JP6023803B2 - 神経変性及び虚血性脳疾患を処置するための化合物及び薬学的組合せ - Google Patents

Description

本発明は、生物化学、薬理学、神経生物学、バイオテクノロジー及び医科学、特に神経学及び内科学に関する。本発明は、一般に虚血性、炎症性及び／又は神経変性損傷に起因又は由来する中枢神経系（ＣＮＳ）疾患のための療法の創出に関する。

本発明は、組織低酸素症並びに炎症性構成要素及び神経変性構成要素の疾患を特徴とする脳血管疾患の治療のための、構造中にピロール環を示すＣ−フィコシアニン（Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）誘導体又はこの分子の部分の使用に基づく。本発明には、予防的及び治療的の両方で投与される、前記化合物と他の生体分子との薬学的組合せも含まれる。

脳血管疾患、脱髄性疾患、及び神経変性疾患の治療は、神経科学分野の新しい未開拓の領域である。脳卒中（ＣＶＡ）は、６５歳以上の世界人口のおよそ５％が罹患し、罹患した個体に深刻な身体障害を引き起こし得る（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２００４）。５０歳以上の人々の９０％超が死亡し、生存した患者のおよそ１５％〜３０％は何らかの後遺症を示す（Ｂｕｅｒｇｏ−Ｚｕａｚｎａｂａｒ Ｍ Ａら Ｒｅｖｉｓｔａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃａ ｄｅ ｌａｓ Ｃｉｅｎｃｉａｓ Ｍｅｄｉｃａｓ ｅｎ Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ：２〜２２；Ｍｉｒａｎｄａ Ｑ Ｊ Ａ．Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００４；１：１７〜２１；Ｒｏｓａｍｏｎｄ Ｗら Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００７：１６９〜１７１）。

世界保健機関（ＷＨＯ）のデータによれば、ＣＶＡのおよそ８０％は、主要な脳動脈の１つにおける、血栓又は塞栓による急性閉塞に起因する虚血型である（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２００４）が、これは、その動脈が血液を供給していた領域の血流の減少を引き起こす。

神経保護は予防的及び治療的な処置戦略であり、例えば虚血の間などに、ＣＮＳ疾患において生じるニューロンの病理学的な消失を防止することが基本的な目的である。神経再生には、例えば多発性硬化症（ＭＳ）などの神経炎症性及び神経変性疾患において生じた損傷を後退させるという基本的な目的がある。

脳虚血治療の主要な目的は、（１）隣接区域への起こり得る拡大を制限して、虚血帯の大きさを縮小すること、（２）進行性の細胞死の進展を、適切な治療用量域内で回復可能な境界帯に制限すること、である（Ｍｕｈａｍｍａｄ Ｓ Ｈ Ａ Ｓ．Ｅｕｒ Ｎｅｕｒｏｌ．２００８；５９：４〜１４）。

新たな神経保護及び／又は神経再生治療剤の候補は、虚血性事象の間及び後に、進行性の脳損傷を引き起こす、細胞の代謝生化学的過程を遮断及び／又は減衰しなければならない。さらに、これらの候補は、脳損傷の発症機構内で考え得る広範囲の薬理学的標的を包含しなければならない（Ｏｖｂｉａｇｅｌｅ Ｂら Ｃｕｒｒ Ｔｒｅａｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ．２００３；５：４４１〜４４９）。

天然源から抽出された化合物が、虚血型障害並びに神経変性疾患において、神経保護及び／又は神経再生作用を有する証拠がある。いくつかの研究は、天然及び合成カンナビノイドが、脳虚血（Ｍａｕｌｅｒ Ｆら Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００２；３０２（１）：３５９〜６８；Ｉａｄｅｃｏｌａ Ｃ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００１；１４：８９〜９４；Ｓｉｎｏｒ Ａ Ｄら Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２０００；２７８（３）：１５７〜６０）、多発性硬化症（Ｂａｋｅｒ Ｄ、Ｐｒｙｃｅ Ｇ、Ｃｒｏｘｆｏｒｄ Ｊ Ｌ、Ｂｒｏｗｎ Ｐ、Ｐｅｒｔｗｅｅ ＲＧら Ｎａｔｕｒｅ ２０００；４０４（６７７３）：８４〜８７）、ハンチントン病（Ｌａｓｔｒｅｓ−Ｂｅｃｋｅｒ Ｉら Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００２；９２９（２）：２３６〜４２）及びパーキンソン病（Ｌａｎｇｅ Ｊ Ｍら ＤＤＴ．２００５；１０（１０）：６９３〜７０２）において、異なる抗酸化機構によって、並びにアミノ酸及び炎症メディエーターの遊離の減少及び遮断による興奮毒性の阻害によって、神経保護作用を生じ得ることを示す。

それにもかかわらず、用量依存性、各用量におけるカンナビノイド化合物の濃度、摂取者の経験及び摂取時間に大いに依存する、カンナビノイド関連の重要な有害作用が存在する。

急性作用は、大部分がカンナビノイドの抗コリン作用によると報告されており、口の渇き、目の発赤、かすみ目、血圧降下、心拍数上昇、反応能力低下、知覚される感覚の増大、協調運動障害及び精神運動速度の減速が含まれる。慢性作用も報告されており、例えば、がんの発生率の増加の可能性を含む免疫系の機能不全などであり、これは、肺がんの場合では、喫煙者における発生率を上回る。カンナビノイド摂取者については、急性心筋梗塞、不妊、肝炎患者における肝線維症のリスクの増加及びてんかん増加の起こり得るリスクがいまだに議論されており、いくつかの心理的作用が、例えば幻覚、時空間知覚の歪曲、又は離人症及び／若しくは現実感喪失現象などの知覚の変化が大麻摂取によって誘発され得るという事実によって示されている。不安発作、精神病型の急性発作、多幸感、過度な多弁、並びに短期記憶喪失などの認知機能不全又は思考速度の低下、不可逆的な認知変容、既往の精神問題の悪化、統合失調症のリスクの増加。気分の変容についても記述されており（鬱状態及び／又は躁状態）、社会的周辺感、並びに場合によって他の薬物の摂取を開始させる大麻摂取の依存性が記述されてきた。妊娠期間中における大麻摂取は、青年期を通じて子どもに認知的及び精神病理学的な変化をもたらし得ることは強調されなければならない。

Ｃ−ｐｈｙｃｏは、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）などのラン藻から発見されたビリタンパク質であり、これはしばしば、多くの国々で栄養補助食品として用いられており、十分に証明された栄養的及び細胞保護的特性を有している（Ｂｏｃｋｏｗ Ｂ Ｉ．米国特許第０５７０９８５５号（１９９８）；Ｋａｙ，Ｒ．Ａ． Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．１９９１；３０：５５５〜５７３；Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｄｅ Ｒ Ｃら Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９３；５３：５７〜６１）。

