KR20170118253A - 암 세포의 역분화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포의 분화를 유도하는 적어도 하나의 조절 인자를 사용하여 암 환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 세포의 역분화{REPROGRAMMING CANCER CELLS}

본 발명은 암세포를 역분화하여 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

암 세포는 줄기 세포와 유사하다

MUC1은 모든 성인 상피 세포에서 발견되는 막 횡단 단백질이다. 그러나, 이의 발현패턴은 건강한 세포상에서 보다 암 세포 상에서 상이하다. 암세포 상에서는 상기 단백질은 전체 세포 표면에 균일하게 퍼지는 반면에, 건강한 세포 상에서는 꼭대기 테두리로 발현이 제한된다. 본 발명자들은 최근에 MUC1*로 명명한(일부 이전의 특허 출원에서는 MGFR로 기재되어 있음) MUC1의 막횡단 절단 생성물이 암포상에서 클래스 I 성장 인자 수용체로 기능한다는 것을 발견하였다. MUC1*의 작용 기작이 해명되었다. 즉, 본질적으로 프라이머리(Primary) 서열 PSMGFR(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (서열번호 l))로 구성된 잘려진 세포외 도메인의 리간드-유도 이성체화가 성장 및 생존 경로를 활성화시킨다. MUC1 절단은 벌크의 세포외 도메인과 리간드 결합 위치를 차폐하는 자가응집(self-aggregation) 도메인을 방출시킨다.

본 발명자들은 만능 줄기 세포 상에서 모든 MUC1이 성장 인자 수용체 형태, MUC1*로 절단되고, 줄기세포의 성장을 유도하는 성장 인자 수용체로서 작용한다는 것을 최근 발견하였다. 만능 줄기 세포상에서, MUC1*의 성장 인자 수용체 기능은 그들의 생존에 필요하다. 줄기 세포상에서 MUC1*의 세포외 도메인의 이량체화(dimerization)를 완전히 차단하는 것은 치명적이다. 그러나, 줄기 세포가 분화 과정을 시작하는 경우, MUC1의 절단이 크게 줄어든다. 사실, 새롭게 분화중인 줄기 세포는 본질적으로 오직 전체 길이의 MUC1만을 발현한다. 본 발명자들은 단백질의 MUC1* 형태가 성장 인자 수용체이며, 이의 활성화 만이 배아 줄기세포와 유도 만능 줄기세포 모두의 성장 및 생존에 필수적이고 충분하다는 것을 입증하였다.

암 세포 상에서 대부분의 MUC1은 MUC1*로 절단된다. 암 단계가 진행됨에 따라, 만능 줄기세포와 같은 암세포가 오로지 MUC1*으로 존재할때까지 MUC1* 비율이 증가한다. 암 줄기세포는 보통의 암세포에 비하여 보다 많은 MUC1*을 발현한다. 화학 요법 약물에 대한 저항성을 획득한 암 세포들은 MUC1*의 발현을 증가시키지만 MUC1-FL(전체 길이)의 발현은 증가시키지 않음으로써 이와 같이 행동한다. 만능 줄기세포는 MUC1*과 동시에 편재되는(co-localize) MUC1*의 활성화 NM23 (MNE-7, H1, 또는 H2)를 분비한다. NM23을 분비하는 암세포와 이량체를 우선적으로 형성하는 돌연변이들은 MUC1*-포지티브 세포를 구성적으로 활성화한다. MUC1* 혼자만의 형질감염(transfection) 만으로도 세포를 변환하는 데 충분하다.

성인 세포들은 만능( pluripotent ) 줄기 세포로 되돌리기 위해 역분화될 수 있다

최근에 성인 세포들이 만능 줄기 세포가 되도록 "역분화"될 수 있다는 것이 입증되었다. 이와 같은 역분화된 세포들을 자연 발생된 배아 줄기세포와 구별하기 위하여 새로운 형태의 역분화된 세포를 "유도 만능 세포(induced pluripotent cell)" 또는 IPS 세포라고 부른다. 첫 번째 iPS 세포는 4개 유전자로 세포를 형질도입하여 제조되었다. 한 그룹은 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc에 대한 유전자가 삽입된 반면에, 다른 그룹은 Oct4, Sox2, Nanog와 Lin28에 대한 유전자가 삽입되었다.

이와 같은 유전자 6개(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc Nanog와 Lin28) 모두는 이후 다른 유전자들의 전사를 조절하는 전사 인자들을 암호화한다. 이들 2개의 그룹 모두에 의해 사용되는 방법에 대해 공통인 유전자들은 Oct4, Sox2이고, Klf4가 Nanog의 발현을 유도하는 전사 인자이기 때문에 추정을 통해 Klf4/Nanog도 포함된다. 이후 연구를 통해 오직 3개의 유전자들, Oct4, Sox2 및 Klf4 또는 Nanog들만을 삽입함으로써 세포를 만능 세포로 유도할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 더욱 최근의 연구는 유전자 자체 보다는 이들이 암호화하는 단백질들을 첨가하여 이들 유전자중 일부를 교체할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 또 다른 연구에서는 Oct4 및 Sox2에 대한 유전자들이 형질도입되고, Nanog의 발현을 유도하는 화합물들이 만능성을 유도한다는 것을 발견하였다.

FGF는 마우스 줄기세포의 경로를 유발시키고, 인간 줄기세포를 미접촉(만능) 줄기세포 보다는 초기항원자극된(Primed) 줄기세포로 만든다

최근의 연구는 본 기술분야의 방법에 따라 배양된 인간 줄기세포가 진정하게 만능성을 갖는지 여부에 대한 질문을 해왔다. watershed research 기사에서, Jaenisch와 동료들은 초기항원자극이 없는 미접촉(naive) 용어를 사용한 진정한 만능 줄기세포 보다는 "초기항원자극된(Primed)" 인간 배아 줄기(ES) 세포를 기술하고 있다. 둘다 배반포 단계 배아에서 유래된 인간 배아 줄기(ES) 세포를 마우스 ES 세포와 비교하여, 연구자들은 인간의 ES 세포들이 형태학적으로 그리고 분자적으로 마우스 줄기 세포와 상이하다는 것을 발견하였다. 그들은 또한 지금까지 분리되었던 인간 ES 세포는 진정한 만능 세포가 아니며, 성장의 후반기 단계인 낭배외피(epiblast) 단계로부터 유래된 마우스 줄기세포를 더욱 닮았다는 것을 보고하였다. 이와 같은 발견들은 본 발명자들이 인간 만능 ES 세포가 진정한 만능 줄기세포가 아니라는 생각을 강력하게 주장하는 것이다. Jaenisch와 동료들은 미접촉(나이브) 줄기세포를 규명하는 분자 마커들과 초기항원자극된(프라임드) 줄기세포를 규명하는 마커들을 발현하였다.

연구자들은 LIF 및 글리코겐 합성효소 카이네이즈 3β(GSK3β)와 마이토젠-활성화 단백질 카이네이즈(MAP 카이네이즈 ERK1/2) 경로의 억제제와 결합된 Oct4, Klf4, 및 Klf2 인자들의 이소(ectopic) 유도를 통해서 일시적으로 인간 초기항원자극된 줄기세포를 미접촉 상태로 되돌리는 것을 가능하게 하였다. klf4와 Klf2 발현을 유도할 수 있는 단백질 카이네이즈 A 경로 길항제(agonist)인 Forskolin은 이소성 형질전환 유전자(transgene) 발현에 대한 요구를 일시적으로 대체하였다. 일단 인간 ES 세포가 미접촉 상태로 되돌려졌을 경우, 이들 세포들은 PD/CH/LIF/FK에서 에서 배양될 필요가 있었지만, 이들이 초기항원자극된 세포로 성숙되기 전에 수회 계대배양하는 동안 오직 미접촉 상태로 존재할 수 있었다. 이것은 연구자들이 만능 미접촉 상태에서 인간의 ES 세포를 촉진 및 유지시키는 성장 인자를 규명할 수 없었다는 강력한 증거이다.

기존의 인간 ES 세포와는 대조적으로, 이와 같은 후생학적으로 되돌려진 미접촉 줄기세포들은 이후부터 미접촉 마커들로 부르게될 Klf4, Klf2, Tbx3, Gbx2, Lin28 및 SOCS3의 발현과, 더욱 성숙한 초기항원자극된 상태에 대한 마커인 Otx2, Soxl7, Cerl, Foxa2, Zicl, Lhx2 및 XIST의 발현 손실을 얻었다. 또한, 일시적으로 미접촉 상태로 되돌려진 초기항원자극된 세포들은 콜로니(colony) 형태 보다는 시트(sheet) 형태로 성장하였다. 그러나 이와 같은 기존의 연구는 제조된 인간 줄기세포를 미접촉 줄기세포로 증식시키는 성장 경로 또는 성장 인자를 규명할 수 없었다. 추가로, 유전자의 이소성 발현 및 성장 인자들의 혼성을 이용하더라도 되돌려진 세포들이 짧은 기간동안 미접촉으로 남아있은 후 초기항원자극 세포로 진행하였다.

