JP6002745B2 - 細胞において多能性を誘導する方法 - Google Patents
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Description
本願は、2008年10月9日付けで出願された米国仮特許出願第61/104,231号(その内容全体が参照により援用される)の利益を主張するものである。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV
LSSHSPGSGSSTTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS
APDNKPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
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APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTS
ASGSASGSASTLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS
SVPPLTSSNHSTSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI
YKQGGFLGLSNIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS
VSDVPFPFSAQSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR
DTYHPMSEYPTYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号1)は、完全長MUC1受容体(ムチン1前駆体、Genbankアクセッション番号:P15941)を表す。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(配列番号2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTA(配列番号3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG(配列番号4)
配列番号2、配列番号3及び配列番号4は、MUC1受容体及び短縮アイソフォームを細胞膜表面に対して指向付ける(directing)N末端MUC−1シグナル伝達配列を表す。配列番号2、配列番号3及び配列番号4の変異体によって示されるように、C末端で最大3個のアミノ酸残基が欠けている場合がある。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(配列番号5)は、そのN末端にnat−PSMGFRを有し、完全長MUC1受容体の膜貫通配列及び細胞質配列を含む短縮MUC1受容体アイソフォームを表す。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号6)は、MUC1成長因子受容体の天然一次配列(「PSMGFR」の一例であるnat−PSMGFR)を表す。
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号7)は、配列番号6のN末端に単一のアミノ酸欠失を有する、MUC1成長因子受容体の天然一次配列(「PSMGFR」の一例であるnat−PSMGFR)を表す)。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号8)は、増進された安定性を有するMUC1成長因子受容体の天然一次配列の「SPY」機能的変異体(「PSMGFR」の一例であるvar−PSMGFR)を表す。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号9)は、配列番号8のC末端に単一のアミノ酸欠失を有する、増進された安定性を有するMUC1成長因子受容体の天然一次配列の「SPY」機能的変異体(「PSMGFR」の一例であるvar−PSMGFR)を表す)。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(配列番号10)は、MUC1細胞質ドメインのヌクレオチド配列を表す。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(配列番号11)は、MUC1細胞質ドメインのアミノ酸配列を表す。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(配列番号12)は、NME7のヌクレオチド配列(NME7:GENBANKアクセッション番号:AB209049)を表す。
IGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMY(配列番号13)は、NME7のアミノ酸配列(NME7:GENBANKアクセッション番号:AB209049)を表す。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(配列番号14)は、NM23−H1のヌクレオチド配列(NM23−H1:GENBANKアクセッション番号:AF487339)を表す。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(配列番号15)は、NM23−H1のアミノ酸配列(NM23−H1:GENBANKアクセッション番号:AF487339)を表す。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(配列番号16)は、NM23−H1 S120G突然変異体のヌクレオチド配列(NM23−H1:GENBANKアクセッション番号:AF487339)を表す。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(配列番号17)は、NM23−H1 S120G突然変異体のアミノ酸配列(NM23−H1:GENBANKアクセッション番号:AF487339)を表す。
atgtacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc agcaaacttc
ggggggcggcggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga aaaacagccc
ggaccgcgtcaagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc agcggcgcaa
gatggcccaggagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc tgggcgccga
gtggaaacttttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta agcggctgcg
agcgctgcacatgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga aaaccaagac
gctcatgaagaaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg gcggcaatag
catggcgagcggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc agcgcatgga
cagttacgcgcacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc aggaccagct
gggctacccgcagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc agcccatgca
ccgctacgacgtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga cctacatgaa
cggctcgcccacctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca tggctcttgg
ctccatgggttcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg ttacctcttc
ctcccactccagggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca gcatgtatct
ccccggcgccgaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt cccagcacta
ccagagcggcccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct cacacatgtg
a(配列番号18)は、配列番号1ヒトSOX2のヌクレオチド配列(SOX2:GENBANKアクセッション番号:NM_003106)を表す。
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPK
MHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGG
LLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQ
PMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSH
SRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM(配列番号19)は、ヒトSOX2のアミノ酸配列(SOX2:GENBANKアクセッション番号:NM_003106)を表す。
atggcgggacacctggcttcagattttgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctctgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactga(配列番号20)は、ヒトOCT4のヌクレオチド配列を表す。
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN(配列番号21)は、ヒトOCT4のアミノ酸配列を表す。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(配列番号22)は、NM23−H2のヌクレオチド配列(NM23−H2:GENBANKアクセッション番号:AK313448)を表す。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(配列番号23)は、NM23−H2のアミノ酸配列(NM23−H2:GENBANKアクセッション番号:AK313448)を表す。
atggctgtcagcgacgcgctgctcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaagacactgcgtcaagcaggtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttcccccagtgcttcccgccggcccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcgccggagccggtgcggcttgcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctggacctggactttattctctccaattcgctgacccatcctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtcagcctcctcttcgtcgtcgccgtcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatccgggccgggaacgacccgggcgtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtccgctccccctccgacggctcccttcaacctggcggacatcaacgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggccgagctcctgcggccagaattggacccggtgtacattccgccgcagcagccgcagccgccaggtggcgggctgatgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgctgagcgcccctggcagcgagtacggcagcccgtcggtcatcagcgtcacgaaaggcagccctgacggcagccacccggtggtggtggcgccctacaacggcgggccgccgcgcacgtgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggccaccggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtcttgaggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccatccccacccggggcccaattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccgccgctccattaccaagagctcatgccacccggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtgattacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcgaacccacacaggtgagaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagatgaactgaccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgaccgagcattttccaggtcggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttt(配列番号24)は、KLF4のヌクレオチド配列(KLF4:GENBANKアクセッション番号:AF022184)を表す。
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPAGPYDLAAATVATDLESAGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVTKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKR(配列番号25)は、KLF4のアミノ酸配列(KLF4:GENBANKアクセッション番号:AF022184)を表す。
atggatttttttcgggtagtggaaaaccagcagcctcccgcgacgatgcccctcaacgttagcttcaccaacaggaactatgacctcgactacgactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccagcagcagcagcagagcgagctgcagcccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgetgcccaccccgcccctgtcccctagccgccgctccgggctctgetcgccctcctacgttgcggtcacacccttctcccttcggggagacaacgacggcggtggcgggagcttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgctgggaggagacatggtgaaccagagtttcatctgcgacccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatccaggactgtatgtggagcggcttctcggccgccgccaagctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgcgcgcaaagacagcggcagcccgaaccccgcccgcggccacagcgtctgctccacctccagcttgtacctgcaggatctgagcgccgccgcctcagagtgcatcgacccctcggtggtcttcccctaccctctcaacgacagcagctcgcccaagtcctgcgcctcgcaagactccagcgccttctctccgtcctcggattctctgctctcctcgacggagtcctccccgcagggcagccccgagcccctggtgctccatgaggagacaccgcccaccaccagcagcgactctgaggaggaacaagaagatgaggaagaaatcgatgttgtttctgtggaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtcagagtctggatcaccttctgctggaggccacagcaaacctcctcacagcccactggtcctcaagaggtgccacgtctccacacatcagcacaactacgcagcgcctccctccactcggaaggactatcctgctgccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagcaacaaccgaaaatgcaccagccccaggtcctcggacaccgaggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttggagcgccagaggaggaacgagctaaaacggagcttttttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatgaaaaggcccccaaggtagttatccttaaaaaagccacagcatacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgttgcggaaacgacgagaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtgcg(配列番号26)は、c−Mycのヌクレオチド配列(c−Myc:GENBANKアクセッション番号:BC000917)を表す。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(配列番号27)は、c−Mycのアミノ酸配列(c−Myc:GENBANKアクセッション番号:BC000917)を表す。