Ｃ−Ｐｈｙｃｏに関する研究の大部分は、抗酸化特性を実証する目的を有してきた。（１）化学発光、及び（２）２−デオキシリボース損傷の阻害、についてのアッセイによって、Ｃ−Ｐｈｙｃｏのフリーラジカル捕捉作用が実証された（Ｒｏｍａｙ Ｃら Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．１９９８；４７：３６〜４１；Ｂｈａｔ Ｖ Ｂら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７５：２０〜２５）。

Ｃ−Ｐｈｙｃｏは、アスコルビン酸＋Ｆｅ^２＋（Ｒｏｍａｙ Ｃら Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．１９９８；４７：３６〜４１）又は２，２’アゾビス２−アミジノプロパン塩酸塩（ＨＡＡＰ）処理後における、ラット肝ミクロソームの過酸化脂質の増加を著しく抑制することが証明されている。後者はフリーラジカル生成開始剤であり（Ｂｈａｔ Ｖ Ｂら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７５：２０〜２５）、これは本化合物が良好な脂質過酸化抑制剤であることを示している。

一方で、Ｃ−Ｐｈｙｃｏは、ＯＮＯＯ−を介するＤＮＡの酸化的損傷を阻害し、腫瘍の増殖を制限することによって、抗癌剤として作用する（Ｌｉ Ｂら Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２００５；５９：５５１〜６０）。さらに、この天然化合物が、血小板凝集を阻害することが実証された（Ｈｕｉ−Ｆｅｎ Ｃｈら Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００６；９５：４３５〜４４０）。

Ｃ−Ｐｈｙｃｏは、脳顆粒細胞の培養物におけるカリウム及び血清がないことによるニューロン死を、１〜３ｍｇ／ｍＬの濃度で２４時間防止する（Ｒｉｍｂａｕ Ｖら Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１；３６４：９６〜１０４）。

Ｃ−Ｐｈｙｃｏの活性は、カイニン酸で誘導されたラットの脳損傷モデルにおいても検討された（Ｒｉｍｂａｕ Ｖら Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ．１９９９；２７６：７５〜７８）。１回の１００ｍｇ／ｋｇ用量のＣ−Ｐｈｙｃｏ投与は、未処置の対照群と比べて、処置された動物において兆候及び変化を低減させることが立証された。

加えて、１）単離された酵素のアッセイ及び（２）全血アッセイを通じて、Ｃ−Ｐｈｙｃｏは、ＣＯＸ−２を阻害することが実証されている（Ｒｅｄｄｙ Ｃ Ｍら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７７：５９９〜６０３）。

Ｃ−Ｐｈｙｃｏは、カラゲニン及びグルコースオキシダーゼによって誘導されたマウス及びラットの肢腫脹モデルにおいて（Ｒｏｍａｙ Ｃｈら Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００；５２：３６７〜３６８；Ｍａｄｈｙａｓｔｈａ ＨＫら Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００８）、及びアラキドン酸によって誘導されたマウスの耳の炎症モデルにおいて（Ｒｏｍａｙ Ｃｈら Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００；５２：３６７〜３６８）、用量１００〜２００ｍｇ／ｋｇで経口経路によって投与された場合、浮腫を軽減させることができた。

総説に、異なる動物モデルにおいてＣ−Ｐｈｙｃｏを用いて実施された主要な研究がまとめられている（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００３ Ｊｕｎ；４（３）：２０７〜１６）。ほとんどの実験において、治療効果が観察されるためには高い用量のＣ−Ｐｈｙｃｏを必要とした（１００ｍｇ／ｋｇを超えて３００ｍｇ／ｋｇまで）。

フィコシアノビリン（ＰＣＢ）は、Ｃ−Ｐｈｙｃｏの発色団であり、化学的観点からは、タンパク質断片を含まず、ピロール環が存在することが特徴である。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、初めは抗ウイルス活性を有する可溶性タンパク質として発見され、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮα及びβ）及びＩＩ型（ＩＦＮγ）に分類することができる。ＩＦＮα及びβは、一般に共通の受容体複合体を使用していると考えられているが、いくつかの報告は、ＩＦＮα及びβにはある特定の生物学的作用を誘導する能力に違いがあることを示唆している。これらは、ＩＦＮ特異的遺伝子の選択的誘導（Ｒａｎｉ ＭＲＳら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６、２７１：２２８７８〜２２８８４；Ｐｌａｔａｎｉａｓ ＬＣら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４、２６９：１７７６１〜１７７６４）、異なる成長因子の阻害作用（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ ＭＧら Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ １９９０、１０：１４１〜１５１）及び赤血球産生作用（Ｍｅａｎｓ ＲＴら Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９６、２４：２０４〜２０８）を含む。このことから、ＩＦＮαについて確認された生物学的作用は、必ずしもＩＦＮβについても確認されるものではなく、逆もまた同じであることが推定され得る。

ＩＦＮαとβとのシグナル伝達事象の相違についてのあり得る説明は、ＩＦＮβの特異的な受容体に結合するリンタンパク質の存在であり、これはリン酸化されたチロシンであるように思われ、ＩＦＮαの受容体１（ＩＦＮＡＲ１）に結合している（Ｃｒｏｚｅ Ｅら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６：２７１：３３１６５〜３３１６８；Ｐｌａｔａｎｉａｓ ＬＣら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１：２３６３０〜２３６３３）。

ＩＦＮα及びβの作用機構は非常に複雑である。これらの２つのサイトカインは、異なるシグナル伝達経路を通って作用する。後者は、証拠によって裏付けられている。ＪＡＫキナーゼＴＹＫ２が存在しないＵＩＡ細胞において実施された研究（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ Ｌら １９９２．Ｃｅｌｌ ７０：３１３〜３２２）では、これらの細胞はＩＦＮαに結合及び応答することができないが、ＩＦＮβには結合及び応答することができることが示された（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ Ｓら １９８９．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９、４６０５〜４６１２）。このことは、ＩＦＮαの結合部位には、ＴＹＫ２の存在が必要であることを示唆している。ＩＦＮβの結合部位の場合は、ＴＹＫ２の非存在下でも形成し得る。

ＭＳにおいてＩＦＮαで実施された臨床試験（ＣＴ）は、低い効力を示した（Ｇｉｌｈｕｓ ＥＮ、Ｗｏｒｌｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９９５、５：１０〜１２；Ｓｈｅｒｉｄａｎ Ｐ（編）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓ １９９３〜１９９４． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９５、３〜３５ページ；Ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ Ａｌｆｅｒｏｎ、ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｍｏｎｉｔｏｒ、１９９７；４（１２）：４）。

