JP6016895B2

JP6016895B2 - スクアレンを産生する微細藻類の新規菌株

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Publication number: JP6016895B2
Application number: JP2014511822A
Authority: JP
Inventors: ポーラ，ベルナール; ジョウ，ジエ; ドゥフルティン，ソフィー; ファンデワル，グザヴィエ
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Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2016-10-26
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Description

本発明は、スクアレンの産生に特に好適な微細藻類の新規な菌株およびその使用に関する。

スクアレンは、３０個の炭素原子および５０個の水素原子を含む、式：２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサ−ヘキセンのトリテルペン（イソプレノイド）である。

これは、ヒトを含むすべての高等生物において天然に生じる脂質である（皮脂において見出される）。スクアレンは、実際には、コレステロール、ステロイドホルモンおよびビタミンＤの生合成における重要な中間体である（コレステロール代謝経路の酵素（スクアレンモノオキシゲナーゼ）は、スクアレン分子の一端部を酸化することにより環化を誘引してラノステロールをもたらし、これがコレステロールおよび他のステロイドに変換されることとなる）。

工業的には、スクアレンは、食品分野、化粧品分野および薬学分野において特に用いられる。

栄養補助食品としては、スクアレンは通常カプセルまたは油として配合される。

化粧品分野においては、この分子は、脂肪の跡または脂っぽさを残すことなく直ぐに皮膚に浸透し、他の油およびビタミンと良好に混合される保湿クリームにおいて、抗酸化剤、帯電防止および皮膚軟化剤として用いられることが可能である。

この分野においては、スクアレン（６つの不飽和性）のきわめて低い安定性のために、スクアレンは飽和されてスクアレンよりも良好な抗酸化剤であるスクアラン（水素化によって得られる）を形成し、これは、一般にきわめて高い純度レベル（９９％）で市場において見出されることに留意すべきである。

毒性に関する研究では、化粧品において用いられている濃度では、スクアレンおよびスクアランは全く毒性を示さず、ヒトの皮膚に対する刺激物でも感作物質でもないことが示されている。

薬学分野においては、スクアレンはワクチンの補助剤として用いられる。

これらの補助剤は、免疫系を刺激し、ワクチンに対する応答を高める物質である。

スクアレンは、ワクチンを免疫原性とするために、１９９７年から、インフルエンザワクチン（季節性インフルエンザに対するＣｈｉｒｏｎ社製のＦｌｕａｄ）において、一投与量当たりおよそ１０ｍｇのスクアレンで、ワクチン投与物質に添加されるエマルジョンの形態で用いられている。

スクアレンを含有するすべてのワクチンと同様、これらのエマルジョンは乳白色の外観を有する。

スクアレンはまた：
− Ｇｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ社によって、２００９年におけるインフルエンザの流行に対するＰａｎｄｅｍｒｉｘおよびＡｒｅｐａｎｒｉｘワクチンにおいて用いられたＡＳ０３アジュバント系の特許取得された構成成分として、
− Ｎｏｖａｒｔｉｓ社によって用いられたＭＦ５９アジュバント系の特許取得された構成成分として、
新興のウイルスＨ５Ｎ１、次いで、２００９Ｈ１Ｎ１を標的とする特に実験用ワクチン、抗マラリア剤またはインフルエンザワクチンのワクチンアジュバントとして用いられる。

スクアレンはまた、メモリーＣＤ４細胞の産生を介してヒトの身体の免疫応答を刺激するためにインフルエンザワクチンに添加されている。

これは、季節性インフルエンザウイルス抗原と組み合わされて市場に出されたインフルエンザワクチン用の最初の水中油型アジュバントである。

この応用分野においてスクアレンの純度レベルは重要である。

実際に、経口摂取される場合、スクアレンは完全に安全であると考えられるが；しかしながら、注射経路は議論の対象となる。

実際に、医学分野においては、このアジュバントは当然のようにその不純物に対しても強い免疫応答を誘起してしまうことが可能であるために、スクアレンが不純物により汚染されている場合に、ヒトレシピエントに対する有害性リスクが高まってしまう場合がある。