atgggctccgtgtccaaccagcagtttgcaggtggctgcgccaaggcggcagaagaggcgcccgaggaggcgccggaggacgcggcccgggcggcggacgagcctcagctgctgcacggtgcgggcatctgtaagtggttcaacgtgcgcatggggttcggcttcctgtccatgaccgcccgcgccggggtcgcgctcgaccccccagtggatgtctttgtgcaccagagtaagctgcacatggaagggttccggagcttgaaggagggtgaggcagtggagttcacctttaagaagtcagccaagggtctggaatccatccgtgtcaccggacctggtggagtattctgtattgggagtgagaggcggccaaaaggaaagagcatgcagaagcgcagatcaaaaggagacaggtgctacaactgtggaggtctagatcatcatgccaaggaatgcaagctgccaccccagcccaagaagtgccacttctgccagagcatcagccatatggtagcctcatgtccgctgaaggcccagcagggccctagtgcacagggaaagccaacctactttcgagaggaagaagaagaaatccacagccctaccctgctcccggaggcacagaa(配列番号28)は、LIN28のヌクレオチド配列(LIN28:GENBANKアクセッション番号:AF521099)を表す。
MGSVSNQQFAGGCAKAAEEAPEEAPEDAARAADEPQLLHGAGICKWFNVRMGFGFLSMTARAGVALDPPVDVFVHQSKLHMEGFRSLKEGEAVEFTFKKSAKGLESIRVTGPGGVFCIGSERRPKGKSMQKRRSKGDRCYNCGGLDHHAKECKLPPQPKKCHFCQSISHMVASCPLKAQQGPSAQGKPTYFREEEEEIHSPTLLPEAQN(配列番号29)は、LIN28のアミノ酸配列(LIN28:GENBANKアクセッション番号:AF521099)を表す。
atgtctcccgccccaagaccctcccgttgtctcctgctccccctgctcacgctcggcaccgcgctcgcctccctcggctcggcccaaagcagcagcttcagccccgaagcctggctacagcaatatggctacctgcctcccggggacctacgtacccacacacagcgctcaccccagtcactctcagcggccatcgctgccatgcagaagttttacggcttgcaagtaacaggcaaagctgatgcagacaccatgaaggccatgaggcgcccccgatgtggtgttccagacaagtttggggctgagatcaaggccaatgttcgaaggaagcgctacgccatccagggtctcaaatggcaacataatgaaatcactttctgcatccagaattacacccccaaggtgggcgagtatgccacatacgaggccattcgcaaggcgttccgcgtgtgggagagtgccacaccactgcgcttccgcgaggtgccctatgcctacatccgtgagggccatgagaagcaggccgacatcatgatcttctttgccgagggcttccatggcgacagcacgcccttcgatggtgagggcggcttcctggcccatgcctacttcccaggccccaacattggaggagacacccactttgactctgccgagccttggactgtcaggaatgaggatctgaatggaaatgacatcttcctggtggctgtgcacgagctgggccatgccctggggctcgagcattccagtgacccctcggccatcatggcacccttttaccagtggatggacacggagaattttgtgctgcccgatgatgaccgccggggcatccagcaactttatgggggtgagtcagggttccccaccaagatgccccctcaacccaggactacctcccggccttctgttcctgataaacccaaaaaccccacctatgggcccaacatctgtgacgggaactttgacaccgtggccatgctccgaggggagatgtttgtcttcaaggagcgctggttctggcgggtgaggaataaccaagtgatggatggatacccaatgcccattggccagttctggcggggcctgcctgcgtccatcaacactgcctacgagaggaaggatggcaaattcgtcttcttcaaaggagacaagcattgggtgtttgatgaggcgtccctggaacctggctaccccaagcacattaaggagctgggccgagggctgcctaccgacaagattgatgctgctctcttctggatgcccaatggaaagacctacttcttccgtggaaacaagtactaccgtttcaacgaagagctcagggcagtggatagcgagtaccccaagaacatcaaagtctgggaagggatccctgagtctcccagagggtcattcatgggcagcgatgaagtcttcacttacttctacaaggggaacaaatactggaaattcaacaaccagaagctgaaggtagaaccgggctaccccaagtcagccctgagggactggatgggctgcccatcgggaggccggccggatgaggggactgaggaggagacggaggtgatcatcattgaggtggacgaggagggcggcggggcggtgagcgcggctgccgtggtgctgcccgtgctgctgctgctcctggtgctggcggtgggccttgcagtcttcttcttcagacgccatgggacccccaggcgactgctctactgccagcgttccctgctggacaaggtc(配列番号30)は、MMP14のヌクレオチド配列(MMP14:GENBANKアクセッション番号:BC064803)を表す。