그러므로, 필요한 것은 배아 또는 유도 만능 상태로부터 수확된 후 인간 줄기세포를 직접 미접촉 줄기세포로 증식시키는 방법, 또는 초기항원자극 세포를 미접촉 상태로 변환한 후 이 상태를 연장된 시간동안 유지시키는 방법이다. 필요한 것은 초기항원자극된 세포를 미접촉 세포로 안정적으로 변환하는 방법이지만, 현재 방법은 세포들을 미접촉 상태로 일시적으로 유지시킬 수 밖에 없다. 또한, 이와 같이 기존에 보고되었던 초기항원자극된 줄기 세포들을 미접촉 상태로 전환하는 방법은 완전한 전환을 달성할 수 없다. 왜냐하면 연구자들은 미접촉 마커 대 초기항원자극된(프라임드) 마커의 발현에 있어서 증가와 감소만을 관찰한 것을 보고했기 때문이다. 필요한 것은 초기항원자극된 세포들을 미접촉 상태로 완전하게 전환하는 방법이며, 이들 세포들은 초기항원자극된 상태의 마커들을 발현하지 않는다. 그 결과, 인간 줄기세포의 효율적인 직접 분화를 위해 미접촉 줄기세포의 개시 스탁(starting stock)이 필요할 것이다.

암 치료를 위한 MicroRNAs의 사용은 큰 약속을 보유한다. 만능 줄기세포, 분화된 줄기세포 및 암세포들 간의 상이한 조절 성분들을 규명하는데 목적을 두었던 모든 과거의 연구들은 미접촉이 아닌 초기항원자극 인간 줄기 세포를 이용하여 수행되어, 인간 치료법의 기초로서 유효하지 않은 결과물을 제공하였다. 지금까지도, 분화를 유도하는 MicroRNAs를 규명해왔던 연구자들은 FGF와 마우스 피더 세포를 사용하여 증식된 줄기세포들을 사용하였으며, 새로운 연구들은 인간 세포들을 더이상 진정한 만능이 없는 초기항원인식 상태로 변환한다는 것을 나타내고 있다. 중요한 것은, FGF 및 마우스 성분들에 의해 프라임드 상태로 되는것이 억제된 인간 줄기세포를 사용하여 수행된 시험들은 인간 의료에 적용가능하지 않은 잘못된 정보를 산출할 수 있기 때문에 미접촉 인간 줄기세포를 사용하여 중요한 실험들을 수행하는 것이 필요하다는 것이다.

지금까지, 암들은 조직 기원, 암세포들이 과발현되는 분자 마커, 또는 암세포들을 과발현시키는 성장 인자 수용체에 따라 특징지워졌다. 그러나, 어떤 환자들이 주어진 치료에 반응하는지를 예상하기엔 충분하지 않으며, 또한, 대부분의 경우에 현재의 치료가 완전하게 암을 치료하기 위해 매우 좁게 포커스를 맞추다 보니, 궁극적으로 전이가 자주 발생하게 된다.

그러므로, 암세포의 성장 및 분화들을 조절하는 조절 인자들의 독특한 징표에 따라 암들을 카테고리화하는 방법을 개발하여, 각각의 암 아형을 역분화하는 치료를 개발할 필요가 있다. 또한, 특정 치료에 반응하는 환자들의 그룹들을 정확하게 예측 가능하도록 암 아형들을 분류하는 방법을 개발할 필요도 있다. 또한, 미접촉 인간 줄기세포을 성장 및 유지시켜 항암 치료를 위해 인간 줄기세포 및 암세포 성장 및 분화를 조절하는 조절 징표들을 정확히 규명하고 조작할 수 있는 방법을 개발할 필요도 있다.

본 발명은 앞서 언급한 문제들을 극복하고, 인간 미접촉 줄기세포를 성장 및 유지시키고, 중기세포의 성장과 분화를 조절하는 조절 네트워크에 따라 암을 카테고리화하는 방법 및, 이들의 성장 및 분화를 조절하는 네트워크를 역분화하거나 혼란스럽게하여 암을 치료하거나 암 발병 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 분화를 유도하는 조절 신호들을 전달하는 인자들을 환자 또는 암발생 위험이 있는 객체에게 투여하여 암을 억제 또는 예방한다. 또 다른 구현에서, 만능을 유도하는 조절 신호와 분화를 유도하는 조절신호로 구성된 각기 상이한 2개의 조절신호들을 전달하는 인자들을 환자 또는 암발생 위험이 있는 객체에게 투여하여 암을 억제 또는 예방한다. 또 다른 구현예에서, 2개의 상이한 아형을 갖는 암에서 우세한 인자들로서, 조절 신호들을 전달하는 적어도 2개의 인자들의 혼합물을 환자 또는 암발생 위험이 있는 객체에게 투여하여 암을 억제 또는 예방한다. 또 다른 구현예에서, 상이한 아형의 암에서 우세한 조절 신호들을 전달하는 인자들을 암환자에게 투여하여 암을 억제한다. 예를 들면, MUC1*-포지티브 암을 갖는 환자는 MUC1*-네거티브 암에서 우세한 조절 신호들을 전달하는 인자들로 치료 가능하다. 환자는 분화를 유도하는 조절 신호들을 전달하는 인자들로 추가로 치료 가능하다.

바람직한 일 구현예에서, MUC1*-포지티브 암들은 환자에게 MUC1*-네거티브 암의 microRNA 징표를 주입함으로써 치료 또는 예방된다.

또다른 바람직한 구현예에서, 유방암 및 전립선암은 환자에게 miR-145를 튜여함으로써 치료 또는 예방된다. 일 측면에서, 본 발명은 분화에서 주요한 miR-145 및 다른 microRNA, 및 선택적으로 MUC1*-네거티브 암에서 주요한 microRNA를 포함한 치료들을 고려하고 있다.

조절 신호들을 전달하는 인자들은 핵산, RNA, microRNA, 유전자 및 유전자 산물들이다. 조절 신호들을 전달하는 인자들은 microRNA, microRNA 클러스터, 유전자 또는 유도된 유전자 산물, 또는 microRNA를 침묵시키는 동일한 유전자 세트를 침묵시키기 위해 설계된 상보적 핵산들일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조절 신호들을 전달하는 인자들은 microRNA 및 microRNA 클러스터이다.

또 다른 구현예에서, 하나 이상의 암 형태로부터의 신호들이 암을 치료 또는 예방히기 위해 환자에게 투여된다.

일 측면에서, 본 발명은 (i) 적어도 2개의 조절 인자, 또는 (ii) 적어도 하나의 암 아형 징표에 대해 특이적인 적어도 2개의 조절 인자들의 발현을 유발시키는 제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 암 아형 징표는 환자를 괴롭히는 암의 암 아형 징표와 상이한, 암환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 조절 인자는 RNA, microRNA, 또는 단백질이다. 상기 적어도 하나의 암 아형 징표에 특이적인 적어도 2개의 조절 인자들의 발현을 유발시키는 제제는 소분자(small molecule)이다. 상기 microRNA는 microRNA-145일 수 있다. 상기 환자를 괴롭히는 암은 MUC1*-포지티브 암일 수 있으며, 상기 적어도 하나의 암 아형 징표에 특이적인 조절 인자들은 MUC1*-네거티브 암세포일 수 있다. 일 측면에서, 상기 암 아형 조절 인자의 암세포들은 환자의 암세포들과 공동배양될 수 없다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 (i) 적어도 2개의 조절 인자, 또는 (ii) 적어도 하나의 줄기세포 아형 징표에 대해 특이적인 적어도 2개의 조절 인자들의 발현을 유발시키는 제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 줄기세포 아형 징표는 새롭게 분화되고 있는 인간 줄기세포 또는 분화가 완료된 세포의 징표일 수 있다. 상기 줄기세포는 미접촉(초기항원자극이 없는) 세포일 수 있다. 상기 환자를 괴롭히는 암은 MUC1*-포지티브 암일 수 있으며, 상기 적어도 하나의 줄기세포 아형 징표에 특이적인 인자들은 새롭게 분화되고 있는 인간 줄기세포 또는 분화가 완료된 세포로부터 유래될 수 있다. 상기 줄기세포는 미접촉 줄기세포일 수 있다. 상기 조절 인자는 RNA, microRNA, 또는 단백질일 수 있다. 상기 microRNA는 microRNA-145일 수 있다. 상기 적어도 하나의 줄기세포 아형 징표에 특이적인 적어도 2개의 조절 인자들의 발현을 유발시키는 제제는 소분자이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 적어도 2개의 조절 인자, 또는 (ii) 적어도 하나의 증식 고조 징표(proliferation plateau signature)에 대해 특이적인 적어도 2개의 조절 인자들의 발현을 유발시키는 제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 조절 인자는 RNA, microRNA, 또는 단백질일 수 있다. 상기 microRNA는 microRNA-145일 수 있다. 상기 적어도 하나의 증식 고조 징표에 특이적인 적어도 2개의 조절 인자들의 발현을 유발시키는 제제는 소분자이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에서 암을 치료하기에 유용한 조절 인자를 규명하는 방법에 관한 것으로, 상기 규명 방법은 하기 단계를 포함한다:

(i) 인간 미접촉 만능 줄기 세포로부터 제1의 조절 인자의 분자 조성물을 수득하는 단계;

(ii) 단계 (i)의 미접촉 만능 줄기세포로부터 분화된 세포로부터 제2의 조절인자의 분자 조성물을 수득하는 단계;

(iii) 상기 제1 및 제2의 조절 인자의 분자 조성물 간의 조절 인자의 분자 조성물을 비교하는 단계;

(iv) 상기 제2의 조절 인자의 분자 조성물에서 현저하게 발현이 증가되는 조절 인자를 규명하는 단계;

(v) 환자를 괴롭히는 암 아형으로부터 제3의 조절 인자의 분자 조성물을 수득하는 단계;

(vi) (iv)에서 규명된 조절 인자들을 상기 제3의 조절인자의 분자 조성물과 비교하는 단계;

(vii) 환자의 암 아형에서 존재하지 않거나 현저하게 감소된 조절 인자를 규명하는 단계.