従って、スクアレンは不純物（微量の金属、特に水銀、および他の毒素）を含有しない高品質のものであることが重要である。

一定数のスクアレンの製造経路が文献において提案されている。

これは、深海鮫などの軟骨魚類の肝臓に蓄えられていることが見出されることの多い化合物である（よってこの名とされている）。

従って、これが乱獲される１つの理由であるが、鮫は鰭を採るために既に漁の対象とされている。鮫の肝臓は、現在、「健康によい」と表現されるゲルカプセルの製造用に販売されている。

しかしながら、それ故、市販されているスクアレンは主に鮫の肝臓から抽出されているが、健康上の問題が存在している。

これは、鮫は、ヒトに有害な物質を産する可能性がある病原菌に感染している可能性があるためである。加えて、生体の解毒および精製器官である鮫の肝臓は、ヒトに有害であるカーチャトキシン（ｃａｒｃｈａｔｏｘｉｎ）などの毒素を含有している場合がある。

これらの環境問題（鮫の生息数の大幅な減少）および健康上の問題（魚の肝臓もまた健康に関する懸念材料である毒素を有する）により、これを植物から抽出することが促されている。

それ故、オリーブ油およびヤシ油、ならびに、穀類からの他の油またはアマランス、種子、米ぬかまたはコムギ麦芽に由来する他の油からこれを単離することが可能である。

しかしながら、この場合における主な欠点は、スクアレンは、約０．１％〜０．７重量％ときわめて少量でしか抽出されないことである。

鮫の肝臓または植物からのこれらの抽出方法の最初の代替として、微生物：天然酵母または組み換え型酵母、特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）タイプからスクアレンを生成するための最初の方法が提案されているが、相当量の濃縮および精製方法が行われるために経済的ではなくなってしまう場合が多い。

そして、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がスクアレンを産生することが可能であることが知られているが、しかしながら、その量は、約０．０４１ｍｇ／バイオマス１ｇときわめて少量である（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ、Ｐ．ｅｔａｌ．、２００１、ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、ｐｐ．８１１−８１６）。

従って、遺伝子組み換えによってこれらの産生能を最適化するための研究が行われている。

スクアレンを産出する組み換え型酵母は、それ故、以下の利点を有する。
− 宿主細胞と同一のＧＲＡＳ（一般に安全と認められる（ＧｅｎｅｒａｌｌｙＲｅｇａｒｄｅｄＡｓＳａｆｅ））ステータスによる利点を有する、
− 宿主細胞と同様に病原菌、プリオンまたは毒素を含まない、および
− ワクチン分野において既に使用実績がある（Ｂ型肝炎抗原を含有するベクターを発現するこれらの酵母など）。

しかしながら、医学分野について国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットによって提示されているとおり（ワクチンアジュバントとしての９７％を超える純度を有するスクアレンの生産）、この最初の代替は、組み換え型酵母によりスクアレンを過剰産出させる（乾燥細胞の１５重量％超）ことが可能である場合にのみ工業化が可能である。

実際のところ、これらの組み換え型細胞を得るためには、分子生物学的ツールを用い、スクアレン生合成経路の刺激およびスクアレン異化反応経路の阻害をもたらす数多くの面倒で、時間がかかり、複雑な代謝工学ステップを実施する必要がある。

実際に、前記国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットを再度引用すると、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デルカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ＨＭＧＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ）およびスクアレンシンセターゼを含む多くの遺伝子がスクアレン生合成に関与している。

異化反応経路については、遺伝子が、スクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧ１）、ラノステロールシンセターゼ、Ｃ１４−ジメチラーゼ、ｄ１４−レダクターゼ、Ｃ４−メチルオキシダーゼ、Ｃ４−デルカルボキシラーゼ（ＥＲＧ２６）、３−ケトレダクターゼ、Ｃ２４−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ８−イソメラーゼ、Ｃ５−デサチュラーゼ、ｄ２２−デサチュラーゼおよびｄ２４−レダクターゼを含む、スクアレンのエルゴステロールへの変換に関与する数多くの酵素をコードする。

しかも、ＬＥＵ２（β−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素）、オキシドスクアレンシクラーゼ、ジモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよびエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−脱水素酵素といった他の分解酵素もまた考慮されなければならない。

鮫の肝臓または植物からの抽出方法の第２の代替として、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）（トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属を含む）、特にシゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）またはシゾキトリウムリマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｌｉｍａｃｉｎｕｍ）の微細藻類からスクアレンを生産する有望な方法が提案されている。

