CN102869765B - 微生物的功能性增强以最小化丙烯酰胺的产生 - Google Patents

Abstract

本发明公开提供了酵母，所述酵母用核酸分子(GAT1)转化以在食品制作/加工条件下减少天冬酰胺转运/降解的氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的细胞壁或细胞外蛋白的基因(ASP1或ASP3)和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因(AGP1或GNP1或GAP1)。基因改造的酵母具有增强的减少通过加热制备的食物中的丙烯酰胺浓度的能力。还提供了该转基因酵母用于减少食品中丙烯胺浓度的方法和用途和使用该转基因酵母制备的具有减少的丙烯胺含量的食品。

Description

微生物的功能性增强以最小化丙烯酰胺的产生

相关申请

本申请要求基于申请日分别为2010年3月2日和2010年3月23日的相应的美国临时专利申请号61/309,623和61/316,634的优先权，要求35U.S.C.119的益处，通过引用将它们全部并入本文。

技术领域

本发明公开涉及用于减少食物中的丙烯酰胺的产品和方法，还涉及丙烯酰胺含量减少的食品。具体而言，本发明公开涉及基因改造的微生物以增强它们减少丙烯酰胺的能力。

背景技术

丙烯酰胺是无色无嗅的结晶固体，它是一种重要的工业单体，常用作水泥粘结剂并用于聚合物和凝胶的合成。基于各种体内和体外研究，清楚地证明了丙烯酰胺和其代谢物环氧丙酰胺的致癌和遗传毒性作用(Wilson等2006;Rice,2005)。国际癌症研究署(IARC)1994年对丙烯酰胺进行了评价，基于在小鼠和大鼠中完成的阳性生物测验，国际癌症研究署将丙烯酰胺分类为“可能对人类致癌”，其得到了丙烯酰胺在哺乳动物组织中生物转化为遗传毒性的环氧丙酰胺代谢物这一证据的支持(IARC,1994)。已知丙烯酰胺至环氧丙酰胺的生物转化在人类和啮齿类组织中都可有效地发生(Rice,2005)。除IARC的分类之外，欧盟的‘毒性、生态毒性和环境科学委员会’以及英国的独立性的‘食物、消费者产品和环境中的化学品致癌性委员会’均建议，由于丙烯酰胺的内在毒性包括对体细胞和生殖细胞的遗传毒性和神经毒性、致癌性和生殖毒性，应将人类与丙烯酰胺的接触控制在尽可能低的水平。

在对饮食中的丙烯酰胺暴露的人类流行病学研究方面，还没有证据表明这种化学品的任何致癌作用；然而，也认识到对丙烯酰胺的这些流行病学研究其灵敏性可能还不足以揭示暴露于丙烯酰胺的人中的潜在肿瘤(Rice,2005;Wilson等2006)。

2002年，瑞典国家食品局发表了一份报告，详述了多种常见食品中的丙烯酰胺含量，这些食品具体是经加热处理的富含碳水化合物的食品诸如薯条和薯片。这一清单现在已扩展到包括基于谷物的食品、基于蔬菜的食品、基于豆类的食品、饮料诸如咖啡或咖啡替代品；表1是FDA数据，显示了多种食品中的丙烯酰胺浓度。

现在已确认，丙烯酰胺是在食品烹饪过程中产生的，主要是通过天冬酰胺这种氨基酸和还原糖例如葡萄糖之间的美拉德（Maillard）反应，其中天冬酰胺是限制性前体(Amrein等2004;Becalski等2003;Mustafa等2005;Surdyk等2004;Yaylayan等2003)。

也已经有一些方法试图减少食品中的丙烯酰胺含量，包括添加天冬酰胺酶的商业制备物(丹麦的Novozymes,和荷兰的PreventASe,DSM)，深度酵母发酵6小时(Fredriksson等2004)，发酵前在面团中添加甘氨酸(Brathen等2005;Fink等2006)，油炸前将马铃薯浸入氯化钙中(GokmenandSenyuva,2007)，用蔗糖代替还原糖(Amrein等2004)，处理条件诸如温度、pH和水分含量的总体优化(Claus等2007;Gokmen等2007)，以及关于原材料的不同选择的研究(Claus等2006)。所有上述的这些方法在某种程度上都还不够好，或者由于存在一些内在的问题使它们在食品制造过程中并不实用，这些问题包括成本、对食品感官特性的影响和/或在食品加工条件下不能有效减少丙烯酰胺。

像很多微生物一样，酿酒酵母能够天然地消耗/降解丙烯酰胺前体天冬酰胺和还原糖。这也可能是为什么在深度发酵6小时后的面包中观察到丙烯酰胺含量降低的原因(Fredriksson等2004)。然而，这种可有效减少丙烯酰胺的深度发酵时间对于现代食品制造工艺而言是不实用的。

在酿酒酵母中，负责降解天冬酰胺的基因是ASP1和ASP3，它们分别编码胞浆的天冬酰胺酶和细胞壁的天冬酰胺酶。在酿酒酵母中至少还有41个基因被注解为术语“氨基酸转运”，这种转运子中的6个已知能够转运天冬酰胺到细胞中["酵母属基因组数据库"http://www.yeastgenome.org/(10/01/09)]。酿酒酵母中的这6个天冬酰胺转运子基因的名字为GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2和AGP3。还已明确，酿酒酵母能够利用很多种氮源供其生长，并且在混合底物培养基中，酿酒酵母能够从好的氮源至差的氮源顺次选择(Cooper,1982)。这种顺次使用受（多种）分子机制的控制，所述分子机制是由传感系统和称为氮分解代谢产物抑制（NCR）的转录调控机制组成的。一般而言，NCR是指降解氮源所需的渗透酶和分解代谢酶的基因表达之间的差异。氮分解代谢途径的表达被称为Gln3p、Gat1p、Dal80p和Gzf3p的四种调控子的调控，这些调控子结合于上游的激活性共有序列5’-GATAA-3’。Gln3p和Gat1p正作用于基因表达，而Dal80p和Gzf3p负作用于基因表达。在较好氮源的存在下，Gln3p和Gat1p被TOR激酶Tor1p和Tor2p磷酸化；然后与Ure2p形成胞浆复合物并从而受抑制而不能激活NCR-灵敏性的转录。在较差氮源的存在下或者氮源饥饿时，Gln3p和Gat1p被去磷酸化，与Ure2p解离，在细胞核中累积并激活NCR-灵敏性的转录。

也已明确证明，URE2的特定突变产生显性突变，称为[URE3]。[URE3]是一种酵母朊蛋白，通过Ure2p自催化转变为感染性的、蛋白酶抑制性的淀粉样纤维而形成(Wickner,1994)。缺失功能性Ure2p的酿酒酵母细胞和受[URE3]感染的细胞的表型是类似的，因为它们不再响应NCR(Wickner,1994;Wickner等1995)。如上所述，响应于较好的氮源，Ure2p参与Gln3p和Gat1p活性的下调。

发明内容

本发明公开提供了微生物，所述微生物用至少一种核酸分子转化以在食品制作/加工条件下降低氮分解代谢产物抑制。本发明公开还提供微生物，所述微生物用至少一种核酸分子转化以在食品制作/加工条件下过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因。本发明公开还提供微生物，所述微生物用至少一种核酸分子转化以在食品制作/加工条件下减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因。

在一种实施方式中，所述微生物用核酸分子转化，所述核酸分子编码胞外天冬酰胺酶，诸如细胞壁相关的天冬酰胺酶，Asp3p。另一种实施方式中，所述微生物用核酸分子转化，所述核酸分子编码氨基酸转运子，诸如天冬酰胺氨基酸转运子，例如Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2p和/或Agp3p。

另一种实施方式中，所述微生物用核酸分子转化，所述核酸分子编码Asp3p和Gap1p两者或Asp3p和Gat1p两者。另一种实施方式中，所述微生物用第一和第二核酸分子转化，其中所述第一核酸分子编码Asp3p，所述第二核酸分子编码Gap1p或Gat1p。

仍然另一种实施方式中，所述微生物用核酸分子转化，所述核酸分子修饰天冬酰胺转运/降解的氮分解代谢产物抑制的调控因子的活性，所述调控因子诸如Ure2p、Dal80p、Gzf3p、Gln3p、Gat1p、Tor1p和/或Tor2p。另一种实施方式中，所述微生物用核酸分子转化，所述核酸分子修饰氮分解代谢产物抑制调控因子Gln3p和Ure2p两者的活性。仍然另一种实施方式中，所述微生物用第一和第二核酸分子转化，所述核酸分子修饰氮分解代谢产物抑制，其中第一核酸分子编码Gln3p，第二核酸分子修饰Ure2p的表达。

