with high expression of AGF throughout the body. It was confirmed.
  • both the visceral fat and the subcutaneous fat showed that the weight of adipose tissue was significantly reduced in the K14-AGF Tg mouse compared to the Rita-mate WT mouse. That is, as in the case of CAG-AGF Tg mice, it was found that the expressed AGF had an antiobesity effect and an effect of reducing adipose tissue.
  • FIG. 24 shows the ratio of the blood glucose level after administration to the blood glucose level before insulin administration.
  • K14-AGF Tg mice had a greater decrease in blood glucose level than Rita-Mate WT mice at all times after insulin administration and had increased insulin sensitivity. That is, it was revealed that insulin sensitivity was enhanced by the action of AGF protein highly expressed in CAG-AGF Tg mice.
  • Example 15 mouse AGF exhibited an effect of suppressing weight loss and an effect of improving glucose tolerance. Therefore, it was confirmed that human AGF had the same effect by performing the following test.
  • Human AGF-expressing adenovirus (hAGF-Adeno) prepared in Example 12 and control Three adenoviruses (Cont-Adeno) were administered to each of the three mice in the same manner as in Example 15, but the body weight after 13 days decreased by an average of 4.6 g in hAGF-Adeno-administered mice, and in Cont-Adeno-administered mice. Average increased by 0, lg.
  • Example 15 Furthermore, a glucose metabolism test was performed in the same manner as in Example 15 except that D-glucose injected intraperitoneally was 0.5 gZkg, and blood collection after administration was performed 30, 60, 90, and 120 minutes later. As shown in FIG. 25, it was revealed that the hAGF-Adeno-administered mice had lower blood glucose levels and improved glucose tolerance than the Cont-Adeno-administered mice at all times after glucose administration. In other words, it became clear that the action of hAGF protein highly expressed in hAGF-Adeno-administered mice caused weight loss and improved glucose tolerance.
  • Example 21 Amount of AGF protein in blood of CAG-AGF Tg mouse >>
  • CAG-AGF Tg mice In CAG-AGF Tg mice (Example 1), it was examined how much AGF protein was expressed in blood. Blood was collected from the fundus of 4-month-old female CAG-AGF Tg mice and Rita-Mate WT mice, and serum was obtained according to a standard method. The obtained serum was subjected to Western blotting in the same manner as in Reference Example 1 (3), and the AGF protein was detected. The results of Western blotting were captured with a scanner, and the concentration of AGF protein band was quantified using image analysis software (NIH image 1.62f). As a result, it was found that the AGF protein concentration in the serum was increased 2.4-fold in the CAG-AGF Tg mouse compared to the Rita-mate WT mouse.
  • Example 22 Amount of AGF protein in blood of mouse to which mouse AGF-expressing adenovirus was administered >>
  • Example 15 the amount of AGF protein in blood when a mouse AGF-expressing adenovirus was administered to mice was examined. Before and after administration of mouse AGF-expressing adenovirus and control adenovirus (day 0) and after administration: Blood was collected from the eyes of mice on days! 7 to 7, and serum was obtained according to a standard method. Western blotting was performed in the same manner as in Reference Example 1 (3), and AGF proteins were detected. As a result, it was found that the administration of the control adenovirus did not change the AGF protein concentration, but the administration of the mouse AGF-expressing adenovirus increased the AGF protein concentration over time after peaking on the fourth day.
  • mice to which the mouse AGF-expressing adenovirus was administered were treated with AGF tandem on day 0 and day 4.
  • the concentration of the protein band was quantified.
  • administration of mouse AGF adenovirus increased the AGF protein concentration by 2.5 times.
  • the K14-AGF Tg mice used in Examples 18 and 19 were examined for the extent to which AGF protein was expressed in blood.
  • Blood was collected from the eye fundus of 8-month-old female K14-AGF Tg mice and Rita-mate WT mice, and serum was obtained according to a standard method.
  • Western blotting was performed in the same manner as in Reference Example 1 (3), and the AGF protein was detected and quantified. As a result, it was found that the serum AGF protein concentration was increased 1.8-fold in CAG-AGF Tg mice as compared to Rita-mate WT mice.
  • Peptide A was conjugated to the carrier protein Psicycloglobulin (SIGMA) to produce an antigen, and 100 / ig of the peptide was immunized every two weeks every eight weeks into Peas. One week after the final immunization, whole blood was collected to obtain serum. An affinity column was made with peptide A.
  • the serum was affinity-purified using an affinity column to obtain an IgG antibody that binds to peptide A (hereinafter, anti-YP-030-A IgG).
  • concentration of the antibody was determined by measuring the absorbance at 280 nm and setting the molecular extinction coefficient to 1.38.
  • the bound fraction of Fab 'and HRP was collected by gel filtration using a Superdex 200 16Z60HR column, and the HRP-labeled anti-human An AGF antibody Fab 'fragment (HRP-anti-SF-YP-030 Fab') was obtained.
  • the antibody concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm and setting the molecular extinction coefficient to 1.38.
  • the anti-YP-030-A IgG prepared in Example 24 was added at 20 ⁇ g / mL to a microplate for ELISA (NUNC) at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. Aspirate the solution in the well, wash twice with PBS (phosphate buffered saline), add 300 ⁇ L / well of blocking solution (1% BSA, 0.05% NaN, PBS), and add Leave at room temperature at
  • the purified standard human AGF protein is diluted to 100-0.39 ng / l with a diluent (1% BSA, PBS containing 0.05% Tween20).
  • the solution was serially diluted 2-fold to mL, added at 100 ⁇ L / well, and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • adjust the HRP-labeled antibody HRP-anti-SF-YP-030 Fab,
  • Reaction was carried out for 0.5 hours at C. After washing 9 times with the washing solution, a TMBZ substrate solution (manufactured by IBL) was added at 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 30 minutes. Reaction stop solution (IN ⁇
  • the absorbance at A450 nm was measured using Analysis using the program attached to Spectramax revealed that there was a concentration region where linearity could be obtained, and a calibration curve could be created. As described above, an ELISA system for detecting human AGF could be constructed.
  • Example 27 Amount of human AGF protein in blood of mouse to which human AGF-expressing adenovirus was administered >>
  • the amount of AGF protein in blood when human AGF-expressing adenovirus was administered to mice was examined.
  • the human AGF-expressing adenovirus (hAGF-Adeno) and the control adenovirus (Cont-Adeno) prepared in Example 12 were administered in the same manner as in Example 20.
  • hAGF-A Weight loss and improvement in glucose tolerance were similarly observed in deno-administered mice.
  • blood was collected from the fundus oculi to obtain serum according to a conventional method.