これらの微細藻類は、従属栄養的条件下（暗中；炭素源としてのグルコースの供給）でスクアレンを産生し、従って、微生物発酵分野における当業者により容易に操作され得る。

従って、これらの方法は、制御された発酵条件によって、食品、化粧品および医学的な要求を満たすための精製を容易に行うことが可能であるスクアレンの品質を提供する。

しかしながら、これらのトラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微細藻類において、スクアレンは、ω３族の多価不飽和脂肪酸である、ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）などの対象である他の脂質化合物の副産物である。

それ故、スクアレンは、市販のＤＨＡ油の不鹸化性画分の成分の一種として特に記載される（カロチノイドおよびステロールと共に）と考えられる。

比較として、シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１菌株は、０．０１７％のスクアレンに対して、細胞の乾燥重量基準で６．２％の割合でＤＨＡを産生する。

その結果、スクアレンを自然に産生するこれらの微生物は、その量は以下のように少量である。
− トラウストキトリド（ＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄＡＣＥＭ６０６３）（Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１、４３９−４４７を参照のこと）については約０．１ｍｇ／バイオマス１ｇ、
− シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１（Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．、２００４、５２、ｐｐ．１１９６−１２００を参照のこと）については約０．１６２ｍｇ／バイオマス１ｇ、
− ホンコンマングローブオーランチオキトリウム（ＨｏｎｇＫｏｎｇｍａｎｇｒｏｖｅｓＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＢＲ−ＭＰ４−Ａ１（Ｌｉｅｔａｌ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．、２００９、５７、ｐｐ．４２６７−４２７２を参照のこと）からの単離物については約０．１８ｍｇ／バイオマス１ｇ。

産生を増加させるためには、従って、発酵条件を最適化することが重要であることが見受けられた。

ＱｉａｎＬｉｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．、２００９、５７、４２６７−４２７２による論文においては、スクアレンはステロール生合成の重要な中間体であり、スクアレンのステロールへの変換の第１のステップは酸素−依存スクアレンエポキシダーゼによって触媒されることが明記されている。

従って、溶存酸素に富む条件は、反対に、細胞内スクアレンを蓄積するために必要に応じて回避されるべきである。

それ故、低溶存酸素レベル（０〜５％飽和度）でのトラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ６０６３の培養により、１ｍｇ／ｇを上回るスクアレンを蓄積することが可能となり、一方で、より高い溶存酸素レベル（４０％〜６０％）での増殖では、０．０１ｍｇ／ｇのスクアレンの達成しか可能ではない。

同様に、１５℃の温度での培養は、トラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ６０６３によるスクアレンの産生は１．２ｍｇ／ｇであり、一方で、２０℃ではわずかに０．７ｍｇ／ｇである（Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１、３、４３９−４４７を参照のこと）。

Ｇ．Ｃｈｅｎｅｔａｌ．、ＮｅｗＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１０、２７−４、ｐｐ．３８２−３８９による論文においては、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）はポリケチドシンターゼ（頭字語：ＰＫＳ）経路によってＤＨＡを主に産生するが、一方で、スクアレンは代わりにコレステロール生合成経路によって合成され、これは、これらの２種の化合物に対するトラウストキトリド（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）の栄養上の要求は異なっていることを意味することが想起される。

彼らの研究の目的は、従って、スクアレンの産生における種々の窒素源の効果を系統的に調べることであった。

それ故、Ｇ．Ｃｈｅｎらは、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）は、グルタミン酸ナトリウム、イースト菌抽出物およびトリプトンからなる窒素源の混合物を含有する培地中では、急速に増殖して「大」量のスクアレンを蓄積することが可能であることを見出した。

これに関わらず、このスクアレンの「大量」の産生は完全に相対的である。

これらの著者らは、基準となる培地の値と比して、スクアレン含有量および収率をそれぞれ２６．３％および１０．１％で顕著に増加させることに成功しているが、これらの最適化された条件は、実際には０．７２ｍｇ／ｇのスクアレン含有量および５．９０ｍｇｌ／ｌの滴定量をもたらす。

