JP6013195B2 - アクリルアミドの産生を最小化するための微生物の機能強化 - Google Patents
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Description
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、それぞれ2010年3月2日および2010年3月23日に出願した対応する米国仮特許出願第61/309623号および第61/316634号の優先権に基づく米国特許法第119条の利益を主張するものである。
一実施形態では、食品調製/加工条件下で、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により形質転換された微生物が提供される。
別の態様では、本明細書に記載する微生物を、調製または加工条件下で食品に添加する工程を含み、前記微生物が、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって前記食品製品中のアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法が提供される。本明細書ではまた、食品調製または加工条件中にアスパラギンを減少させるための本明細書に開示する微生物の使用も提供される。
a) 窒素異化抑制を減少させるならびに/あるいはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/またはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により微生物を形質転換する工程と、
b) 前記微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程と
を含み、前記微生物が、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによってアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法が提供される。
a) 窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する、少なくとも1つの核酸分子により微生物を形質転換する工程と、
b) 前記微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程と
を含み、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法が提供される。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に開示する形質転換微生物を使用して製造される、アクリルアミド濃度が減少した食品製品を提供する。
(実施例1)出芽酵母の株におけるASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3およびGAT1遺伝子のクローニングおよび恒常的発現ならびにURE2、TOR1、DAL80およびGZF3の欠失
クローン選択のために、抗生物質耐性マーカーkanMXを使用した。工業用/市販のパン酵母または実験室株を形質転換させて、ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1またはASP3とGAP1の組み合わせもしくはASP3とGAT1の組み合わせを恒常的に発現させた、あるいはURE2、TOR1、DAL80もしくはGZF3遺伝子を欠失させた、またはtor1Δと、ASP3の過剰発現の組み合わせを有するようにした。唯一の遺伝子および代謝改変は、ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1、またはASP3とGAP1の組み合わせもしくはASP3とGAT1の組み合わせの意図した恒常的発現であった、あるいはURE2、TOR1、DAL80およびGZF3遺伝子を欠失させた、またはtor1Δと、ASP3の過剰発現の組み合わせを有するようにした。
PGK1プロモーターおよびターミネーターシグナルの制御下でASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1遺伝子を含む組換え核酸により酵母を形質転換した。PGK1プロモーターはNCRを受けない。URE2欠失カセットは、標的となる遺伝子欠失のための5'および3'URE2フランキング配列を含んでいた。
図1〜8は、以下に記載するこの実施例で使用される直接反復配列の組換えを通して、設計した遺伝子カセットが形質転換酵母の選択およびその後の抗生物質耐性マーカーの除去をどのように可能にするかを説明している。ASP1セルフクローニングカセットを、他の実施例について説明したのと類似の方法で構築し、形質転換し、抗生物質耐性マーカーを除去した。
図11〜20は、ASP3、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1またはASP3とGAP1の組み合わせもしくはASP3とGAT1の組み合わせにより形質転換した、あるいはURE2、TOR1、DAL80もしくはGZF3遺伝子を欠失させた、またはtor1Δと、ASP3の過剰発現の組み合わせを有する酵母についての、アスパラギンおよび/またはアクリルアミドの有意な減少を示している。図11はまた、細胞質ASP1の過剰発現が、細胞壁結合型アスパラギナーゼをコードするASP3の過剰発現と比べて作用しないことを明らかに示している。
1. pAC1-ASP3、pAC1-AGP1、pAC1-AGP3、pAC1-GNP1およびpAC1-GAT1の構築
ASP3、AGP1、GNP1およびGAT1を恒常的PGK1プロモーターおよびターミネーターシグナルの制御下におくために、ORFの各々をpAC1にクローニングした(図9)。その5'末端中に構築したMlu1およびBmt1制限酵素部位を含んだプライマーを使用して、開始コドンから終止コドンまでの各ORFを、出芽酵母ゲノムDNAから増幅した。