  • the amount of human AGF protein in the serum was measured using the ELISA system constructed in Example 26.
  • the medicament of the present invention can be used for the treatment and / or prevention of obesity, diabetes, and / or hyperlipidemia.
  • the description of "Artificial Sequence” is described in the numerical sequence heading ⁇ 223> in the following sequence listing.
  • the base sequence represented by the IJ number 1, 6, 7, 9, 10, 13, 14, 16, 19, 20, and 40-44 is the primer sequence artificially synthesized.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 is a sequence containing ⁇ .
  • the amino acid sequence IJ represented by the sequence of SEQ ID NO: 46 is the sequence of peptide A.

Abstract

　アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）又はそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬を開示する。ＡＧＦを有効成分とする肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の改善の機能を付与した機能性食品又は健康食品を開示する。更に、ＡＧＦ又はそれをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症を治療又は予防する方法を開示する。加えて、ＡＧＦ又はそれをコードするポリヌクレオチドの抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬を製造するための使用を開示する。

Description

明 細 書
抗肥満薬
技術分野
[0001] 本発明は、アンジォポェチン関連増殖因子（Angiopoietin- Related Growth Factor;
以下、 AGFと称する)若しくはその誘導体又はそれをコードするポリヌクレオチドを有 効成分とする抗肥満薬に関する。本発明の抗肥満薬は、医薬品として投与すること ができるだけでなぐ種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼 料として飲食物の形で与えることも可能である。
背景技術
[0002] 肥満の有害性は広く知られているにもかかわらず、近年肥満が顕著に増加している 。肥満つまり脂肪組織の過剰蓄積が多彩な疾患の原因となっていることは周知の事 実であり、疾患としての肥満症を治療対象にすることが提唱されている。肥満を原因 の一つとして発症する疾患として、例えば、腰痛、膝関節痛、及び変形性関節症があ る。これらの整形外科学的疾患は肥満による体重増加が直接の原因となりうる。肥満 に伴う脂肪の過剰蓄積は、糖尿病、高脂血症、高血圧、又は動脈硬化性疾患の原 因となっている。特に内臓脂肪の蓄積がこれらの疾患の発症に関与していることが明 らかにされている（非特許文献 1)。
[0003] 基本的な肥満改善方法としては、運動療法と食事療法があるが、どちらも継続的な 実施が困難である。また、運動又は食事療法以外の改善方法としては医薬品の使用 があり、現時点では、世界的に見ると、シブトラミンとオルリスタツトが主に使用されて いる。しかし、それらの効果は弱ぐどちらも副作用の問題がある。 日本ではマジンド ールのみが認可されているが、適用が高度肥満者に限定されており、投与期間も限 定されている (非特許文献 2)。
[0004] 社会の近代化に伴い、 日本のみならず世界的に糖尿病患者は急増している。特に 、患者数の多い II型糖尿病は、肥満や脂肪の過剰蓄積が発症に関与していることが 知られている。 II型糖尿病の治療としては、肥満症と同様に運動療法と食事療法があ るが、継続的な実施が困難であり、医薬品が使用されている。重度の糖尿病患者で はインスリン療法が行なわれている。しかし、インスリン療法には低血糖の副作用の危 険性が常にある。経口血糖降下薬として、チアゾリジン系薬剤又はスルホニルゥレア（
SU)薬等が多く使用されている。しかしながら、チアゾリジン系薬剤には、肝障害'浮 腫'心不全という副作用があり、 SU薬には肥満を助長する副作用が危惧され、安全 で、体重増加を伴わなレ、インスリン抵抗性改善薬が強く求められている（非特許文献
3)。
[0005] 肥満の糖尿病患者の内臓脂肪では脂肪細胞の肥大化が観察される。この肥大化 した脂肪細胞からは、インスリン抵抗性を惹起するようなアディポサイト力イン類が産 生及び分泌され、近傍の脂肪細胞、筋細胞、及び/又は肝細胞に作用して、インス リン抵抗性を引き起こしていると考えられる。このように、脂肪組織は、糖尿病病態に おいて、インスリン抵抗性を増強する方向に関わる組織へと変化する（非特許文献 4 及び 5)。
[0006] 肥満や糖尿病の原因となる脂肪組織の蓄積に関与する因子としてはレブチンがよ く知られている。レプチンは、体重増加抑制ホルモンであり、レプチンを欠失すること で食欲が亢進し、エネルギー消費が減弱し肥満となることが知られている。このような 脂肪組織の蓄積、及び脂肪細胞の肥大化に関与する因子の発見は、肥満症、糖尿 病、又は高脂血症等の疾患の治療薬開発に非常に有用である (非特許文献 6)。
[0007] アンジォポェチン関連増殖因子（AGF)は、 N末端側にコイルドコイル（Coiled-coil )ドメインを、 C末端側にフイブリノ一ゲン様（Fibrinogen-like)ドメインを持つ分泌タン パク質である。 AGFは特許文献 1で報告された NL8と同一であり、 NL8を CHO細胞 に安定発現させて、ヌードマウスに皮下移植すると、 CHOが腫瘍形成能を持つよう になることが報告されている。また、 AGFを K14プロモーターを用いて表皮細胞に強 制発現させたトランスジヱニックマウス等を用いて、 AGFに、血管新生活性、表皮細 胞増殖活性、軟骨細胞増殖活性、創傷治癒促進活性、及び組織再生活性があるこ とが示されている（特許文献 1、非特許文献 7)。しかし、前記以外の AGFの生理機能 に関しては何ら知見がな力つた。
[0008] 非特許文献 1 :「メタボリズム（Metabolism)」，（米国)， 1987年， 36卷， p.54_ 59 非特許文献 2 :「日本臨床」， 2003年， 61卷，増刊号 6,肥満症， p.649— 654 非特許文献 3 :「日本臨床」， 2002年， 60卷，増刊号 9，新時代の糖尿病学 3, p.31 0 - 331
非特許文献 4 :「医学のあゆみ」， 2000年， 192卷， p.513 - 518
非特許文献 5 :「医学のあゆみ」， 2000年， 192卷， p.541 - 545
非特許文献 6 :「トレンズ'イン'モレキュラー 'メディスン（Trends in Molecular Medicine
)」， （オランダ）， 2002年， 8卷， 9号， p. 442 -447
非特許文献 7：「プロシデイング ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ォ フ *ザヽュナイティッド、ステートオフ 'アメリカ (Proceedings of the national academy of sciences of the United Statesof America) J , (米国）, 2003年， 100卷， p. 9494— 9499
特許文献 1：国際公開 W099/15653号パンフレット
特許文献 2：国際公開 WO03/083114号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の課題は、新規の抗肥満薬を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは鋭意検討した結果、 AGFノックアウト (KO)マウス及び AGFトランスジ ヱニック (Tg)マウスの作製及び解析により、 AGFが抗肥満、抗糖尿、及び抗高脂血 症の作用を有することを明らかにした。すなわち、 AGFノックアウトマウスが顕著な肥 満を示すことを見出した（実施例 3)。更に、 AGFノックアウトマウスは、肥満に伴う脂 肪組織の重量が増加しており（実施例 4)、脂肪細胞が肥大化 (実施例 5)、肥満で増 加することが知られている骨格筋及び肝臓組織中のトリグリセリド量が増加することを 見出した（実施例 6)。一方、 AGFトランスジヱニックマウス（CAG—AGF Tgマウス； 全身に AGFを強制発現したマウス）は体重増加が抑制されており（実施例 3)、脂肪 組織の重量増加が抑制され (実施例 4)、脂肪細胞の肥大化は抑制され (実施例 5)、 骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量は減少（実施例 6)されること、更には、インスリ ン感受性の向上、並びに脂質代謝及び耐糖能が改善されること（実施例 16及び実 施例 17)を見出した。更に、 AGFノックアウトマウスは高インスリン血症となり、耐糖能 が悪化することが示された（参考例 2)。更に、 AGF発現アデノウイルス投与マウスに おいて、体重増加が抑制され、且つ耐糖能が改善されたこと（実施例 15及び実施例 20)、別の AGFトランスジエニックマウス（K14—AGF Tgマウス；表皮に AGFを強 制発現したマウス）において、抗肥満作用、脂肪組織減少作用、インスリン感受性亢 進作用を有すること（実施例 18及び実施例 19)を見出した。
これらの知見から、 AGFは抗肥満、糖尿、及び/又は高脂血症治療薬の有効成 分となることを明らかにし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
[1]下記（a)〜（d)からなる群から選んだポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチドを有効成分とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は高 脂血症治療薬：
(a)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
(b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列において、 1〜： 10個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸 配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列をコードする DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコー ドされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
(d)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 歹 1Jとの同一性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有 するポリペプチド、
[2]前記ポリペプチドを有効成分とする、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の改 善の機能を付与した機能性食品又は健康食品、 [3]前記ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを、肥満、糖尿病、及び
Z又は高脂血症の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、 肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症を治療又は予防する方法、並びに
[4]前記ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドの、抗肥満薬、糖尿病治 療薬、及び Z又は高脂血症治療薬を製造するための使用
に関する。
[0012] 本明細書において、用語「トランスジェニック動物」は、プロモーター及び遺伝子を 染色体に導入して、遺伝子を所望の個所で強制発現させた動物を意味し、用語「ノッ クアウト動物」は、染色体に遺伝子操作することで特定の遺伝子の発現を欠失させた 動物を意味するものとして使用する。
発明の効果
[0013] AGFは、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は高脂血症治療薬の有効成分とし て有用である。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]プラスミド pBS— loxP— lox71— mAGF— iS geoの構造を模式的に示す図面 である。記号「pro.」及び「pri.」は、それぞれ、プロモーター及びプライマーを意味 する。
[図 2]AGF K〇マウスの体重変化を示すグラフである。横軸は週齢 (週）を、縦軸は 体重（g)を示す。また、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 ヘテロ KOマウス、及びホモ KOマウスを意味する。
[図 3]CAG— AGF Tgマウス (標準食)の生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化を 示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) /体重 (g)を示す。また、記号「W
T」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 4]CAG— AGF Tgマウス (高脂肪食負荷)の生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量 変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) /体重 (g)を示す。また、 記号「WT」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 5]AGF K〇マウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化（白色脂肪組織重量
)を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g)を示す。また、記号「WT」、 ΓΗ TRJ、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 AGFヘテロ K〇マウス、及び AGFホモ K〇マウスを意味する。
園 6]AGF K〇マウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化（白色脂肪組織重量 Ζ体重)を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) /体重 (g)を示す。ま た、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 AGFヘテロ KOマ ウス、及び AGFホモ K〇マウスを意味する。
[図 7]CAG_AGF Tgマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。また、記号「TG
」及び「NTG」は、それぞれ、 Tgマウス及び WTマウスを意味する。
園 8]AGFホモ KOマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