スクアレンの産生を最適化するという同一の目的で、Ｋ．Ｗ．Ｆａｎｅｔａｌ．、ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０、２６−３、ｐｐ．１３０３−１３０９では、スクアレンモノオキシゲナーゼ（ステロール生合成における重要な酵素）の抑制剤であるテルビナフィンヒドロキシクロリドが用いられている。

スクアレン含有量および収率は、微生物培養の熟成度に関連していることは公知である。

細胞培養の熟成度が高いほどスクアレンの蓄積は少なくなり；実際には、ステロール生合成経路における前記スクアレンの消費が増えてしまう。

従って、テルビナフィンは、ステロール経路に向かうこのスクアレンの消費を防止するよう作用し、従って、細胞内における対照に比して３６％〜４０％以下までのスクアレンの蓄積を促進させることが可能である。

しかしながら、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について記載のもの（０．０４１ｍｇ／バイオマス１ｇ）よりもかなり高く、または、トルラスポラデルブリュッキイについて記載のもの（０．２４ｍｇ／バイオマス１ｇ）よりも高いが、この研究において用いられたオーランチオキトリウムマングローヴァイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ３菌株で達成された最も高いスクアレンの産生は、わずかに０．５３ｍｇ／バイオマス１ｇである。

それ故、成されたすべての試みに関わらず、これらの値は、オリーブ油に係る基準値（約４．２４ｍｇ／ｇ）よりもかなり低く、工業規模において要求される値に遠く及ばない。

従来技術において記載されているものよりもかなり効果的であると共にかなり経済的な産生方法の開発に関して、本出願人は、そのリサーチの最中に、例えば１ｇのバイオマス当たり１８ｍｇのスクアレン、すなわちオーランチオキトリウムマングローヴァイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ３菌株で達成された最高のスクアレン産生の３０倍を超える、１ｇのバイオマス当たり１０ｍｇを超えるスクアレン産生を可能とするスクアレン産生に係る優れた能力を有する微細藻類の新規菌株を同定した。しかも、顕著なスクアレン産生能力に追加して、この菌株はまた、バイオマスの乾燥重量基準で１５％超、例えばバイオマスの乾燥重量基準で１７．６％でドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）などの対象となる他の脂質化合物をもたらすことが可能である。

このシゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）の菌株は、フランスにおいて、２０１１年４月１４日に、パスツール研究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＣｕｌｔｕｒｅｓ］（ＣＮＣＭ）に、番号Ｉ−４４６９で寄託され、また、中国において、武漢大学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｕｈａｎ），Ｗｕｈａｎ４３００７２，Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａのＣＨＩＮＡＣＥＮＴＥＲＦＯＲＴＹＰＥＣＵＬＴＵＲＥＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ（ＣＣＴＣＣ）に、番号Ｍ２０９１１８で寄託された。これは、１８ＳＲＮＡをコードする遺伝子の部分配列によって特徴付けられ（配列番号１）：
１ＧＡＧＧＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＣａＴＴＣＣａＡＴＡＧＣＡａＧＡＣＧＣＧＡＡＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴ
６１ＣＴＣＧＴＣＡＣＴＡＣＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＴＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＡ
１２１ＴＧＴＧＧＴＡＧＣＣＧＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＧＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＧＴ
１８１ＴＡＴＡＧＴＣＡＣＣＧＴＡＧＧＣＣＡＡＴＡＣＣＣＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＣＧＡ
２４１ＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＡＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧ
３０１ＡＣＣＴＡＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡ
３６１ＴＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＴＡＴＡＡＡＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧＧＡＴＴＡＴＡＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＣＧ
４２１ＴＴＣＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＣＧＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＴＧＧＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＧＡＧＡ
これは、シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）のタイプの菌株であると同定され得る。

従って、本発明は、２０１１年４月１４日に、ＣＮＣＭに番号Ｉ−４４６９で寄託されたシゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）の菌株に関する。この菌株は、本出願において後に「ＣＮＣＭＩ−４４６９」と記載され得る。

この菌株は、スクアレンを大量に産生するという有利な特性を有する。実際に、１００グラムの乾燥バイオマスに対して１グラムの規模でスクアレンを得ることが可能となる。特に、産生されたスクアレンの定量化は、実験の段落において詳述されている方法に従って実施され得る。