ＩＦＮβは、ＭＳ用として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された薬物の１つであり、報告によれば、その有効性が低いこと、及び効果を実現するために高い用量に依存することも反映されている（Ｚａｒａｇｏｚａ Ｇａｒｃｉａ Ｆら Ｆａｒｍ Ｈｏｓｐｉｔ．２００２；２６：２９４〜３０１）。

加えて、ＩＦＮ療法について、用量及び投与経路に依存する副次的作用が記述されている。患者は、各々の注射後２４〜４８時間の間、インフルエンザ類似の反応、例えば発熱、筋肉痛、震え及び全身の不快感を経験し得る。注射部位の壊死は、患者の５％に起こる。

他方で、インターロイキン２（ＩＬ−２）の主要なｉｎ ｖｉｖｏ作用の１つは、胸腺の発達及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の末梢増殖（ｃＴｒｅｇ）の促進である。ＩＬ−２又はＩＬ−２Ｒβ欠損マウスにおけるＴｒｅｇ活性の喪失は、重篤な抗原依存性のリンパ節障害と、それに続く致死的な自己免疫をもたらす。ＩＬ−２依存性のＴｒｅｇの存在は、多くの養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）及び遺伝子実験を根拠とする。近時、Ｔｒｅｇは、虚血後の炎症性脳損傷の脳保護調節因子としての不可欠な役割を有することが実証されている（Ｌｉｅｓｚ Ａら Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００９１５、１９２〜１９９）。

自己免疫疾患（例えばＭＳなど）及び脳虚血は、Ｔｒｅｇの相対的欠乏を特徴とする。したがって、Ｔｒｅｇの増大はこれらの疾患を改善し得る。ＩＬ−２は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇの増大を引き起こすことができ、この治療法の見込みのある臨床適用を提供し得る（Ｌｉｕ Ｒ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４０：１５７７〜８９）。

ＩＬ−２は、生物学的応答調節物質だと考えられており、例えば黒色腫及び腎細胞癌などのがん治療並びにＨＩＶに用いられてきた。ＩＬ−２は、低投与量では所望の治療効果を実現しないため、高用量スケジュールで試験された。

高用量スケジュールは、静脈内経路で、８時間ごとに、もし患者が耐えられれば、１５回用量までのＩＬ−２投与を行うことを意味する。このスケジュールは、著しい副次的作用を伴い、それらは、多くの場合治療を中止すれば後退させ得るが、それらのいくつかは、重篤なために患者は入院させられ、時には薬物を受けながら集中治療を必要とする。

別の特に興味深い産物は、ＧＨＲＰ−６（「成長ホルモン放出ペプチド−６」）として知られるペプチドである。このペプチドは、初めは腸のメタエンケファリン由来として記述されたが、その後ヒトを含むほ乳類の異なる種において、予期されなかった成長ホルモン（ＧＨ）分泌促進作用を示した（Ｂｏｗｅｒｓ ＣＹら Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９８４、１１４：１５３７〜４５；Ｐａｎｄｙａ Ｎら Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１９９８、８３：１１８６〜９）。この分子は、異なる形態の矮小発育症の鑑別臨床診断のための分泌促進剤として、ヒトに静脈内投与されてきた（Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｖら Ｌａｎｃｅｔ．２０００；３５６：１１３７〜４２）。

ＧＨＲＰ−６は、ＣＮＳにおいて、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の発現を増加させる（Ｆｒａｇｏ Ｌ．Ｍら Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００２、１４３：４１１３〜４１２２）。ＩＧＦ−１は、ある特定の過程に介在し、例えば、（１）オリゴデンドロサイトの成熟に関連する事象を増加させる（Ｗｉｌｓｏｎ Ｈ．Ｃら Ｇｌｉａ ２００３、４４：１５３〜１６５）、（２）ＴＮＦ−α依存性のアポトーシス経路を遮断する、及び（３）主要組織適合複合体のクラスＩ分子の発現を減少させる（Ｉｔｏ Ｔら Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ ２００４、１６４：６２３〜６３４）。

ＧＨ及びＩＧＦ−１の分泌の減少は、高齢者においてより高頻度の脳の虚血過程と関連することが実証されている（Ｆｒｕｔｏｓ ＭＧら Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００７、２９３：Ｅ１１４０〜５２）。

ＧＨ／ＩＧＦ−１軸の老化は、ＧＨの産生及び分泌を刺激する治療で修復されるに違いない。成体ラットをＧＨＲＰ−６で長期間、全身的に治療すると、例えば視床下部及び小脳などのいくつかの脳領域におけるＩＧＦ−１レベルが増加する。同様に、通常は抗アポトーシス作用と関連している細胞内シグナル伝達カスケードが、これらの区域で活性化する。異常に高濃度のグルタミン酸ナトリウムは、ニューロンの過興奮を惹起し、細胞損傷及び／又は細胞死を引き起こし得る。ＧＨＲＰ−６は、カスパーゼ７及び９の活性化を低減することによって、グルタミン酸塩に誘導される細胞死を逆戻りさせる（Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｒｕｂｉｎ ｄｅ Ｃｅｌｉｘ Ａら Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ２００６、９９：８３９〜４９）。

ＧＨ分泌促進合成ペプチドの成功にもかかわらず、まだ残る問題は、１日に数回注射しなければならないこと、高価であって、副次的作用を有すること、及びおそらくシグナル伝達カスケードの内部受容体を調節することであり、これはその効果が時間とともに減少することを意味する。ＧＨＲＰ−６の注射に伴う副次的作用は、がん、低血圧、鬱血性心疾患、制御されていない出血、手根管症候群、インスリン感受性の低下、低血糖、女性化乳房、浮腫、小児白血病、ケトン体形成及びアレルギー反応である。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、多数の全く異なる脳疾患の重症度又は進行を決定する「最終共通カスケード」の構成要素に、非特異的な様式で作用する。ＥＰＯは、抗アポトーシス、抗炎症、抗酸化、神経栄養、血管形成、及び幹細胞調節作用を有し、したがって神経系の可塑性に影響し得る。ＥＰＯの保護及び再生特性だけではなく、神経及び精神疾患のいくつかの動物モデルにおいて、認知機能の改善も報告されている。「ゲッチンゲンＥＰＯ脳卒中試験」は、ヒトの急性脳疾患における神経保護療法のための最初の有望な証拠をもたらした。ＥＰＯを用いた、統合失調症患者における認知機能の改善のための実験的治療は、慢性脳疾患のための新しい戦略である。神経系の炎症性疾患の例としての慢性進行性ＭＳにおける探索的アッセイは、運動及び認知機能に対するＥＰＯ治療の最初の肯定的な結果をもたらした（Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈら（２００８）Ｊ Ｒｅｎ Ｎｕｔｒ．１８：１４６〜５３）。ＥＰＯは、脳及び他の臓器において、特に発達期間中に、造血機能を有する。アシアロＥＰＯ、又は低シアル酸ＥＰＯは、ニューロン培養から脳損傷のｉｎ ｖｉｖｏモデルに至るまでの広範な種類の実験的背景において、神経栄養及び神経保護剤として同定された。アシアロＥＰＯが神経保護を生じる異なる機構は、ｉ）グルタミン酸ナトリウム毒性の減少、ｉｉ）抗アポトーシス性のニューロン因子の発生誘導、ｉｉｉ）炎症の軽減、ｉｖ）一酸化窒素に誘導された損傷の軽減、及びｖ）直接的な抗酸化作用が認識されている。証拠によれば、アシアロＥＰＯは、大人及び子供において、多くの種類のＣＮＳ障害のための新しい戦略、特に周産期仮死のための可能性のある代替戦略になり得ることが示唆される（Ｓ Ｊｕｕｌ．（２００２）Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ ９１ ｓ４３８：３６〜４２）。