MSPAPRPSRCLLLPLLTLGTALASLGSAQSSSFSPEAWLQQYGYLPPGDLRTHTQRSPQSLSAAIAAMQKFYGLQVTGKADADTMKAMRRPRCGVPDKFGAEIKANVRRKRYAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPPQPRTTSRPSVPDKPKNPTYGPNICDGNFDTVAMLRGEMFVFKERWFWRVRNNQVMDGYPMPIGQFWRGLPASINTAYERKDGKFVFFKGDKHWVFWEGIPESPRGSFMGSDEVFTYFYKGNKYWKFNNQKLKVEPGYPKSALRDWMGCPSGGRPDEGTEEETEVIIIEVDEEGGGAVSAAAVVLPVLLLLLVLAVGLAVFFFRRHGTPRRLLYCQRSLLDKV(配列番号31)は、MMP14のアミノ酸配列(MMP14:GENBANKアクセッション番号:BC064803)を表す。
atgatcttactcacattcagcactggaagacggttggatttcgtgcatcattcgggggtgtttttcttgcaaaccttgctttggattttatgtgctacagtctgcggaacggagcagtatttcaatgtggaggtttggttacaaaagtacggctaccttccaccgactgaccccagaatgtcagtgctgcgctctgcagagaccatgcagtctgccctagctgccatgcagcagttctatggcattaacatgacaggaaaagtggacagaaacacaattgactggatgaagaagccccgatgcggtgtacctgaccagacaagaggtagctccaaatttcatattcgtcgaaagcgatatgcattgacaggacagaaatggcagcacaagcacatcacttacagtataaagaacgtaactccaaaagtaggagaccctgagactcgtaaagctattcgccgtgcctttgatgtgtggcagaatgtaactcctctgacatttgaagaagttccctacagtgaattagaaaatggcaaacgtgatgtggatataaccattatttttgcatctggtttccatggggacagctctccctttgatggagagggaggatttttggcacatgcctacttccctggaccaggaattggaggagatacccattttgactcagatgagccatggacactaggaaatcctaatcatgatggaaatgacttatttcttgtagcagtccatgaactgggacatgctctgggattggagcattccaatgaccccactgccatcatggctccattttaccagtacatggaaacagacaacttcaaactacctaatgatgatttacagggcatccagaaaatatatggtccacctgacaagattcctccacctacaagacctctaccgacagtgcccccacaccgctctattcctccggctgacccaaggaaaaatgacaggccaaaacctcctcggcctccaaccggcagaccctcctatcccggagccaaacccaacatctgtgatgggaactttaacactctagctattcttcgtcgtgagatgtttgttttcaaggaccagtggttttggcgagtgagaaacaacagggtgatggatggatacccaatgcaaattacttacttctggcggggcttgcctcctagtatcgatgcagtttatgaaaatagcgacgggaattttgtgttctttaaaggtaacaaatattgggtgttcaaggatacaactcttcaacctggttaccctcatgacttgataacccttggaagtggaattccccctcatggtattgattcagccatttggtgggaggacgtcgggaaaacctatttcttcaagggagacagatattggagatatagtgaagaaatgaaaacaatggaccctggctatcccaagccaatcacagtctggaaagggatccctgaatctcctcagggagcatttgtacacaaagaaaatggctttacgtatttctacaaaggaaaggagtattggaaattcaacaaccagatactcaaggtagaacctggacatccaagatccatcctcaaggattttatgggctgtgatggaccaacagacagagttaaagaaggacacagcccaccagatgatgtagacattgtcatcaaactggacaacacagccagcactgtgaaagccatagctattgtcattccctgcatcttggccttatgcctccttgtattggtttacactgtgttccagttcaagaggaaaggaacaccccgccacatactgtactgtaaacgctctatgcaagagtgggtg(配列番号32)は、MMP16のヌクレオチド配列(MMP16:GENBANKアクセッション番号:AB009303)を表す。
MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILCATVCGTEQYFNVEVWLQKYGYLPPTDPRMSVLRSAETMQSALAAMQQFYGINMTGKVDRNTIDWMKKPRCGVPDQTRGSSKFHIRRKRYALTGQKWQHKHITYSIKNVTPKVGDPETRKAIRRAFDVWQNVTPLTFEEVPYSELENGKRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGFLAHAYFPGPGIGGDTHFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHSNDPTAIMAPFYQYMETDNFKLPNDDLQGIQKIYGPPDKIPPPTRPLPTVPPHRSIPPADPRKNDRPKPPRPPTGRPSYPGAKPNICDGNFNTLAILRREMFVFKDQWFWRVRNNRVMDGYPMQITYFWRGLPPSIDAVYENSDGNFVFFKGNKYWVFKDTTLQPGYPHDLITLGSGIPPHGIDSAIWWEDVGKTYFFKGDRYWRYSEEMKTMDPGYPKPITVWKGIPESPQGAFVHKENGFTYFYKGKEYWKFNNQILKVEPGHPRSILKDFMGCDGPTDRVKEGHSPPDDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVIPCILALCLLVLVYTVFQFKRKGTPRHILYCKRSMQEWV(配列番号33)は、MMP16のアミノ酸配列(MMP16:GENBANKアクセッション番号:AB009303)を表す。
体細胞をリプログラムして、多能性状態へと戻すことができることが最近発見された。転写因子OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、c−MYC及びLIN28をコードする遺伝子、又はタンパク質自体を体細胞に導入し、多能性状態へと戻すことができる。これらの多能性因子の多くは、以前は癌遺伝子であると考えられていた。c−Mycはよく知られた癌遺伝子であり、同様にKlf4は異形成を誘導することが示されている(非特許文献21)。OCT4は多能性幹細胞を同定する上で最も基準となるものとして同定されている。核内のOCT4の存在は細胞が多能性であることを示唆し、その欠如は細胞が分化過程に入っており、もはや任意の細胞型に分化可能でないことを示唆する。最近では、OCT4も同様に多くの癌細胞の核内に存在するが、正常な成熟細胞には存在しないことが知られるようになっている。本発明者らは、MUC1膜貫通タンパク質(配列番号1)の切断形態であるMUC1*が、固形腫瘍癌のおよそ75%で発現される強力な成長因子受容体であり(Raina et al., 2009)、多能性幹細胞上でもこの「腫瘍形成」形態で発現される(Hikita et al., 2008)ことを最近発見した。本発明は、MUC1*及びMUC1*関連因子、並びにそれらを多能性の誘導若しくは維持のため、又は多能性誘導の効率を増進するために利用する方法に関する。
MUC1*は、線維芽細胞のクローン性成長(コロニー拡大)を促進する。完全長MUC1(配列番号1)、MUC1* 1110(配列番号5)又は空ベクターをトランスフェクトした3Y1細胞の単一細胞クローンを、10%ウシ胎仔血清、ペニシリン/ストレプトマイシン及びG418(600μg/ml)を含有するDMEM培地中に、60mm皿当たり1000個の細胞でプレーティングした。細胞を9日間増殖させた後、4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定した。皿を水で洗浄した後、70%メタノール中1%クリスタルバイオレットで室温で20分間染色した。皿を水で3回洗浄し、室温で一晩乾燥させて、写真に撮った。図1Aから、吸収されるクリスタルバイオレットの量(細胞数の指標)は、MUC1*単一細胞クローン#3及び#44を増殖させる場合にはるかに高いことが示される。対照的に、完全長MUC1をトランスフェクトした細胞(単一細胞クローン#8及び#17)は、空ベクターをトランスフェクトした細胞に対して成長速度の増大を示さなかった。このことから、切断形態のMUC1*は成長及び/又は生存の利点を有するが、完全長タンパク質は有しないことが示される。
Fessler et al., 2009は、HERCEPTIN(登録商標)抵抗性細胞がTAXOL(登録商標)、ドキソルビシン及びシクロホスファミドに対しても抵抗性であることを報告している。報告されているように、これらの薬物抵抗性癌細胞はMUC1*を過剰発現することによって抵抗性を得る。以下の実験から、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFR部分を遮断することによって、癌細胞において獲得された薬物抵抗性が取り消されることが示された。親細胞(BT474)又は抵抗性細胞(BTRes1)を、96ウェルプレート(4ウェル/条件)において、10000細胞/ウェルの密度でプレーティングした。翌日、TAXOL(登録商標)(パクリタキセル、Sigma、T7191)の存在下又は非存在下で、細胞に抗MUC1* Fab、対照Fabを添加したか、又はFabを添加しなかった。2日後、細胞を50μlのトリプシン中に再懸濁し、トリパンブルーの存在下で計数した。細胞死率をトリパンブルー取り込み率として算出した。BT474細胞は、各々の条件下でTAXOL(登録商標)に応答して細胞死を起こし、BTRes1細胞はMUC1*抗体の存在下でのみ細胞死を起こした(図1B)。
MUC1*陽性ZR−75−30細胞(6000個/ウェル)、又は対照(MUC1陰性)HEK293細胞(4000個/ウェル)を、96ウェルプレートにプレーティングした。翌日、0時間の細胞数を数え、24時間又は48時間毎に種々の濃度の抗MUC1*抗体又はFabを低(0.1%)血清培地に添加した。数日間のインキュベーションの後、細胞をトリプシン中に再懸濁し、計数して、正規化成長率を算出した。ZR−75−30細胞の刺激は、リガンド誘導性成長刺激について実証されているように、釣鐘型曲線を示したが、HEK293細胞は示さなかった(図1C)。MUC1を標的とするsiRNA、又は対照siRNAを安定にトランスフェクトしたMUC1*陽性T47D乳癌細胞を用いた同様の実験では、成長の刺激は対照をトランスフェクトした細胞でしか起こらず、抗体の特異性がさらに実証される(図1D)。同一の結果が、MUC1*の天然リガンドであるNM23についても実証されている(図1E)。