結果的に、本発明はまた、この菌株の変異体、または、前記菌株から派生した菌株に関し、前記変異体または前記派生した菌株は、１００ｇの乾燥バイオマス当たり１ｇ以上のスクアレン含有量を産生する特性を保有する。特に、これは、１００ｇの乾燥バイオマス当たり１ｇ以上のスクアレン含有量を産生することが可能であり、および、突然変異誘発により、または、遺伝子形質変換によりＣＮＣＭＩ−４４６９菌株から得られるシゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）の菌株に関連している。突然変異誘発は、部位特異的および／または無作為的であり得る。

本発明はまた、ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株の突然変異誘発または遺伝子形質変換ステップ、および、任意により、１００ｇの乾燥バイオマス当たり少なくとも１ｇのスクアレンを産生する菌株を選択するスクリーニングステップを含む、このような菌株を調製する本発明に関する。

本発明は、この菌株を適切な培地において培養するステップ、および、バイオマスを回収するステップを含む、ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株もしくはスクアレン産生能力を保有するその変異体の培養方法に関する。培養は、従属栄養的条件下で実施される。一般に、培養ステップは、菌株を活性化させるための前培養ステップ、次いで、実際の培養または発酵ステップを含む。後者のステップは、対象の脂質化合物を産生するステップに対応する。

これらの微細藻類を培養するための条件はこの分野において周知である。例えば、上記のＧ．Ｃｈｅｎによる論文には、以下の連続的なステップを含む方法が記載されている：
− グルコース、グルタミン酸ナトリウム、イースト菌抽出物および種々の微量元素を含む寒天栄養培地上で維持した菌株から開始し、
− 活性化されたバイオマスを得るために、オービタルシェーカ上のエルレンマイヤーフラスコ中において、ｐＨ６、２５℃の温度で、前培養物を調製し、
− 前培養において用いられたものと同一の培地を有する他の系列の産生エルレンマイヤーフラスコに、約０．５％（ｖ／ｖ）の前段のステップにおいて得られたバイオマスを接種し、温度を２５℃に維持する。

前培養ステップは、２４〜７４時間、好ましくは約４８時間継続され得ることが好ましい。培養ステップに関して、これは６０〜１５０時間継続され得ることが好ましい。

微細藻類の増殖に要求される炭素源はグルコースであることが好ましい。

窒素源の性質に関して、本出願人は、イースト菌抽出物、尿素、グルタミン酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムからなる群から単独で、または、組み合わせで選択することが可能であることを見出した。同様に、尿素を、グルタミン酸ナトリウムで完全にもしくは部分的に置き換えること、または、グルタミン酸ナトリウムと硫酸アンモニウムとの混合物を用いることが可能である。

従来技術における方法において慣習的に用いられているイースト菌抽出物、５ｍｌ／ｌの比率で用いられるＳｉｇｍａ社により販売されているＢＭＥ反応混液などのビタミン反応混液が加えられた尿素を選択することが可能である。

前培養培地は、ビタミンＢ１、Ｂ６およびＢ１２を含んでいることが好ましい。

培地のｐＨに関して、本明細書中以下において例示するとおり、これは、５．５〜６．５、好ましくは６の固定値で維持されることとなる。ｐＨは、例えば２Ｎ硫酸、次いで、８Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによる、当業者に公知であるいずれかの手段により調節され得る。

最後に、溶存酸素含有量は、２０％〜０％の値で調節され、０％で放置される前に、好ましくは、２４および４８時間、好ましくは３６時間の最初の期間の間５％で維持され得る。酸素移動容量に関して、これは、さらに、４５ｍｍｏｌ／ｌ／時間を超えることがないよう、当業者に公知のいずれかの手段によって調節されることとなる。

本発明は、特に、対象脂質化合物を産生するためのＣＮＣＭＩ−４４６９菌株もしくはスクアレン産生能力を保有するその変異体の使用に特定的に関連する。対象脂質化合物は、スクアレン、および、特にドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）を含む。好ましくは、この対象化合物はスクアレンである。スクアレンは、１００ｇの乾燥バイオマス当たり１ｇ以上の含有量で産生され得ることに留意すべきである。