一种实施方式中，所述微生物是真菌或细菌。所述真菌可以是任何真菌，包括酵母，诸如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、贝酵母（Saccharomycesbayanus）、卡氏酵母（Saccharomycescarlsbergensis）、白色念珠菌（Candidaalbicans）、乳酒假丝酵母（Candidakefyr）、热带念珠菌（Candidatropicalis）、罗伦隐球酵母（Cryptococcuslaurentii）、新型隐球酵母（Cryptotoccousneoformans）、异常汉逊酵母（Hansenulaanomala）、多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromycesfragilis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）、乳酸克鲁维马克斯变种(Kluyveromycesmarxianusvarlactis)、毕赤酵母（Pichiapastoris）、深红酵母（Rhodotorularubra）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）、解脂耶氏酵母（Yarrowialipolyitca）或属于真菌界的任何酵母种。可用的其他真菌包括但不限于，曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、根霉属（Rhizopus）和毛霉属（Mucor）的种。细菌可以是任何细菌，包括欧文氏菌属（Erwiniasp.）、乳酸杆菌属（Lactobacillussp.）、乳球菌属（Lactococcussp.）、芽孢杆菌属（Bacillussp.）、小球菌属（Pediococcussp.）、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、短杆菌属（Brevibacteriumsp.）和明串珠菌属（Leuconostocsp.）。在一种实施方式中，所述微生物是灭活的，诸如灭活的酵母。

在一种实施方式中，所述至少一种核酸分子可操作性地连接于组成型活性启动子。另一种实施方式中，所述至少一种核酸分子可操作性地连接于不被氮分解代谢产物抑制的启动子。

本发明公开还提供减少食品中的丙烯酰胺的方法，包括在食品制作或加工条件下将本文公开的微生物加入到食品中；其中所述微生物在食品制作或加工条件下减少氮分解代谢产物抑制或过度表达参与天冬酰胺转运和/或降解的基因；从而减少食品中的丙烯酰胺。

本发明公开还提供减少食品中的丙烯酰胺的方法，包括（a）用至少一种核酸分子转化微生物以减少氮分解代谢产物抑制或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因；（b）在食品制作或加工条件下将所述微生物加入到食品中；其中所述微生物减少氮分解代谢产物抑制或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而减少所述食品中的丙烯酰胺。

另一种实施方式中，提供利用本文公开的转化的微生物产生的一种食品，所述食品具有降低的丙烯酰胺浓度。仍然另一种实施方式中，提供一种食品，所述食品利用本文公开的方法产生，具有降低的丙烯酰胺浓度。

在一种实施方式中所述食品是基于谷物的（grain-based）食品，包括但不限于饼干（biscuits）、面包和薄脆饼干；基于蔬菜的食品，包括但不限于马铃薯制品；饮料，包括但不限于咖啡和咖啡替代品；水果、豆类，奶或肉制品。

下文的发明详述将使本发明公开的其他特征和益处更加明显。然而应理解，虽然这些详细描述和具体实例示出了本发明公开的优选实施方式，但是这些详细描述和具体实例仅仅用于说明的目的，因为根据这些详细描述，本领域技术人员将明白可在本发明公开的精神和范围内进行多种改变和改动。

附图说明

现在将结合附图阐述本发明公开：

图1图示了所构建的ASP3基因盒以及在后续步骤中整合到酿酒酵母菌株的LEU2或URA3位点之后去除kanMX标记。通过PGK1启动子正向重复的重组，产生仅含有原始DNA序列的自克隆菌株来去除kanMX标记。

图2图示了所构建的GAP1基因盒以及在后续步骤中整合到酿酒酵母菌株的URA3位点之后去除kanMX标记。通过PGK1启动子正向重复的重组，产生仅含有原始DNA序列的自克隆菌株来去除kanMX标记。

图3图示了所构建的AGP3基因盒以及在后续步骤中整合到酿酒酵母菌株的LEU2位点之后去除kanMX标记。通过PGK1启动子正向重复的重组，产生仅含有原始DNA序列的自克隆菌株来去除kanMX标记。

图4图示了所构建的AGP2基因盒以及在后续步骤中整合到酿酒酵母菌株的LEU2位点之后去除kanMX标记。通过PGK1启动子正向重复的重组，产生仅含有原始DNA序列的自克隆菌株来去除kanMX标记。

图5图示了所构建的GNP1基因盒以及在后续步骤中整合到酿酒酵母菌株的LEU2位点之后去除kanMX标记。通过PGK1启动子正向重复的重组，产生仅含有原始DNA序列的自克隆菌株来去除kanMX标记。

图6图示了所构建的AGP1基因盒以及在后续步骤中整合到酿酒酵母菌株的URA3位点之后去除kanMX标记。通过PGK1启动子正向重复的重组，产生仅含有原始DNA序列的自克隆菌株来去除kanMX标记。

图7图示了所构建的GAT1基因盒以及在后续步骤中整合到酿酒酵母菌株的LEU2位点之后去除kanMX标记。通过PGK1启动子正向重复的重组，产生仅含有原始DNA序列的自克隆菌株来去除kanMX标记。

图8图示了利用kanMX标记将自克隆的ure2Δ基因盒整合到酿酒酵母菌株的URE2位点，然后通过起正向重复作用的5’URE2侧接序列部分的重组来去除kanMX标记。所产生的转化将URE2基因从基因组缺失。

图9显示了所构建的pAC1的质粒图谱，所述pAC1用于克隆基因盒以整合到LEU2位点。

图10显示了pAC2的质粒图谱，所述pAC2用于克隆基因盒以整合到URA3位点。

图11显示了在使用商业面包酵母（BY）的面包面团中天冬酰胺的消耗，所述商业面包酵母过度表达基因ASP1或ASP3。

图12显示了在图11所列的试验中在时间点5h取出的经烘焙的面团样品中的丙烯酰胺浓度。

图13显示了在使用商业面包酵母（BY）的面包面团中天冬酰胺的消耗，所述商业面包酵母过度表达ASP3或GAP1和ASP3/GAP1组合。

图14显示了在使用实验酵母（LY）的面包面团中天冬酰胺的消耗，所述实验酵母中DAL80或者URE2基因被敲除。

图15显示了在图14所列的试验中在时间点5h取出的经烘焙的面团样品中的丙烯酰胺浓度。

图16显示了使用商业酵母（BY）在复合培养基中培养5小时后培养基中天冬酰胺的消耗，所述商业酵母过度表达AGP2或者AGP3。

图17显示了使用商业面包酵母（BY）在含有天冬酰胺和氨的合成培养基中天冬酰胺的消耗，所述商业面包酵母过度表达GAT1或者ASP3和GAT1/ASP3组合。

图18显示了使用商业面包酵母（BY）在含有天冬酰胺和氨的合成培养基中天冬酰胺的消耗，所述商业面包酵母过度表达GNP1。

图19显示了使用实验酵母（LY）在含有天冬酰胺和氨的合成培养基中天冬酰胺的消耗，所述实验酵母过度表达ASP3、或者TOR1敲除、和tor1Δ/ASP3组合。

图20显示了使用过度表达AGP1的商业面包酵母（BY）和GZF3敲除的实验酵母（LY）在含有天冬酰胺的合成培养基中培养5小时后天冬酰胺的消耗。

具体实施方式

本发明的发明人制备了消耗和/或降解天冬酰胺的能力增加的酵母菌株，天冬酰胺是在食品处理或制作过程产生的限制性前体，其导致产生丙烯酰胺。

微生物

在一种实施方式中，提供了微生物，所述微生物用至少一种核酸分子转化以在食品制作/加工条件下减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因。

另一种实施方式中，所述微生物用至少两种、至少3种、至少4种、至少5种或更多的核酸分子转化。

本文所用的短语“过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因”是指相对于没有用所述核酸分子转化的对照而言，转运到细胞膜或分泌到细胞壁和参与氨基酸天冬酰胺的转运和/或降解的mRNA或蛋白的表达增加了。

所述核酸分子可以是编码直接或间接参与天冬酰胺转运的蛋白和/或直接或间接参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的任何核酸分子。一种实施方式中，所述核酸分子编码细胞壁天冬酰胺酶或其具有天冬酰胺降解活性的片段。胞外天冬酰胺酶是本领域已知的酶，包括但不限于，来自任何来源的、能够将天冬酰胺转变为天冬氨酸的胞外诸如细胞壁天冬酰胺酶，例如酵母Asp3p，或其同源物，这些酶可以是由编码细胞壁天冬酰胺酶的任何天冬酰胺酶基因编码的，包括但不限于ASP3或其同源物。在一种实施方式中，细胞壁天冬酰胺酶是由SEQIDNO:2所示的核酸分子ASP3或其同源物或片段编码的，或包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列Asp3p或其同源物或片段。包含编码胞外天冬酰胺酶的核酸分子的微生物将能够在食品制作和加工条件下降解天冬酰胺。