虚血性梗塞は、脳のニューロン及びグリア組織に影響を及ぼす多様な病態生理学的変化と関係がある。これらの変化は、末梢血への特異的タンパク質の放出と言い換えられる。ニューロン特異的エノラーゼタンパク質、Ｓ１００Ｂタンパク質及び特異的なグリア繊維性タンパク質は、ヒトにおける梗塞後の脳損傷の、可能性のあるマーカーである。

ＥＰＯ及びアシアロＥＰＯタンパク質は、脳虚血及び神経変性疾患の治療に用いられてきたが、それらの使用に関連した有害作用もまた報告されている。ＥＰＯ療法及びヘマトクリット値の上昇は、例えば高血圧及び血栓症などの有害事象と関係がある。これらの場合において、より高い効力を示す薬物の組合せの使用もまた合理的であり、それがより低い用量の使用、他の投与経路及び有害事象の低減を導き得る。

したがって、所望の効果を実現するために要求される高い薬物用量に関係がある有害事象を低減するために、ＣＮＳの虚血性又は神経変性損傷の療法のための、より効力のある薬物又は組み合わせた分子を発見することが必要とされている。

本発明は、配列リストに示された配列を有し、構造中にテトラピロール系を有する発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）を提供して、上記の課題を解決する。これらの化合物が、組織の虚血又は変性の予防又は治療における使用に耐える特性を有することが初めて実証される。特定の具現において、これらの化合物は、虚血性及び神経変性疾患の治療に用いられ得る。

本発明の発色性又はＰＣＢ−ａａペプチドは、Ｃ−Ｐｈｙｃｏのα（α−Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）及びβ（β−Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）鎖の酵素消化によって得られる、それらの３〜６個のアミノ酸の配列に存在する。
これらのペプチドは、
配列番号１：^７９ＭＡＡＢＬＲ^８４（β−Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）、
配列番号２：^８４ＢＡＲ^８６（α−Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）、
配列番号３：^８０ＡＡＢＬＲ^８４（β−Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）、
配列番号４：^８２ＢＬＲ^８４（β−Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）、
配列番号５：^８１ＡＢＬＲ^８４（β−Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）
である。

ここで、Ｂ（太字）は、フィコシアノビリン（ＰＣＢ）に共有結合したシステインである。

さらに、本発明の目的は、配列番号１〜５と同定された少なくとも１つのペプチド及び薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物である。

本発明の新規性は、神経保護及び神経再生作用の実証にあり、その作用は、Ｃ−Ｐｈｙｃｏに関する発色性ペプチド及びＰＣＢより高く、ＰＣ１２細胞系並びに脳虚血及びＭＳの動物モデルにおいて、グルタミン酸ナトリウムによって誘導される、脳虚血に類似する機構の損傷からの保護を示す。

ＰＣＢ−ａａ及びＰＣＢペプチドは、ＰＣＢ−ａａに対して２５分の１及びＰＣＢに対して１０分の１のモル濃度で保護作用を示したが（ＰＣＢ−ａａ２μＭ及びＰＣＢ５μＭが、損傷を施した細胞を１００％保護する）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏ５０μＭが、およそ７５％の細胞を保護するのに必要であった。

加えて、特定の具現において、動物をＰＣＢ−ａａ及びＰＣＢで処置した場合に、スナネズミの脳虚血再かん流モデルＩ／Ｒにおいて、梗塞体積の減少が実証された。結果によれば、ＰＣＢ（４３．１％）に比してＰＣＢ−ａａ（４９．２％）の有効性がより高いことが示される。

したがって、本発明の目的は、虚血又は組織変性の治療に有用な薬物の製造のための、配列番号１〜配列番号５と同定され、省略してＰＣＢ−ａａと呼ばれるペプチド及びＰＣＢによって構成される群から選択された化合物の使用でもある。特定の具現において、前記化合物は虚血性、炎症性又は神経変性損傷性のＣＮＳ疾患の予防又は治療に使用される。

本発明の別の態様は、配列番号１〜配列番号５と同定されたペプチド及びＰＣＶによって構成される群から選択された化合物を含む医薬組成物として、その化合物を必要とする対象に投与することを特徴とする、虚血又は組織変性の治療又は予防方法を提供するものである。特定の具現において、本発明の方法は、虚血又は組織変性が、虚血性、炎症性又は神経変性損傷と共に進行するＣＮＳ疾患を引き起こすことによって特徴づけられる。

別の具体化において、本発明は、配列番号１〜配列番号５と同定されたペプチド及びフィコシアノビリンによって構成される群から選択された第１の構成要素、並びにα（ＩＦＮ−ａ）及びβ（ＩＦＮ−ｂ）インターフェロンを含むＩ型インターフェロン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アシアロＥＰＯ及びヒトＧＨの分泌促進ペプチド（ＧＨＲＰ−６）によって構成される群から選択された第２の構成要素を含む薬学的組合せを提供する。

神経保護及び／又は神経再生特性に関する活性成分の相乗効果は、原因が異なる脳虚血、並びに例えばＭＳ、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳性運動失調症、ハンチントン病及びパーキンソン病などの神経変性疾患におけるそれらの使用の根拠となる。

ＩＦＮα及びβはＩ型ＩＦＮであり、及び共通の受容体複合体を使用しているにもかかわらず、多くの観察から、ＩＦＮα及びβはある特定の生物学的作用を誘導する特性に違いがあることが示唆されている。

特定の具現において、ＰＣＢ−ａａ／ＩＦＮ−ａ及びＰＣＢ／ＩＦＮ−ａの組合せの評価は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける予防的スケジュールで実施され、疾患の発症防止に関して、個別の有効成分に対する前述の組合せの相乗効果を実証した。