이와 같은 규명 방법에서, 조절 인자는 RNA, microRNA 또는 단백질일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암환자의 치료에 유용한 조절 인자를 규명하는 방법에 관한 것으로, 상기 규명 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(i) 암세포로부터 제1의 조절 인자의 분자 조성물을 수득하는 단계;

(ii) 새롭게 분화하고 있는 인간 줄기세포로부터 제2의 조절 인자의 분자 조성물을 수득하는 단계;

(iii) 상기 제1 및 제2의 조절 인자의 분자 조성물 간의 조절 인자의 분자 조성물을 비교하는 단계; 및

(iv) 상기 제2의 조절 인자의 분자 조성물에서 현저하게 발현이 증가되는 조절 인자를 규명하는 단계.

이와 같은 규명 방법에서, 상기 제1의 분자 조성물은 상기 환자의 암 아형으로부터 유래될 수 있다. 상기 조절 인자는 RNA, microRNA 또는 단백질이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상이한 암 아형의 성장을 유도하는 조절 인자를 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암환자의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 조절 인자는 상기 상이한 암 아형과 비교하여, 환자를 괴롭히는 암에서 존재하지 않거나 보다 낮은 수준으로 발현될 수 있다. 상기 조절 인자는 microRNA일 수 있다. 상기 조절 인자는 microRNA-145일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자에게 적어도 2개의 상이하고 암 아형 징표에 특이적인 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는 암환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 조절 인자들은 microRNA, 핵산, 단백질 또는 조절 인자들의 활성을 모방하는 소분자로부터 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자에게 적어도 2개의 별도의 microRNA를 투여하는 단계를 포함하되, 이중 하나의 microRNA는 분화를 유도하고, 나머지 microRNA는 만능(pluripotency)을 유도하는, 암환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자에게 적어도 2개의 상이한 microRNA, 또는 microRNA 클러스터(cluster)를 투여하는 단계를 포함하되, 각각의 microRNA 또는 microRNA 클러스터는 특이적인 아형의 암에서 주로 발현되는, 암환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 특이적인 암 아형은 MUC1*-포지티브 및 MUC1*-네거티브일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암환자에게 암환자의 암 아형과는 상이한 암 아형의 특징을 갖는 microRNA, 또는 microRNA 클러스터를 투여하는 단계를 포함하는, 암환자의 치료 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 객체에게 적어도 2개의 암 아형 징표의 조절 인자의 혼합물을 투여하는 단계를 포함하되, 각각의 암 아형 징표의 조절 인자는 상이한 암 아형을 특이적으로 식별하는, 객체의 암에 대한 예방접종 방법에 관한 것이다. 상기 조절 인자는 microRNA이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 MUC1* 성장 인자 수용체 경로를 활성화시키는 제제와 함께 배양하는 단계를 포함하는, Rho 카이네이즈(kinase) 억제제에 대한 요구 없이 만능 줄기세포를 증식시키는 방법에 관한 것이다. 상기 제제는 NM23이고, 주로 이량체(dimer) 형태로 존재할 수 있다. 상기 증식 방법은 인간 섬유아세포 피더층(feeder layer) 상에서 상기 만능 줄기세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 증식 방법은 층이 없는 형태의 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포 성분 상에서 상기 만능 줄기 세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 방법은 MUC1* 항체 표면 상에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 상기 표면은 Vita^TM 세포 배양판일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 마우스 피더 세포 또는 이들의 추출물의 부재하에서 MUC1* 경로를 자극하는 단계를 포함하는, 미접촉 줄기 세포를 증식 또는 유지시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 MUC1* 항체 표면 상에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 표면은 Vita^TM 세포 배양판일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 혼합된 세포 집단을 MUC1* 항체로 코팅된 표면에 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 미접촉 줄기 세포는 MUC1* 항체의 표면에 결합하고, 상기 MUC1* 항체의 표면은 Vita^TM 판 상에 형성될 수 있는, 혼합된 세포 집단으로부터 미접촉 줄기 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 어떠한 암세포 형태들이 또 다른 암 세포 형태의 조절된 배지에서 성장할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함하되, 상기 또 다른 암 세포 형태의 조절된 배지에서 성장하는 능력은 2개의 암들이 동일한 아형에 속하는 것을 의미하는, 암의 형태를 카테고리화하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 앞서 기술한 카테고리화 방법에 따라 암세포 형태를 카테고리화 하는 단계, 및 microRNA 분석과 총 전사체(transcriptome) 분석을 포함하는 분자 분석을 수행하여 조절 인자를 규명하는 단계를 포함하는, 암 아형의 성장과 분화를 제어하는 조절 인자를 규명하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 앞서 기술한 조절 인자 규명 방법을 사용하여, 수득된 조절 인자 정보를 이용한 암 아형에게 효과적인 처리를 규명하는 단계를 포함하는, 환자에서 암 아형에 대한 특정 조절 인자 처리의 적합성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 방법들 및 다른 목적들은 하기의 발명의 상세한 설명, 첨부된 참조 도면과 청구항을 통해서 보다 상세하게 이해될 것이다.