園 9]リタ一メイト WTマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
[図 10]CAG— AGF Tgマウスの組織 (肝臓）中 TG含量を示すグラフである。横軸は 高脂肪食負荷 (箇月間）を、縦軸は TG含量 (mg/g組織)を示す。また、記号「WT」 及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 11]CAG— AGF Tgマウスの組織 (骨格筋）中 TG含量を示すグラフである。横軸 は高脂肪食負荷 (箇月間）を、縦軸は TG含量 (mg/g組織)を示す。また、記号「W
T」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。
[図 12]AGF KOマウスの組織中 TG含量を示すグラフである。縦軸は TG含量 (mg
Zg組織)を示す。また、横軸の記号「L」及び「SM」は、それぞれ、肝臓及び骨格筋 を意味し、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、ヘテロ K〇マ ウス、及びホモ ΚΟマウスを意味する。
[図 13]AGF K〇マウスの糖負荷試験の結果 (血糖値）を示すグラフである。横軸は 時間（分）を、縦軸は血糖値 (mgZdL)を示す。また、記号「WT」及び「HM」は、そ れぞれ、 WTマウス及びホモ K〇マウスを意味する。
[図 14]AGF K〇マウスの糖負荷試験の結果（血漿インスリン）を示すグラフである。 横軸は時間（分)を、縦軸は血漿インスリン (ngZmL)を示す。また、記号「WT」及び 「HM」は、それぞれ、 WTマウス及びホモ KOマウスを意味する。
[図 15]CAG_AGF Tgマウスの酸素消費量を示すグラフである。横軸において、レ ーン 1は「明期」、レーン 2は「喑期」、レーン 3は「24時間」であり、縦軸は VO (mL/ kg/min)を示す。また、記号「WT」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウ スを意味する。
園 16]マウス AGF発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフ である。黒丸は、 mAGF—Adeno投与マウスの結果であり、白丸は、 Cont—Adeno 投与マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値 (mgZd L)である。
[図 17]高脂肪食で飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの血 漿中インスリン濃度（縦軸； ng/mL)を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は
、それぞれ、 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。
[図 18]高脂肪食で飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの血 清コレステロール濃度（縦軸; mg/dL)を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」 は、それぞれ、 CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。
[図 19]高脂肪食で飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの血 清遊離脂肪酸濃度（縦軸； μ Eq/L)を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は
、それぞれ、 CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。
[図 20]CAG— AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの糖代謝試験の結果を示 すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は、それぞれ、 CAG—AGF Tgマウス及び リタ一メイト WTマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分)であり、縦軸は血糖値（ mg/dL)である。
[図 21]CAG_AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスのインスリン感受性試験の 結果を示すグラフである。記号「TG」及び「NTG」は、それぞれ、 CAG—AGF Tg マウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）であり、縦 軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％)である。
[図 22]K14_AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスにおける内臓脂肪組織重量 を示すグラフである。記号「K14_AGF」及び「NTG」は、それぞれ、 K14—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの内蔵脂 肪組織重量の百分率（％)である。
[図 23]K14— AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスにおける皮下脂肪組織重量 を示すグラフである。記号「K14_AGF」及び「NTG」は、それぞれ、 K14—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの皮下脂 肪組織重量の百分率（％)である。
[図 24]K14_AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスのインスリン感受性試験の 結果を示すグラフである。記号「K14_AGF」及び「NTG」は、それぞれ、 K14—A GF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）で あり、縦軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％)であ る。
[図 25]ヒト AGF発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフであ る。黒丸は、 hAGF— Adeno投与マウスの結果であり、白丸は、 Cont— Adeno投与 マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値 (mg/dL)で ある。
発明を実施するための最良の形態
[1]本発明の医薬
本発明の抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は高脂血症治療薬 (以下、総称して 、本発明の医薬と称する）は、下記（a)〜（d)からなる群から選んだポリペプチド、又 は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも 1つを有効成分として含 有すること力 Sできる：
(a)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
(b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列において、 1〜： 10個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸 配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列をコードする DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコー ドされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
(d)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 歹 1Jとの同一性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有 するポリペプチド。
[0016] なお、本明細書における「抗肥満薬」には、肥満患者の治療のために使用する薬 剤と、肥満傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。また、本明 細書における「糖尿病治療薬」には、糖尿病である患者の治療のために使用する薬 剤と、糖尿病傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。更に、 本明細書における「高脂血症治療薬」には、高脂血症である患者の治療のために使 用する薬剤と、高脂血症傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれ る。
[0017] 本発明の医薬の有効成分であるポリペプチドとしては、配列番号 3で表されるァミノ 酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列からなるヒト AGF、又は配列番 号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配列からなるマ ウス AGFが好ましい。
[0018] 配列番号 3で表されるアミノ酸配列は、ヒト AGF前駆体のアミノ酸配列である。ヒト A GFは、 N末端にシグナル配列（一 20〜― 1)を持ち、細胞外に分泌発現される際に シグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号 3で表されるァミノ 酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列からなるヒト成熟 AGF力 生理 活性を有する。
同様に、配列番号 5で表されるアミノ酸配列は、マウス AGF前駆体のアミノ酸配列 である。マウス AGFは、 N末端にシグナル配列（— 24〜― 1)を持ち、細胞外に分泌 発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号 5 で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配列からなるマウス 成熟 AGFが、生理活性を有する。
[0019] 本発明の医薬の有効成分として用いることのできる前記ポリペプチド (b)、すなわち 、配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列、 又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配列 において、 1〜： 10個（例えば、 1〜数個）のアミノ酸残基が置換、欠失、及び Z又は揷 入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドとしては 、前記各配列において、好ましくは 1〜7個、より好ましくは 1〜5個のアミノ酸残基が 置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を 有するポリペプチドを挙げることができる。
[0020] ポリペプチドの機能を維持するために、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と 似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グルー プに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。こ れらのアミノ酸をグノレープ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能 は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリ ペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。 非極性アミノ酸： Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Phe、及び TYp
非荷電性アミノ酸： Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、及び Gin
酸性アミノ酸: Asp及び Glu
塩基性アミノ酸： Lys、 Arg、及び His
[0021] 或るポリペプチドが体重増加抑制活性を有するか否かの判定方法は、特に限定さ れるものではないが、例えば、実施例 3に記載の方法によって確認することができる。 すなわち、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて作製したトランスジエニック 動物を、標準食又は高脂肪食で飼育し、その体重変動を野生型動物と比較すること によって確認することができる。また、実施例 15又は実施例 20に記載の方法によつ て確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドを発現するアデノウイルスを、 標準食又は高脂肪食で飼育したマウスに投与し、その体重変動をコントロールアデノ ウィルスを投与した場合と比較することによって確認することができる。
[0022] 本発明の医薬の有効成分として用いることのできる前記ポリペプチド（c)における「 ストリンジェントな条件」としては、ハイブリダィゼーシヨンのための条件として、「5xSS PE、 5xデンハート（Denhard's)液、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、 40%ホル ムアミド、 200 μ g/mLサケ精子 DNA、 37°Cオーバーナイト」程度の条件であり、よ り厳しレヽ条件としては「5xSSPE、 5xデンノヽート夜、 0. 5%SDS、 50%ホノレムアミド、 200 μ gZmLサケ精子 DNA、 42°Cオーバーナイト」程度の条件である。また、洗浄 のための条件として、緩い条件としては「5xSSC、 1%SDS、 42°C」であり、通常の条 件として「0. 5xSSC、0. 1%SDS、 42°C」程度の条件であり、より厳しい条件として ίま「0. 2xSSC、 0. 10/0SDS、 65°C」程度の条件である。なお、 5XSSPEの糸且成 fま、 50mmolZLリン酸ナトリウム（pH7. 4)、 0. 75mol/L NaCl、及び 5mmol/L E DTAであり、 5XSSCの組成は、 0. 75mol/L NaCl及び 75mmol/Lタエン酸ナ トリウム（ρΗ7· 0)である。
[0023] 本発明の医薬の有効成分として用いることのできる前記ポリペプチド（d)における 前記同一性は、少なくとも 95%以上である力 97%以上の同一性を示すことが好ま しい。なお、アミノ酸配列の同一性は、 BLAST検索アルゴリズムを用いて決定するこ とができる。具体的には、 BLASTパッケージ（sg 2bit版、バージョン 2.0.12 ; NCBIよ り入手）の bl2seqプログラム [Tatiana A. Tatusova,
Thomasし Madden, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250 (1999)]を用い、デフォルト パラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ アラインメント パラメーター として、プログラム名 blastp、 Gap挿入 Cost値を 0、 Gap伸長 Cost値を 0、 Query配 列のフィルタ一として SEG、 Matrixとして BLOSUM62を使用することができる。