另一种实施方式中，所述核酸分子编码能够将天冬酰胺转运到细胞中的氨基酸转运子或其片段。氨基酸转运子是本领域已知的，包括但不限于，来自任何来源的、能够主动地(actively)将天冬酰胺转运到微生物中的氨基酸转运子，例如酵母Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2p和Agp3p(NP_012965、NP_009905、NP_010796、NP_015058、NP_009690、和NP_116600)或其同源物，可由任何氨基酸转运子基因编码，包括但不限于，GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2和AGP3(SGD:S000001747、SGD:S000000530、SGD:S000002916、SGD:S000006186、SGD:S000000336和SGD:S000001839)或其同源物。因此，在一种实施方式中所述氨基酸转运子由分别如SEQIDNO:4、6、8、10、12或30所示的核酸分子GAP1、AGP3、AGP2、GNP1、AGP1或DIP5或其同源物或片段编码，或包含分别如SEQIDNO:3、5、7、9、11或29所示的氨基酸序列Gap1p、Agp3p、Agp2p、Gnp1p、Agp1p或Dip5p或其同源物或片段。包含编码氨基酸转运子的核酸分子的微生物将能够在食品制作和加工条件下消耗或摄取天冬酰胺。

另一种实施方式中，微生物用编码细胞壁天冬酰胺酶的核酸和编码氨基酸转运子的核酸转化。在这种实施方式中，所述微生物能够消耗和降解天冬酰胺。

本文所用的短语“减少”天冬酰胺转运/降解的“氮分解代谢产物抑制(NCR)”是指NCR-灵敏性基因的基因抑制的真正减少或指NCR-灵敏性基因的内源表达或外源表达的增加。例如，减少NCR的核酸分子可以是修饰氮分解代谢产物抑制的表达的调控因子，或者可以是NCR-灵敏性基因的过度表达。

仍然另一种实施方式中，所述核酸分子修饰氮分解代谢产物抑制的调控因子的活性。氮分解代谢产物抑制的调控因子是本领域已知的，包括但不限于，来自任何来源的调控因子，例如酵母SEQIDNO:13、15、17、19、21、33或31所示的Gat1p、Ure2p、Tor1p、Dal80p、Gzf3p、Tor2p或Gln3p或其同源物或片段，可由编码调控因子的任何基因编码，例如SEQIDNO:14、16、18、20、22、34或32所示的GAT1、URE2、TOR1、DAL80、GZF3、TOR2、或GLN3。例如，所产生的微生物中可以不再有功能性负调控子，诸如Ure2p、Tor1p、Tor2p、Dal80p或Gzf3p。这可通过例如以下途径实现：利用将野生型菌株与[URE3]菌株接合或通过任何分子生物学方法包括URE2的细胞质导入（cytoduction）和过度表达来诱导[URE3]表型，通过导致URE2基因缺失的核酸分子、ure2突变表型的分离和表达，使得其不再下调Gln3p和Gat1p的活性。细胞缺少功能性Ure2p的结果将导致NCR灵敏性基因例如参与天冬酰胺转运和利用的那些基因(即ASP3、AGP1、GAP1、GAT1、DAL80和GZF3)在良好氮源例如氨或谷氨酰胺的存在下不再受抑制。因此，在一种实施方式中，所述核酸分子包含URE2、TOR1、TOR2、DAL80和/或GZF3缺失基因盒。缺少功能性Ure2p、Tor1p、Dal80p和/或Gzf3p的微生物将能够在食品制作和加工条件下消耗和降解天冬酰胺。或者，这可通过造成功能性正调控子例如Gat1p和/或Gln3p的过度表达的核酸分子来实现。

本文所用术语“基因”与其通常含义相符，是指可操作性连接的一组核酸序列。在本发明公开的上下文中，基因修饰可包括基因中可操作性连接的多个序列中的任何一个的修饰。“可操作性连接”是指特定的序列直接或者间接地相互作用以执行他们预定的功能，例如基因表达的调节或调整。可操作性连接的序列的相互作用可以由例如转而与核酸序列相互作用的蛋白所调节。

本发明公开的多个基因和核酸序列可以是重组的序列。本文所用术语“重组的”是指已经过重组，从而与核酸构建物相关时，该术语指由核酸序列组成的分子，所述核酸序列在某些点经由分子生物学技术组合在一起或由分子生物学技术产生。术语“重组的”当与蛋白或多肽相关时，是指利用经由分子生物学技术产生的重组核酸构建物表达的蛋白或多肽分子。术语“重组的”当与基因组成相关时，是指配子或后代或细胞或基因组具有等位基因的新组合，这些新组合在自然存在的亲代基因组中是不存在的。重组的核酸构建物中包括的核苷酸序列可与、或经操作而与其在天然状态下不相连的那些核酸序列相连，或与天然状态下与其在不同的位点相连的那些核酸序列相连。因此，将某核酸构建物称为“重组的”时，则表示所述核酸分子已利用基因工程被人类干预操作。

可用例如Itakura等.U.S.Pat.No.4,598,049、Caruthers等.U.S.Pat.No.4,458,066、以及ItakuraU.S.Pat.Nos.4,401,796和4,373,071中公开的技术来化学合成核酸分子。由于“重组的”这一术语在本文的含义，这些合成的核酸从其本质来讲是“重组的”（是将分子的组成部分组合在一起的连续步骤的产物）。

序列之间的同源性程度（诸如天然的Asp3p、Gap1p、Dip5p、Gnp1p、Agp1p、Agp2p、Agp3p、Tor1p、Tor2p、Gat1p、Gln3p、Dal80p、Gzf3p或Ure2p氨基酸序列或天然的ASP3、GAP1、DIP5、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3、TOR1、TOR2、GAT1、GLN3、DAL80、GZF3或URE2核酸序列和同源物的序列）可表示为当这些序列进行最优比对时的同一性百分比，意思是序列之间完全匹配的发生率。可使用多种算法诸如Smith和Waterman的本地同源性算法,1981,Adv.Appl.Math2:482，Needleman和Wunsch的同源性比对算法,1970,J.Mol.Biol.48:443，Pearson和Lipman的搜索相似性算法，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444，以及这些算法的计算机执行(诸如WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,Madison,WI,U.S.A.)，来进行序列的最优比对以比较其同一性。也可使用Altschul等.,1990,J.Mol.Biol.215:403-10描述的BLAST算法来进行序列比对(利用所发表的缺省设置)。可通过国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，通过互联网http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得用于进行BLAST分析的软件。BLAST算法包括首先通过识别查询序列中的短的长度数据（shortwordsoflength）W来识别高分值序列对（HSPs），所述短的长度数据当与数据库序列中相同长度的数据比对时匹配或者满足某正阈值分数T。T表示相邻（neighbourhood）数据分数阈值。初始的相邻数据匹配作为种子来启动搜索以找到更长的HSPs。数据匹配沿每个序列在两个方向延伸，只要累积比对分值可得到增加。当满足以下参数时，停止各个方向的数据匹配延伸：累积比对数值从其可获得的最大值下降数量X；由于一个或多个负值残基比对的积累，累积分值达到零或更低；或者到达了两个序列之一的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序可使用以下缺省参数进行核酸的两条链的比较：数据长度(W)11，BLOSUM62分值矩阵x(Henikoff和Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)比对(B)50,期望值(E)10(在其他实施方式中可变为1或0.1或0.01或0.001或0.0001；虽然E值高出0.1很多可能不能识别功能性类似的序列，但是对于具有类似性的短区域，其可用于检测显著性低的匹配，E值介于0.1和10)，M=5,N=4。对于蛋白比较，可使用BLASTP，缺省参数如下：G=11(打开缺口的成本);E=1(延伸缺口的成本);E=10(期望值，在该设置中，在与正在搜索的数据库同样大小的数据库中，预期有10个分值相当于或好于所规定的比对分值S的匹配偶然发生；可增加或减少E值以改变搜索的严格性)；W=3（数据大小，BLASTN缺省的是11，对于其他比对程序是3）。BLOSUM矩阵为比对中的每个位置分配概率分值，该分值是基于在相关蛋白的共有节段（blocks）中已知的替代发生频率。BLAST2.0缺省使用BLOSUM62（缺口存在成本=11;每残基缺口成本=1;λ比率=0.85）替代矩阵。有多种其他矩阵可替代BLOSUM62使用，包括：PAM30(9,1,0.87);PAM70(10,1,0.87)BLOSUM80(10,1,0.87);BLOSUM62(11,1,0.82)和BLOSUM45(14,2,0.87)。使用BLAST算法时，两个序列之间的统计学相似性的衡量方式之一是最小总体概率(P(N))，其指示了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率。可选的实施方式中，在测试序列的比较中如果最小总体概率小于约1，小于约0.1，小于约0.01，或小于约0.001，则认为核苷酸序列或氨基酸序列是基本上相同的。还可用同一性百分数来表示序列间的相似性。