본 발명은 하기의 상세한 설명 및 도해마을 통해 주어진 첨부된 도면을 통해서 보다 상세하게 이해될 것이지만, 이에 제한되지는 않는다.
도 1은 bFGF 및 조건 배지(CM) 또는 NM23-S120G를 회수하여 H9 인간 줄기세포를 분화하도록 한 후 48, 96 또는 144시간째에, 또는 MUC1* 수용체의 세포외 도메인인 PSMGFR 펩티드를 첨가하여 NM23-MUC1* 상호작용을 고의적으로 중단시키는 시점에서 H9 인간 줄기세포에서 발현된 microRNA-145의 양에 대한 그래프를 도시하고 있다.
도 2는 NM23-WT(와일드 형태)의 다중체(multimerization) 상태, NM23-S120G의 2개의 상이한 배치(batch) 및 80% 이량체 형태를 야기하는 변성후 재구성된 NM23-S120G의 1개의 배치를 나타내는 FPLC 흔적들의 오버레이(overlay)를 도시하고 있다.
도 3A는 NM23-WT 또는 NM23-S120G의 상이한 배치들의 다중체 상태를 나타내는 비변성된, 천연 겔 사진을 도시하고 있다.
도 3B는 재구성된 후 겔-정제된 NM23-S120G가 본질적으로 100% 이량체인 것을 나타내는 비변성된 겔 사진을 도시하고 있다.
도 4는 NM23-WT(A) 또는 NM23-S120G(B)가 히스티딘 태깅된 PSMGFR 펩티드(MUC1* 세포외 도메인)가 포화상태로 고정화되고 NTA-SAM으로 코팅된 칩 상으로 유동되는 표면 플라즈마 공명 실험의 센소그램(청력측정; sensogram)을 도시하고 있다. 실험 결과는 헥사머(hexamer)로 존재하는 NM23-WT가 MUC1* 펩티드에 결합하지 않으며, NM23-S120G 이량체 형태가 MUC1* 펩티드에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 5는 NM23-S120G의 상이한 프랩(preparation)들이 히스티딘 태깅된(tagged) PSMGFR 펩티드(MUC1* 세포외 도메인)가 포화상태로 고정화되고 3.8%(A) 또는 5.7%(B) NTA-SAM 코팅된 칩 상으로 유동되는 표면 플라즈마 공명 실험의 센소그램을 도시하고 있다. C 부분에서, 비환원 겔은 각각의 프랩에 존재하는 이량체의 양을 나타낸다. 실험 결과, MUC1* 펩티드에 결합된 양은 시료에 존재하는 이량체 량의 직접 함수인 것을 나타낸다.
도 6은 상이한 다중체 상태(A-C, D, F), NM23-WT(E)로 특징지워지는 NM23-S120G의 상이한 프랩들, 또는 100% 이량체(A)이지만 PSMGFR (MUC1* 세포외 도메인) 펩티드(B) 또는 항-MUC1* Fab(C)에 의해 경쟁적으로 억제되는 NM23-S120G 프랩에서 배양되는, H9 인간 줄기세포 Day 3 post-plating의 10X 사진들을 도시하고 있다. 결과는 NM23-WT에 존재하는 NM23의 헥사머 형태가 분화를 유도하고, NM23-MUC1* 수용체 상호작용을 방해함으로써 분화를 유도한다.
도 7은 50% 이량체로 구성된 NM23-WT 또는 NM23-S120G 돌연변이체가 첨가된 T47D 인간 유방암 세포의 공초점 현미경 사진을 도시하고 있다. 결과는 NM23-WT (맨위줄)의 첨가는 MUC1* 수용체와의 공동 국소화(co-localization) 증가를 야하지 않고, 핵으로의 전치(translocation) 증가를 유도하지 않는다. 내생성 NM23이 존재하여 투여량 의존적 효과가 관찰된다는 점을 상기하라. 반대로, NM23-S120G(맨아래줄)의 첨가는 MUC1* 수용체와의 공동 국소화되고, 30분후 핵으로 전치되며, 효과는 투여량 의존적이다.
도 8은 50% 이량체로 구성된 NM23-S120G 돌연변이체가 첨가된 T47D 인간 유방암 세포의 공초점 현미경 사진을 도시하고 있다. 사진은 NM23-S120G를 도입하고 60분후에 찍었으며, NM23과 MUC1* 수용체가 공동-국부화되며, 효과가 투여량 의존적이라는 것을 나타낸다.
도 9는 NM23-S120G(50% 이량체) 또는 bFGF에서 배양되고, 인간 피더 세포 또는 마우스 피더 세포상에서 성장된 후 미접촉 세포의 마커, Klf4 및 초기항원인식된 세포 마커 FoxA2의 존재 검출을 위해 염색된 NM23-S120G 인간 H9 배아 줄기세포의 공초점 현미경 사진을 도시하고 있다. 그 결과, 인간 피더 세포상의 NM23에서 배양된 인간 줄기세포가 Klf4에 대해 양성으로 염색되고 FoxA2에 음성으로 염색된다.
도 10은 NM23-S120G(50% 이량체)에서 배양되고, 인간 섬유아세포 피더 세포(HS27)상에서 증식된 인간 H9 배아 줄기세포의 공초점 현미경 사진을 도시하고 있다. DAPI 및 브라이트필드(bright field) 사진들은 인화된 필드내 모든 세포가 가상으로 미접촉 마커 Klf4에 대해 양성이고, 초기항원인식 마커 FoxA2에 대해 음성이다는 것을 나타낸다.
도 11A-11I는 Roh 키나아제 억제제(ROCi Y-27632)(맨아래줄; G, H, I)로 처리되었거나, 또는 ROCi로 처리되지 않은 인간 H9 줄기 세포들(A-E, G-I; 4X, F: 10X)의 현미경 사진을 도시하고 있다. 왼쪽(A, D, G) 및 오른쪽(C, F, I)상에 위치한 Vita 세포 배양 플레이트와 함께 항-MUC1* 항체 플레이트를 원심분리하여 세포를 표면으로 유도한다. 그 결과, 인간 피더세포상에서 NM23에서 배양된 인간 배아 세포들은 ROCi로부터 유리하지 않으며, 플레이트와 결합한 후 단순히 짧은 원심분리를 통해 ROCi 처리와 동등하게 성장하여 세포를 플레이트 표면으로 가져온다. 반대로, 마우스 피더세포 상에서 FGF에서 배양된 배아 줄기세포는 플레이트에 현저하게 결합하지 않으며, 이후 플레이트에 결합하여 ROCi 없이 성장한다.
도 12는 또 다른 암 세포 형태로부터의 조건 배지(CM) 존재하에 성장에 대응하는 암세포 성장 그래프를 도시하고 있다. 이 그래프는 암세포 형태의 하나의 지시자가 이들이 MUC1*-포지티브 또는 네거티브인지, 및 MUC1* 포지티브 암세포가 MUC1*-네거티브 암세포로부터의 조건 배지의 존재하에서 성장하지 않는다는 것을 나타낸다. U87 MUC1*-포지티브 신경교종(glioma)은 MUC1*-포지티브 유방암 세포(T47D)로부터의 조건 배지에서 성장하지만, MUC1*-네거티브 전립선암 세포(LnCAP)로부터의 조건 배지에서는 성장하지 않는다.
도 13은 MUC1* 수용체로 감염된 또 다른 암 세포 형태로부터의 조건 배지(CM) 존재하에 성장에 대응하는 암세포 성장 그래프를 도시하고 있다. U87 MUC1*-포지티브 신경교종은 만일 이들이 MUC1*(FLR)을 암호화하는 유전자로 형질전된될 경우 MUC1*-네거티브 대장암 세포 HCT-116으로부터의 조건 배지에서 성장하지만, 만일 공백터(empty vector)로 형질감염되면 성장하지 않는다.
도 14는 MUC1*-포지티브(A)인 다른 암세포 형태로부터의 조건 배지 존재하에서의 성장에 대응한 MUC1*-포지티브인 T47D 인간 유방암 세포의 그래프를 도시한다. B 부분은 미분화 줄기세포 또는 새롭게 분화중인 줄기세포로부터의 조건 배지 존재하에서의 성장에 대응하는 T47D 암세포의 성장을 도시하고 있다.
도 15는 성장을 향상시키는 MUC1*-포지티브 암세포, 또는 MUC1* 네거티브 암세포 더하기/빼기 MUC1*으로의 형질감염(모두 줄기세포를 균형상태로 전달한다)의 배지에서 성장할때의 인간 배아 줄기세포의 성장을 나타내는 표이다. 배아 줄기세포는 MUC1*-포지티브 암세포(T47D 및 HCT-MUC1*)로부터의 조건 배지에서 증식하지만, MUC1*-네거티브 세포(HCT)로부터의 조건 배지에서는 증식하지 않는다.
도 16은 도 15의 표에 기술된 대로 성장하고, MUC1*-네거티브 암세포, 또는 MUC1*으로 형질감염되어 줄기세포를 균형상태로 만드는 암세포들의 조건 배지에서 성장을 나타내는 인간 줄기 세포의 사진을 도시하고 있다.
도 17은 NM23-S120(50% 이량체)에서 성장하고, 실시예에 기술된 12.5μg/ml C3 mab 항-MUC1* 항체로 코팅된 Vita 플레이트상에 도말된 인간 iPS 세포의 사진을 도시하고 있다. Rho 카이네이즈 억제제를 첨가하지 않았고, 세포 흡착을 향상시키기 위해 플레이트를 원심분리하지 않아서 수회 계대배양 중에 여전히 iPS 세포가 부착, 증식 및 성장한다. 17A는 10배 확대를 나타내고, 17B는 20배 확대를 나타낸다.

본 출원에서, "a" 및 "an"은 모두 단일 및 복수 개체를 참조하는데 사용된다.

정의

MUC1*-포지티브 암세포로 불리는 MUC1-포지티브 암세포는 건강한 상태(MUC1-네거티브 암세포와 마찬가지로)에서 오직 상피세포 상에만 존재하며, 여기서 이의 발현은 조직의 상부 테두리에 클러스터링되어 제한되는 MUC1 막횡단 단백질의 비정상적인 발현을 특징으로 한다. 본 명세서에 사용된 MUC1*-포지티브 암세포로 분리는 MUC1-포지티브 암센터상에서 발견되는 비정상적인 MUC1 발현은 많은 수의 단백질이 열결된 반복 유닛이 결핍된 절단된 형태인 조직의 상부 테두리에서 클러스터 형태로의 발현 보다는 전체 조직 표면상에서의 단백질의 과발현 및 균일한 분포를 의미한다.

본원에서 사용된 "활성화" MUC1*는 MUC1*에 결합하여 성장 자극 및/또는 세포 생존 증가를 유발하는 리간드를 의미한다.

본원에서 사용된, "조건 배지"는 다량의 물질들이 세포로부터 배지로 분비되기에 충분한 시간동안 세포가 성장한 배지를 의미한다.

본 발명에 사용된, "새롭게 분화하는" 줄기세포는 만능에서 보다 분화된 상태로 변하는 세포를 의미한다.

본원에서 사용된, "MUC1"는 배양된 암세포 상 및 암 조직상에서 단백질의 주요형태인 막결합 MUC1 절단 산물을 의미한다. MUC1*는 세포질내 미부(tail), 막횡단 도메인, 및 약 45 아미노산의 세포외 도메인(ECD)를 포함한다. 정확한 절단 위치는 다소 불확실하게 남아있다.

이와 같은 MUC1*의 세포외 도메인의 프라이머리 서열은 이에 제한되지는 않지만 아미노산 서열 GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 l) (PSMGFR 펩티드로 불림)로 구성될 수 있다. "MUC1 성장인자 수용체의 프라이머리 서열"(PSMGFR)은 일부의 경우 MGFR의 대부분 또는 모두, 및 하기에 정의된 상기 펩티드 서열의 기능적 변형체 및 분획을 정의하는 펩티드 서열이다. PSMGFR은 서열번호 1, NM23 또는 서열번호 1에 대한 항체에 결합하는 이의 모든 기능적 변형체 및 분획들로 한정되며, 아미노산 치환체로 20까지의 정수값(즉, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 또는 20) 및/또는 이의 N-말단 및/또는 C-말단에서 아미노산 첨가 또는 삭제로 20까지의 정수값을 가질 수 있다. 본원에 사용된, PSMGFR 약자는 특별한 언급이 없는 한 아미노산 서열과 혼동되어서는 안된다.

본 명세서에 사용된, "MUC1 포지티브 세포"는 MUC1을 비정상적으로 발현하는 세포를 의미한다.