[0024] 本発明の医薬の有効成分として用いることのできるポリペプチドとしては、前記ポリ ペプチド（a)〜（d)の N末端側にシグナル配列を含むものが好ましレ、。シグナル配列 としては、ポリペプチドの膜通過を先導する配列であれば限定されず、例えば、 Biochemistry, 28(3)， 923-930, 1989に記載のシグナル配列を用いることができる。よ り好ましくは、前記ポリペプチド（a)〜（d)の N末端側に、配列番号 3で表されるァミノ 酸配列におけるシグナル配歹 IK_ 20〜一 1)又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列 におけるシグナル配歹 ΙΚ— 24〜― 1)を含むものが好まし 配列番号 3で表されるァ ミノ酸配列又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列が最も好ましい。
[0025] 本発明の医薬の有効成分として用いることのできるポリペプチドの起源は、ヒト又は マウスに限定されなレ、。前記ポリペプチド（a)〜（d)のいずれかに該当する限り、例え ば、ヒト又はマウス以外の生物由来のポリペプチドも、また、配列番号 3で表されるアミ ノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配歹 IJ、又は配列番号 5で表される アミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配列を基にして、遺伝子工学 的に人為的に改変したポリペプチドも、本発明の医薬の有効成分として用いることが できる。
また、前記ポリペプチドは、組換え体であることが好ましい。
[0026] 前記ポリペプチド（a)〜（d)をコードするポリヌクレオチド、すなわち、本発明の医薬 の有効成分として用いることのできるポリヌクレオチドには、 DNA及び RNAが含まれ 、 DNAであることが好ましレ、。前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号 2で 表される塩基配列における 61番〜 1410番の塩基からなる配歹 lj、又は配列番号 4で 表される塩基配列における 73番〜 1371番の塩基からなる配列を含み、かつ体重増 加抑制活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。 好ましくは、配列番号 2で表される塩基配列又は配列番号 4で表される塩基配列から なるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号 2で表される塩基配列における 61番〜 14 10番の塩基からなる配歹 lj、又は配列番号 4で表される塩基配列における 73番〜 13 71番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドである。
[0027] 本発明には、前記ポリペプチド（a)〜（d)、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの少なくとも 1つを、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療又は予防 が必要な対象に、有効量で投与することを含む、肥満、糖尿病、及び Z又は高脂血 症を治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、前記ポリペプチド（a)〜 (d)、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、抗肥満薬、糖尿病治療 薬、及び Z又は高脂血症治療薬を製造するための使用が含まれる。
[0028] 本発明の医薬であるポリペプチドの投与方法としては、例えば、錠剤、丸剤、カブ セル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静 注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非 経口投与を挙げることができる。特に酵素の影響を受けるポリペプチドにあっては、 経皮投与や静注等の非経口投与とするか、あるいは、消化酵素の影響の少ない消 化管の下部 (例えば、空腸、回腸、結腸、又は大腸）に前記ポリペプチドが分解され ずに送達される製剤技術を用いることが好ましい。 [0029] 前記ポリペプチド（a)〜（d)を有効成分とする製剤は、ポリペプチドの製剤化に通常 用いられる薬理学上許容される担体ゃ賦形剤、その他の添加剤を用いて医薬組成 物として調製されうる。
[0030] 非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、 又は乳濁剤を含む。水溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用 蒸留水又は生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤 としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ォリーブ油のような 植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート 80等を含む。前記組 成物はさらに湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は 防腐剤などを含んでいてもよい。組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す 濾過、殺菌剤の配合、または照射によって無菌化される。また、無菌の固体組成物を 製造し、使用に際し無菌水その他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもで きる。
[0031] 本発明の医薬には、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療又は予防におい て意図される効果を生じるのに充分な、すなわち、治療的有効量又は薬理学的有効 量の前記ポリペプチド（a)〜（d)が含まれる。実際の投与における有効量の確認は、 例えば、標的疾患の回復の程度を測定することにより行うことができる。実際に投与さ れるべき量は、処置される個体の症状、年齢、体重等の種々の要因に依存し、好まし くは所望の効果が顕著な副作用を伴うことなく発揮される量が決定され、投与される。 このような有効量、また毒性等については、当業者であれば、公知のモデル動物を 用いて容易に決定することができる。例えば、通常成人において有効成分の量が 1 日 1 μ g〜2g力好ましレヽ。更に好ましくは 1日 1 μ g〜200mgである。
[0032] また、前記ポリペプチドに代えて、それをコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療 において抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は高脂血症治療薬として投与すること もできる。一般に遺伝子治療における投与形態は大きぐ非ウィルスベクターを用い る方法とウィルスベクターを用レ、る方法に分類される [『別冊実験医学
遺伝子治療の基礎技術』羊土
社 (1996);『別冊実験医学遺伝子導入 &発現解析実験法』羊土社 (1997);日本遺伝 子治療
学会編『遺伝子治療開発研究ハンドブック』 NTS(1999)]。
[0033] 非ウィルスベクターによる方法としては、例えば、内包型リボソームによる方法、静 電気型リボソームによる方法、 HVJ—リボソーム [J.Clin.Invest. 93: 1458-1464 (1994) 等]を利用する方法、レセプター介在性導入法、パーティクルガンで金属粒子などの 担体と共に細胞へ導入する方法、プラスミドの直接導入法、あるいは、正電荷ポリマ 一による導入法等が組織への遺伝子導入法として挙げられる。細胞への遺伝子導入 法としては、例えば、リポフエクシヨン、リン酸-カルシウム共沈法、 DEAE—デキストラ ン法、又は微小ガラス管を用いた DNAの直接注入法等が公知である。
[0034] ウィルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はァ デノ随伴ウィルスベクターが知られている。具体的には、例えば、無毒化したレトロゥ イノレス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、 ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスウィルス、 SV40、 HIV,又はセンダイウイ ルス等の DNA又は RNAウィルスに、前記ポリペプチド（a)〜（d)をコードするポリヌ クレオチドを導入し、細胞をウィルス感染させることにより細胞内に遺伝子を導入する こと力 Sできる。
[0035] 前記ポリペプチド（a)〜（d)をコードするポリヌクレオチドを含む抗肥満薬、糖尿病 治療薬、又は高脂血症治療薬は、直接体内への遺伝子の導入を行うインビボ (in vivo)法、及び、体外へ取り出された細胞へ遺伝子導入し、遺伝子が導入された細胞 を体内へ戻すエタスビボ（ex vivo)法のどちらによって投与してもよレ、。
[0036] インビボ投与のための製剤形態としては、注射や点滴に用いることができる液剤を 挙げること力 Sできる。液剤の調製は、具体的には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（P BS)等の緩衝液、生理食塩水、又は滅菌水等の溶剤に溶解した後、必要に応じフィ ルター濾過などにより滅菌し、無菌的な容器に充填する。必要に応じ、懸濁剤、凍結 剤、又は遠心分離濃縮凍結剤等の形態とすることもできる。また、前記ポリヌクレオチ ドは、例えば、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、ロウ、流動パラフィン、硬膏剤、プラス チック、ダルコール類、高級アルコール、樹脂、グリセリン、乳化剤、又は懸濁剤を含 む半固形の軟膏として患部へ局所投与することができる。このような軟膏は必要に応 じ親水性ポリマーと混合してシート状に成形し、患部に対して接着して用いることもで きる。
[0037] 前記ポリヌクレオチドを含む抗肥満薬、糖尿病治療薬、又は高脂血症治療薬の投 与は、疾患の種類、症状に応じた適当な方法 ·部位を選択して行われる。投与方法と しては非経口投与が好ましい。具体的には、例えば、皮下、皮内、血管内、筋肉内、 及び軟膏などによる表層への投与が可能である。皮下、皮内、血管、筋肉などへの 投与は注射やカテーテル等により行い得る。
[0038] 本発明の医薬には、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療又は予防におい て意図される効果を生じるのに充分な、すなわち、治療的有効量又は薬理学的有効 量の前記ポリペプチド（a)〜（d)をコードするポリヌクレオチドが含まれる。実際の投 与における有効量の確認は、例えば、標的疾患の回復の程度を測定することにより 行うことができる。実際に投与されるべき量は、処置される個体の症状、年齢、体重等 の種々の要因に依存し、好ましくは所望の効果が顕著な副作用を伴うことなく発揮さ れる量が決定され、投与される。このような有効量、また毒性等については、当業者 であれば、公知のモデル動物を用いて容易に決定することができる。例えば、通常成 人において有効成分の量が 1日 0. 1 μ g〜200mgが好ましい。更に好ましくは 1日 0 • 1 μ g〜20mgである。
[0039] [2]本発明の健康食品
本発明における有効成分である、前記ポリペプチド（a)〜（d)は、医薬品として投与 することができるだけでなぐ種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品 )又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が 含まれる。
[0040] 本明細書において「健康食品」とは、健康に何らかの効果を与える力、あるいは、効 果を期待することができる食品を意味し、「機能性食品」とは、前記「健康食品」の中 でも、種々の生体調節機能 (例えば、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又 は神経系などの生理系統の調節機能）を充分に発現することができるように設計及 び加工された食品を意味する。
本発明の健康食品としては、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療機能を有 するものが好ましい。
「肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の改善効果を有することを特徴とする前記ポ リペプチド（a)〜（d)のポリペプチド含有食品用組成物」及び「肥満、糖尿病、及び/ 又は高脂血症の改善効果を有することを特徴とする前記ポリペプチド（a)〜（d)のポ リペプチド含有機能性食品素材」も本発明に含まれる。前記ポリペプチド（a)〜（d)の ポリペプチド含有食品用組成物は、食品に使用可能な担体、その他の添加剤を含 むことができる。
[0041] 本発明の健康食品は、有効成分として、前記ポリペプチド（a)〜（d)を含有すること 以外は、一般的な健康食品と同様に調製することができる。例えば、食品として摂取 可能な物質に、有効量の前記有効成分を含有させることにより、本発明の健康食品 を調製することができる。前記有効量は、食品の形状若しくは種類、又はそれを摂取 する個体の症状、年齢、体重等の種々の要因に応じて適宜決定することができる。 例えば、通常成人において有効成分の量が 1日 1 μ g〜2gが好ましい。更に好ましく は 1日 1 μ g〜200mgである。
実施例
[0042] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限 定するものではなレ、。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Molecular ClomngJ， SambrooK, り,し old spring Harbor Laboratory
Press, 1989年など）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場 合には、市販品の指示書に従って実施可能である。
[0043] ノックアウト動物及びトランスジエニック動物の作製については、特に断りがない場 合 ίま、 Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd Edition, B. Hogan, R. Beddington, F. Costantim, E. Lacy, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994に従って、 ES細胞を用いたキメラマウス 作製については、 AL Joyner:
Gene Targeting, A Practical Approach, OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1993又は バイオマニュアルシリーズ 8,ジーンターゲッティング ES細胞を用いた変異マウスの 作製，相沢慎一/著，羊土社， 1994に従って実施可能である。 [0044] 《参考例 1 : AGF K〇マウスの作製》
(1)ターゲッティングベクターの作製
マウス AGF遺伝子の 5，側のゲノム配列（5 ' long arm)、 pgkプロモーター、ネオマイ シン耐性遺伝子、マウス AGF遺伝子のェクソン（exon) 2の一部とェクソン 3を含むゲ ノム配列（3 ' short
arm)、及び HSV_tk遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作 製した。
[0045] すなわち、 WO03/083114号公報の実施例 1と同様に作製したマウス AGFのタンパ ク質
コード領域全長に対応する cDNAをプローブとして、添付マニュアルに従ってマウス ゲノミックライブラリー（Mouse Genomic, 129 SVJ Library；ストラタジーン社）のスクリー ユングを行い、約 17. 9kbpの配歹 lj (AGF遺伝子を含む、 mouse-pub-genome配列 AC073775.2の 90644〜108544)を持つファージクローンを単離し、プラスミド pBlues cript (ストラタジーン社）にサブクローニングした。このプラスミドクローン（pBN2)を制 限酵素 Sail及び Mfelで切断することで、約 6. 2kbpの 5 'ロングアーム（