在某些实施方式中，本文所述的核酸和蛋白序列可以是基本上相同的，例如与Asp3p、Gap1p、Gnp1p、Agp1p、Agp2p、Agp3p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dip5p、Gln3p、Dal80p、Gzf3p、或Ure2p氨基酸序列或ASP3、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3、TOR1、TOR2、DIP5、GLN3、GAT1、DAL80、GZF3或URE2核酸序列基本上相同。这些序列之间的基本上相同性可反映在当最优化比对时它们之间的同一性百分数中，例如同一性百分数大于50%，80%-100%，至少80%，至少90%或至少95%，在基因靶向底物（genetargetingsubstrates）中可以指基因靶向底物的一部分与靶向序列的一部分之间的同一性性，其中同一性性程度可有利于同源性配对和重组和/或修复。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个序列在中度严格或高度严格条件下杂交。中度严格条件下与膜结合的序列杂交可例如在在65℃下在0.5MNaHPO4,7%十二烷基硫酸钠(SDS),1mMEDTA中进行，在42℃在0.2xSSC/0.1%SDS中洗涤(参见Ausubel,等.(eds),1989,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,GreenPublishingAssociates,Inc.,以及JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,p.2.10.3)。或者，高度严格条件下与膜结合的序列杂交可例如在65℃在0.5MNaHPO4,7%SDS,1mMEDTA中进行，在68℃在0.1xSSC/0.1%SDS中洗涤(参见Ausubel,等.(eds),1989,如上)。可根据目标序列按照已知方法改变杂交条件(参见Tijssen,1993,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",Elsevier,NewYork)。一般而言，选择严格条件使其低于具体序列在规定的离子强度和pH下的热熔点约5℃。严格条件下的洗涤可以例如至少15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟或120分钟。

本领域公知，可在多肽诸如Asp3p、Gap1p、Gnp1p、Agp1p、Agp2p、Agp3p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dip5p、Gln3p、Dal80p、Gzf3p、或Ure2p的结构中进行一些修饰和改变而不实质性改变该多肽的生物功能，从而获得生物学等同性多肽。一个方面，具有天冬酰胺转运活性的蛋白可包括通过保守性氨基酸替代而与天然的Gap1p、Gnp1p、Dip5p、Agp1p、Agp2p、Agp3p或其他氨基酸转运子序列不同的蛋白。类似地，具有天冬酰胺酶活性的蛋白可包括通过保守性氨基酸替代而与天然的Asp3p或其他细胞壁天冬酰胺酶序列不同的蛋白。如本文所用，术语“保守性或保守的氨基酸替代”是指在蛋白中的某给定位置将一种氨基酸替换为另一种，其中可以进行所述替代而不实质性丧失相关的活性。在进行这些改变时，可以在侧链取代基的相对相似性（例如它们的大小、电荷、疏水性、亲水性等）的基础上进行类似的氨基酸残基的替换，可用常规测试来检测这些替代对于蛋白功能的影响。

某些实施方式中，可进行保守性氨基酸替代，其中氨基酸残基被替换为具有相似亲水值（例如，在加或减2.0的数值范围内）的另一种残基，其中下述残基可能是疏水性指数约-1.6的氨基酸诸如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)被分配给氨基酸残基（如美国专利号4,554,10中所详述，该专利通过参考纳入本文）：Arg(+3.0);Lys(+3.0);Asp(+3.0);Glu(+3.0);Ser(+0.3);Asn(+0.2);Gln(+0.2);Gly(0);Pro(-0.5);Thr(-0.4);Ala(-0.5);His(-0.5);Cys(-1.0);Met(-1.3);Val(-1.5);Leu(-1.8);Ile(-1.8);Tyr(-2.3);Phe(-2.5);以及Trp(-3.4)。

可选的实施方式中，可进行保守性氨基酸替代，其中氨基酸残基被替换为具有相似亲水值（例如，在加或减2.0的数值范围内）的另一种残基。这些实施方式中，可在氨基酸残基的疏水性和电荷特性的基础上给各个氨基酸残基分配疏水性指数，如下：Ile(+4.5);Val(+4.2);Leu(+3.8);Phe(+2.8);Cys(+2.5);Met(+1.9);Ala(+1.8);Gly(-0.4);Thr(-0.7);Ser(-0.8);Trp(-0.9);Tyr(-1.3);Pro(-1.6);His(-3.2);Glu(-3.5);Gln(-3.5);Asp(-3.5);Asn(-3.5);Lys(-3.9);以及Arg(-4.5)。

可选的实施方式中，可进行保守性氨基酸替代，其中氨基酸残基被替换为同类中的另一种残基，其中氨基酸被分为几类：非极性、酸性、碱性和中性，如下：非极性：Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Pro,Met;酸性：Asp,Glu;碱性：Lys,Arg,His;中性：Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,Gln,Tyr。

可选的实施方式中，保守性氨基酸改变包括基于亲水性或疏水性、大小或体积、或电荷等考虑而进行的改变。氨基酸的一般特征为疏水性或亲水性，这主要是根据氨基酸侧链的特性。基于Eisenberg等.(J.Mol.Bio.179:125-142,184)的标准化共有疏水性范围，疏水性氨基酸表现出的疏水性大于零，亲水性氨基酸表现出的疏水性小于零。基因编码的疏水性氨基酸包括Gly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Met和Trp，基因编码的亲水性氨基酸包括Thr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、Ser和Lys。非基因编码的疏水性氨基酸包括叔丁基丙氨酸，而非基因编码的亲水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。

可以根据氨基酸的侧链的性质而将疏水性或亲水性氨基酸进一步细分。例如，芳香性氨基酸是侧链含有至少一个芳香环或杂芳香环的疏水性氨基酸，所述芳香环或杂芳香环可含有一个或多个取代基诸如–OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中R是独立的(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代的(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元杂芳基、取代的5-20元杂芳基、6-26元烷杂芳基、取代的6-26元烷杂芳基。基因编码的芳香性氨基酸包括Phe、Tyr和Tryp。

非极性氨基酸是具有侧链的疏水性氨基酸，其侧链在生理pH时不带电荷，并且侧链的化学键中两个原子共有的电子对一般被两个原子各自平均占有（即侧链不是极性的）。基因编码的非极性氨基酸包括Gly、Leu、Val、Ile、Ala和Met。非极性氨基酸可被进一步分类为包括脂肪族氨基酸，其为具有脂肪烃侧链的疏水性氨基酸。基因编码的脂肪族氨基酸包括Ala、Leu、Val、和Ile。

极性氨基酸是具有在生理pH时不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但是所述侧链中的一个化学键中两个原子共有的电子对被两个原子中的一个更近地占有。基因编码的极性氨基酸包括Ser、Thr、Asn和Gln。

酸性氨基酸是侧链pKa值小于7的亲水性氨基酸。由于氢离子的丢失，酸性氨基酸通常具有在生理pH时带负电荷的侧链。基因编码的酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸是侧链pKa值大于7的亲水性氨基酸。由于与水合氢离子结合，碱性氨基酸通常具有在生理pH时带正电荷的侧链。基因编码的碱性氨基酸包括Arg、Lys和His。

本领域技术人员将理解上述分类不是绝对的，（一种）氨基酸可被分到多于一类中。此外，可根据氨基酸已知的行为和或基于特定分析方法的特征性化学、物理或生物性质将氨基酸分类，或者根据与之前已鉴定的氨基酸的比较将氨基酸分类。