別の特定の具現において、スナネズミの脳Ｉ／Ｒモデルにおいて、ＰＣＢ−ａａを３．３７５ｍｇ／Ｋｇ、ＰＣＢを７５０μｇ／Ｋｇ及び両方のＩＦＮを５００ｎｇ／Ｋｇの用量で投与して、ＰＣＢ−ａａ及びＰＣＢとＩＦＮ−ａ及びＩＦＮ−ｂとの組合せをそれらの個別の有効成分と比較して評価し、ＩＦＮ−ａとＰＣＢ及びＰＣＢ−ａａとの組合せについてそれぞれ８３．３％及び８９．３％、並びにＩＦＮ−ｂとＰＣＢ及びＰＣＢ−ａａとの組合せについてそれぞれ８７．０％及び９３．６％の脳梗塞体積の減少に関する相対的な有効性が示され、これらは有効成分単独よりも高い。

加えて、別の特定の具現において、１日用量としてＰＣＢ−ａａ／Ｋｇを３．３７５ｍｇ／Ｋｇ、ＰＣＢを７５０μｇ／Ｋｇ及びＩＦＮ−ｂを５００ｎｇ／Ｋｇで６回用量で投与して、ＰＣＢ−ａａ／ＩＦＮ−ｂ及びＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂの組合せを評価した。結果によれば、ＥＡＥモデルにおいて、臨床症状が、単独の有効成分の場合よりも大きい相対的な有効性が示された。したがって、ＥＡＥ動物モデルにおける治療効果も実証された。

他の具現では、薬学的組合せとしてのＰＣＢ−ａａ／ＩＦＮ−ｂ及びＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂの組合せを、ＥＡＥモデルに異なった経路（腹腔内、経鼻、経口及び直腸内）で投与して評価し、臨床的兆候について同様な薬理学的作用を実証することが含まれた。前述の薬学的組合せの部分を形成する化合物は、１回の治療過程の間に、同じ個体に同時に又は別々に適用してもよい。本発明において言及する薬学的組合せは、非経口、経鼻、経口又は直腸内投与用であってもよく、これらの経路のための適当な添加剤と一緒であってもよい。

別の特定の具現において、脳虚血におけるＰＣＢ−ａａ、ＰＣＢ及びＩＬ−２の効果を評価した。スナネズミの脳虚血モデルにおいて、脳梗塞体積の減少に関して、ＰＣＢ−ａａ／ＩＬ−２及びＰＣＢ／ＩＬ−２の組合せは個別の活性成分に対して相乗効果を有した（ＰＣＢ−ａａについて４９．２％の有効性、ＰＣＢについて４３．１％の有効性、ＩＬ−２について２５．８％並びにＰＣＢ−ａａ／ＩＬ−２の組合せについて８４．３％及びＰＣＢ／ＩＬ−２の組合せについて７４．５％）。

他方で、スナネズミの脳Ｉ／Ｒ動物モデルに腹腔内投与して、ＰＣＢ／ＧＨＲＰ−６の組合せ及び個別の有効成分の評価を実施した。形態計測的な観点から、組合せに関しては相乗効果が認められ、８５％という値の有効性を示したのに対して、ＰＣＢでは３５．８％及びＧＨＲＰ−６では３６．１％であった）。

本発明の別の新規性は、ＰＣＢ−ａａ／ＥＰＯ及びＰＣＢ−ａａ／アシアロＥＰＯの組合せについて実証された梗塞体積の減少に関する、単独の構成要素と比べた場合の相乗効果からなった（ＰＣＢ−ａａについて４９．２％の有効性、ＥＰＯについて３６．９％、アシアロＥＰＯについて３９．４％、ＰＣＢ／ＥＰＯの組合せについて８７．７％、ＰＣＢ／アシアロＥＰＯの組合せについて９０．５％、ＰＣＢ−ａａ／ＥＰＯの組合せの９１．７％及びＰＣＢ−ａａ／アシアロＥＰＯの組合せについて９４．５％）。上記のことは、進行する又は虚血性損傷の結果であるＣＮＳ疾患の治療のための、前記組合せの使用の根拠となる。

本発明の治療的な組合せを形成する構成要素は、薬物治療の過程の間に、同じ個体に同時に又は逐次的に投与され得る。

本発明の目的は、配列番号１〜配列番号５と同定されたペプチド及びフィコシアノビリンによって構成される群から選択された第１の構成要素、並びにα（ＩＦＮ−ａ）及びβ（ＩＦＮ−ｂ）ＩＦＮを含むＩ型ＩＦＮ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アシアロＥＰＯ及びヒトＧＨ分泌促進ペプチド（ＧＨＲＰ−６）によって構成される群から選択された第２の構成要素を含む、虚血、炎症又は神経変性に起因するＣＮＳ疾患を予防又は治療する医薬の製造のための、薬学的組合せの使用でもある。本発明の一態様において、前記医薬は、急性又は慢性疾患の結果として損傷を受けた脳実質を保護する。

本発明は、虚血、炎症又は神経変性に起因するＣＮＳ疾患の予防又は治療方法も含み、これは、配列番号１〜配列番号５と同定されたペプチド及びフィコシアノビリンによって形成される群から選択された第１の構成要素；並びにαインターフェロン（ＩＦＮ−ａ）及びβインターフェロン（ＩＦＮ−ｂ）を含むＩ型インターフェロン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アシアロＥＰＯ及びヒト成長ホルモンの分泌促進ペプチド（ＧＨＲＰ−６）によって形成される群から選択された第２の構成要素を含む薬学的組合せを、それを必要とする対象に投与することを特徴とする。本方法は、組合せを形成する構成要素が、薬物治療の過程の間に、同じ対象に同時に又は逐次的に投与され得ることによって特徴づけられる。特定の介入において、本治療は原因が異なる脳虚血、ＭＳ、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳性運動失調症、ハンチントン病及びパーキンソン病に適用される。