mouse-pub-genome配列 AC073775.2の 90664〜96900を含む）を切り出した。また、 前記プラスミド PBN2を铸型にして、配列番号 6 (
CTAGACTAGTTGCAAAGGCGTGCGGCGG人工配歹 IJ)及び配列番号 7 ( 基配列からなるプライマーセットを用いて PCRを行レ、、約 2. Okbpの 3 'ショートアーム (mouse-pub-genome配列 AC073775.2の 105903〜107914を含む）を得た。 5，ロング アーム及び 3 'ショートアームを、それぞれ、プラスミド pPNT (Cell,
1991, 65(7)， 1153-1163)の Xholサイト及び Xbalサイトへ揷入してターゲッティングべ クタ一を完成した。
[0046] (2)相同組み換え ES細胞の取得
得られたターゲッティングベクターを制限酵素 Notlで切断し、 ES細胞株 R1 ( Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 90, 8424-8428,
1993)へ電気穿孔法で導入した。 G418を含んだ培地で ES細胞を培養し、耐性株を 得た。 ES細胞から DNAを抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザン ブロット解析によって同定した。具体的には、 AGFのェクソン 4とェクソン 5を含む、配 列番号 8 (
Figure imgf000019_0001
GTGGATAGGGACAGAGACTCATATTCTGマウス）で表される塩基配列からなる D NAをプローブとして、制限酵素 Hindlllで切断した DNAを用いてサザンブロット解 析を行った。その結果、野生型の 4. 6Kbに対して相同組換えでは 6. 5Kbの DNA 断片を検出することができた。
(3) AGF K〇マウスの作製
得られた ES細胞株を、 C57BL/6マウスと DBAZ2マウス交雑第 2代である BDF 2マウスより得た胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子宮へ移植した。操作 胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスを C57BL/6 マウスと交配することによって、 AGFの開始コドンを欠失した変異アレルを持つへテ 口接合体マウス（以下、 AGFヘテロ Κ〇マウスと称する）を得た。 AGFヘテロ Κ〇マウ ス同士の交配によってホモ接合体マウス（以下、 AGFホモ ΚΟマウスと称する）を得た 。仔マウスの尻尾より単離したゲノム DNAを铸型として PCRを行レ、、マウスの遺伝子 型を、 PCRによって生じる DNA断片のサイズによって確かめた。すなわち、尻尾をプ ロティナーゼ Κで処理し、 DNAをフエノール'クロ口ホルム抽出した。抽出した DNA は、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、トリス— EDTA緩衝液 (以下、 TE溶液と称する）に溶解した。ネオマイシン耐性遺伝子配列及びターゲッテ イングによって欠失するゲノム配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデ ザインした。
(ネオマイシン耐性遺伝子）
フォワードプライマー：配列番号 9 (5し agaggctattcggctatgac-3'人工配列） リバースプライマー：配列番号 10 (5，- caccatgatattcggcaagc- 3，人工配列）
(ゲノム DNA)
フォワードプライマー：配列番号 11 (5'_tggcctctgttatcatgctc-3，マウス）
リバースプライマー：配列番号 12 (5'-ctacctacatccactcctac-3，マウス）
[0048] 得られた仔マウス由来ゲノム DNAについて、前記プライマーを用いて PCRを行つ た。 PCRは DNAポリメラーゼ（ExTaq ; Takara社）を用いて、 95°C (5分間）の熱変性 を行った後、 95°C (1分間）、 60°C (1分間）、及び 72°C (1分間）からなるサイクルを 3 0サイクル実施し、更に 72°C (7分間）の伸長反応を行レ、、増幅される断片のサイズを 調べた。変異アレルがある場合は、ネオマイシン耐性遺伝子を検出する PCRにおい て 545bpのバンドが検出され、野生型アレルがある場合は、マウス AGFェクソン 1を 含むゲノム DNAを検出する PCRにおいて 322bpのバンドが検出される。これらの結 果より、マウスの遺伝子型を判定した。その結果、 AGFホモ KOマウスでは、変異ァレ ルのバンドが検出され、野生型アレルのバンドが検出されず、 AGFヘテロ KOマウス では、変異アレルのバントと野生型アレルのバンドが共に検出され、野生型マウス [以 下、リタ一メイト（Littermate) WTマウスと称する]では変異アレルのバンドが検出され ず、野生型アレルのバンドが検出された。
[0049] また、前記参考例 1 (2)のサザンブロット解析を行なうことでも、マウスの遺伝子型を 調べた。その結果、 AGFホモ K〇マウスでは、変異アレルの 6. 5kbpのバンドが検出 され、 AGFヘテロ K〇マウスでは、変異アレルの 6. 5kbpのノ ントと野生型ァレノレの 4 . 6kbpのバンドが共に検出され、リタ一メイト WTマウスでは野生型アレルの 4. 6kbp のバンドが検出された。
[0050] 更に、 AGF KOマウスから採血した血液を 37°Cに 30分間静置後、遠心し、その 上清から血清を得た。血清をリシス（lysis)バッファー [0.5mol/L HEPES (pH7.2), 1% TritonX-100, 10%グリセロール，
10mmol/L Na P O , O. lmol/L NaF， O. lmmol/L Na VO，
4 2 7 3 4
4mmol/L EDTA (pH8)， 0.05mg/mLァプロチュン， lmmol/L PMSF, O.lmmol/Lロイ ぺプチ
ン， 0.025mmol/Lぺプスタイン A]で 20倍希釈したものを 2 X SDSサンプルバッファー で倍量希釈した。 1レーン当たり 20 μ Lを 10%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行 レ、、ウェスタンブロッテイングを行なった。ウェスタンブロッテイングは、ブロッキング斉 1J として 5%ゥシ血清アルブミン（BSA)含有 TBS— T[20mmol/L
Tris-HCl (pH 7.5), 150mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20]を、 1次抗体として抗マ ウス AGF抗体 (WO03/083114号公報）を、 2次抗体として抗ラビット抗体（ALI3404 ;
BIO
SourCE社）を 3%BSA含有 TBS—Tで 5000倍に希釈したものを各々使用した。 AG Fホモ KOマウスでは、 AGFのバンドが欠失してレ、ることより AGFの欠損を確認した。
[0051] 《実施例 1 : CAG—AGF Tgマウスの作製》
本実施例では、 CAG (modified chicken beta- actin promoter with CMV-IE enhancer)プロモーター [GENE,
108(1991) 193-200]制御下に全身にマウス AGFを強制発現させた AGFトランスジェ ニックマウス（以下、 CAG—AGF Tgマウスと称する）を作製した。プラスミド pBlues criptll KS ( + ) (ストラタジーン社）のマルチクローニングサイトに、 CAGプロモータ 一（1. 7kb)、 1οχ71酉己歹 IJ、ブラストサイジン遺伝子（bsr)、ポリ Aシグナル配歹 1J (0. 5k b)、lox P配歹 1J、マウス AGF cDNA配歹 IJ、及び IRES (internal
ribosomal entry site) - β _geo_ポリ A配列（4. 5kb)を順に挿入したプラスミドを以 下の方法で作製した。
[0052] マウス AGF全長 cDNA(WO03/083114号公報）を铸型に、配列番号 13 (
AGAAGCTTCACCATGGGGACCGCCAGGCTAC人工酉己歹 IJ)及び配列番号 14 ( 塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして PCR (95°Cで 10分間の反応後、 94 °Cで 15秒間、 60°Cで 30秒間、及び 72°Cで 2分間からなる反応を 45サイクル実施） を行い、得られた PCR産物を pZErO_ 2クローニングベクター（インビトロジェン社） にサブクローユングした。得られたプラスミドを制限酵素 Hindlllと Sailで切断し、プラ スミド pBluescriptn SK (ストラタジーン社）の Hindlllと Sailサイトへ揷入してマウス AGF全長遺伝子をもつプラスミド pBS _mAGFを作製した。次に、プラスミド pBS _ mAGFに IRES— β _geo_ポリ Α遺伝子を導入するために、この遺伝子を持つプ ラスミド pU_ San (Hum
Mol Genet 8:387-396 1999)を制限酵素 Sailと Bglllで切断して IRES— β _geo_ ポリ A遺伝子を切り出し、 pBS— mAGFの Bglllと Sailサイトへ挿入し、マウス AGF c DNA配列及び IRES— β— geo—ポリ Α配列を持つプラスミド pBS— mAGF— iS ge oを作製した。
CAGプロモーター、 1οχ71酉己歹 lj、 bsr、及びポリ Aシグナル配列を持つプラスミド pC AGlox71bsr (Nucleic Acids Res. 1997;25(4):868_872)の、ポリ Aシグナルの 3，側に 、 loxP配列を挿入して、 bsrと polyAシグナルを 1οχ71配歹 IJと loxP配列で挟んだ構造 を持つプラスミドを作製した。すなわち、 loxPを含むリン酸化（kination)処理した 81b Pの断片（配列番号 15 :
AGGTCCCTCGACCTGCAGCCCGGGGGATC：人工配歹 IJ)を、制限酵素 Smalでの 切断後 BAP (bacterial
alkaline phosphatase)処理したプラスミド pCAGlox71bsrへ揷入し、プラスミド loxP _1οχ71を作製した。プラスミド 1οχΡ_1ρχ71に揷入された loxP配列を確認するため に、 T3プライマー（配列番号 16 :AATTAACCCTCACTAAAGGG)を用いてシークェ ンシングを行い、揷入した loxP配列を含む領域の塩基配列を調べた。その結果、 T3 プライマーで読んだ塩基配列が、前記配列番号 15で表される塩基配列と一致し、 lo xPと 1οχ71が同じ方向であることを確認した。プラスミド 1οχΡ_1οχ71を制限酵素 Spe Iで切断し、得られた CAGプロモーター、 1οχ71配歹 1J、 bsr、ポリ Aシグナル配歹 lj、及 び loxP配列を含む断片を、プラスミド pBS— mAGF— β geoの Spelサイトへ揷入し 、 目的のプラスミド pBS— loxP— lox71— mAGF— β geoを作製した。得られたプラ スミド pBS— loxP— lox71— mAGF— §60の構造を図1に示す。このプラスミドを 制限酵素 Notlで切断し、直鎖 DNA断片 [CAGプロモーター（promoter)、 1οχ71配 歹 1J、 bsr、ポリ Aシグナル配列（pA)、 lox P配歹、マウス AGF cDNA配歹 lj、及び IR ES - β— geo—ポリ Α配列（pA)を含む]を得た。
[0054] ΤΤ2 ES細胞 [Anal. Biochem., 1993， 214(1): 70-76]に電気穿孔法で前記直鎖 D NA断片を導入した（0. 8V, 3 z F)。 4 z gZmLブラストサイジン存在下で ES細胞 を培養して、遺伝子が導入された細胞を選択し、 20クローンを樹立した。これらの細 胞に CAG_Creベクター（Blood,
1326-1333, VollOO, 2002)をサークルのまま電気穿孔法で導入した（0· 8V, 3 μ F)
[0055] CAGプロモーターによって発現した Creリコンビナーゼ力 1οχ71— ΙοχΡ間の遺伝 子を除去すれば、 AGF及び —geoが CAGプロモーター活性によって発現する。 そこで、 β—geo発現クローンを選択するために、 G418 (200 /i g/mL)存在下で E S細胞を培養し、 1οχ71— ΙοχΡ間が除去された遺伝子構造を持つ細胞を選択した。 この段階で選ばれた 15クローンの細胞は、 CAGプロモーター（1. 7kb)、 1οχ71配 歹 IJ、マウス AGF cDNA配歹 IJ、及び IRES— β—geo—ポリ Α配歹 lj (4. 5kb)をもち、 CAGプロモーターの制御下に AGFが恒常的に発現している ES細胞となる。 CAG — Creベクターを導入する前の 1οχ71—1οχΡ間が除去されていない各クローンの ES 細胞をネガティブコントロールとして、選ばれた 15クローンの ES細胞で AGFが発現 していることを、参考例 1 (3)と同様の抗 AGF抗体を用いたウェスタンブロッテイング で確認した。すなわち、 ES細胞をリシスバッファー及び 2 X SDSサンプルバッファー で 2倍希釈したものをサンプルとしてウェスタンブロッテイングを行レ、、 AGFが発現し ていることを確認した。 AGFの発現を確認した ES細胞の中から、 8— 1、 8— 2、及び 9—1の 3ラインを選び、これを各々胚盤胞へマイクロインジヱクシヨンし、操作胚を子 宮へ移植した。操作胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラ マウスを C57BL/6マウスと交配することによって CAGプロモーターの制御下に AG Fが恒常的に発現しているトランスジヱニックマウスを得た。トランスジヱニックマウスを 同定するため、仔マウスの尻尾より単離したゲノム DNAを鎳型として PCRを行った。 尻尾をプロティナーゼ Kで処理し、 DNAをフエノール'クロ口ホルム抽出した。抽出し た DNAは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、 TE溶液に溶 角早した。
[0056] マウス AGF cDNA配列及び LacZ配列に基づいて次の塩基配列からなるプライ マーをデザインした。
(AGF)
フォワードプライマー：配列番号 17 (5，- cccactacgacagcttctcc_3，マウス）
リバースプライマー：配歹 1J番号 18 (5し agccgggtcaacataacagc_3，マウス)
(LacZ)
フォワードプライマー：配列番号 19 (5'-gcgttacccaacttaatcg-3，人工配列） リバースプライマー：配列番号 20 (5'-tgtgagcgagtaacaacc_3，人工配列）
このプライマーを用いて PCRを行うと、導入遺伝子からは、 AGF cDNAを検出す る PCRにおレ、て 325bp断片が増幅され、 LacZを検出する PCRにおレ、ては 320bp 断片が増幅され、マウスゲノム DNAからはこれらのサイズの断片は増幅されないは ずである。前記プライマーを用いて、得られた仔マウス由来ゲノム DNAについて PC Rを行った。 PCRは DNAポリメラーゼ（ExTaq ; Takara社）を用いて、 94°C (5分間）熱 変性を行った後、 94°C (1分間）、 62°C (1分 30秒間）、及び 72°C (1分 30秒間）から なるサイクルを 28サイクル実施し、更に 72°C (7分間）の伸長反応を行い、増幅される 断片のサイズを調べた。その結果、 3ラインとも、 AGF cDNAを検出する PCR及び LacZを検出する PCR共にバンドが確認された。すなわち、 3ラインともジャームライン トランスミッションを確認し、それぞれ CAGプロモーターの制御下に AGFが恒常的に 発現しているトランスジエニックマウスであることが確認された。
[0057] 《実施例 2 : CAG_AGF Tgマウスの AGF遺伝子発現》