본 명세서에 사용된, "MUC1 네거티드 세포"는 MUC1을 정상적으로 발현하는 세포를 포함하여 MUC1을 비정상적으로 발현하지 않는 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된, "MUC1* 세포" 또는 "MUC1* 포지티브 세포"는 MUC1, MUC1*의 절단 형태를 발현하는 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된, "MUC1* 네거티브 세포"는 MUC1*을 발현하지 않는 세포를 의미하며, 세포가 MUC1*을 발현하지 않는한 MUC1 포지티브 또는 MUC1 네거티브 세포를 포함할 수 있다.

일부 과거의 특허출원에서, 막횡단 MUC1 절단 산물이 MGFR 및 MUC1*으로 불리워져왔다. MUC1* 및 MGFR(MUC1 성장 인자 수용체)는 MUC1 세포질 도메인, 막횡단 도메인 및 본질적으로 PSMGFR로 구성된 절단 세포외 도메인을 포함한다. 2004년 8월 24일자로 출원된 미국특허공개번호 2006/0173171은 MUC1 활성, 특히 MUC1 및 이의 다양한 분획들의 아미노산 서열을 개시하고 있으며, 이는 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.

본 명세서에서 언급된 "암 아형"은 성장 및 분화를 조절하는 조절 인자들의 특징적인 세트에 따라 특징지워지는 그룹들로 분리되는 암의 분류이다. 상이한 암 아형들 간에는 조절 인자들의 발현수준에 현저한 차이가 있다는 것을 의미한다. 특이적인 조절 인자들은 하나의 암 아형으로부터 또 다른 하나의 암 아형에서 현저하게 감소하거나 증가된 발현 수준을 갖는 조절 인자일 수 있다. 암 아형에 특이적인조절 인자들의 모임을 본 원에서 "암 아형 징표"로 부른다.

아형 징표들은 암세포에 제한되지 않는다. 줄기세포들은 유사한 수단에 의해 아형으로 분류될 수 있다. 줄기세포 및 전구세포들은 각각의 아형에 특이적인 조절 인자들을 규명하기 위해 분석된다. 즉, 각 인자의 발현 수준들에 있어서 현저한 차이가 있음을 의미한다. 특이적인 조절인자들은 하나의 줄기세포 아형으로부터 다른 하나의 줄기세포 아형까지 현저하게 증가 또는 감소된 발현 수준을 갖는 조절인자들일 수 있다. 하나의 중기세포 아형에 특이적인 조절 인자들의 모임을 "줄기세포 아형 징표"로 부른다. 줄기세포 아형 징표들은 암을 치료 또는 예방하기 위해 인간에게 투여될 수 있다. 특히, 치료 또는 예방되어저야할 암에서 다운 조절되는 조절 인자들로 구성된 줄기세포 아형 징표가 바람직하다.

*본 명세서에서 사용되는 줄기세포 "증식 고조"는 보다 성장한 상태로의 분화가 일시적으로 정지하고, 줄기세포 또는 전구세포들의 아형 집단의 팽창으로 특징지워지는 성장을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, "증식 고조 아형 징표"는 증기 고조에서 줄기세포 또는 전구세포들의 아형에 특이적인 조절 인자들의 모임을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "조절 인자"는 핵산, RNA, microRNA, 유전자 또는 유전자 산물일 수 있다.

본 명세서에 사용된 "소분자"는 1KDa 이하, 또는 바람직하게는 800Da 이하의 분자량을 갖는 화합물을 의미하고, 조절 인자의 발현을 유도하거나 조절 인자의 활성을 흉내내는 제제로 사용될 수 있다. 이와 같은 화합물의 합성은 당업자에게는 본 출원에 개시된 대로 사용하기 위한 분석 형태의 주어진 지식으로 가능하다.

본 명세서에 사용된, 조절 인자 발현에서 "현저한 증가"는 암 역분화 분야의 당업자에게 알려진 용어이다.

암세포와 만능 줄기세포는 유사하다

암세포와 만능 줄기세포 모두의 성장 및 생존은 MUC1* 성장 인자 수용체 경료에 의해 매개된다. 성인 세포를 만능 줄기세포(유도 만능 줄기세포; iPS 세포)로의 전환을 유도하는 유전자는 MUC1, 이의 절단 효소 및 이의 활성화 리간드, NM23의 전사를 조절하는 유전자들이다.

MUC1은 만능 줄기세포 상에서 및 암세포 상에서 성장인자 수용체 형태인 MUC1*으로 절단되어, 이들 두 세포 상에서 강력한 성장인자 수용체로 기능한다. 만능 줄기세포, 배아 줄기(ES) 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포 상에서, 모든 MUC1은 본질적으로 절단된 성장인자 수용체 형태인 MUC1*으로 잘려진다. MUC1*의 리간드-유도 활성화는 만능 줄기세포 성장에 필수적이며 충분하다. 이량체 형태의 NM23은 MUC1* 성장 인자 수용체의 세포외 도메인과 결합하여 이량체화하여, 수용체의 성장 및 생존 기능을 활성화시킨다. 나노몰 량의 이량체 형태의 NM23의 첨가는 그 자체로 인간 만능 줄기세포 성장을 완전히 지지하며, 분화를 억제한다. 이는 섬유아세포 피더 세포 또는 이들의 추출물 부존재시 인간 줄기세포 성장을 지지할 수 있는 알려진 유일한 단일 제제이다. 일단 줄기세포가 분화를 시작하면, 어떠한 MUC1*도 검줄되지 않을 정도로 MUC1 절단이 크게 감소되어 거의 없어진다. MicroRNA-145(miR-145)는 만능으로부터 모다 분화된 상태로 줄기세포의 변이를 신호한다. 여기서, 본 발명자들은 MUC1*-NM23 상호작용의 특이적 억제가 miR-145의 현저한 발현 증가 및 동시적인 분화 개시를 유발시킨다(도 1).

만능 줄기세포와 같이 모든 고형암의 75%가 MUC1*을 발현하고, 이들의 성장 및 생존은 MUC1*에 의해 매개된다. 줄기세포 성장을 지지하는 리간드인 NM23을 첨가하면 암세포의 성장을 촉진시키고 생존을 증가시킨다. 암세포들은 분화된 성인 세포와 만능 줄기세포 사이의 공간을 차지한다. 암세포는 어느 정도의 "줄기 특성"을 갖는다. 이들은 자가복제 능력을 갖고, 특정 세포 형태로 규명되는 특성중 많은 수가 소실된다.

만능 줄기세포와는 달리 MUC1* 이외의 암세포들은 전장(full length) MUC1(MUC1-FL)을 발현할 수 있다. 중요하게는, 전이가 가능하고 "암 줄기세포"로 불리는 약제 저항성 암세포들은 보통의 암세포들보다 많은 MUC1*을 발현한다. 특정 암세포가 약제 내성을 획득할 경우 5배 내지 10배정도 MUC1* 발현을 증가시킨다. 이와 같은 반경은 암세포들이 줄기세포로 되돌아가는 중이며, 높은 전이성의 MUC1*-포지티브 암세포들이 만능 줄기세포와 가장 밀접하다는 생각과 일치한다.

암세포와 줄기세포 간의 또 다른 유사성은 만능을 조절하는 유전자의 규명에 있다. 체세포를 iPS 세포로의 역분화이 가능하다고 규명된 만능 유전자, Oct4, Sox2, 및 Klf4/Nanog는 다른 유전자들의 발현을 조절하는 전사 인자들 및 이들에 의해 암호화된 단백질들이다. Young 및 이의 동료들은 OCT4, SOX2 및 NANOG가 결합하는 프로모터 위치를 규명하였으며, 이들 프로모터로부터 발현되는 유전자들을 규명하였다. 즉, 이와 같은 "만능 유전자들"에 의해 상향 조절된 유전자들이 규명되었다. 각각의 전사 인자는 12개의 유전자들에 관한 전사를 조절한다. 이들중 다수의 유전자가 MUC1-관련 인자들이라는 것이 본 발명자들에 의해 규명되었다. OCT4 및 SOX2는 MUC1 프로모터 자체에 결합한다. SOX2 및 NANOG는 NM23(NME7) 프로모터에 결합한다. NM23-H1 및 H2는 이미 MUC1*의 리간드로 규명되었다. 이와 같은 실험에 사용된 항체들은 또한 NM23/NME7을 인식한다. 그러므로, NME7은 MUC1*의 활성화 리간드이다. OCT4 및 SOX2 모두는 본원에서 MUC1의 절단효소로 개시된 MMP16에 대한 프로모터에 결합한다. OCT4, SOX2 또는 NANOG는 또한 절단효소 MMP2, MMP9, MMP10, ADAM TSL-1, ADAM TS-4, ADAM-17(MUC1 절단 효소), ADAM-TS16, ADAM-19 및 ADAM-28(이들은 MUC1의 절단에도 참여할 수 있다)에 대한 프로모터에 결합한다. 요약하면, 만능을 유도하는 유전자들은 MUC1, 이의 절단 효소 및 이의 활성화 리간드의 발현을 유도한다.

이와 같은 발견은 암세포들이 줄기세포와 매우 유사하고, MUC1*-포지티브 암세포들이 만능 줄기세포와 가장 유사하다는 것을 강력하게 주장한다.

만능 줄기세포들은 성인 세포로 분화를 유도하는 고유의 프로그램을 갖고 있다.