GAP1、AGP1およびASP3を恒常的PGK1プロモーターおよびターミネーターシグナルの制御下におくために、各ORFをpAC2にクローニングした(図10)。その5'末端中に構築したMlu1およびBmt1制限酵素部位を含んだプライマーを使用して、開始コドンから終止コドンまでの各ORFを、出芽酵母ゲノムDNAから増幅した。
DNA合成によりure2Δカセットを完成させた(MrGene、ドイツ)。
Swa1(Fermentas、カナダ)を使用して各カセットを適当なプラスミドから切断し、0.8%アガロースゲル上で可視化した。ゲルから予想バンドサイズを分割および抽出した(Qiagen、米国-Gel extraction kit)。抽出、クリーンアップおよび定量化後、500ngの線状カセットを使用して、出芽酵母株を形質転換した。酢酸リチウム/ポリエチレングリコール/ssDNA法を使用して酵母株を形質転換した。形質転換後、500μg/mL G418(Sigma、米国)を補充したYPDプレート上に蒔く前に、細胞を30℃で3時間、YEG中で回復させた。コロニーが現れるまで、プレートを30℃でインキュベートした。
Pme1(Fermentas、カナダ)を使用して3149bpのure2ΔカセットをpMrG-ure2Δから切断し、0.8%アガロースゲル上で可視化した。ゲルから予想3149bpバンドを分割および抽出した(Qiagen、米国-Gel extraction kit)。抽出、クリーンアップおよび定量化後、500ngの線状カセットを使用して、出芽酵母株PDMを形質転換した。酢酸リチウム/ポリエチレングリコール/ssDNA法を使用して酵母株を形質転換した。形質転換後、500μg/mLのG418(Sigma、米国)を補充したYPDプレート上に蒔く前に、細胞を30℃で3時間、YEG中で回復させた。コロニーが現れるまで、プレートを30℃でインキュベートした。
以下の成分で、全粒粉パン生地を調製した:全粒粉、グルテン粉、塩、植物油、糖蜜、水および酵母(試験株または対照のいずれか)。方法は、「ノータイム生地(no time dough)」法の工程に厳密に従った。また、5時間の時点で、アクリルアミドデータを得るためにサンプルを加熱した(詳細は以下に示す)。
1. -30℃冷凍庫中で液体窒素デュワーを冷却し、液体N2で充填する。
2. 250mLメディアボトル中、L-アスパラギンを50mLの濾水に溶解する。
3. 生地配合に添加する酵母(湿性または乾燥のいずれか)の水分/固形含量を測定する。
4. 計算した量の酵母を200mLコニカルファルコンチューブに計り分ける。
5. 添加する酵母により持ち込まれる水分含量を説明することにより、必要とされるRO水の量を決定する。上皿秤上の重量で必要とされる量のRO水を計り分ける。
6. 残っているRO水(30℃)の2/3と共に適当な量の酵母を再懸濁する。水洗に残っている1/3を使用する。
7. ミキシングボウルの重量を測定する。
8. 乾燥成分(小麦粉、グルテンおよび塩)をキッチンエイドミキシングボウル中に量り分ける。へらで20〜30秒間乾燥成分を攪拌する。へら型アタッチメントをフックに変える。
9. ミキシングボウルに測定した植物油および糖蜜およびL-アスパラギン溶液を添加する。生地が一様な硬さになるまで速度2で混合する。
10. タイマーを10分に設定する。
11. 混合生地に酵母懸濁液を添加する。直ちにタイマーを開始し、速度2で混合する。
酵母添加の時間:
12. 残っている水でファルコンチューブをすすぎ、リンスをミキシングボウルに添加する。
13. 10分後にタイマーが鳴るまで混合し続ける。
14. ミキシングボウル+生地の最終重量を計る。
15. 直ちに生地を約1.0cmの厚さに伸ばし、円形のクッキー型を使用して実験のために適当な数の生地サンプルを切り抜く。
1つの生地サンプルを素早く取り出し、ばらばらにし、次いで、液体窒素を乳鉢に注ぎ込んで生地小片を凍結させる。これを「T=15分」サンプルとする。
さらなる分析のために、凍結生地小片を、ラベルを付した50mLファルコンチューブ中-80℃で保管する。
16. 残っている生地サンプルをクッキングシート上にのせ、30℃でインキュベートする。
17. 実験のために所望の時点で生地サンプルを取り出し、より小さい片に分解し、液体窒素で凍結する。
凍結片を、ラベルを付した50mLファルコン中-80℃で保管する。
18. いくつかの実験については、T=5時間で、追加のクッキーを取り出し、400°F(204℃)で20分間焼き、-80℃で保管する。
アスパラギナーゼ活性を止めるために、予め調製した生地サンプルを、調製の時に液体窒素で処理した。次いで、サンプルをひき、分析まで-80℃で保管した。以下の修正を含むベーカリー製品のための抽出プロトコル後に、酵素分析(K-ASNAM-Megazyme)を通して生地サンプル中のアスパラギンの分析を行った:均質化した生地サンプル(2g)を、素早く秤量し、100mL容量フラスコに移した。酵素活性のあらゆる再発を防ぐために、約90mLの80℃MilliQ H2Oを添加し、80℃水浴中で20分間サンプルをインキュベートした。次いで、サンプルを室温まで冷却させ、容積に希釈し、一定分量を分析のために遠心分離でスピンダウンした(RT、4000xg、15分)。
Claims (31)
- 下記a)とb)の組み合わせまたはb)とc)の組み合わせにより形質転換された酵母であって、
a)が、食品調製/加工条件下で、窒素異化抑制の制御因子の活性を改変する核酸分子であり、
b)が、食品調製/加工条件下で、細胞壁アスパラギナーゼをコードする核酸分子であり、および、
c)が食品調製/加工条件下で、アミノ酸輸送体をコードする核酸分子である、
酵母。 - 前記アスパラギナーゼが、ASP3によりコードされる、請求項1に記載の酵母。
- 前記アスパラギナーゼが、Asp3pである、請求項1に記載の酵母。
- 前記アミノ酸輸送体が、GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2またはAGP3によりコードされる、請求項1に記載の酵母。
- 前記アミノ酸輸送体が、Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2pまたはAgp3pである、請求項1に記載の酵母。