実施例 1で作製した CAG—AGF Tgマウスで、 AGF遺伝子がどの程度発現して レ、るかを調べた。 CAG—AGF Tgマウス及び同腹の野生型マウス（リタ一メイト WT マウス)の白色脂肪 (WAT)、褐色脂肪 (BAT)、大脳、小脳、視床下部、心臓、肝臓 、腎臓、脾臓、骨格筋、及び膝臓の各組織よりトリゾール試薬 (Invitrogen社)を用いて 総 RNAを調製した。市販の RNA精製試薬（RNeasy；キアゲン社)及び DNァーゼ（キ ァゲン社）を用いて総 RNAを DNァーゼ処理及びクリーンアップした。 DNァーゼ処 理した総 RNAO. を、スーパースクリプト 'ファーストストランドシステム（RT—PC R用） (LIFE
TECHNOLOGIES社）を用いて cDNAに変換した。
[0058] AGF及び内部標準の 18Sリボゾ一マル RNA (18SrRNA)の発現量は定量 PCR法 で行なった。定量 PCRは、シークェンスディテクシヨンシステム（ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System ; Applied Biosystems社)を用レヽ飞、リアノレタイムの'虫光量 を計測することで測定した。铸型として cDNAを、プライマーとして各遺伝子毎にデ ザインしたプライマー及びタックマンプローブ（Taq
Man probe)を使用した。 AGF遺伝子の発現量測定には、プライマーとして配列番号 21 (TCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGTマウス）と配列番号 22 (
CACCTGATGCACAGGTTCCAマウス）を用レヽ、 PCR試薬として市販の試薬（SYBR Green PCR Master Mix ;アプライドバイオシステムズ社）を用いて PCRを行った。 18S rRNAの発現量測定には、プライマーとして配列番号 23 (
TGGTTGATCCTGCCAGTAGマウス）と酉己歹 IJ番号 24 (
CGACCAAAGGAACCATAACTマウス）を、タックマンプローブとして配列番号 25 ( CCGGTACAGTGAAACTGCGAATGマウス）を用レヽ、 PCR試薬として市販の試薬（ TaqMan
Universal PCR Master Mix ;アプライドバイオシステムズ社）を使用して PCRを行った
[0059] PCRの反応は、 95°C (10分間）の初期変性反応を実施した後、 94°C (15秒間）と 6 0°C (60秒間）からなるサイクル反応を 45回繰り返すことにより実施した。遺伝子発現 量算出の標準曲線は、上記 cDNA又はマウスゲノム DNAを鎳型として用いて同様 の反応を行なレ、、遺伝子の発現量はサンプル間の相対値で算出した。
その結果、 CAG-AGF Tgマウスの組織では、 WTマウスの組織に比べて AGF 遺伝子の発現量が上昇していることが判った。特に、骨格筋、 BAT、心臓での発現 上昇が顕著であった。
[0060] 《実施例 3：遺伝子改変マウスの体重変化》
(l) CAG-AGF Tgマウスの体重変化 CAG-AGF Tgマウスを C57BL/6に 2世代戻し交配し、 F2の CAG—AGF T gマウスを得た。 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを標準食（CE- 2 ; クレア社)で通常に飼育した。 6週齢の雌マウスの体重を比較したところ、 CAG-AG F Tgマウス fま 15. 7g± 0. 8g (SD)、 WTマウス ίま 17. 8g± 0. 5g (SD)であり、 1 2週齢の雌マウスの体重を比較したところ、 CAG—AGF Tgマウスは 19. 5g± 0. 7 g (SD)、 WTマウスは 23. 5g± 2. 5 g (SD)であり、 CAG—AGF Tgマウスの方 が体重が少なレ、ことが判った。
[0061] 次に、同じマウスを引き続き高脂肪食負荷して体重の変動を調べた。高脂肪食（ high fat diet 32 ;クレア社)で通常に 12週間飼育し、体重の変動を調べた。その結果 、 12週間での体重増加量が、 CAG-AGF Tgマウスは、 7. lg± lg (SD)であった のに対して、 WTマウスは 21. 8g±4g (SD)であった。これらのことより、 CAG-AG F Tgマウスでは、標準食での体重増加抑制、高脂肪食での顕著な体重増加抑制 があることが判り、 AGFに体重増加抑制作用があることが判った。
[0062] (2) AGF K〇マウスの体重変化
AGFホモ ΚΟマウス、 AGFヘテロ ΚΟマウス、及びリタ一メイト WTマウスを標準食で 通常に飼育した。 1週間毎に 24週齢まで各マウスの体重を測定した。結果を図 2に 示す。図 2に示すように、 AGFホモ ΚΟマウスでは、約 12週齢より、 WTマウスに比べ て体重が重くなり始め、その後も体重増加が続き、顕著な肥満となることが判った。 A GFヘテロ K〇マウスでは、 AGFホモ KOマウスとリタ一メイト WTマウスの中間的な表 現型となった。
[0063] 《実施例 4：遺伝子改変マウスの臓器重量変化》
(1) CAG-AGF Tgマウスの臓器重量変化
CAG-AGF Tgマウスでは体重増加が抑制されていることが判った力 その原因 を明らかにするために、臓器の重量を測定した。 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一 メイト WTマウスの、生殖器脂肪 (WAT)、褐色脂肪 (BAT)、肝臓、心臓、腎臓、及び 脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。標準食で飼育した 12週 齢のマウスと、高脂肪食で 12週齢〜 24週齢の 12週間飼育したマウスで調べた。そ の結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓では、標準食飼育及び高脂肪食飼 育共に、 CAG-AGF Tgマウスと WTマウスで組織重量の変化はなかった。一方、 生殖器脂肪（白色脂肪組織）は、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、 CAG-AGF Tgマウスの方が、 WTマウスよりも体重当たりの組織重量が減少していた。すなわち , CAG-AGF Tgマウスで体重増加が抑制されていたのは、白色脂肪組織の重量 増加が抑制されていたためであることが示された。すなわち、 AGFは、他の臓器重量 には何ら影響を与えず、肥満などに伴う脂肪組織重量の増加を抑制する作用がある ことが判った。 白色脂肪組織に関する結果を図 3 (標準食)及び図 4 (高脂肪食負荷） に示す。
[0064] (2) AGF K〇マウスの臓器重量変化
AGF ΚΟマウスでは体重が増加していることが判った力 S、その原因を明らかにす るために、臓器の重量を測定した。標準食で飼育した 20週齢雌の AGFホモ KOマウ ス、 AGFヘテロ KOマウス、及びリタ一メイト WTマウスの、生殖器脂肪（WAT)、褐色 脂肪 (BAT)、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重 量を計測した。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓は、 AGFホモ KO マウス、 AGFヘテロ ΚΟマウス、及び WTマウスで組織重量の変化はなかった。一方 、生殖器脂肪は、 AGFホモ ΚΟマウスの方力 WTマウスよりも、マウス個体当たり及 び体重当たりの組織重量が増加していた。 AGFヘテロ ΚΟマウスは、 AGFホモ ΚΟ マウスと WTマウスの中間的な組織重量となった。すなわち、 AGF KOマウスで体重 が増加していたのは、生殖器脂肪組織等の白色脂肪組織の重量が増加していたた めであることが示された。このことより、 AGF K〇マウスは、 CAG—AGF Tgマウス と逆の表現型となることが明らかとなり、 AGFの生理活性として他の臓器重量には影 響を与えずに脂肪組織の重量増加抑制作用があることが明らかとなった。生殖器脂 肪組織（白色脂肪組織）に関する結果を図 5 (白色脂肪組織重量)及び図 6 (白色脂 肪組織重量 Z体重）に示す。
[0065] 《実施例 5：遺伝子改変マウスの脂肪細胞形態変化》
(1) CAG-AGF Tgマウスの脂肪細胞形態変化
高脂肪食負荷することで白色脂肪組織の重量が増大し、更に脂肪細胞が肥大化 することが知られている。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知 られてレヽる（医学のあゆみ， 192, 513— 518, 2000 ;医学のあゆみ， 192, 541 - 5 45, 2000)ため、 CAG—AGF Tgマウスの脂肪細胞の形態を調べた。高脂肪食で 12週齢〜 24週齢の 12週間飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマ ウスの生殖器脂肪組織を採取し、 10%中性緩衝ホルマリン液 (Wako)で固定し、パラ フィン包坦後、薄切切片の作製及びへマトキシレンーェォジン（H&E)染色を行なつ た。結果を図 7に示す。リタ一メイト WTマウス (NTG)では、脂肪細胞が肥大化してい た力 CAG—AGF Tgマウス（TG)では、脂肪細胞の肥大化が抑制されて、ほぼ正 常の大きさに維持されていた。
[0066] (2) AGF K〇マウスの脂肪細胞形態変化
糖尿病モデルマウスや肥満モデルマウスでは、脂肪組織の重量増大に伴って脂肪 細胞が肥大化していることが知られている [Diabetologia, 14(3), 141-148， 1978]。脂 肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られているため、 AGF K 〇マウスの脂肪細胞の形態を調べた。 AGFホモ KOマウス及びリタ一メイト WTマウス の生殖器脂肪組織 (WAT)及び褐色脂肪組織 (BAT)を採取し、 10%中性緩衝ホ ルマリン液で固定し、パラフィン包坦後、薄切切片の作製及びへマトキシレンーェォ ジン（H&E)染色を行なった。結果を図 8 (AGFホモ KOマウス）及び図 9 (リタ一メイト WTマウス）に示す。リタ一メイト WTマウスの WATは、脂肪細胞が正常の大きさであ つたが、 AGFホモ KOマウスの WATは、脂肪細胞が肥大化していることが判った。更 に、 AGFホモ KOマウスではリタ一メイト WTマウスに比べて BATでの脂肪の蓄積が 観察された。
[0067] 《実施例 6：遺伝子改変マウスの組織中トリグリセリド含量変化》
(1) CAG—AGF Tgマウスの組織中トリグリセリド含量変化
肥満では、脂肪組織の増大に加えて、骨格筋や肝臓中でのトリグリセリド (TG)含量 の増加が起きることが知られている（日本臨床、 1995年、 53卷、 1995年特別号、肥満 症、 p354_p358)。そこで CAG—AGF Tgマウスの骨格筋 (腓腹筋)及び肝臓組織 中の TG含量を調べた。 CAG—AGF Tgマウス（Tg)及びリタ一メイト WTマウス（W T)を高脂肪食 (high
fat diet 32 ;クレア社)で 1箇月間及び 3箇月間飼育し、各マウスの骨格筋及び肝臓組 織から、クロ口ホルム一メタノール溶液を用いて、組織中の TGを抽出した（生化学実 験講座 3、脂質の化学、東京化学同人)。抽出した TGの濃度をキット（トリグリセライド Eテストヮコ一；和光純薬工業社)を用いて測定し、組織中の TG含量を求めた。結果 を図 10 (肝臓)及び図 11 (骨格筋）に示す。骨格筋と肝臓共に CAG—AGF Tgマウ スは WTマウスに比べて、組織中の TG含量が減少していることが判った。このことより 、肥満によって増加することが知られている骨格筋や肝臓中の TG含量を、 AGFが 減少させる活性があることが明らかとなった。
[0068] (2) AGF K〇マウスの組織中 TG含量
AGF KOマウスの骨格筋 (腓腹筋)及び肝臓組織中の TG含量を調べた。 AGF KOマウス及びリタ一メイト WTマウスの骨格筋及び肝臓組織から前記（1)の方法で、 組織中の TGを抽出した。抽出した TGの濃度をキット（トリグリセライド Εテストヮコー； 和光純薬工業社)を用いて測定し、組織中の TG含量を求めた。結果を図 12に示す 。 AGF ΚΟマウスは WTマウスに比べて、骨格筋及び肝臓組織中の TG含量が顕著 に増加していることが判った。 AGF ΚΟマウスは CAG— AGF Tgマウスと逆の表 現型となることが判り、 AGFの生理活性として、骨格筋や肝臓中の TG含量を減少さ せる活性があることが明らかとなった。
[0069] 《参考例 2 :AGF KOマウスの血糖値及び血中インスリン濃度変化》
AGFホモ K〇マウス及びリタ一メイト WTマウスの糖負荷試験を行レ、、血糖値及び 血中インスリン濃度を調べた。マウスを 16時間絶食後、 lg/kgの D—グノレコースを 腹腔内注射 (ip)による投与し、投与前、並びに投与後 15、 30、 60、及び 120分後 に眼静脈より採血した。ダルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を、 RIA 2抗体法（SRL社)を用いて血中インスリン濃度を測定した。結果を図 13 (血糖値)及 び図 14 (血漿インスリン）に示す。
[0070] WTマウスは、糖負荷により上昇した血糖値が投与後 30分後から減少し始めるのに 対して、 AGFホモ K〇マウスは、糖負荷によって血糖値がより大きく上昇し、投与後 6 0分後でも血糖値は減少し始めなかった。これらのことより、 AGFホモ Κ〇マウスでは 耐糖能異常が起きていることが判った。血中インスリン濃度は、 WTマウスでは、糖負 荷によりインスリン濃度が上昇した力 S、 AGFホモ KOマウスでは、糖負荷前から血中ィ ンスリン濃度が顕著に高値であり、高インスリン血症の状態にあることが判った。これ らのことより、 AGF遺伝子を欠失した AGFホモ K〇マウスでは、糖尿病が惹起される ことが判り、 AGFに抗糖尿病作用があることが明らかとなった。
[0071] 《実施例 7 : CAG _AGF Tgマウスの酸素消費量》
CAG -AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの酸素消費量を測定した。酸素 消費量測定装置（OXYMAX ; Columbus Instruments社）を用いて、絶食下で、マウス の酸素消費量を 24時間に渡り計測した。計測方法は酸素消費量測定装置に添付の 取扱説明書に従った。 CAG -AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウス各 14匹の 、酸素消費量を計測し、明期の 12時間（7 : 00〜： 19 : 00)、喑期の 12時間（19 : 00〜 7 : 00) ,及び 24時間の酸素消費量を求め、 CAG -AGF Tgマウスと WTマウス間 で比較した。結果を図 15に示す。何れの時間帯においても、 CAG -AGF Tgマウ スの酸素消費量 (V〇）が WTマウスに比較して多いことが判った。この結果、 AGFに
2
は酸素消費量を亢進する活性があることがわかった。酸素消費量とエネルギー消費 量は相関するので、酸素消費量が亢進することで、抗肥満の作用がある [FEBS Letters, 491(1-2): 154-158， 2001]。 AGFには酸素消費量を亢進する活性があるこ とが判ったので、 AGFには抗肥満作用があることが裏付けられた。
[0072] 《実施例 8 : CAG— AGF Tgマウスの組織中の遺伝子発現変動》
CAG -AGF Tgマウスの褐色脂肪組織（BAT)及び骨格筋での、 UCP ( Uncoupling Protein)退 is子及び PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated
Rec印 tor)遺伝子の発現変動を調べた。 CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WT マウスの BAT及び骨格筋組織から、実施例 2と同様の方法で、総 RNAを調製し、 D Nァーゼ処理後、 cDNA合成した。 UCP 1、 UCP3、 PPAR- ひ、 PPAR— δ、及び β—ァクチンの発現量は定量 PCR法で行なった。定量 PCRは、実施例 2に記載の 方法と同様の方法で実施した。各遺伝子の定量 PCRで用いたプライマーとしては表 1に記載のプライマーを用いた。また、市販の PCR試薬として、 /3—ァクチンについ ては SYBR