本発明は、ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株もしくはスクアレン産生能力を保有するその変異体を培養するステップ、ならびに、対象脂質化合物富化バイオマスを回収するステップ、ならびに、任意により、対象脂質化合物を収集および／または精製するステップを含む対象脂質化合物の産生方法に関する。対象脂質化合物は、スクアレン、および、特にドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）を含む。好ましくは、この対象化合物はスクアレンである。特に、スクアレンは、１００ｇの乾燥バイオマス当たり１ｇ以上の含有量で産生され得る。

発酵ステップの後、バイオマスは、それ自体が当業者に公知であるいずれかの方法によって発酵培地から回収され、例えばバイオマスは、発酵槽から取り出され、精密ろ過もしくは遠心分離によって単に濃縮されるか、または、水溶液による一連の濃縮−希釈を介して洗浄され得る。

それ故、本発明は、ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株もしくはスクアレン産生能力を保有するその変異体を含むバイオマスに関する。特に、発酵または培養ステップの後、このバイオマスは、スクアレンおよびドコサヘキサエン酸、好ましくはスクアレンなどの対象脂質化合物に富んでいる。これは、本書面に記載の方法によって得ることが可能である。実際に、発酵の後、バイオマスは、１７．６重量％のドコサヘキサエン酸および１．８重量％のスクアレンを含有し得る。ここで、「スクアレンに富んでいる」という用語は、１００ｇの乾燥バイオマス当たり１ｇ以上の含有量を意味することが意図されている。

バイオマスに追加して、本発明はまた、ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株もしくはスクアレン産生能力を保有するその変異体を含むこのバイオマスから調製された細胞抽出物もしくはライセートに関する。特に、この抽出物もしくはライセートは、発酵後に回収されたバイオマスから調製される。この抽出物またはライセートは、スクアレンおよびドコサヘキサエン酸、好ましくはスクアレンなどの対象脂質化合物に富んでいる。脂質内容物を抽出するための細胞の破壊は、機械的、化学的または酵素的経路といった種々の経路で実施され得る。

数回にわたる順次の抽出において、その後、ヘキサン／エタノールで細胞ライセートから油が抽出され得る。ヘキサン画分が次いで分離され、次いで、原油が単離されるようヘキサンが蒸発される。

それ故、対象脂質化合物、好ましくはスクアレンを産生する方法は、バイオマスを収集するステップ、細胞抽出物もしくはライセートを調製するステップ、および、対象脂質化合物、好ましくはスクアレンを含む原油を抽出するステップを含む。

本発明はまた、ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株もしくはスクアレン産生能力を保有するその変異体を含むこのバイオマスから調製された、対象脂質化合物、好ましくはスクアレンを含む粗もしくは精製油に関する。

最後に、本発明は、医学分野、化粧品分野および食品分野向けの組成物の調製における本発明の方法のいずれか１つにより産生されたスクアレンまたはドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）、特にスクアレンなどの対象脂質化合物の使用に関する。それ故、本発明は、本発明の方法のいずれか１つによりスクアレンまたはドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）、特にスクアレンなどの対象脂質化合物を産生するステップ、次いで、医学分野、化粧品分野および食品分野向けの組成物を調製するステップを含む、医学分野、化粧品分野および食品分野向けの組成物の調製方法に関する。

特に、本発明は、ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株もしくはスクアレン産生能力を保有するその変異体、培養もしくはその発酵後に得られたバイオマス、および、細胞抽出物もしくはそのライセートを含む産生物もしくは組成物に関する。好ましくは、この産生物またはこの組成物は、食品組成物もしくは食品、または、栄養補助剤である。これは、液体形態であっても固体形態であってもよい。特に、細胞または細胞抽出物もしくはそのライセートの凍結乾燥物が含有されている。この産生物またはこの組成物は、粉末、顆粒、ゲルカプセル、カプセルまたは錠剤の形態、好ましくはカプセルの形態であり得る。あるいは、産生物または組成物は液体形態であり、本発明の方法のいずれか１つにより得られた粗もしくは精製油を含む。

本発明は、例示であると共に非限定的であることが意図される以下の実施例によってより明白に理解されるであろう。

実施例１：シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株によるスクアレンの産生の研究
シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株の顕著なスクアレン産生能力を実証するために、この菌株を、文献におけるスクアレン産生に係る標準微細藻類菌株（すなわち、シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）菌株（ＲＣＣ８９３、ＲｏｓｃｏｆｆＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、フランス））と比較した。