所述微生物可以是适合加入到食品中的任何微生物，包括但不限于，真菌和/或细菌。本发明公开中可使用的真菌包括但不限于，黑曲霉（Aspergillusniger）、米曲霉（Aspergillusoryzae）、粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）、脉孢中间致癌变种（Neurosporaintermediavar.oncomensis）、卡门伯特青霉（Penicilliumcamemberti）、白地青霉（Penicilliumcandidum）、娄地青霉（Penicilliumroqueforti）、少孢根霉（Rhizopusoligosporus）、米根霉（Rhizopusoryzae）。另一种实施方式中，真菌是酵母，诸如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、贝酵母（Saccharomycesbayanus）、卡氏酵母（Saccharomycescarlsbergensis）、白色念珠菌（Candidaalbicans）、乳酒假丝酵母（Candidakefyr）、热带念珠菌（Candidatropicalis）、罗伦隐球酵母（Cryptococcuslaurentii）、新型隐球酵母（Cryptotoccousneoformans）、异常汉逊酵母（Hansenulaanomala）、多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromycesfragilis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）、乳酸克鲁维马克斯变种(Kluyveromycesmarxianusvarlactis)、毕赤酵母（Pichiapastoris）、深红酵母（Rhodotorularubra）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）、解脂耶氏酵母（Yarrowialipolyitca）或属于真菌界的任何菌株。从很多商业来源可获得酵母菌株，所述商业来源诸如LallemandInc.(加拿大)、ABMauri(澳大利亚)和Lesaffre(法国)。另一种实施方式中，细菌可以是任何细菌，包括欧文氏菌属（Erwiniasp.）、乳酸杆菌属（Lactobacillussp.）、乳球菌属（Lactococcussp.）、芽孢杆菌属（Bacillussp.）、小球菌属（Pediococcussp.）、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、短杆菌属（Brevibacteriumsp.）和明串珠菌属（Leuconostocsp.）。

一种实施方式中，微生物是灭活的，诸如灭活的酵母。本文所用术语“灭活的”是指仍然保持了它们的营养成分和其他性质的灭活的（inactive）、无活力的（inviable）和/或死的微生物的组合物。例如，可以在允许所需的一种或多种蛋白过度表达的条件下培养酵母。然后可用此酵母产生灭活的酵母，例如，通过多种巴氏灭菌方法，包括但不限于高温和短时巴氏灭菌；多种灭菌方法，包括但不限于湿热和照射；多种灭活方法，包括但不限于高压、光催化和脉冲光、光敏化、电场包括RF和脉冲电场、细胞破碎、超声、均质化、自溶和基于化学的灭活，包括但不限于甲醛、硫柳汞、氯胺、二氧化氯、碘、银、铜、抗生素和臭氧。

可例如通过转化将重组的核酸构建物导入微生物宿主细胞中。这些重组的核酸构建物可包括衍生自相同的宿主细胞物种的序列或者衍生自不同的宿主细胞物种的序列，所述序列被分离并重新导入到宿主物种的细胞中。

由于宿主细胞的原始转化，也可能由于后续的重组和/或修复事件，重组核酸序列可整合到宿主细胞基因组中。或者，重组序列可保持为染色体外元素。可以例如用有机体诸如转化的酵母菌株来复制这些序列，所述转化的酵母菌株作为起始菌株进行菌株改良程序（通过突变、群体配种或原生质体融合来实现）。考虑到“重组的”这一术语在本文中的应用，所产生的保留了本发明重组序列的菌株本身被认为是“重组的”。

转化是这样一种过程：由于一种或多种外源核酸整合到细胞中，细胞所携带的遗传物质被改变了。例如，可利用多种方法转化酵母(Gietz等.,1995)。这种转化可能是通过将外源核酸整合到细胞的遗传物质中而发生的，或者是通过由于细胞暴露于外源核酸而造成的细胞内源遗传物质改变而发生。转化体或者转化的细胞是通过摄入了外源核酸而得到功能增强的细胞或细胞后代。当这些术语用于本文时，它们适用于转化的细胞的后代，其中在后续的细胞代中保留了所需的遗传改变，而不管后续细胞代的细胞中是否还存在其他突变或改变。

在一种实施方式中，可提供载体，该载体包含重组的核酸分子，所述分子具有天冬酰胺酶或氨基酸转运子或NCR正调控因子或突变的NCR负调控因子编码序列，或它们的同源物，所述分子处于调节多肽的调控性表达的异源启动子序列的控制下。为了提供这样的载体，可将开放阅读框（ORF），例如，来自宿主微生物的开放阅读框，插入到包含表达盒的质粒中，所述表达盒将调控重组基因的表达。或者，核酸分子可以是用于缺失NCR负调控因子的缺失盒。可将重组分子导入到所选的微生物中以提供具有改变的天冬酰胺转运和降解活性的转化的菌株。可选的实施方式中，还可通过用另一种启动子代替天然的启动子来实现宿主中天然的天冬酰胺酶或氨基酸转运子或NCR调节因子编码序列或同源物的表达。也可使用另外的调控元件来构建使用了内源编码序列的重组表达盒。重组基因或表达盒可整合到宿主的染色体DNA中。

在一种实施方式中，微生物被转化以在食品制作/加工条件下持续降解和/或摄取天冬酰胺。例如，核酸分子可操作性连接于组成型活性的启动子。本领域已知组成型活性启动子，包括但不限于PGK1启动子、TEF启动子、截短的HXT7启动子。或者，核酸分子可操作性连接于不受氮分解代谢产物抑制的影响的启动子，诸如ADH1、GAL1、CUP1、PYK1或CaMV35S。

本文所用术语“启动子”是指当转录调控区可操作性连接于目标序列时，能够以所需的空间或时间方式以及所需的程度调节或调整目标核苷酸序列转录的核苷酸序列。当转录调控区和目标序列功能性连接从而允许目标序列的转录受到转录调控区的调节或调控时，转录调控区和目标序列是“可操作地或可操作性连接的（"operablyoroperativelylinked）”。某些实施方式中，为了能够可操作地连接，转录调控区可与目标序列位于同一条链上。某些实施方式中，转录调控区可位于目标序列的5'。某些实施方式中，转录调控区可能直接就是目标序列的5'或者这些区域之间有介入序列。某些实施方式中，转录调控区可位于目标序列的3'。转录调控区和目标序列的可操作连接可能需要合适的分子（例如转录激活蛋白）连接到转录调控区，因此本发明公开涵盖了提供这些分子（体外或体内）的实施方式。

可使用的启动子包括但不限于，选自合适的天然酿酒酵母启动子的那些，例如PGK1启动子。这些启动子可以和另外的调控元件诸如PGK1终止子一起使用。可使用多种天然的或重组的启动子，其中选择或构建启动子以使其在所选条件诸如食品制作加工条件下调节天冬酰胺降解活性诸如Asp3p活性的表达。多种组成型启动子可例如可操作性连接于编码序列。

在一种实施方式中，核酸分子包含插入到LEU2位点的ASP3或GNP1，或AGP2，或AGP3,或GAT1基因盒(图1、3、4、5或7)。另一种实施方式中，核酸分子包含插入到URA3位点的GAP1或AGP1或ASP3基因盒（图1、2和6）。另一种实施方式中，核酸分子包含插入到URE2位点的ure2Δ基因盒(图8)。

方法

另一个方面，提供了一种在食品制作或加工过程中减少天冬酰胺的方法，包括在食品制作或加工条件下将本文所述微生物加入到食品中；其中所述微生物减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而减少食品中的天冬酰胺。本文还提供本文所述微生物的用途，即在食品制作或加工条件下减少天冬酰胺。

另一种实施方式中，提供一种在食品制作或加工过程中减少天冬酰胺的方法，包括

a)用至少一种核酸分子转化微生物以减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因；

b)在食品制作或加工条件下将微生物加入到食品中；

其中所述微生物减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而减少天冬酰胺。

天冬酰胺是食品制作或加工过程中产生丙烯酰胺的反应的限制性前体。因此，另一种实施方式中，提供一种减少食品中的丙烯酰胺的方法，包括在食品制作或加工条件下将本文所述微生物加入到食品中；其中所述微生物减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而减少食品中的丙烯酰胺。本文还提供本文所述微生物用于在食品制作或加工条件下减少丙烯酰胺浓度的用途。

另一种实施方式中，提供一种减少食品中的丙烯酰胺的方法，包括

a)用至少一种核酸分子转化微生物以减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因；

b)在食品制作或加工条件下将微生物加入到食品中；

其中所述微生物减少氮分解代谢产物抑制和/或过度表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而减少食品中的丙烯酰胺。