結合を、Biacore3000装置及びBiaEvaluationソフトウェアを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定した。ヒスチジンタグ付きMUC1* 1110−ecd(配列番号5)又は無関係のペプチド(HHHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS(配列番号34))を、Mahantaet al. 2008に記載されるように、本発明者らの研究室で作製した5.7%NTA−Ni++ SAMでコートしたSPRチップの別個のフローチャネルに固定化した。精製したウシ又は組み換えヒトNM23の35μLのプラグを5uL/分という一定流量(flow stream)で注入し、センサーグラム(sensograms)を記録した。ウシ肝臓から精製したNM23(Sigma、N−2635)を、PBS単独で希釈した。親和性を、1:1ラングミュアモデルを用いて広範囲の濃度にわたって測定した。一次速度式ではこの系を適切に表すことができないため、実際の親和性は変わることがある(図1F)。
未分化(多能性)状態又は分化したばかりの状態のヒト胚性幹細胞を、免疫細胞化学(ICC)によって分析した。ヒト胚性幹細胞(hESC)を手で解離させ(dissected)、マトリゲルでプレコートした8ウェルチャンバースライド(Nunc)にプレーティングした。未分化細胞については、細胞をプレーティングの5日後〜7日後に固定した。分化細胞については、プレーティングの5日後〜7日後にbFGFを培養培地から除去して、細胞を14日間分化させた後、固定した。細胞はPBSで洗浄してから、0.1Mカコジル酸緩衝液中4%パラホルムアルデヒドで、4℃で15分間固定した。細胞を、PBS中1%BSA及び1%ロバ又はヤギ血清で1時間ブロッキングした。0.1%NP−40を細胞内抗原に対する抗体として使用した。一次抗体をブロッキングバッファー(block)で希釈し、細胞と共に4℃で1時間インキュベートした。以下のタンパク質に対する一次抗体を使用した:OCT4(Santa Cruz、Clone Clones H−134及びC−10、100倍希釈)、完全長MUC1(VU4H5、Santa Cruz Biotechnology、50倍希釈)、MUC1*(Minerva、250倍希釈)又はNM23(Santa Cruz、Clone NM301、100倍希釈))。細胞をPBSで5分間、3回洗浄した後、以下の二次抗体と共に30分間インキュベートした:AlexaFluor 488ヤギ抗ウサギIgG、AlexaFluor 555ヤギ抗マウスIgG、AlexaFluor 350ヤギ抗ウサギIgG(Invitrogen、200倍);ヤギ抗マウスIgM−TR(Santa Cruz、100倍)。細胞をPBSで5分間、3回洗浄した後、退色防止封入剤(anti-fade mounting medium)(Biomeda)を用いてカバースリップを載せた。5分間のDAPI染色(1μg/ml)によって核を可視化した。免疫染色した細胞を、OlympusのBX−51落射蛍光顕微鏡上で可視化した。これらの実験の結果から、MUC1*は未分化細胞(多能性幹細胞)の表面上に存在するが(図2A、図3B、図3C)、分化hESC上には存在しない(図2D)ことが示される。図3から、MUC1*のリガンドであるNM23はMUC1*と共局在化することが示される(図3A〜図3C)。MUC1*及びそのリガンドであるNM23は、多能性幹細胞(OCT4陽性細胞)上でしか発現されず、分化した細胞上では発現されない(図3C及び図3F)(DAPIによってOCT4陰性細胞の核が染色される)。
二価抗MUC1*を用いたMUC1*の刺激の多能性幹細胞に対する効果を決定するために、以下の実験を行った。結果から、MUC1*を二量化するリガンドの添加によって、多能性(OCT4陽性)幹細胞の成長が刺激され、フィーダー細胞、その抽出物又はbFGFの非存在下でのその成長も可能となることが示される。
ヒト胚性幹細胞(hESC)を手で解離させ、96ウェルプレートのマトリゲルコートウェル上で1.9×104細胞/ウェルの密度で増殖させた。培養培地は、30%Hs27馴化培地を添加したhESC培地及び4ng/mlのbFGFを含有していた。抗体を、二価抗MUC1*については1μg/ml、一価抗MUC1*については100μg/mlの最終濃度で添加した。実験は3連で(in triplicate)行った。抗体処理の41時間後、LIVE/DEAD生存率/細胞毒性キット(Molecular Probes)を用いて、製造業者の使用説明書に従って、生細胞及び死細胞を定量化した。Victor3Vプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて蛍光を測定した。図5の棒グラフから、二量化リガンド(抗MUC1*)を用いたMUC1*の刺激は、幹細胞成長を増進し、一方で抗MUC1* FabによりMUC1*の細胞外ドメインを遮断し、全幹細胞死をもたらすことが示される。
hESCをトリプシンで解離させ、マトリゲルでプレコートした8ウェルチャンバースライドに、8.2×104細胞/ウェルの細胞密度で播種した。培地を交換し、抗体又は野生型若しくは突然変異体NM23タンパク質を、抗MUC1*抗体については80ng/ml、野生型組み換えNM23若しくは突然変異体(S120G)NM23については1nMの最終濃度で、又は組み換えbFGFを「最小幹細胞培地」(フィーダー馴化培地を含まないhESC培地)中4ng/mlの最終濃度で一日おきに添加した。対照として、Hs27線維芽細胞からの30%馴化培地及び4ng/mlの組み換えbFGF(Peprotech、#100−18B)を含む最小幹細胞培地において、細胞を同様に増殖させた。この実験の結果から、MUC1*リガンドが、マトリゲル上のこれらの細胞の「正常」増殖培地である馴化培地+bFGFと比べて、最小培地における多能性コロニーの成長をより良く刺激することが示される。表1に結果を詳述する。
増殖条件 最初にコロニーが コロニー数 形態
現れた週
最小幹細胞増殖培地
NM23
1nM 2週目 2つのコロニー 説明A参照