前培養および培養培地
ここでは、実際の培養／産生フェーズに先だつ事前の前培養フェーズで微細藻類の発酵を行った。

前培地は、以下の表Ｉに記載の組成を有していた。

培養／産生培地の組成が以下の表ＩＩにより記載されている。

ｇ／ｌでの濃縮ビタミン溶液の組成。

ｇ／ｌでの濃縮微量元素溶液の組成。

発酵の実施
前培養は、２リットルのバッフル付エルレンマイヤーフラスコにおいて実施した。その構成成分を完全に溶解させた後に培地をろ過した。ペトリ皿中で培養した微細藻類のコロニーを採ることにより接種を行った（１つの１０μｌループの割合で）。インキュベーションを、２５℃の温度で、１１０ｒｐｍで振盪しながら（オービタルシェーカで）４８時間行った。

バイオマスは沈殿する（または、壁に付着する）ため、エルレンマイヤーフラスコをよく振盪した後に３００ｍｌのサンプルを採取するよう注意する；前記３００ｍｌを用いて培養に接種した。

実際の培養は、２リットルのバッフル付エルレンマイヤーフラスコの中で、２５℃の温度で、１１０ｒｐｍで振盪しながら（オービタルシェーカで）、以下の方法で実施した。初期ｐＨは＞５．５であった。

平衡グルコース消費で、培養時間は、シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株については６６時間、および、シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＲＣＣ８９３菌株については１３８時間であり、シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株の良好な増殖が反映された。

以下の表ＩＩＩには、シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株およびシゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＲＣＣ８９３菌株で得られた結果が記載されている。

それ故、シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株により１００ｇの乾燥バイオマス当たり１．８ｇのスクアレン含有量を得ることが可能であり、これは、これらの微細藻類では未だかつて観察されたことのない含有量であったことに注目すべきである。標準菌株との比較において、この含有量は、半分の短さの培養時間で少なくとも４倍高いものである。

しかも、シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９に係る発酵後に得られたバイオマスの分析では、１７．６重量％のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含む合計で４１．８重量％の脂肪酸を含有していたことが観察可能であった。

シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）バイオマスにおけるスクアレンの定量化方法
バイオマスのビーズによる破壊およびクロロホルム／メタノールでの冷抽出後に、分析を２５℃でプロトンＮＭＲにより実施した。定量化は、以下に記載のとおり内標準により実施した。

スペクトルを、４００ＭＨｚで操作されるＡｖａｎｃｅＩＩＩ４００分光計（ＢｒｕｋｅｒＳｐｅｃｔｒｏｓｐｉｎ）で得た。

バイオマスの破壊：およそ２００ｍｇの新鮮なバイオマスを正確に計量する。およそ１〜１．５ｃｍのガラスビーズおよび０．１ｍｌのメタノールを加える。チューブを気密封止し、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサにより少なくとも５分間撹拌する。

冷抽出：およそ２ｍｇのトリフェニルリン酸（ＴＰＰ）、０．９ｍｌのメタノールおよび２ｍｌのクロロホルムを添加する。チューブを気密封止し、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサにより１分間撹拌する。冷蔵庫に入れる。沈殿による分離の後（最低で１時間）、透明な上方相を注意深く回収し、これをガラスジャーに移し、周囲温度で、窒素流下に乾燥するまで蒸発させる。乾燥した抽出物を０．５ｍｌのＣＤＣｌ_３および０．１ｍｌのＣＤ_３ＯＤに溶解させ、これをＮＭＲ管に移す。

スペクトルの記録：機器を適切に設定した後、溶剤抑制を行わず、回転させず、少なくとも１５秒間の緩和時間で取得を行う。スペクトル窓は、７．２５ｐｐｍのクロロホルムピークで較正されたスペクトルで少なくとも−１〜９ｐｐｍの間でなければならない。マニュアルモードにおけるフーリエ変換、位相補正およびベースラインの減算（指数関数的増幅を伴わない、ＬＢ＝ＧＢ＝０）後にスペクトルを用いる。

シグナルの使用：７．０５〜７．１５ｐｐｍのクロロホルムシグナルを含有しないＴＰＰ未解像ピークを値１００とする（９つのＴＰＰプロトンとして計数）。１．５５ｐｐｍでのスクアレンシグナルの面積を積分する（６つのプロトンとして一重項の計数）。