一种实施方式中，核酸分子编码如本文所述的细胞壁天冬酰胺酶并且在食品制作或加工条件下所述微生物表达例如，组成型表达所述天冬酰胺酶。另一种实施方式中，核酸分子编码如本文所述的氨基酸转运子并且在食品制作或加工条件下表达例如，组成型表达所述氨基酸转运子。另一种实施方式中，核酸分子既编码细胞壁天冬酰胺酶又编码氨基酸转运子。仍然另一种实施方式中，核酸修饰如本文所述的氮分解代谢产物抑制的调控因子并且在食品制作或加工条件下不表达调控因子，从而在良好氮源的存在下NCR-敏感性基因被表达。仍然另一种实施方式中，转化之后，在允许所需蛋白过度表达的条件下培养微生物，然后将微生物灭活并处理以在食品制作或加工条件下加入到食品中。这种实施方式中，灭活微生物中的蛋白具有天冬酰胺降解活性从而减少食品中的丙烯酰胺。

一种实施方式中，所述食品制作或加工条件包括发酵。例如，本文的方法和用途可用于在面包制作、马铃薯加工、饼干生产、咖啡生产、或零食制作期间食品（包括但不限于碳水化合物）的发酵。

另一种实施方式中，本发明公开提供一种方法，该方法用于选择发酵有机体的天然突变体，该突变体在食品制作和加工条件下具有所需的天冬酰胺降解活性水平。例如，可选择缺少氨基酸转运子或细胞壁天冬酰胺酶的NCR的菌株，所述氨基酸转运子或细胞壁天冬酰胺酶诸如P3、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3、TOR1、TOR2、DIP5、GLN3、GAT1、DAL80、GZF3或URE2。对于酵母突变和选择方法的实例，参见2000年10月31日授予Mortimer等的美国专利No.6,140,108，通过参考纳入本文。这些方法中，可用诱变剂诸如甲基磺酸乙酯、亚硝酸或羟胺处理酵母菌株，所述诱变剂产生具有碱基对替代的突变体。可通过例如涂布在合适的培养基上来筛选具有改变的天冬酰胺降解活性的突变体。

另一种实施方式中，可用定点突变来改变宿主中天冬酰胺转运或天冬酰胺降解活性的水平。例如，可用定点突变从启动子诸如酵母AGP1、ASP3、GAP1、DIP5、GAT1、TOR2、DAL80或GZF3q启动子中去除NCR调节元件。例如，可缺失或通过替代修饰天然的AGP1、ASP3、GAP1、DIP5、GAT1、TOR2、DAL80或GZF3启动子序列（如SEQIDNOS:23-28、35和36分别所示）中的GATAA(G)盒。例如一种实施方式中，可通过用T替代G来修饰一个或所有的GATAA盒，从而该序列变为TATAA。定点突变的方法例如公开于：Rothstein,1991;Simon和Moore,1987;Winzeler等,1999;以及Negritto等,1997。然后可将所选的或者经工程化的缺少NCR的启动子可操作性连接于天冬酰胺酶或氨基酸转运子编码序列，以调节在食品制作和加工条件下蛋白的表达。可选的实施方式中，还可使编码Gln3p、Gat1p、Ure2p、Tor1/2p、Dal80p或Gzf3p（调节酿酒酵母中的NCR）的基因突变来调整NCR。

微生物菌株的相对天冬酰胺转运或降解酶活性可相对于未转化的亲代菌株来测量。例如，可选择在食品制作和加工条件下比亲代菌株具有更大的天冬酰胺转运或降解活性的转化菌株，或者在相同的发酵条件下其活性高出亲代菌株活性一定的比例，例如至少是亲代菌株活性的150%、200%、250%、300%、400%或500%。类似地，本发明公开中的重组核酸表达的或编码的酶的活性可相对于非重组序列（所述重组核酸衍生自该非重组序列）来测定，使用类似的活性倍数。

在本文所述的方法和用途的实施方式中，微生物是适于加入到食品中的任何活的或灭活的微生物，包括但不限于，真菌和/或细菌。如本文所述，可用于本发明方法和用途的真菌包括但不限于，黑曲霉、米曲霉、粗糙脉孢菌、脉孢中间致癌变种、卡门伯特青霉、白地青霉、娄地青霉、少孢根霉、米根霉。另一种实施方式中，真菌是酵母，诸如酿酒酵母、贝酵母、卡氏酵母、白色念珠菌、乳酒假丝酵母、热带念珠菌、罗伦隐球酵母、新型隐球酵母、异常汉逊酵母、多型汉逊酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸克鲁维马克斯变种、毕赤酵母、深红酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母或属于真菌界的任何菌株。细菌可以是任何细菌，包括欧文氏菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、小球菌属、假单胞菌属、短杆菌属和明串珠菌属。

食品

另一方面，本发明公开提供了利用本文所述的转化的微生物生产的具有减少的丙烯酰胺浓度的食品。

另一种实施方式中，本发明公开提供了用本文所述的方法生产的具有减少的丙烯酰胺浓度的食品。

所述食品可以是在其制作或加工条件下产生天冬酰胺并最终产生丙烯酰胺的任何食品。导致产生丙烯酰胺的典型的制作和加工条件包括使用高温（大于120℃）烹调来制作食品，包括但不限于，煎炸和烘焙、烘烤、烤、烧烤、炖和烤。通常在马铃薯食品、烘焙食品和任何谷类或粮食食品中（也参见表1）可发现高浓度的丙烯酰胺。因此，一种实施方式中，食品是蔬菜诸如马铃薯、芋头、或橄榄食品、烘焙食品或任何谷物或谷类食品中。马铃薯食品包括但不限于薯条、薯片、煎炸/烘焙的马铃薯零食和制成的（formed）马铃薯食品。烘焙食品包括但不限于，饼干（biscuits）、曲奇（cookies）、脆饼（crackers）、面包、非发酵面包食品、黄油食品、玉米和面粉饼、油酥糕点（pastries）、馅饼皮、蛋糕和松饼粉、以及油酥糕点面团。例如，面包可包括但不限于，新鲜和冷冻的面包和面团、发酸面团、披萨面团、小圆面包和面包卷以及花色（variety）面包、和相关的面包食品诸如煎炸或烘焙的零食或面饼屑；油酥糕点可包括但不限于，甜的小圆面包、甜甜圈和蛋糕。谷类或粮食食品包括但不限于，典型的早餐谷类、啤酒麦芽和乳清食品、玉米片和咸脆饼干（pretzels）。其他经高温处理的食品包括但不限于咖啡、烤的坚果、烤的芦笋、啤酒、麦芽和乳清饮料、巧克力粉、鱼类食品、肉类和禽肉食品、洋葱汤和浸蘸混合料、坚果酱、裹衣花生、烤的豆类、烤的葵花籽、煎炸或烘焙的食品诸如沙拉三明治（falafels）和kobbeh、以及巧克力条。

以上公开内容大致描述了本发明公开。通过参考以下具体实施例将能够更完整地理解本发明。所述的这些实施例仅用于阐释的目的，并非用于限制本发明公开的范围。情况建议或者需要时可考虑形式的变化和等同替代。虽然本文使用了具体的术语，但这些术语仅用于描述的目的并非用于限制的目的。

以下非限制性实施例解释了本发明公开：

实施例

实施例1：在酿酒酵母菌株中克隆和组成型表达ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3和GAT1基因以及缺失URE2、TOR1、DAL80、和GZF3

对于克隆选择，使用了抗生素抗性标记kanMX。转化工业化/商业化的面包酵母或实验菌株使其组成型表达ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3或GAT1，或ASP3和GAP1的组合或ASP3和GAT1的组合，或缺失URE2、TOR1、DAL80或GZF3基因或具有tor1Δ和ASP3过度表达的组合。仅有的基因和代谢修饰是预期以下组成型表达：ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3或GAT1，或ASP3和GAP1的组合或ASP3和GAT1的组合，或缺失URE2、TOR1、DAL80和GZF3基因或具有tor1Δ和ASP3过度表达的组合。

实施例2：用ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3或GAT1基因盒或URE2缺失基因盒转化酵母

用含有ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3或GAT1基因的重组核酸转化酵母，所述基因处于PGK1启动子和终止子信号的控制下。PGK1启动子不受NCR的影响。URE2缺失盒含有5’和3’URE2侧接序列用于靶基因缺失。

实施例3：允许除去可选择标记的自克隆基因盒

图1-8显示了所设计的基因盒如何允许转化的酵母的选择以及后续通过如下文所述的实施例中使用的正向重复去除抗生素抗性标记。如其他实施例所示的，以类似方式构建了ASP1自克隆基因盒，并将其转化和去除抗生素抗性标记。