Green PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ）を、 UCP 1、 UCP3、 PPAR— a、及び PPAR— δについては、 TaqMan Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ）を使用した,
[0073] [表 1] 遺伝子 フォワードプライマー リバースプライマー タックマンプライマ一
U C Ρ 1 配列番号 2 6 配列番号 2 7 配列番号 2 8
U C P 3 配列番号 2 9 配列番号 3 0 配列番号 3 1
P P A R— α 配列番号 3 2 配列番号 3 3 配列番号 3 4
Ρ Ρ A R - δ 配列番号 3 5 配列番号 3 6 配列番号 3 7 βーァクチン 配列番号 3 8 配列番号 3 9 使用せず
[0074] その結果、 CAG—AGF Tgマウスの BATでは UCP1が発現誘導していること、 C AG-AGF Tgマウスの骨格筋では UCP3、 PPAR- a、及び PPAR— δが発現 誘導していることが判った。すなわち、 AGFは、 BATでは UCP1を発現誘導させ、骨 格筋では UCP3、 PPAR- a、及び PPAR— 5を発現誘導させることが判った。この ことより、 AGFによる熱消費を亢進させる UCPの発現亢進、熱消費や脂質代謝を亢 進させる PPARの発現亢進が、 AGFによる酸素消費量の亢進、体重増加抑制、及 び脂肪組織重量増加抑制等の作用のメカニズムの一つであることが明らかとなった。
[0075] 《実施例 9：マウス AGFとヒト AGFの発現及び精製》
ヒト AGF及びマウス AGFを WO03/083114号公報（実施例 19)に記載の方法に従 つて発現し、精製した。すなわち、 PCRにより得られた約 1. 4kbp (ヒト）又は約 1. 3k bp (マウス）の DNA断片をプラスミド pcDNA— Signal— FLAGに揷入して得られた 発現プラスミドを HEK293細胞に導入した。ヒト AGF及びマウス AGFの発現細胞株 の培養上清を、抗 FLAG— M2モノクローナル抗体ァガロースァフィ二ティーゲル（ ANTI-FLAG
M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel ; Sigma社）を用いてァフィ二ティー精 製してヒト及びマウスのリコンビナント AGFタンパク質を得た。
[0076] 《実施例 10：マウス AGF発現アデノウイルスの作製》
マウス AGFの全長 cDNAを含有するプラスミド pCR2. 1 -mNew (WO03/083114 号公報の実施例 1で作製）を鎳型として、フォワードプライマー（
AATCTAGACACCATGGGGACCGCCAGGCTACG；配列番号 40)とリバースプライ マー（AAGCGGCCGCCAAGCGCACAAGCCGGGTCAA ;配列番号 41)を使用して PCR (pfu DNAポリメラーゼを用レヽ、 95°C10分間の後、 94°C15秒、 60。C30秒、 7 2°C2分のサイクルを 45回）を実施した。得られた PCR産物を pCR4Blunt_TOP〇 (インビトロジェン社製）にサブクローニング後、制限酵素 Xbalと Notlで切断し、 Xbal と Notlで切断した C末端 FLAG付加型発現ベクター pCEP4dE2_FLAG ( WO02/42448号公報の実施例 2と同様に作製）に揷入して、 pCEPdE2_mAGF_ FLAGを得た。 pCEPdE2— mAGF— FLAGを鎳型として、フォワードプライマー（ GAAGATCTACCATGGGGACCGCCAGGCTACGC；酉己歹 [J番号 42)とリバースプライ マー（CCGCTCGAGTGATGGGACAGTCACAAGCGC；配列番号 43)を使用して P CR (PyroBest DNAポリメラーゼを用レヽ、 95°C2分間の後、 98°C20秒、 60°C30 秒、 72°C1分 30秒のサイクルを 20回、続いて 72°C7分）を実施した。得られた PCR 産物を pCR4Blunt— TOPO (インビトロジェン社製）にサブクローニング後、制限酵 素 Bglllと Xholで切断し生じた約 1. 4kbpの DNA断片を、アデノウイルス作製用シャ トルベクター pAdTrack— CMV (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514， 1998)の BglII、 Xhol部位に挿入して、 pAdTra cK— CMV— mAGFを完成させた。このプラスミド又はコントロールとして pAdTrack — CMV (空ベクター）を用レ、、ウィルス粒子を調製した。具体的には、以下の方法に より調製した。
大腸菌 BJ5183 (stratagene社製）を、プラスミド pAdEasy— 1 (He T.-C.ら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95, 2509-2514, 1998)でトランスフォームして、プラスミド pAdEasy— 1を含む大腸菌 BJ5183 [以下、大腸菌 BJ5183 (pAdEasy— 1)と称する]を作製した。先に調製した プラスミド p AdTracK - CMV - mAGF又は pAdTrack - CMVを制限酵素 Pmelで 切断し、これを用いて大腸菌 BJ5183 (pAdEasy— 1)をトランスフォームした。プラス ミド pAdEasy - 1とプラスミド p AdTracK - CMV - mAGF又は pAdTrack - CMV とがリコンビネーションしたクローンを選択するために、得られたトランスフォーマントの クローンからプラスミドを調製して、制限酵素 Paclによる切断パターンを調べた。 3kb 又は 4. 5kbのエキストラバンド（extra
band)が出現するクローンを選択することにより、プラスミドのアーム部位で、デザイン どおりにリコンビネーションを起こしたクローンを得た。
得られたウィルス粒子濃度は、 WO02/42448号公報の実施例 15と同様の方法で求 めた。
[0078] 《実施例 11：アデノウイルスを用いたマウス AGFタンパク質の発現》
実施例 10にて調製したマウス AGFタンパク質発現アデノウイルス及び pAdTrack _CMVコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株 293 (ATCC番号：
CRL-1573)に、細胞 1個当たりおよそ 100個のウィルス粒子になるように感染させた。 具体的には、 I型コラーゲンでコートした 6穴プレート（旭テクノグラス）に 3 X 105で 29 3細胞を蒔き、 2mLの 10%FBS/ペニシリン 100IU/mL、ストレプトマイシン 100 i g/mL/DMEM培地で 1晚培養した後、アデノウイルス 6 X 107粒子を添加し、 1 晚培養し、 2mLのペニシリン 100IU/mL、ストレプトマイシン 100 μ g/mL/DME M培地に置換した。感染後 2日目に培養上清を回収し、 3， 000回転/分で 5分間の 遠心分離を行い、上清をゲル濃度 4— 20%のグラジェントゲル (第一化学薬品）で S DSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE)を実施した。一次抗体として抗 マウス AGF抗体 (WO03/083114号公報の実施例 5で作製）、二次抗体として西洋わ さびパーォキシダーゼ標識ャギ抗ゥサギ IgGポリクローナル抗体（Biosource社製）を 用いたウェスタンブロッテイングを行った。コントロールアデノウイルスにより感染させ た上清をサンプルとした場合には検出されず、マウス AGFタンパク質発現アデノウィ ルスにより感染させた上清をサンプノレとした場合にのみ、予想されるマウス AGF分子 量にバンドが検出され、実施例 10で作製したマウス AGFタンパク質発現アデノウィ ルスにより、実施例 11の方法でマウス AGFタンパク質が発現されることがわかった。
[0079] 《実施例 12：ヒト AGF発現アデノウイルスの作製》
ヒト AGFの全長 cDNAを含有するプラスミド（WO03/083114号公報の実施例 18で 作製；以下、 PCR2. 1—hNew)を铸型として、フォワードプライマー（ リバースプライマー（AACTCGAGCAGCTTCAGGGGCCGAATGAGCATGGC；配列 番号 1)を使用して PCR (PyroBestTM DNAポリメラーゼ（宝酒造）を用い 5%ホルム アミド存在下で 98°C20秒、 64°C30秒、 74°C3分のサイクルを 35回繰り返した）を実 施した。得られた PCR産物を pCR4Blunt— TOP〇（インビトロジェン社製）にサブク ローニング後、制限酵素 Hindlllと Xholで切断し、 Hindlllと Xholで切断した pCEP4 (Invitrogen)に揷入して、 pCEP—hAGFを得た。 pCEP—hAGFを制限酵素 Kpnl 及び Mlulで切断し生じた約 0. 43kbpの DNA断片、全長ヒト AGF cDNAを含む 発現プラスミド（WO03/083114号公報の実施例 19で作製；以下、 pcDNA- SF-h AGF)を制限酵素 Mlul及び Xholで切断し生じた約 0. 98kbpの DNA断片を、アデ ノウィルス作製用シャトルベクター pAdTrack_CMV (Pro
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514， 1998)の Kpnl、 Xhol部位に挿入して、 pAdTr acK— CMV— hAGFを完成させた。このプラスミド又はコントロールとして pAdTrac k CMVを用い、 WO02/42448号公報の実施例 14及び実施例 15と同様の方法で p AdEasyシステム（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514， 1998)を利用して、ウィルス粒子を調製した。得 られたウィルス粒子濃度は、 WO02/42448号公報の実施例 15と同様の方法で求めた
[0080] 《実施例 13：抗ヒト AGF抗体の作製》
全長ヒト AGF精製タンパク質 (WO03/083114号公報の実施例 19)を、ゥサギに免 疫して抗体を得た。初回免疫に 500 /i g、 2回目〜 4回目の免疫に 250 x gを使用し て 2週間毎に免疫した。最終免疫後 2週間目に、全採血により抗血清を得た。抗血清 をプロテイン Aカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製し、 IgG抗体（ 以下、抗 SF— YP— 030 IgG)を得た。
[0081] 《実施例 14 :アデノウイルスを用いたヒト AGFタンパク質の発現》
実施例 10及び実施例 12にて調製したヒト AGFタンパク質発現アデノウイルス及び pAdTrack_CMVコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株 293に、実施例 11と同様の方法で感染させ培養上清を得た。一次抗体として実施例 13で作製した 抗 SF— YP— 030 IgGを使用すること以外は実施例 11と同じ方法を用いて、培養 上清中のヒト AGFタンパク質発現を検出した。その結果、コントロールアデノウイルス により感染させた上清をサンプノレとした場合には検出されず、ヒト AGFタンパク質発 現アデノウイルスにより感染させた上清をサンプノレとした場合にのみ、予想されるヒト AGF分子量にバンドが検出され、実施例 12で作製したヒト AGFタンパク質発現アデ ノウィルスにより、実施例 14の方法でヒト AGFタンパク質が発現されることがわ力つた
[0082] 《実施例 15：高脂肪食負荷マウスへのマウス AGF発現アデノウイルス投与》
雌の C57BLZ6マウス（クレア社）に 8週齢から高脂肪食（high fat diet 32 ;クレア社 )を与えた。高脂肪食負荷マウスは体重が増加し、本試験のウィルス投与時である 38 週齢時で約 54gと、肥満となった。これらのマウス各 4匹に、実施例 10で作製した、マ ウス AGF発現アデノウイルス（mAGF—Adeno)又はコントロールアデノウイルス（Co nt— Adeno)を、 5 X 109PFU/マウス/週ずつ、尾静脈注射にて投与した。最初 にアデノウイルスを投与してから 12日後の体重力 mAGF—Adeno投与マウスで、 平均 7. 3g減少し、 Cont— Adeno投与マウスで 1. 4g減少した。 mAGF—Adeno投 与マウスでは、 AGF遺伝子を持つウィルスを投与することで生体内で AGFタンパク 質が発現して、この AGFタンパク質が体重減少を引き起こしたことが判った。
[0083] 更にこれらのマウスを用いて、糖代謝試験を実施した。これらのマウスを 16時間絶 食後、 0. 4g/kgの D—グルコースを腹腔内注射 (ip)により投与し、投与前、並びに 投与後 15、 30、 60、及び 120分後に眼静脈より採血した。ダルテストエース（三和化 学研究所）を用いて血糖値を測定した。その結果を図 16に示す。
mAGF—Adeno投与マウスは、グルコース投与後のすべての時間において Cont —Adeno投与マウスよりも血糖値が低 耐糖能が改善していることが明らかとなった 。すなわち、 mAGF—Adeno投与マウスで高発現された AGFタンパク質の作用によ り、耐糖能が改善されたことが明らかとなった。
[0084] 《実施例 16 :高脂肪食負荷による CAG— AGF Tgマウスの血中インスリン及び脂質 濃度》
6週齢の CAG—AGF Tgマウス（実施例 1)及びリタ一メイト WTマウス（雌）を、高 脂肪食で 12週間飼育した。眼静脈より採血し、インスリンィムノアッセィ (栄研化学)を 用いて血漿中インスリン濃度を、 Lタイプヮコー コレステロール (和光純薬）を用いて 血清コレステロール濃度を、及び NEFA C—テストヮコー（和光純薬）を用いて血清 遊離脂肪酸濃度を、各キットに添付のプロトコールに従って測定した。結果を図 17 ( 血漿中インスリン濃度、 ng/mL) ,図 18 (血清コレステロール濃度、 mg/dL)、図 1 9 (血清遊離脂肪酸濃度、 x Eq/L)に示す。
その結果、インスリン濃度、コレステロール濃度、遊離脂肪酸濃度の何れも、 CAG -AGF Tgマウス（TG)の方力 リタ一メイト WTマウス（NTG)よりも低いことがわ力 つた。このことより、 CAG—AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用に より、インスリン感受性が亢進したこと、脂質代謝が改善したことが明らかとなった。
[0085] 《実施例 17 : CAG_AGF Tgマウスの糖代謝試験》
CAG-AGF Tgマウス（実施例 1)の糖負荷試験を行レヽ、 AGFによる耐糖能改善 効果を調べた。 4ヶ月齢の雌の CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを 16時間絶食後、 lg/kgの D—グノレコースを腹腔内注射 (ip)により投与し、投与前、 並びに投与後 15、 30、 60、及び 120分後に眼静脈より採血した。グノレテストエース（ 三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。結果を図 20に示す。
CAG—AGF Tgマウスは、グルコース投与後のすべての時間においてリタ一メイト WTマウスよりも血糖値が低ぐ耐糖能が改善していることが明らかとなった。すなわち 、 CAG—AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用により、耐糖能が 改善されたことが明らかとなった。
[0086] 次に、 4ヶ月齢の雌の CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスに、 0· 75 単位 Zkgのインスリンを腹腔内投与した。インスリン投与後、 20、 40、及び 60分後に 眼静脈より採血し、ダルテストエース（三和化学研究所)を用いて血糖値を測定した。 インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合を図 21に示す。