計算および結果の表記：結果は、粗重量割合として表記した。

ここで、
Ａ_ｓ：１．５５ｐｐｍでのスクアレンシグナルの面積。
Ｐ_ＴＰＰ：積分したＴＰＰ未解像ピークのプロトンの数：９
Ｗ_ＴＰＰ：計量したＴＰＰの重量（グラム）
Ｍ_ＴＰＰ：モル質量（グラム／ＴＰＰ１モル）（Ｍ_ＴＰＰ＝３２６ｇ／ｍｏｌ）
Ｍ_Ｓ：モル質量（グラム／スクアレン１モル）（Ｍ_Ｓ＝４１０ｇ／ｍｏｌ）
ＰＥ：新鮮なバイオマスの重量（グラム）

実施例２：シゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＣＮＣＭＩ−４４６９菌株の脂質プロファイルの研究
この菌株の脂質プロファイル（表ＩＶを参照のこと）では、ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）を含む他の対象脂質化合物の産生も可能とされることが判定可能であった。前記プロファイルは、発酵後に得たバイオマスから抽出した原油で生成した。

脂質プロファイルの調製方法
脂肪酸を、メタノール塩酸混液とのエステル交換およびクロロホルムでの抽出後に、メチルエステルの形態でガスクロマトグラフィにより測定した。結果を％分布として表記する；分析は内標準方法により行う。

ｔａｐｆｏｃｕｓライナおよび水素炎イオン化検出器と共にスプリット−スプリットレスインジェクタを備えたクロマトグラフ（Ｖａｒｉａｎ３８００）を用いた。

１ｍｌのメタノール当たりほぼ正確に０．５ｍｇのヘプタデカン酸メチルを含有する内部較正溶液を調製した。ヘプタデカン酸メチルはクロマトグラフ標準点とされる。

ほぼ正確に３０ｍｇの予め乾燥させたサンプルを６ｍｌチューブに計量した。１ｍｌの内部較正溶液、次いで、２ｍｌの３Ｎメタノール塩酸混液を、２つの計測ラインでピペットを用いて添加した。次いで、チューブに蓋をし、１１０℃に恒温化した乾燥浴に４時間入れた。

冷却した後、約０．５ｍｌの水および０．５ｍｌの飽和塩化ナトリウム水溶液を添加し、１ｍｌのクロロホルムで３回抽出した。クロロホルム相を６ｍｌチューブに回収し、これらを硫酸ナトリウムを含有するカラムで乾燥させた。これらを窒素流下で約１ｍｌに濃縮して注入した。

各脂肪酸（ｉ）の％分布を、ヘプタデカン酸メチルピークを排除したラウリン酸（Ｃ１２：０）からＤＨＡ（Ｃ２２：６Δ４ｃ、７ｃ、１０ｃ、１３ｃ、１６ｃ、１９ｃ）（端点を含む）におよぶクロマトグラム上で位置を特定したすべてのピークの面積の和に比したこの脂肪酸のピーク下の面積の比により得た。

Claims

２０１１年４月１４日に、ＣＮＣＭに番号Ｉ−４４６９で寄託されたシゾキトリウムエスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）の菌株。
請求項１に記載の菌株を培養するステップ、および、対象脂質化合物富化バイオマスを回収するステップを含む対象脂質化合物を含む組成物の産生方法。
さらに、前記脂質化合物を含む組成物を収集するステップを含む、請求項２に記載の方法。
前記対象脂質化合物が、スクアレンまたはドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）である、請求項２または３に記載の方法。
スクアレンまたはドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）を含む対象脂質化合物を含む組成物を産生するための請求項１に記載の菌株の使用。
医学分野、化粧品分野および食品分野向けの組成物の調製における、請求項２または３に記載の方法によって産生されたスクアレンまたはドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）を含む前記対象脂質化合物を含む組成物の使用。
スクアレンもしくはドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）を含む、請求項１に記載の菌株またはその細胞抽出物もしくは画分を含む産生物もしくは組成物。
スクアレンを含むことを特徴とする、請求項７に記載の産生物または組成物。
食品製品または栄養補助食品製品であることを特徴とする、請求項７または８に記載の産生物または組成物。