줄기세포들은 만능 종료시 분화 프로그램을 활성화시킨다. 비록 암세포와 줄기세포들이 매우 유사하더라도, 암세포들은 줄기세포와 같은 자가복제 상태를 종료시키지 못하도록 조절장애(dysregulate)된다. 이와 같은 역설중 하나는 줄기세포가 자가복제를 종료시키도록 활성화명서, 암세포를 활성화지 않는 조절인자가 무었인지이다. 어떤 방식으로 줄기세포들이 자가복제를 중지시키는지를 연구함으로써, 본 발명자들은 어떻게 암세포의 자가복제 시스템을 중지시킬 수 있는지를 알 수 있다.

이와 같은 초기 분화 프로그램의 중요한 조절인자들 중 하나는 miR-145이다. 만능 줄기세포를 제1 분화상태로 전이하는 것은 miR-145의 현저한 발현 증가에 의해 감지된다. 여기서, 본 발명자들은 만능 줄기세포의 증식시 NM23-MUC1* 상호작용을 억제시킴으로써 줄기세포들이 분화를 즉시 개시하면서 miR-145의 발현을 조기에 현저한 양으로 증가시킨다는 것을 나타내고 있다(도 1). 이와 같은 결과는 첨가된 제제가 MUC1* 길항제(antagonist) 또는 NM23 길항제인지에 상관없이 동일하다. 이와 같은 결과는 NM23과 MUC1* 모두가 분화 프로그램에서 주요한 조절자들인 것을 나타낸다. 이는 어떤 방식으로 줄기세포들이 NM23-MUC1* 상호작용을 방해하여 분화를 개시하는지에 대한 문제를 제기하게 한다. 본 발명자들은 NM23이 자가 조절 피드백 루프(feedback loop)에서 중요한 역할을 한다는 것을 발견하였다. NM23은 농도에 의존적으로 단량체, 이량체(활성형), 3량체 또는 6량체로 존재할 수 있다. 그러나, S120G 돌연변이와 같은 암세포 유래 돌연변이들은 활성형의 이량체로 주로 존재하며, 보다 높은 순서의 다중체를 형성하는 것을 저항하거나 불가능하다는 것이 알려져 있다. 본 발명은 4량체 및 6량체가 MUC1* 수용체에 결합하지 못한다는 것을 밝혀내었다. 그러므로, 줄기세포가 증식함에 따라 이들이 분비하는 NM23의 농도와 양이 증가한다. 증식하고 있는 줄기세포들 주변의 배지내 NM23 함량은 MUC1*과 반응하지 않는 6량체로 주로 존재하는 농도에 빠르게 도달한다. 그러므로, NM23 6량체 및 5량체는 NM23 길항체의 행동을 흉내내어, miR-145의 급격한 증가 및 분화 개시를 유발한다. 대조적으로, 오직 이량체만을 형성하는 신경 아세포종(neuroblastoma)에서 발견되는 NM23-S120G와 같은 돌연변이들은 구성적으로 활동적이어서 줄기세포와 유사한 자가복제 상태로 암세포를 유지시킨다. 유사하게, 이와 같은 NM23 돌연변이체는 증식하는 인간 줄기세포를 만능 상태로 유지시키고, 이들의 분화를 억제한다(실시예 2 및 3, 도 2,3,6,).

그러므로, NM23-MUC1* 상호작용을 중단시키거나, NM23의 이량체화를 억제시키거나, 야생형 NM23으로 치료하거나, 바람직하게는 4량체 또는 6량체로 존재하는 NM23 돌연변이체, 변형체 또는 키메라(chimera)로 처리하거나, 분화 유도를 위해 miR-145와 miR-145와 동시 발현되는 microRNA 클러스터와 같은 조절 인자들을 첨가함으로써 암 성장을 억제할 수 있다.

세포적 역분화 : 세포 발달은 양방향으로 이루어지며, 프로그래밍 요소들이 소실되지 않는다는 것이 알려져 있다.

성숙한 세포들은 만능 줄기세포로 시간내에 되돌려지거나 전환될 수 있다. 즉, 줄기세포들은 성숙한 세포들로 분화되도록 지시될 수 있다. 본 발명자들은 암세포들이 분화를 지시하고 자가 복제를 중단시키는 요소들의 조절하지 못하는 것을 제외하고는 줄기세포와 유사하다는 것을 밝혀내었다. 그러므로, 암세포들은 자가 복제하지 않는 성숙한 세포들로 분화되도록 역분화될 수 있다.

그러므로, 세포를 분화하도록 유도하는 제제를 처리는 것이 암을 치료 또는 예방하는 방법일 수 있다. 이는 분화를 유도하거나 자가 재생 작동체(effector)를 억제하는 유전자, 유전자 산물, 조절 핵산, microRNA 또는 소분자를 도입시켜 달성될 수 있다. 분화를 유도하고, 이로서 항암 치료 또는 암 예방에 적합한 조절 인자들은, 1) 인간 미접촉 만능 줄기세포의 "줄기세포 아형 징표"를 분화되거나 새롭게 분화중인 줄기세포(미접촉 공급원으로부터)과 비교하는 단계; 2) 이 둘간의 조절 인자들의 발현 수준의 현저한 차이를 규명하는 단계로서, 분화된 세포들의 줄기세포 아형 징표에서의 특이적인 조절 인자들은 분화를 유도하는 조절인자들이며, 3) 분화된 세포들의 줄기세포 아형 징표로부터의 특이적인 조절인자들의 세트를 "암 아형 징표"와 비교하는 단계; 및 4) 암 아형 징표에서 사라지거나 현저하게 상이한 수준으로 발현되는 인자들을 규명하는 단계에 의해 규명될 수 있다. 이들은 분화를 유도하고 암세포를 변경시키고, 이로서 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여하기에 적합한 조절 인자들이다.

분화를 유도하는 후생적인 과정을 조절하거나 만능성을 유도하는 유전자 또는 유전자 산물의 발현을 중지시키는 RNA, 비암호화 RNA 및 microRNA와 같은 발현 유도 조절인자들은 건강하거나 보다 분화된 상태로 암세포나 환자들을 역분화시키기 위해 암세포/환자들에게 도입될 수 있다. 유사하게, 이와 같은 분화를 유도하는 후생적인 과정을 조절하거나 만능성을 유도하는 유전자 또는 유전자 산물의 발현을 중지시키는 조절 RNA, 비암호화 RNA 및 microRNA는 암을 치료하거나 암 발생을 예방하기 위하여 숙주 동물 또는 인간에게 주입될 수 있다. 또한, 본 발명은 암으로 진단되거나 암발생 위험이 있는 환자의 치료를 위해 분화를 유도하는 유전자, 유전자 산물, 암호화 또는 비암호화 핵산 또는 microRNA의 효과를 흉내내는 소분자의 사용을 고려하고 있다.

분화를 유도하는 핵산, microRNA, 유전자 및 유전자 산물을 포함하는 조절 인자들은 암세포 또는 암환자 또는 암발생 위험이 있는 환자에게 투여되어 암세포들을 보다 분화된 상태로 역분화하거나, 자가 재생 능력을 억제한다.

*줄기세포에서 만능성을 조절하는 microRNA는 암 공정을 되돌리고, 자가재생 능력을 억제하기 위해 암세포의 역분화를 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들은 암세포에서 MUC1* 수용체 이량체화를 차단하면 암세포의 성장을 억제한다는 것을 이미 밝힌바 있다. microRNA가 큰 네트워크를 조절하기 때문에 단일의 유전자 또는 유전자 산물보다 세포의 역분화에 있어서 보다 효과적일 것이다. 분화를 유도하는 microRNA 클러스터 또한 암의 치료 또는 예방에 효과적일 것이다.

암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 microRNA는 miR-145, 및 기타 분화를 유도하는 micro들을 포함한다. 전구체들로부터 보다 다음 단계의 분화로 분화를 유도하는 microRNA들은 조직 특이적이다. 치료적 응용에 있어서, 조직 특이적 microRNA는 특정 세포 형태에서 암을 치료 또는 예방하기 위해 초기 분화 개시자와 함께 동시에 투여될 수 있다. 예를 들면, 뇌조직에서 분화를 유도하는 miR-128은 뇌암 치료에 사용될 수 있다. 이것은 miR-145와 같은 기타의 조직 비특이적 분화 조절자들과 독립적으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다.

MUC1 절단 산물에 의해 조절 장애되는 유전자 또는 이들의 유전자 산물(유전자가 암호화하는 단백질)은 암세포를 보다 분화된 상태로 되돌리기 위해 역분화시키도록 암세포에 도입될 수 있다.

일 구현예에서, 만능 세포 및 암세포에서 발현이 감소되는 단백질들은 암환자 또는 환자에게 암 억제제로서 투여되어 환자의 세포를 분화된 상태로 유지하거나, 암세포를 역분화시키 후 보다 분화된 상태로 되돌린다. 또 다른 구현예에서, 만능 줄기 세포 및 암세포에서 발현이 감소되는 조절 핵산들은 암 예방제로서 암환자 또는 환자에게 투여된다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 전장 또는 성숙형(가공후 존재하는 보다 짧은 서열)일 수 있는 microRNA이다. 또 다른 구현예에서, 줄기세포가 분화하는 경우 발현이 증가하는 microRNA는 암 억제제로서 암환자 또는 환자에게 투여된다.