NM23−
S120G
突然変異体
1nM 2週目 7つのコロニー 説明B参照
抗MUC1*
80ng/ml 2週目 5つのコロニー 説明C参照
bFGF
4ng/ml − 0 説明D参照
なし 2週目 2つのコロニー 説明E参照
対照 Hs27線維芽フィーダー細胞からの30%馴化培地
bFGF
4ng/ml 2週目 5 説明F参照
説明A:2つのウェルの一方において2つの大きな未分化のコロニー;3週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える;4週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明B:2つのウェルの一方において7つの大きな未分化のコロニー;3週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える;4週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明C:2つのウェルの一方において5つの大きな未分化のコロニー;3週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える;4週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明D:コロニーなし
説明E:2つの非常に小さな分化したコロニー
説明F:5つのほとんど分化したコロニー
抗MUC1*モノクローナルAbを、Alexa 555色素によってin vitroで標識し、MUC1*をトランスフェクトしたHCT−116細胞(MUC1陰性)(冷PBSで4℃で洗浄した)に4℃で結合させた。20分後、細胞を冷PBSで2回洗浄し、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定するか、又は予熱した(pre-warmed)増殖培地を用いてインキュベートした。40分後、細胞を洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで5分間固定した後、ブロッキングし、PBS中2.5%BSA、2.5%FBS及び0.1%NP−40で透過化処理した。抗EEA1抗体(Cell Signaling Technologies、2411S)及びAlexa 488(Invitrogen、200倍)を用いてエンドソームを染色した(図6)。
MUC1の細胞質ドメイン(MUC1−CD)に相当する、人工的に発現させたペプチドが核に移行することが科学文献において以前に報告されている(Huang, et al. 2005)。別の研究では、MUC1−CDがp53のプロモーター部位に結合することが報告されている(Wei, et al. 2007)。しかしながら、Wei, et al., 2007の報告では、この能力に関して、MUC1−CDがp53の転写を上方調節するか、又は下方制御するかは決定されていない。幹細胞性又は多能性を誘導又は維持するためには、p53を抑制するのが望ましい(Maimets, et al., 2008)。さらに、MUC1の細胞質ドメイン単独の強制発現は、MUC1のいかなる天然状態又は切断状態にも一致しない。したがって、本発明者らは、これが実際に核に移行する多能性のマーカーであるMUC1*であるか否かを決定しようとした。
小分子Nutlinは、p53とその天然阻害剤hDM2との間の相互作用を妨げることによってp53の活性を増大させる(Vassilev et al., 2004)。Nutlinによるp53活性の誘導は、ヒト胚性幹細胞の分化を推進する(Maimets, et al., 2008)。同様に、胚性幹細胞におけるp53の過剰発現は、おそらくはアポトーシスの誘導によってhESCの成長を阻害する(Maimets, et al., 2008)。p53欠損マウスでは、原発腫瘍の形成(establishment)が増進された(Zhou et al., 2000)。このため、p53活性を妨げることによって、iPS細胞株を樹立する効率が増大する。
c−Mycは多能性の誘導を増進することが示されている。NM23はc−mycの転写を誘導し(Dexheimer et al., 2009)、c−mycの必要性をなくす。NM23を、それをコードする核酸のトランスフェクションによって、又はタンパク質自体(細胞侵入を助けるポリアルギニントラクト等の配列で修飾してもよい)を外部から添加することによって、iPSへの変換が起きている細胞に導入する。NM23の野生型又は突然変異体(S120G)(二量体形態が好ましい)を、OCT4、SOX2及びKLF4をトランスフェクトした皮膚線維芽細胞に添加する。iPS細胞生成の効率が増進される。
多能性を誘導若しくは維持するか、又はiPSc形成の効率を向上させるか、又はOCT4、SOX2、KLF4から構成される多能性遺伝子セットの1つ又は複数を置き換えるために、MUC1*を細胞に導入する。MUC1*をコードする核酸を含有するDNA構築物を、上述の多能性遺伝子セット(又はそれらの遺伝子産物)の組み合わせと共に皮膚線維芽細胞にトランスフェクトする。iPSコロニー形成の効率を、生成された幹細胞の数を計数することによって決定する。さらに、細胞をOCT4、SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA 1−60、TRA 1−81、TRA 2−49/6E(アルカリホスファターゼ)及びNANOG等の多能性マーカーの免疫蛍光検出によって分析する。得られた細胞を核型安定性、及び3つの異なる生殖細胞系列(中胚葉、内胚葉及び外胚葉)に沿って分化する能力について評価する。これは、中胚葉検出についてはCD34又は平滑筋アクチン、内胚葉検出についてはGATA−4又はサイトケラチン19、外胚葉検出についてはネスチン又はβIIIチューブリン等といった生殖細胞系列特異的マーカーに対する抗体を用いた免疫蛍光検出によって決定する。MUC1*活性化リガンド、好ましくは抗MUC1*抗体又はNM23(NME)を任意で添加して、多能性の誘導又は維持をさらに増進する。
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