メタノール処理によって得られたＰＣＢの質量分析による特性決定の図である。 トリプシン消化によって得られ、ＰＣＢ−ａａと明記される発色性ペプチド配列番号１の質量分析による特性決定の図である。 トリプシン消化によって得られ、ＰＣＢ−ａａと明記される発色性ペプチド配列番号２の質量分析による特性決定の図である。 トリプシン消化によって得られ、ＰＣＢ−ａａと明記される発色性ペプチド配列番号３〜５の質量分析による特性決定の図である。 図２Ａは、ニューロン細胞系ＰＣ１２における、グルタミン酸ナトリウム（５０ｍＭ）に誘導された損傷に対するＣ−フィコシアニン（Ｃ−Ｐｈｙｃｏ）の神経保護作用のｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究の図である。記号は、培地中のそれぞれの化合物の存在（＋）、非存在（−）又は濃度を示す。異なる文字は、ＡＮＯＶＡに続くニューマンクールズ多重比較検定による統計的有意差、ｐ＜０．０５を示す。グラフに示された値は、平均値±平均値の標準誤差（ＭＳＥ）である。図２Ｂは、ニューロン細胞系ＰＣ１２における、グルタミン酸ナトリウム（５０ｍＭ）に誘導された損傷に対するＰＣＢ及びＰＣＢ−ａａの神経保護作用のｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究の図である。記号は、培地中のそれぞれの化合物の存在（＋）、非存在（−）又は濃度を示す。異なる文字は、ＡＮＯＶＡに続くニューマンクールズ多重比較検定による統計的有意差、ｐ＜０．０５を示す。グラフに示された値は、平均値±平均値の標準誤差（ＭＳＥ）である。 スナネズミにおける総頸動脈（ＣＣＡ）の一過性閉塞（１０分）の２４時間後における、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１〜５）の脳梗塞体積に対する治療処置効果の図である。異なる文字は、ＡＮＯＶＡに続くニューマンクールズ多重比較検定による統計的有意差、ｐ＜０．０５を示す。値をグラフに平均値±ＭＳＥとして示す。 スナネズミにおけるＣＣＡの一過性（１０分）閉塞の２４時間後における、ＰＣＢ、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）、ＩＦＮ−ａ及びＩＦＮ−ｂ並びにＰＣＢ／ＩＦＮ−ａ、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂ、ＰＣＢ−ａａ／ＩＦＮ−ａ及びＰＣＢ−ａａ／ＩＦＮ−ｂの組合せによる脳梗塞体積に対する治療処置の効果の図である。異なる文字は、Ｉ／Ｒ群＋生理食塩水に対する統計的有意差、ｐ＜０．０５を示す。値をグラフに平均値±ＭＳＥとして示す。 Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるＥＡＥの臨床経過に対する、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂ、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂの組合せ及び単独の有効成分の効果の図である。グラフに示された値は、各群の臨床指数の平均値である。 病気のＥＡＥ Ｃ５７ＢＬ６マウスの臨床指数に対する、腹腔内、経鼻、経口及び直腸内という異なる経路で投与されたＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂの組合せの効果の図である。グラフに示された値は、各群の臨床指数の平均値である。 スナネズミにおけるＣＣＡの一過性（１０分）閉塞の２４時間後における、ＰＣＢ、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド２）、ＩＬ−２、又はＰＣＢ／ＩＬ−２及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド２）／ＩＬ−２の組合せによる脳梗塞体積に対する治療効果の図である。異なる文字は、Ｉ／Ｒ＋生理食塩水群に対する有意差、^＊ｐ＜０．０５を示す。グラフに示された値は、平均値±ＭＳＥである。 ＣＣＡの一過性（１０分）閉塞を施したスナネズミにおけるＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）、ＧＨＲＰ−６ペプチド又はその組合せによる治療効果の形態計測的な評価の図である。にせの手術（シャム）、又は生理食塩水処置、若しくはＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）及びＧＨＲＰ−６（６．２５μｇ／ｋｇ、腹腔内経路）処置、若しくはＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）／ＧＨＲＰ−６（対応する用量及び投与経路を維持する）処置を受けた動物の、虚血性事象の３０分、３、６及び１２時間後の左海馬の代表的な画像（倍率４倍）。 ＣＣＡの一過性（１０分）閉塞を施したスナネズミにおけるＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）、ＧＨＲＰ−６ペプチド又はその組合せによる治療効果の形態計測的な評価の図である。各実験群について、両方の海馬のＣ２、ＣＡ３及びＣＡ４領域において実施された両側細胞数計測。異なる文字は、Ｉ／Ｒ＋生理食塩水群に対する有意差、^＊ｐ＜０．０５を示す。グラフに示された値は、平均値±ＭＳＥである。 スナネズミにおけるＣＣＡの一過性閉塞（１０分）の２４時間後における、ＰＣＢ、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド４）、ＥＰＯ、アシアロＥＰＯ、又はそれらの各組合せＰＣＢ／ＥＰＯ、ＰＣＢ／アシアロＥＰＯ、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド４）／ＥＰＯ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド５）／アシアロＥＰＯによる脳梗塞体積に対する治療処置の効果の図である。異なる文字は、Ｉ／Ｒ＋生理食塩水群に対する有意差、ｐ＜０．０５を示す。グラフに示された値は、平均値±ＭＳＥである。

具現方式の詳細な説明／具現例
（例１）メタノール処理によって得られたフィコシアノビリン（ＰＣＢ）及び発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）の質量分析。
図１Ａは、Ｃ−Ｐｈｙｃｏメタノール抽出物の分画限外濾過によって得られた発色団ＰＣＢに対応するｍ／ｚシグナル５８７．２６を示す。

図１Ｂ、Ｃ及びＤは、Ｃ−Ｐｈｙｃｏのトリプシン消化によって得られたＰＣＢ−ａａの質量分析パターンを示す。

（例２）ＰＣ１２細胞系における、グルタミン酸ナトリウムに誘導された損傷に対するＣ−Ｐｈｙｃｏ、ＰＣＢ及びＰＣＢ−ａａの神経保護作用。
ＰＣ１２細胞（１．５×１０^４細胞／ウェル）をＣ−Ｐｈｙｃｏ（２５、５０μＭ）又はＰＣＢ（０．５、１、５μＭ）又はＰＣＢ−ａａ（０．２５、１、２μＭ）で２４時間前処理し、次いで対応する産物（異なる用量）と一緒に５０μＭグルタミン酸ナトリウムと４時間共インキュベーションを施した。細胞生存率を、（３−（４，５−ジメチルトリアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド法（ＭＴＴ）によって測定し、対照に対するパーセントが図２に示すように報告された。Ｃ−Ｐｈｙｃｏと同様の細胞生存率を達成するために必要とされるＰＣＢ及びＰＣＢ−ａａの濃度はより低かったことを観察することができる。ＰＣＢ及びＣ−Ｐｈｙｃｏと同様の効果を実現したＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）の濃度は、前記の化合物よりもはるかに低かった。

（例３）スナネズミＩ／Ｒモデルにおける梗塞体積の減少による、ＰＣＢ−ａａペプチドの神経保護及び／又は神経再生特性の実証。
虚血性事象の３０分、３、６及び１２時間後に、腹腔内経路で、動物を生理食塩水又は累積的用量のＰＣＢ−ａａペプチド（１ごとに３．３７５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。

各処置の有効性パーセントを、以下の式によって算出した：有効性％＝（１−Ｖｉ／ＶＩ／Ｒ）×１００。Ｖｉ：対応する産物で処置した虚血群の梗塞体積、ＶＩ／Ｒ：生理食塩水で処置した虚血群の梗塞体積。