대안적으로, 만능성을 유도하는 유전자를 다운 조절하는 것 또는 만능성을 유도하는 유전자 산물을 억제하는 것이 암치료에 효과적인 방법일 수 있다. 유전자 또는 유전자 산물의 세트는 만능성을 유도하는 것으로 이미 규명되었다. 일단 규명되었으면, 세포를 분화하도록 유도하는 유전자 또는 유전자 산물들의 세트도 암세포가 자가 복제 능력을 잃도록 암세포를 역분화시킬 것이다.

NM23 및 MUC1*은 전사 인자로 작용할 수 있다(도 7, 8). 성장하는 줄기세포에 NM23을 투여하여 줄기세포를 만능 상태로 유지시키고, miR-145 발현 신호의 증가는 줄기세포를 만능성으로부터 빠져나오게 하기 때문에, NM23 및또는 MUC1*가 miR-145를 억제하는 것이 수반된다. MUC1*(PSMGFR)의 세포외 도메인에 대응하는 서열의 펩티드는 NM23 또는 NM23의 이량체와 결합하고 MUC1* 수용체와의 상호작용을 억제하며, 핵에서 다른 목표들과 상호작용하는 세포 내재화(internalization)를 억제한다. PSMGFR 펩티드를 만능 줄기세포에 첨가함으로써 분화를 조절하는 네트워크를 작동시키는 miR-145의 발현을 현저히 증가시킨다. 그러므로, PSMGFR 펩티드의 투여는 분화를 유도하고, 결국 암치료 또는 암예방에 유효하다. 본 발명은 천연 및 비천연 PSMGFR 펩티드의 투여, 펩티드가 NM23에 결합하는한 서열 변형물을 포함하는 펩티드 및 펩티드들의 발현을 유도하는 벡터들 또는 바이러스들의 투여를 고려하고 있다. 본 발명은 또한, NM23 및 MUC1*간의 상호작용을 억제하는 소분자들 또는 항체들(2가, 1가 또는 이중특이적, 천연 또는 합성 항체들 및 항체 분획들)의 투여도 검토하고 있다. 또한, 본 발명자들은 NM23 이량체가 MUC1* 성장 인자 수용체 경로를 활성화시키는 형태인 것을 밝혀내었다는 점을 주지하고 있다. 고농도의 NM23은 MUC1*에 결합하지 않는 것으로 밝혀진 4량체 및 6량체를 형성한다. 그러므로, 본 발명자들은 줄기세포 성장을 자극하기 위해 4량체 및 6량체 형성을 억제하는 NM23-S120G와 같은 돌연변이를 일반적으로 사용한다. 그러나, 보다 높은 다량체를 형성하는 야생형 NM23은 만능성 성장을 중지하고 분화를 개시하는 피드백 루프를 개시한다. 그러므로, 본 발명은 암의 치료 및 예방을 위해 야생형 NM23의 사용도 또한 고려하고 있다.

그러므로, 항암제로서 투여될 수 있는 분화를 유도하는 제제를 규명할 수 있는 것이 중요하다. 유사하게, 만능성을 유도하여 암의 치료 및 예방을 억제할 수 있는 제제의 규명 또한 중요하다.

아형 징표를 구성하는 조절 인자들은 다음과 같이 규명될 수 있다

성장 및 분화를 조절하는 천연 발생 제제의 규명은 당업자에게 알려진 다양한 기술들에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 분화를 유도하는 제제들은 a) 만능 줄기세포에서 존재하지 않거나 매우 감소되거나, b) 새롭게 분화중인 줄기세포에 존재하거나, 및 c) 암세포에 존재하지 않거나 매우 감소되는 사실에 근거하여 규명될 수 있다. 일단 규명이 되면, 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 소분자들을 사용함으로써 분화를 유도하는 천연 발생 제제를 흉내낼 수 있다. 분화를 유도하는 제제를 규명하기 위해 사용되는 분자 대조의 종류는 매우 다양하다. 조절 핵산 및 microRNA를 규명하기 위하여, (만능, 분화중 또는 암)세포의 각각의 세트 또는 이들의 조건 배지로부터 각각 RNA를 추출하고, 딥 시퀀싱(Deep Sequencing)과 같은 기술을 사용하여 비교한다. 분화를 유도하는 제제에 의해 조절되고, 전사 인자로 알려져 있거나 의심되는 유전자 및 유전자 산물을 규명하기 위하여, ChIP(크로마틴 면역 침전 분석)과 같은 분석 또는 ChIP Seq와 같은 기술을 이용한다. 각 세포 형태가 분비하는 단백질과 핵산의 비교는 분화를 유도하는 분비된 단백질들을 규명하기 위해 수행될 수도 있다(하기 실시예 5 참조)

반면에, 자가 복제를 촉진하는 상호작용들이 고의적으로 활성화되어 분화를 능가하는 조절 제제들이 규명될 수 있도록 한다. 이와 같은 자가 복제 조절 제제들은 암 치료를 억제할 수 있다. 대안으로, 이들은 생체내 또는 생체외에서 줄기세포 또는 전구세포의 증식을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 하기에 기술되는 바와 같이, 자가 복제를 유도하는 일부 조절 인자들은 "혼합 신호"를 전달하기 위해 암 치료에 사용될 수 있다.

대안으로, 자가 복제를 유도하는 상호작용들은 고의적으로 억제되어 세포의 분자적 구성에서의 변화가 명백하게 되며, 상호작용의 억제는 자가 복제를 억제하는 조절 제제들의 생산을 증가시키므로 암 치료를 위해 또는 줄기세포의 직접 분화를 위해 사용될 수 있다.

일 구현예에서, NM23 및 MUC1* 간의 상호작용은 예를 들면 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분에 대한 항체 또는 PSMGFR 서열을 갖는 펩티드에 대한 항체의 Fab를 사용하여 억제된다. 딥 시퀀싱과 전사체 분석을 포함한 분자적 분석은 NM23-MUC1* 상호작용의 억제를 사용하거나 사용하지 않은채로 세포 상에서 수행된다. 분자적 분석은 상호작용이 억제될때 상향조절되는 제제(핵산, microRNA 또는 단백질)을 규명하기 위해 수행되며, 상향 조절되는 제제는 분화를 유도하는 제제이다.

MUC1* 세포외 도메인 상에서 분비된 NM23의 활성 이외에, 본 발명자들은 MUC1* 세포외 도메인에 결합된 NM23이 세포의 핵으로 전치되며, 여기서 이들은 만능성을 유도하는 유전자들을 상향 조절하는 전사인자 또는 보조인자(co-factor)로 작용한다(실시예 4, 및 도 7과 8). ChIP 분석 및 ChIP seq 분석은 NM23-MUC1*에 의해 유도되는 만능 유전자 또는 이들에 의해 억제되는 분화 유전자를 규명하기 위해 수행된다. 줄기세포 또는 암세포에 첨가될 경우 이량체 NM23은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하여, 30분 이내에 둘다 전치된다(translocate). 핵 전치 기간중에 MUC1* 및/또는 NM23과 결합하는 항체는 이들이 결합하는 단백질 및 핵산을 침전시키기 위해 첨가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, MUC1의 PSMGFR 영역에 대한 항체가 MUC1*이 결합하는 핵산이 무엇인지를 측정하기 위한 분석, 예를 들면 ChIP 분석에 사용된다. 대안으로, MUC1 세포질 미부(tail)에 결합하는 항체들이 사용될 수 있다. MUC1*에 의해 결합된 핵산 서열을 규명한 후, 유전자 또는 유전자 산물의 상향조절 또는 하향조절을 유발하는 MUC1*이 결합하는 핵산 위치를 측정하기 위해 RT-PCR, 딥 시퀀싱, 전사체 분석 등과 같은 다수의 표준 기술들중 어느 하나를 사용할 수 있다.

2가 항체 또는 이의 활성화 리간드 NM23에 의한 MUC1*의 이량체화는 세포에게 그대로 남아있거나 줄기세포로 되라는 신호를 보낸다는 점은 확실하다. 본 발명자는 항-MUC1* 항체 또는 이량체 NM23d 암세포 및 만능 줄기세포의 성장을 유도하며 줄기세포의 분화를 억제한다는 것을 확신한다. 또한, MUC1*의 발현을 억제하는 것은 세포에게 만능성을 버리거나 분화를 하라는 신호를 제공한다는 점도 확실하다. 그러므로, 만능성을 유도하는 조절 인자를 규명하기 위하여 본 발명자는 첫번째 만능 줄기세포 세트를 MUC1* 자극제로 자극한 후 상향조절된 microRNA, 유전자 또는 유전자 산물을 규명하였다. 만능성에서 상향조절된 것을 강조하기 위하여 본 발명자는 이와 같은 결과를 예를 들면 분화를 유도하는 MUC1* 세포외 도메인 펩티드(PSMGFR)을 첨가하여 MUC1* 신호가 차단된 두번째 만능 줄기세포 세트와 비교하였다. MUC1*이 활성화될때 고발현되지만 MUC1*가 차단될때 소량 발현되는 RNA, microRNA, 유전자 또는 유전자 산물은 만능성을 유도하는 조절 인자이다. MUC1*이 활성화될때 소량 발현되지만 MUC1*이 차단될때 높게 발현되는 RNA, microRNA, 유전자 또는 유전자 산물들은 분화를 유도하는 조절인자들이고, 이들은 암을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 이와 같은 방법은 암 아형 징표를 규명하기 위해 MUC1*-포지티브 암세포 상에서 수행되고, 또한 줄기세포 아형 징표를 규명하기 위하여 만능 줄기세포 상에서 수행된다.