实施例4：利用自克隆酵母研究天冬酰胺和丙烯酰胺的减少，以确定发生丙烯酰胺减少和限制性的前体天冬酰胺

图11-20显示了用ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3或GAT1或ASP3和GAP1的组合或ASP3和GAT1的组合转化的酵母中或具有URE2、TOR1、DAL80、或GZF3基因的缺失或具有tor1Δ和ASP3过度表达的组合的酵母中天冬酰胺和/或丙烯酰胺的显著减少。图11还清楚地显示了，与ASP3（编码细胞壁相关的天冬酰胺酶）的过度表达比较而言，细胞质ASP1的过度表达没有效果。

在面包面团中测试了某些转化的菌株诸如ASP3、GAP1/ASP3和ure2Δ(图11、13和14)。在两个独立的发酵罐中同时培养转化的酵母菌株和商业面包酵母对照菌株，第二天收获细胞用于面团试验。将天冬酰胺加入到面团中以使用酶学分析监测天冬酰胺的消耗。转化的酵母一混合到面团中就观察到天冬酰胺水平立即开始降低；相反，使用对照菌株未检测到天冬酰胺有明显的下降。面团形成之后，定期从加入了酵母的面团中取样以测试天冬酰胺浓度。有些实验中取出的面团（含有较高水平的天冬酰胺）还用于制作烘焙的样品以测定最终的面包产品中丙烯酰胺的浓度。图12和14中显示了该实验的丙烯酰胺结果，表明转化的酵母菌株比对照酵母样品更显著地减少了丙烯酰胺。该结果与面团分析中所发现的天冬酰胺减少一致。

还在液体培养基中测试了转化的酵母以模拟工业化加工条件，其中酵母的环境条件可能具有较高的水分含量（即马铃薯、谷类和咖啡的生产）。将每个菌株的相同细胞数目的细胞接种到独立的试管中，试管中含有复合培养基或合成的实验培养基并且含有不同水平的天冬酰胺。定期取样用酶学试剂盒或通过LC-MS/MS测定天冬酰胺浓度。图16-20显示了转化的酵母菌株具有增强的天冬酰胺降解。

为了减少食品中的丙烯酰胺，生产商面临着改变他们的加工和/或产品参数而不影响其产品的味道、质感和外观这一挑战。作为例子，我们用转化的酵母和商业面包酵母对照制作了多种面包。最终产品显示没有颜色、尺寸或质感上的差别。重要的是，不要求在烘焙工艺中有改变即可实现面包中形成的丙烯酰胺的这些显著的减少。

上述实施例使用的实验程序

1.pAC1-ASP3、pAC1-AGP1、pAC1-AGP3、pAC1-GNP1和pAC1-GAT1的构建

为了将ASP3、AGP1、GNP1和GAT1置于组成型PGK1启动子和终止子信号的控制下，将每个ORF克隆入pAC1(图9)。从酿酒酵母基因组DNA扩增从起始密码子到终止密码子各ORF，所用的引物含有置入其5’末端的Mlu1和Bmt1限制性酶切位点。

PCR之后，跑0.8%的琼脂糖胶，回收纯化PCR(Qiagen,USA—PCR纯化试剂盒)，PCR产物（插入物）和pAC1（载体）均用Mlu1和Bmt1(Fermentas,加拿大)消化。用rAPiD碱性磷酸酶(Roche,USA)处理经消化的载体以防止再环化，然后室温连接插入物和去磷酸化的载体(T4DNA连接酶—Roche,USA)；用连接混合物(2μL)转化DH5α^TM感受态细胞(Invitrogen,USA)，然后在补充有100μg/mL氨苄青霉素(Sigma-Aldrich,USA)的LB(Difco,USA)平板上培养。转化的克隆随机选择，从中收获质粒(Qiagen,USA–QIAprepSpinMiniprep试剂盒)，用Mlu1和Bmt1(Fermentas,加拿大)消化以鉴定带有大小正确的插入物的质粒；测序确证了插入物对应于AGP1、AGP3、GNP1或GAT1。

2.pAC2-GAP1,pAC2-AGP1和pAC2-ASP3的构建

为了将GAP1、AGP1和ASP3置于组成型PGK1启动子和终止子信号的控制下，将每个ORF克隆入pAC2(图10)。从酿酒酵母基因组DNA扩增每个ORF，从起始密码子到终止密码子，所用的引物含有置入其5’末端的Mlu1和Bmt1限制性酶切位点。

PCR之后，跑0.8%的琼脂糖胶，回收纯化PCR(Qiagen,USA–PCR纯化试剂盒)，PCR产物（插入物）和pAC1（载体）均用Mlu1和Bmt1(Fermentas,加拿大)消化。用rAPiD碱性磷酸酶(Roche,USA)处理经消化的载体以防止再环化，然后室温连接插入物和去磷酸化的载体(T4DNA连接酶–Roche,USA)；用连接混合物(2μL)转化DH5α^TM感受态细胞(Invitrogen,USA)，然后在补充有100μg/mL氨苄青霉素(Sigma-Aldrich,USA)的LB(Difco,USA)平板上培养。转化的克隆随机选择，从中收获质粒(Qiagen,USA–QIAprepSpinMiniprep试剂盒)，用Mlu1和Bmt1(Fermentas,加拿大)消化以鉴定带有大小正确的插入物的质粒；测序确证了插入物对应于GAP1、AGP1或ASP3。

3.ure2Δ基因盒的构建

DNA合成产生ure2Δ基因盒(MrGene,德国)。

4.将线性基因盒转化入酿酒酵母并筛选转化子

用Swa1(Fermentas,加拿大)将各个基因盒从合适的质粒上切下来，跑0.8%琼脂糖胶。从琼脂糖胶上切下预期大小的条带并回收(Qiagen,USA–胶回收试剂盒)。回收之后，纯化并定量，用500ng的线性基因盒转化酿酒酵母菌株。用醋酸锂/聚乙二醇/ssDNA方法转化酵母菌株。转化后，细胞在YEG中30℃恢复3小时，然后涂布在补充了500μg/mLG418(Sigma,USA)的YPD平板上。平板在30℃温育直至出现克隆。

5.将线性ure2Δ基因盒转化入酿酒酵母并选择转化子

用Pme1(Fermentas,加拿大)从pMrG-ure2Δ切下3149bp的ure2Δ基因盒，跑0.8%的琼脂糖胶。从琼脂糖胶上切下预期的3149bp条带，回收(Qiagen,USA–胶回收试剂盒)。回收之后，纯化并定量，用500ng的线性基因盒转化酿酒酵母菌株PDM。用醋酸锂/聚乙二醇/ssDNA方法转化酵母菌株。转化后，细胞在YEG中30℃恢复3小时，然后涂布在补充了500μg/mLG418(Sigma,USA)的YPD平板上。平板在30℃温育直至出现克隆。

还从商业来源获得了tor1Δ、dal80Δ、gzf3Δ和ure2Δ的缺失突变实验酵母菌株以完成某些测试。

6.天冬酰胺和丙烯酰胺减少的研究

用以下成分制备全麦面包面团：全麦面粉、活性小麦面筋（Vitalwheatgluten）、盐植物油、糖蜜、水和酵母（测试菌株或对照）。所用方法严格遵照“快速（notime）面团”方法的程序。在时间点5小时，还加热样品以获得丙烯酰胺数据（详见下文）。

1.将液氮杜瓦瓶在-30℃冷冻并填充液氮。

2.在250mL培养瓶中将L-天冬酰胺溶解在50-mL的过滤水中。

3.测定将要加到面团配方中的酵母（湿或干）的水分/固体含量。

4.算出酵母的量，并在200-mL的Falcon锥形管中量出。

5.将要加入到面团中的酵母所带入的水分含量计算在内，确定所需的RO水量。在盘天平上量出所需重量的RO水。

6.用所有的RO水的2/3重悬合适量的酵母(30℃)。用剩余的1/3洗涤。

7.测定混合碗的重量。

8.称出干组分（面粉、面筋和盐）并置于KitchenAid混合碗中。用叶片搅拌干组分20-30秒。替换连接到钩子上的叶片。

9.将量取好的植物油和糖蜜以及L-天冬酰胺溶液加到混合碗中。以速度2混合直至面团达到均一的稠度。

10.设置定时器10分钟。

11.将酵母悬浮液加到混合的面团中。马上计时并以速度2混合。

酵母加入的时间：

12.用剩余的水洗涤Falcon管并将洗涤物加入到混合碗中。

13.继续混合直至10分钟后定时器响。

14.记录(take)混合碗+面团的最终重量:

15.马上将面团碾为～1.0cm厚度并用圆形曲奇切割器切割出合适数量的面团样品用于实验。快速取出1个面团样品并掰断，然后将液氮倒入研钵中以冷冻面团小块。此为“T=15min”样品。将冷冻的面团小块在带有标签的50-mLFalcon管中-80℃保存用于后续分析。

16.将剩余的面团样品置于烘焙纸上，30℃温育。

17.在所需的时间点取出用于实验的面团样品，分成小片并用液氮冷冻。将冷冻的面团小片在带有标签的50-mLFalcon管中-80℃保存。

18.对于某些实验，在T=5小时时，取出另一个曲奇，在400°F(204℃)烘焙20分钟，-80℃保存。

根据标准实验程序制备液体培养制品并加入不同量的天冬酰胺。将各个菌株的相同细胞数目的细胞接种在含有灭菌处理的培养基的独立试管中，定期取样，用酶学试剂盒(Megazyme,K-ASNAM)或通过LC-MS/M（下述）测定天冬酰胺浓度。

7.天冬酰胺和丙烯酰胺的定量

先前制备的面团样品在其制备时用液氮处理以中止其天冬酰胺酶活性。然后碾碎样品，-80摄氏度保存直至分析。用酶学分析方法(K-ASNAMMegazyme)来分析面团样品中的天冬酰胺，遵照该分析方法用于烘焙产品的提取程序但进行以下改动：快速称取均质化的面团样品(2g)并转移到100mL容量瓶中。加入约90mL80摄氏度的MilliQH₂O以防止酶学活性的任何再发生，样品在80摄氏度的水中温育20分钟。然后使样品在室温冷却，稀释到体积(dilutedtovolume)，将一等份离心下来(RT,4000xg,15min.)用于分析。用ELISA方法来分析实验室制备的烘焙样品中的丙烯酰胺。在研磨器中碾碎面包样品，该研磨器同时还保证了均质性。样品保存在-80摄氏度直至分析。称取2g的样品均质物，用水萃取30分钟。然后过滤样品，离心，然后固相萃取纯化，洗脱丙烯酰胺。然后用ELISA试验(Abraxis)分析萃取的分析物。

对于用LC-MS/MS分析天冬酰胺，用以下参数分析用液体培养基制备的细胞培养物样品。2x250mmAquasil柱(Thermo)，由12%MeOH和1mM甲酸铵组成的二元流动相，监测天冬酰胺离子转变133.0->74.0和133.0->87.0(MRM)。使用同位素标记的¹³C—丙烯酰胺(CambridgeIsotopeLaboratories)内标，使用浓度为0.01g/L，直接加入到澄清的细胞培养物上清液中。

虽然已参考目前认为是优选的实施例描述了本发明公开，但是应理解，本发明公开不限于所公开的实施例。相反，本发明公开意在涵盖包括在所附的权利要求的精神和范围内的各种改变和等同设置。

所有的出版物、专利和专利申请均通过参考而将其全部纳入本文，就如同具体地和独立地说明每个单独的出版物、专利或专利申请通过参考将其全部纳入本文一样。

表1：食物中丙烯酰胺浓度的FDA数据总结(U.S.FDA2004a,2004b)

表2：序列表

SEQID

参考文献:

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Claims (38)

1.酵母，所述酵母用以下至少两种核酸分子转化：a)以在食品制作/加工条件下减少氮分解代谢产物抑制的核酸分子；b)以在食品制作/加工条件下过表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因的核酸分子；和c)以在食品制作/加工条件下过表达编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因的核酸分子。

2.权利要求1的酵母，其中所述b)的核酸分子编码细胞壁天冬酰胺酶。

3.权利要求2的酵母，其中所述天冬酰胺酶由ASP3编码。

4.权利要求2的酵母，其中所述天冬酰胺酶是Asp3p。

5.权利要求1的酵母，其中所述c)的核酸分子编码氨基酸转运子。

6.权利要求5的酵母，其中所述氨基酸转运子由GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2或AGP3编码。

7.权利要求5的酵母，其中所述氨基酸转运子是Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2p或Agp3p。

8.权利要求1的酵母，其中所述a)的核酸分子修饰氮分解代谢产物抑制的调控因子的活性。

9.权利要求8的酵母，其中所述调控因子由URE2、GAT1、TOR1、TOR2、DAL80、GLN3或GZF3编码。

10.权利要求8的酵母，其中所述调控因子是Ure2p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dal80p、Gln3p或Gzf3p。

11.权利要求8的酵母，其中所述a)的核酸分子包含URE2缺失盒。

12.权利要求8的酵母，其中所述a)的核酸分子编码[URE3]。

13.权利要求1-12中任一项的酵母，其中所述酵母是灭活的。

14.权利要求1-12中任一项的酵母，其中所述酵母是酿酒酵母(S.cerevisiae)。

15.权利要求1-12中任一项的酵母，所述酵母被转化以在食品制作/加工条件下持续降解和/或摄取天冬酰胺。

16.权利要求1-12中任一项的酵母，其中所述核酸分子的至少一种可操作性连接于组成型活性启动子。

17.权利要求1-12中任一项的酵母，其中所述核酸分子的至少一种可操作性连接于不受氮分解代谢产物抑制的影响的启动子。

18.权利要求1的酵母，所述酵母用第一核酸分子和第二核酸分子转化，其中第一核酸分子编码Asp3p，第二核酸分子编码Gap1p或Gat1p。

19.在食品制作或加工过程中减少天冬酰胺的方法，包括在食品制作或加工条件下将权利要求1-18中任一项的酵母加入到食品中；其中所述酵母在食品制作或加工过程中减少氮分解代谢产物抑制和/或过表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而在食品制作或加工过程中减少天冬酰胺。

20.减少食品中的丙烯酰胺的方法，包括在食品制作或加工条件下将权利要求1-18中任一项的酵母加入到食品中；其中所述酵母在食品制作或加工过程中减少氮分解代谢产物抑制和/或过表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而减少食品中的丙烯酰胺。

21.在食品制作或加工过程中减少天冬酰胺的方法，包括

a)用以下至少两种核酸分子转化酵母：i)以减少氮分解代谢产物抑制的核酸分子；ii)以过表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因的核酸分子；和iii)以过表达编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因的核酸分子；

b)在食品制作或加工条件下将所述酵母加入到食品中；

其中所述酵母减少氮分解代谢产物抑制和/或过表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而在食品制作或加工过程中减少天冬酰胺。

22.减少食品中的丙烯酰胺的方法，包括

a)用以下至少两种核酸分子转化酵母：i)以减少氮分解代谢产物抑制的核酸分子；ii)以过表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因的核酸分子；和iii)以过表达编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因的核酸分子；

b)在食品制作或加工条件下将所述酵母加入到食品中；

其中所述酵母减少氮分解代谢产物抑制和/或过表达编码参与天冬酰胺降解的胞外蛋白的基因和/或编码参与天冬酰胺转运的蛋白的基因，从而减少食品中的丙烯酰胺。

23.权利要求21或22的方法，其中所述至少一种核酸分子编码细胞壁天冬酰胺酶。

24.权利要求23的方法，其中所述天冬酰胺酶由ASP3编码。

25.权利要求23的方法，其中所述天冬酰胺酶是Asp3p。

26.权利要求21或22的方法，其中所述iii)的核酸分子编码氨基酸转运子。

27.权利要求26的方法，其中所述氨基酸转运子由GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2或AGP3编码。

28.权利要求26的方法，其中所述氨基酸转运子是Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2p或Agp3p。

29.权利要求21或22的方法，其中所述i)的核酸编码蛋白质，所述蛋白质修饰所述酵母中氮分解代谢产物抑制的调控因子的活性。

30.权利要求29的方法，其中所述调控因子由URE2、GAT1、TOR1、TOR2、DAL80、GLN3或GZF3编码。

31.权利要求29的方法，其中所述调控因子是Ure2p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dal80p、Gln3p或Gzf3p。

32.权利要求29的方法，其中所述i)的核酸包含URE2缺失盒。

33.权利要求21或22的方法，其中所述酵母是无活性的。

34.权利要求33的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。

35.权利要求21或22的方法，其中所述核酸分子的至少一种可操作性连接于组成型活性启动子。

36.权利要求21或22的方法，其中所述核酸分子的至少一种可操作性连接于不受氮分解代谢产物抑制的影响的启动子。

37.权利要求21或22的方法，其中所述食品是基于蔬菜的食品、饮料、烘焙食品、谷物食品、水果制品、豆类制品、奶制品或肉制品。

38.权利要求1-18中任一项的转化的酵母在产生具有降低的丙烯酰胺浓度的食品中的用途。