CAG—AGF Tgマウスはインスリン投与後すベての時間においてリタ一メイト WT マウスよりも血糖値の低下が大きぐインスリン感受性が亢進していたことが判った。 すなわち、 CAG—AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用により、ィ ンスリン感受性が亢進したことが明らかとなった。
[0087] 《実施例 18 : K14— AGF Tgマウスの体重及び脂肪重量変化》
K14プロモーター制御下に AGFを強制発現させたトランスジエニックマウス（
WO03/083114号公報の実施例 8)を作製した。
このマウスは、表皮細胞から AGFタンパク質を高発現し、発現した AGFの作用によ り血管新生、組織再生が引き起こされることが判っている。全身に AGFを高発現した マウスを用いて実施例 3、実施例 4、及び実施例 17で示したのと同様に、表皮細胞で 高発現された AGFが抗肥満、及び抗糖尿病の作用を示すことを確認した。
[0088] 8ヶ月齢雌の K14—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウス各 5匹の体重を測定 したところ、 K14—AGF Tgマウスは平均約 21gであり、リタ一メイト WTマウスの平 均約 3 lgと比べて、体重が減少していることが明ら力となった。次に、 K14—AGF T gマウス及びリタ一メイト WTマウスの横隔膜から腹腔の最下部までの領域を 2mm間 隔で、実験動物用 X線 CT (ァロカ社製)で撮影し、内臓脂肪組織重量及び皮下脂肪 組織重量を計測した。結果を図 22 (内臓脂肪組織重量)及び図 23 (皮下脂肪組織 重量)に示す。
内臓脂肪及び皮下脂肪共に K14— AGF Tgマウスのほうがリタ一メイト WTマウス に比べて、顕著に脂肪組織重量が減少していることが明らかとなった。すなわち、 C AG-AGF Tgマウスの場合と同様に、発現した AGFに抗肥満作用、及び脂肪組 織を減少する作用があることが判った。
[0089] 《実施例 19 : K14 AGF Tgマウスのインスリン感受性試験》
K14-AGF Tgマウスのインスリン感受性を調べた。 8ヶ月齢雌の K14—AGF T gマウス及びリタ一メイト WTマウスに、 0. 75単位/ kgのインスリンを腹腔内投与した 。インスリン投与後、 20、 40、 60、 80、及び 100分後に眼静脈より採血し、ダルテスト エース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。インスリン投与前の血糖値に 対する、投与後の血糖値の割合を図 24に示す。
K14-AGF Tgマウスはインスリン投与後すベての時間においてリタ一メイト WT マウスよりも血糖値の低下が大きぐインスリン感受性が亢進していたことが判った。 すなわち、 CAG—AGF Tgマウスで高発現された AGFタンパク質の作用により、ィ ンスリン感受性が亢進したことが明らかとなった。
[0090] 《実施例 20：高脂肪食負荷マウスへのヒト AGF発現アデノウイルス投与》
実施例 15では、マウス AGFの体重減少抑制作用及び耐糖能改善作用を示した。 そこで、ヒト AGFに同様の作用があることを以下の試験を実施することで確認した。 実施例 12で作製したヒト AGF発現アデノウイルス（hAGF—Adeno)及びコントロー ルアデノウイルス（Cont—Adeno)を各 3匹のマウスに、実施例 15と同様に投与した ところ、 13日後の体重力 hAGF—Adeno投与マウスで平均 4. 6g減少し、 Cont— Adeno投与マウスで平均 0. lg増加した。更に、腹腔内注射した D—グルコースが 0 . 5gZkg、投与後の採血を 30、 60、 90、及び 120分後に行ったこと以外は、実施例 15と同様に糖代謝試験を実施したところ、図 25に示すように、 hAGF—Adeno投与 マウスは、グルコース投与後の全ての時間において Cont—Adeno投与マウスよりも 血糖値が低ぐ耐糖能が改善していることが明らかになった。すなわち、 hAGF-Ad eno投与マウスで高発現された hAGFタンパク質の作用により、体重減少が引き起こ されたこと、及び耐糖能が改善されたことが明らかとなった。
[0091] 《実施例 21 : CAG— AGF Tgマウスの血中 AGFタンパク質量》
CAG-AGF Tgマウス（実施例 1)において、 AGFタンパク質が血中にどの程度 発現しているかを調べた。 4ヶ月齢の雌の CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト W Tマウスから眼底採血し、定法に従って血清を得た。得られた血清を、参考例 1 (3)と 同様の方法でウェスタンブロッテイングを行レ、、 AGFタンパク質を検出した。スキャナ 一でウェスタンブロッテイングの結果を取り込み、画像解析ソフト（NIH image 1. 6 2f)を用いて AGFタンパク質のバンドの濃度を数値化した。その結果、リタ一メイト W Tマウスと比較して、 CAG—AGF Tgマウスで血清中の AGFタンパク質濃度が 2. 4 倍に亢進していることが判った。
[0092] 《実施例 22：マウス AGF発現アデノウイルス投与したマウスの血中 AGFタンパク質量 》
実施例 15で、マウス AGF発現アデノウイルスをマウスに投与した際の、血中の AG Fタンパク質量を調べた。マウス AGF発現アデノウイルス及びコントロールアデノウィ ルス投与前（0日目）及び投与後:!〜 7日目のマウスから眼底採血し、定法に従って 血清を得た。参考例 1 (3)と同様の方法でウェスタンブロッテイングを行レ、、 AGFタン ノ ク質を検出した。その結果、コントロールアデノウイルス投与では、 AGFタンパク質 濃度は変化しないが、マウス AGF発現アデノウイルス投与では、 4日目をピークにし て経時的に AGFタンパク質濃度が上昇していることが判った。実施例 21と同様の方 法で、マウス AGF発現アデノウイルスを投与したマウスの 0日目と 4日目の AGFタン ノ ク質のバンドの濃度を数値化した。その結果、マウス AGFアデノウイルスを投与す ることで AGFタンパク質濃度が 2. 5倍に亢進していることが判った。
[0093] 《実施例 23 : K14_AGF Tgマウスの血中 AGFタンパク質量》
実施例 18及び実施例 19で使用した K14—AGF Tgマウスで AGFタンパク質が 血中にどの程度発現しているかを調べた。 8ヶ月齢の雌の K14—AGF Tgマウス及 びリタ一メイト WTマウスから眼底採血し、定法に従って血清を得た。参考例 1 (3)と同 様の方法でウェスタンブロッテイングを行い、 AGFタンパク質を検出、数値化した。そ の結果、リタ一メイト WTマウスと比較して、 CAG—AGF Tgマウスで血清中の AGF タンパク質濃度が 1. 8倍に亢進していることが判った。
[0094] 《実施例 24 :抗ヒト AGF抗体作製》
ヒト AGFの部分配列であるペプチド（SRMLDPAPEPQRDQTQR;配列番号 45)の N 末端に Cys残基を付加したペプチド（CSRMLDPAPEPQRDQTQR;配列番号 46) (以 下、ペプチド A)を合成及び精製した。ペプチド Aをキャリアタンパク質のゥシサイログ ロブリン（SIGMA)に結合して抗原を作製し、 100 /i gのペプチドを 2週間毎に、合計 8 回ゥサギに免疫した。最終免疫後 1週間目に全採血を行い、血清を得た。ペプチド A でァフィ二ティーカラムを作製した。ァフィ二ティーカラムを用いて血清をァフィ二ティ 一精製し、ペプチド Aに結合する IgG抗体（以下、抗 YP— 030— A IgG)を得た。抗 体の濃度は 280nmの吸光度を測定して、分子吸光係数を 1. 38として求めた。
[0095] 《実施例 25 :抗 SF_YP_030 IgGの HRP標識》
0. lmol/Lクェン酸緩衝液に透析した抗 SF—YP— 030 IgG (実施例 13で作製 )に、攪拌しながら、ペプシン (シグマ）を添加し、 37°Cで 1時間反応して抗体を部分 切断した。反応液を 0. lmol/Lリン酸緩衝液（pH6. 0)で平衡化した Superdex 2 00 16/60HRカラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いたゲルろ過により F (ab' ) を採取した。得られた F (ab' ) に 2 _メルカプトェチルァミン塩酸塩（ナカライテスタ
2 2
)を添加後 37°Cで 90分間反応して還元し、 ULTROGEL ACA54カラム（
BIOSEPRA社）を用いたゲルろ過により Fab'を採取した。架橋斉 ljEMCS [
N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide； DOJINDO社]と西洋わさびペルォキシダー ゼ (HRP ;東洋紡）を混合し、 37°C60分間反応させ、 0. lmol/Lリン酸緩衝液 (pH 6. 0)で平衡化した P6— DGカラム（BIORAD社）を用いたゲルろ過により EMCSと H RPのコンジユゲート画分（以下、 EMCS— HRP)を採取した。続いて、 Fab，と EMC S— HRPを混合し 4°C16時間反応させた後、 Superdex 200 16Z60HRカラムを 用いたゲルろ過にて Fab'と HRPとの結合画分を採取し、 HRP標識抗ヒト AGF抗体 Fab'フラグメント（HRP—抗 SF—YP— 030 Fab' )を得た。抗体の濃度は 280nm の吸光度を測定して、分子吸光係数を 1. 38として求めた。
[0096] 《実施例 26：ヒト AGF検出 ELISA系構築》
実施例 24で作製した抗 YP— 030— A IgGを 20 μ g/mLで、 ELISA用マイクロ プレート（NUNC社）に 100 μ L/ウエノレ入れ、 4°Cでー晚静置した。ゥエル内の溶液 を吸引除去し、 PBS (リン酸緩衝化生理食塩水）で 2回洗浄後、ブロッキング液（1 % BSA、 0. 05%NaN、 PBS)を 300 μ L/ゥエル添加し、 4°Cでー晚静置し、ブロッ
3
キングした。洗浄液（0. 05%Tween20添加 10mmol/Lリン酸緩衝液）で 2回洗浄 後、標準ヒト AGF精製タンパク質を希釈液（1%BSA, 0. 05%Tween20含有 PBS) で 100〜0. 39ng/mLまで 2倍連続希釈し、 100 μ L/ゥエルずつ添加し、 37°Cで 1時間反応した。洗浄液で 7回洗浄後、実施例 25で作製した HRP標識抗体 (HRP —抗 SF— YP— 030 Fab，）を希釈液で 1 μ g/mLに調製し、 100 ゥエルず つ添加後、 37°Cで 0. 5時間反応した。洗浄液で 9回洗浄後、 TMBZ基質液 (IBL社 製）を 100 μ L/ゥエルずつ添加後、室温で 30分間反応した。反応停止液（IN Η
2
SO )を 100 x L/ゥヱル添カ卩し、発色反応を停止した。吸光光度計 (スぺクトラマック
4
ス）を用いて A450nmでの吸光度を測定した。スぺクトラマックスに添付のプログラム を用いて解析したところ、直線性が得られる濃度領域があり、検量線を作成すること ができた。以上のようにしてヒト AGFを検出する ELISA系を構築することができた。
[0097] 《実施例 27 :ヒト AGF発現アデノウイルス投与したマウスの血中ヒト AGFタンパク質量 》
ヒト AGF発現アデノウイルスをマウスに投与した際の、血中の AGFタンパク質量を 調べた。各 6匹の高脂肪食負荷マウスに実施例 12で作製したヒト AGF発現アデノウ ィルス（hAGF—Adeno)及びコントロールアデノウイルス（Cont—Adeno)を、実施 例 20と同様に投与した。その結果、実施例 20に記載した場合と同様に、 hAGF-A deno投与マウスで体重減少、耐糖能改善が同様に観察された。アデノウイルス投与 4日目に、眼底採血を行い常法に従って血清を得た。血清中のヒト AGFタンパク質 量を実施例 26で構築した ELISA系を用いて測定した。その結果、 Cont—Adenoを 投与したマウスの血清からはヒト AGFタンパク質は検出されず、 hAGF—Adenoを 投与したマウスの血清からは、 0. 7〜： 1. 2 z g/mLの濃度でヒト AGFタンパク質が 検出された。この結果、血中の AGFタンパク質濃度が 0. 7〜： 1. 2 M gZmLあれば、 期待される体重減少及び耐糖能改善の作用が得られることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
[0098] 本発明の医薬は、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療及び/又は予防の 用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。
配列表フリーテキスト
[0099] 以下の配列表の数字見出し < 223 >には、「Artificial Sequence」の説明を記載す る。酉己歹 IJ番号 1、 6、 7、 9、 10、 13、 14、 16、 19、 20、及び 40〜44の酉己歹 IJで表される 各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号 15の配列で表さ れる塩基配列は、 ΙοχΡを含む配列である。配列番号 46の配列で表されるアミノ酸配 歹 IJは、ペプチド Aの配列である。

Claims

請求の範囲
[1] 下記（a)〜（d)からなる群から選んだポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコード するポリヌクレオチドを有効成分とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は高脂 血症治療薬：
(a)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
(b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列において、 1〜： 10個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸 配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 列をコードする DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコー ドされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
(d)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番〜 450番のアミノ酸からなる配列 、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番〜 433番のアミノ酸からなる配 歹 1Jとの同一性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有 するポリペプチド。
[2] 請求項 1に記載のポリペプチドを有効成分とする、肥満、糖尿病、及び/又は高脂 血症の改善の機能を付与した機能性食品又は健康食品。
[3] 請求項 1に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド を、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療又は予防が必要な対象に、有効量 で投与することを含む、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症を治療又は予防する方 法。
[4] 請求項 1に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド の、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は高脂血症治療薬を製造するための使用
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