- 前記制御因子が、URE2、GAT1、TOR1、TOR2、DAL80、GLN3またはGZF3によりコードされる、請求項1に記載の酵母。
- 前記制御因子が、Ure2p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dal80p、Gln3pまたはGzf3pである、請求項1に記載の酵母。
- 前記a)の核酸分子が、URE2欠失カセットを含む、請求項1に記載の酵母。
- 前記a)の核酸分子が、[URE3]をコードする、請求項1に記載の酵母。
- 前記酵母が不活性である、請求項1から9のいずれか一項に記載の酵母であって、不活性な酵母が、その栄養内容物、およびアスパラギン分解活性を含む他の特性をまだ保持している、不活性の、生存不能の、および/または死んだ酵母の組成物である、酵母。
- 前記酵母が出芽酵母である、請求項1から10のいずれか一項に記載の酵母。
- 食品調製/加工条件下で、アスパラギンを絶えず分解するおよび/または取り込むよう形質転換された、請求項1から11のいずれか一項に記載の酵母。
- 前記核酸分子の少なくとも1つが、恒常的活性型プロモーターと作動可能に連結している、請求項1から12のいずれか一項に記載の酵母。
- 前記核酸分子の少なくとも1つが、窒素異化抑制を受けないプロモーターと作動可能に連結している、請求項1から12のいずれか一項に記載の酵母。
- Asp3pをコードする第1核酸分子およびGap1pもしくはGat1pをコードする第2核酸分子により形質転換された、請求項1に記載の酵母。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の酵母を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程を含み、前記酵母が、食品調製または加工中に、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の酵母を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程を含み、前記酵母が、食品調製または加工中に、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法。
- a) 下記のi)とii)の組み合わせまたはii)とiii)の組み合わせにより酵母を形質転換する工程と、
b) 前記酵母を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程と
を含み、前記酵母が、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法であって、
i)が、窒素異化抑制の制御因子の活性を改変する核酸分子であり、
ii)が、細胞壁アスパラギナーゼをコードする核酸分子であり、および、
iii)が、アミノ酸輸送体をコードする核酸分子である、
方法。 - a) 下記のi)とii)の組み合わせまたはii)とiii)の組み合わせにより酵母を形質転換する工程と、
b) 前記酵母を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程と
を含み、前記酵母が、窒素異化抑制を減少させ、かつ/またはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子および/もしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法であって、
i)が、窒素異化抑制の制御因子の活性を改変する核酸分子であり、
ii)が、細胞壁アスパラギナーゼをコードする核酸分子であり、および、
iii)が、アミノ酸輸送体をコードする核酸分子である、
方法。 - 前記アスパラギナーゼが、ASP3によりコードされる、請求項18または19に記載の方法。
- 前記アスパラギナーゼが、Asp3pである、請求項18または19に記載の方法。
- 前記アミノ酸輸送体が、GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2またはAGP3によりコードされる、請求項18または19に記載の方法。
- 前記アミノ酸輸送体が、Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2pまたはAgp3pである、請求項18または19に記載の方法。
- 前記制御因子が、URE2、GAT1、TOR1、TOR2、DAL80、GLN3またはGZF3によりコードされる、請求項18または19に記載の方法。
- 前記制御因子が、Ure2p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dal80p、Gln3pまたはGzf3pである、請求項18または19に記載の方法。
- 前記核酸が、URE2欠失カセットを含む、請求項18または19に記載の方法。
- 前記酵母が不活性である、請求項18から26のいずれか一項に記載の方法であって、不活性な酵母が、その栄養内容物およびアスパラギン分解活性を含む他の特性をまだ保持している、不活性の、生存不能の、および/または死んだ酵母の組成物である、方法。
- 前記酵母が出芽酵母である、請求項18から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、恒常的活性型プロモーターと作動可能に連結している、請求項18から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、窒素異化抑制を受けないプロモーターと作動可能に連結している、請求項18から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記食品製品が、植物性食品製品、飲料、ベーカリー製品、穀物製品、果物製品、豆類製品、乳製品または肉製品である、請求項16から30のいずれか一項に記載の方法。
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