図３で認め得るように、配列番号１〜配列番号５にある発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）で処置された動物は、生理食塩水で処置された虚血群に対して、梗塞体積の著しい減少を示した。

（例４）スナネズミの両側虚血再かん流モデルにおける、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ａ、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ａ、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂの組合せの効果。
動物を、虚血性事象の３０分、３、６及び１２時間後に、生理食塩水（腹腔内経路で）又は以下の用量の個々の化合物、ＰＣＢ（７５０μｇ／Ｋｇ、腹腔内経路）、若しくはＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）（３．３７５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＦＮ−ａ及びＩＦＮ−ｂ（５００ｎｇ／Ｋｇ、皮下経路）で、又はＰＣＢ／ＩＦＮ−ａ、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂ、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ａ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂの組合せで、図４に示した用量に従って処置した。有効性パーセントは例３に記述したようにして算出した。

脳梗塞体積の減少は、群ごとに、評価した処置の有効性を立証し（図４）、ＰＣＢで処置した群においては４３．１％の有効性、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）では４９．２％、ＩＦＮ−ａで処置した群においては３５．４％、ＩＦＮ−ｂでは３７．０％、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ａで処置した群においては８３．３％、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ａは８９．３％、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂは８７．０％、及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂは９３．６％の梗塞指数の減少を認め、組合せで処置した動物における両有効成分の相乗効果を立証する。

（例５）ＥＡＥモデルにおける臨床的兆候に関する、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ａ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ａの組合せの個別の有効成分に対する薬理学的作用の実証。
他方において、ＥＡＥモデルにおいて、予防的スケジュールでＰＣＢ／ＩＦＮ−ａ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ａの組合せの評価を実施し（表１）、疾患の発症防止に関して、上記した用量において前記組合せの相乗効果が実証された。

表１に示すように、異なる用量のＰＣＢ／ＩＦＮ−ａ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ａの組合せは、ＥＡＥの発症が誘導された動物をそれぞれ８５％から１００％の間で保護する。

（例６）ＥＡＥモデルにおける臨床的兆候に関する、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂの組合せの個別の有効成分に対する薬理学的作用の実証。
Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける臨床的兆候の減少に関して、予防的（表２）並びに治療的スケジュール（図５）において、ＰＣＢ／ＩＦＮｂ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂの組合せの薬理学的作用を実証するために、以下の個々の化合物を用いた：ＰＣＢ（７５０μｇ／ｋｇ、腹腔内経路）、ＰＣＢ−ａａ（３．３７５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内経路）を１５日間にわたって毎日投与及びＩＦＮｂ（５００ｎｇ／Ｋｇ、皮下経路）６回用量、週に３回、又はこれらの組合せを表２に示された用量に従って使用した。

各処置の有効性パーセントを、以下の式によって算出した：有効性％＝（１−ＡＣ_ｉ／ＡＣ_ＥＡＥ）×１００。ＡＣ_ｉ：対応する産物で処理された群の曲線下面積、ＡＣ_ＥＡＥ：ＥＡＥ群の曲線下面積。

予防的スケジュールにおいて、処置はＥＡＥ誘導の１５日前に実施し、治療的スケジュールにおいては臨床的兆候の出現時から開始した。対照群は健常動物に相当し、何も処置を受けなかった。

表２は、予防的スケジュールで得られた結果を示し、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂの組合せは、それぞれ９０％から１００％の動物をＥＡＥの発症から保護した。したがって、個別の有効成分に関して、相乗効果が認められた。

図５は、個別の有効成分、ＰＣＢ（７５０μｇ／ｋｇ、腹腔内経路）、ＰＣＢ−ａａ（３．３７５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内経路）、ＩＦＮ−ｂ（５００ｎｇ／Ｋｇ、皮下経路）、によって得られた臨床的兆候の減少よりも大きな減少を示し、治療的スケジュールにおいても、ＥＡＥモデルにおいて組合せによって処置した群、ＰＣＢ（７５０μｇ／ｋｇ）／ＩＦＮ−ｂ（５００ｎｇ／Ｋｇ）又はＰＣＢ−ａａ（３．３７５ｍｇ／ｋｇ）／ＩＦＮ−ｂ（５００ｎｇ／Ｋｇ）における相乗効果を実証し、ＰＣＢ／ＩＦＮ−ｂの組合せについて８７．７％の有効性、ＰＣＢ−ａａ／ＩＦＮ−ｂの組合せについて９４．５％、ＰＣＢについて４６．１％、ＰＣＢ−ａａについて５３．９％及びＩＦＮβについて３４．８％である。

（例７）ＥＡＥモデルにおけるＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮｂの組合せの異なる経路による治療効果の実証。
ＥＡＥ群の動物は、生理食塩水の腹腔内経路による毎日投与を受けた。ＰＣＢ−ａａ（ペプチド１）／ＩＦＮ−ｂ（３．３７５ｍｇ／ｋｇのＰＣＢ−ａａ＋５００ｎｇのＩＦＮ−ｂ／Ｋｇ）の組合せで処置したマウスを、投与経路：腹腔内、経口、経鼻及び直腸内、によって異なる群に分けた。治療的スケジュールは、免疫後第９日から第２４日まで、連続して１５日間続けられた。対照群は健常マウスに相当し、何も処置を受けなかった。免疫後第２７日に臨床評価を実施した。

図６において立証されているように、評価した異なる経路間で（腹腔内、経鼻、経口及び直腸内）統計的有意差は検出されず、これは、これらが等しい有効性で使用できることを示している。

（例８）スナネズミの両側Ｉ／Ｒモデルにおける、ＰＣＢ／ＩＬ−２及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド２）／ＩＬ−２の組合せの神経保護及び／又は神経再生作用。
虚血性事象の３０分、３、６及び１２時間後に、動物を生理食塩水（腹腔内経路による）によって、又は累積的用量のＰＣＢ（７５０μｇ／Ｋｇ、腹腔内経路による）、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド２）（３．３７５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ−２（１００ｎｇ／Ｋｇ、皮下経路）によって、又はＰＣＢ／ＩＬ−２及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド２）／ＩＬ−２（対応する用量及び投与経路を維持する）によって処置した。図７において、群ごとの梗塞体積の減少を認めることができる。

各処置の有効性パーセントは、例３に記述されたようにして算出し、これは、ＰＣＢについて４３．１％、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド２）について４９．２％、ＩＬ−２について２５．８％、ＰＣＢ／ＩＬ−２の組合せについて７４．５％、及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド２）／ＩＬ−２について８４．３％であり）、これは組合せによって処置された動物における両有効成分の相乗効果を立証する。

（例９）スナネズミの両側虚血再かん流モデルにおける、ＰＣＢ／ＧＨＲＰ−６の組合せ及びその個別の有効成分の治療効果。
ＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）、ＧＨＲＰ−６ペプチド又はその組合せによる治療処置の形態計測的な評価を、ＣＣＡの一過性（１０分）閉塞を施したスナネズミにおいて試験した。虚血性事象の３０分、３、６及び１２時間後に、累積的用量のＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）（７５０μｇ／Ｋｇ、腹腔内経路による）、ＧＨＲＰ−６（６．２５μｇ／ｋｇ、腹腔内経路）、又はＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）／ＧＨＲＰ−６（対応する用量及び投与経路を維持する）を評価した。各実験群について、Ｃ２、ＣＡ３及びＣＡ４領域における両側細胞数計測を実施し、それをシャム（陰性又はにせの手術）群に対するパーセントで示した。結果によれば、Ｉ／Ｒ群の動物において、実質的に全ての海馬帯（ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４）を包含する細胞系のほとんど全てが喪失したことが示された。

ＰＣＢ−ａａ（ペプチド３）について３５．８％及びＧＨＲＰ−６（図８）について３６．１％の有効性である個別の有効成分に対して、ＰＣＢ−ａａの組合せ（ペプチド３）／ＧＨＲＰ−６（８５％の有効性）で処置した群において相乗効果が認められた。

（例１０）スナネズミの両側Ｉ／Ｒモデルにおける、ＰＣＢ／ＥＰＯ、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド４）／ＥＰＯ、ＰＣＢ／アシアロＥＰＯ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド５）／アシアロＥＰＯの組合せ並びにそれらの個別の有効成分の治療効果。
虚血性事象の３０分、３、６及び１２時間後に、動物を生理食塩水（腹腔内経路を通して）によって、又は累積的用量のＰＣＢ（７５０μｇ／Ｋｇ、腹腔内経路による）、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド４）３．３７５ｍｇ／ｋｇ、ＥＰＯ（５００Ｕ／Ｋｇ、腹腔内経路を通して）、アシアロＥＰＯ（２００Ｕ／Ｋｇ、経鼻経路を通して）によって、又はＰＣＢ／ＥＰＯ若しくはＰＣＢ−ａａ（ペプチド４）／ＥＰＯ、ＰＣＢ／アシアロＥＰＯ及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド５）／アシアロＥＰＯ（用量及び対応する投与経路を維持する）によって処置した。

組合せ及びそれらの個別の構成要素の治療効果の評価を行った。各処置の有効性パーセントを、例３に記述されたようにして算出した。

群あたりの脳梗塞体積の低下が観察され、これは、評価した処置の有効性を立証し（図９）、ＰＣＢで処置された群の梗塞体積の減少は４３．１％の有効性であり、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド４）では４９．２％、ＥＰＯでは３６．９％、アシアロＥＰＯでは３９．４％だが、ＰＣＢ／ＥＰＯ（８７．７％の有効性）、ＰＣＢ／アシアロＥＰＯ（９０．５％の有効性）、ＰＣＢ−ａａ（ペプチド４）／ＥＰＯ（９１．７％）及びＰＣＢ−ａａ（ペプチド５）／アシアロＥＰＯ（９４．５％）で処置した群ではさらに大きく、これは組合せにおける有効成分の相乗効果を示す。

Claims (12)

1. アミノ酸が３から６個の配列で、フィコシアノビリン構造を有する発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）において、アミノ酸配列が、配列番号３〜配列番号５と同定された配列によって構成される群から選択されることを特徴とする上記発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）。
2. アミノ酸が３から６個の配列で、フィコシアノビリン構造を有する発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）において、アミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号５と同定された配列によって構成される群から選択されることを特徴とする上記発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）の少なくとも１つ及び許容される医薬添加剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
3. 虚血性及び神経変性疾患の予防及び治療のために、配列番号１から配列番号５にある前記発色性ペプチド（ＰＣＢ−ａａ）の少なくとも１つを０．９〜３．３７５ｍｇの範囲で及び薬学的に許容される添加剤を含むことを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 構成要素が相乗効果を有し、配列番号１〜配列番号５と同定されたペプチド及びフィコシアノビリンからなる群から選択された第１の構成要素、並びにＩ型インターフェロン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アシアロＥＰＯ及びヒト成長ホルモンの分泌促進ペプチド（ＧＨＲＰ−６）によって構成される群から選択された第２の構成要素を含むことを特徴とする、薬学的組合せ。
5. 第２の構成要素がインターフェロンα又はインターフェロンβの場合がある、請求項４に記載の組合せ。
6. 配列番号１から配列番号５と同定された前記ペプチドのいずれかを０．９〜３．３７５ｍｇ／Ｋｇ重量、フィコシアノビリンを３００〜７５０μｇ／Ｋｇ重量及びインターフェロンα又はβを５００〜５０００ｎｇ／Ｋｇ重量で使用する、請求項４に記載の組合せ。
7. 配列番号１〜配列番号５と同定されたペプチド及びフィコシアノビリンによって形成される群から選択された第１の構成要素、並びにインターフェロンα（ＩＦＮ−ａ）及びインターフェロンβ（ＩＦＮ−ｂ）を含むＩ型インターフェロン；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；アシアロＥＰＯ及びヒト成長ホルモンの分泌促進ペプチド（ＧＨＲＰ−６）によって形成される群から選択された第２の構成要素を含み、虚血、炎症又は神経変性に起因するＣＮＳ疾患を予防又は治療する医薬を製造するための、請求項４に記載の薬学的組合せ。
8. 前記医薬が、急性又は慢性疾患の結果として損傷を受けた脳実質を保護する、請求項７に記載の薬学的組合せ。
9. 前記ＣＮＳ疾患が、原因が異なる脳虚血、多発性硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含む、請求項７に記載の薬学的組合せ。
10. 配列番号１〜配列番号５と同定されたペプチド及びフィコシアノビリンによって構成される群から選択された第１の構成要素；並びにインターフェロンα（ＩＦＮ−ａ）及びインターフェロンβ（ＩＦＮ−ｂ）を含むＩ型インターフェロン；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；アシアロＥＰＯ及びヒトＧＨのペプチド分泌促進（ＧＨＲＰ−６）によって構成される群から選択された第２の構成要素を含む薬学的組合せを含む、虚血、炎症又は神経変性に起因するＣＮＳ疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
11. 前記組合せが、急性又は慢性疾患の結果として損傷を受けた脳実質を保護する、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記組合せを形成する前記構成要素が、原因が異なる脳虚血、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳運動失調症、ハンチントン病及びパーキンソン病などのＣＮＳ疾患の薬物治療の過程の間に、同じ対象に同時に又は逐次的に投与され得る、請求項１０に記載の医薬組成物。