MUC1* 발현은 예시적이며, 암세포의 역분화를 위해 도입되어 더욱 분화된 세포로 되도록 하는 유전자, 유전자 산물 또는 microRNA를 규명하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 본 발명은 자가 복제 또는 분화를 촉진하는 기타의 제제들을 이용하여 유사한 분석을 수행하는 것도 고려한다.

microRNA 및 암에서 하향 조절되는 이들의 목표물들과 같은 조절 인자들은 항암 치료제 또는 암예방 백신으로서 암세포의 성장 및 분화 상태를 조절하기 위해 사용될 수 있다. MUC1* 발현은 만능 줄기세포 및 여러 암들에서 높다. 또한, 이의 발현은 덜 공격적인 암보다 더욱 줄기세포와 유사한 공격적이고 전이성의 암에서 더욱 높다. MUC1* 및 이의 활성화 리간드 NM23간의 상호작용을 길항하는 제제는 분화를 유도한다. 이와 같은 특징은 MUC1* 및 이의 발현을 조절하는 인자들을 암세포의 역분화를 위한 이상적인 치료 목표로 만든다.

암의 치료 또는 예방을 위해 억제 또는 하향 조절되어져야 하는 다른 목표물을 규명하는 특징들은 1) 만능 줄기세포 및 암세포에서의 고발현; 2) 공격적이지 않은 암 보다는 공격적인 암에서의 고발현; 3) 성숙된 분화 세포에서의 부재; 및 4)이의 발현을 억제가 분화를 유도하는 것을 입증하는 것을 포함한다. 결국, 암세포들을 더욱 분화된 상태로 유도하여 역분화시키기 위해서 본 발명자는 MUC1, MUC1*, 이의 활성화 리간드 NM23, 또는 ADAM-17로도 불리는 MMP-14, MMP-16 및 TACE를 포함하는 이의 절단 효소를 도입하였다. microRNA는 상호 연관된 유전자 및 유전자 산물들의 대형 네트워크 상에서의 조절을 행사하기 때문에, 목표물, 예를 들면 MUC1의 발현을 조절하는 microRNA, 이의 절단 효소 및 NM23이 암을 역분화하고 암 발생을 예방하기 위한 치료제로 바람직하다. 결국, miR-145는 암을 치료 또는 예방하기 위해 단독으로 또는 다른 마이크로들과 함께 사용되는 microRNA 중 하나이다.

분화의 microRNA 징표를 규명하기 위한 기존의 시도들은 단점이 있으며, 인간 치료에 부적합하다

암의 잠재적 치료를 위한 분화를 지시하는 microRNA를 규명하기 위해 시도되는 모든 연구들은 FGF 경로를 활성화하여 성장한 줄기세포를 사용하여 수행되어왔으며, 대부분은 마우스 섬유아세포 피더 세포, 이들의 조건 배지 또는 마우스 암으로부터 유래된 마트리젤(Matrigel)을 사용하였다. 연구자들은 최근에 FGF 경로의 활성화가 마우스 줄기세포를 만능 상태로 유지시키지만 인간 줄기 세포를 더이상 만능이 아니고, 자연 발생되는 인간 줄기 세포의 대표가 아닌 "초기항원인식(Primed)"로 불리는 상태로 접어들게 한다는 것을 밝혀내었다. 그러므로, 인간 암의 치료를 위해 인간 줄기세포의 분화를 유도하는 조절 제제를 정확하게 규명하기 위하여, 본 발명자는 진정한 만능(미접촉) 인간 줄기세포와 새롭게 분화중인 인간 줄기세포(공급원은 미접촉)를 비교한 후 인간 암세포와 비교해야 하며, 여기서 미접촉 줄기세포에 존재하지 않고, 새롭게 분화중인 줄기세포에는 존재하며, 인간 암에는 존재하지 않는 microRNA와 같은 조절 제제들이 규명되고 암의 치료 또는 예방을 위한 치료제로 사용된다.

연구자들은 유전자 및 다양한 화합물 제제를 도입하여 인간 초기항원인식 줄기세포를 짧을 시간동안 진정한 만능성의 미접촉상태로 만드는 것을 가능하게 하였다. 이와 같은 일시적 미접촉 인간 줄기세포들의 특징은 이들이 콜로니(colony) 보다는 시트(sheet) 형태로 성장하며, 부작용 없이 트립신화(trypsinization)를 통해 수확될 수 있고 초기항원인식 줄기세포보다 보다 높은 수준으로 KLF4를 발현하고, 보다 낮은 수준으로 FOXA2를 발현한다는 것을 나타내었다. 지금까지도, 인간 미접촉 줄기세포의 성장을 유지시키는 경로를 밝혀내지 못하였다. 여기서 본 발명자들은 MUC1* 성장 인자 수용체의 활성화를 통해, FGF, 마우스 섬유아세포 피더 세포, 이들의 조절배지 또는 마트리겔(Matrigel)의 부존재하에서 NM23에서 배양된 인간 줄기세포들이 미접촉 상태를 유지하고, 결국 진정한 만능 인간 줄기세포가 된다는 강력한 증거를 발표한다. 그러므로, 본 발명의 방법에 따라 배양한 후 NM23을 원천징수하여 이들 세포들을 분화시킴으로서 수득된 인간 미접촉 줄기세포의 분석만이 인간 세포의 분화를 유도하는 조절 제제의 정확한 식별을 가능하게 한다.

비록 앞서 FGF-성장 또는 마우스 피더층 유도된 줄기세포를 사용하여 규명되었던 microRNA와 같은 일부 조절 인자들이 정확할 수 있지만, 정확한 조절 인자들과 진정한 만능 인간 줄기세포가 아닌 줄기세포를 사용한 시스템의 인공물의 조절인자들을 구분하는 것은 불가능하다. 또한, 암에서 변경되고 분화를 유도하는 조절 인자들의 치료적 사용은 2개 이상의 이와 같은 조절 성분들 또는 징표들의 조합으로 사용될 경우 더욱 효과적일 것이다. 일부는 긍정적인 효과를, 일부는 부정적인 효과를, 그리고 일부는 효과가 없는 조절 인자의 징표를 포함한 치료가 인간 치료제로서 적합하지 않았다. 그러므로, 보다 분화된 상태로 세포가 전이할때 변경되는 조절 인자들을 규명하기 위해 진정한 만능성 인간 줄기세포(미접촉)가 사용된다는 점과, 암 아형 징표에 대한 추가의 비교는 암에서 소실되거나 부정확한 수준으로 발현되는 효소들의 규명을 나타낸다. 즉 이와 같은 인자들의 발현 수준이 세포에서 회복되는 치료법은 암환자를 위한 또는 암의 예방을 위한 효과적인 치료법을 구성한다 점이 중요하다. 본 발명은 암을 치료하기 위해, 인간 줄기세포의 배양을 위해 또는 이들의 분화를 지시하기 위해 사용되는 본원에 기술된 연구들을 위해 MUC1* 자극을 통하여 배양된 줄기세포를 사용하는 것을 고려한다.

본 발명자들의 실험은 bFGF 또는 마우스 피더 세포 또는 마트리겔 없이 NM23에서 인간 배아(ES) 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포를 배양할때 이들이 미접촉 상태로 변환된다는 것을 나타내고 있다(실시예 6 및 7, 도 9, 10, 11). 줄기세포들은 미접촉 상태의 마커인 Klf4에 대해 양성으로 염색되고, 초기항원인식 상태에 대한 마커인 FoxA2에 대해 음성으로 염색된다. 또한, bFGF 또는 마우스 피더 세포 또는 이들의 조건 배지가 없는 상황에서 항 MUC1* 항체 표면상에 도말되어 배양된 인간 줄기세포는 콜로니 형태 보다는 시트 형태로 성장하며, 이는 또 다른 미접촉 줄기세포의 특징이다. 본 발명자는 Rho 키나제 억제제 또는 MAP 키나제 억제제의 첨가가 미접촉 상태로의 복귀 공정을 촉진시킨다는 것을 밝혀내었다.

본 발명자들은 세포 분화를 유도하는 제제들을 환자에게 투여하여 암성의 자가복제 성장을 제한하여 암을 치료 또는 예방하는 접근을 기술하였다. 대안적인 접근으로는 제1형태의 암 특징을 갖는 첫번째 조절 제제 세트 중 적어도 하나와 제2형태의 암 특징을 갖는 두번째 조절 제제 세트 중 적어도 하나를 환자에게 투여하는 것이다. 즉, 첫번째 암 아형 징표 및 두번째 암 아형 징표를 말한다.

본 발명자는 특정 아형의 암세포가 공동배양될 수 없으며, 다른 암 아형의 조절배지 존재하에서 성장할 수 없다는 것을 발견하였다. 조건 배지는 특정 방식으로 성장하도록 세포를 프로그램할 수 있는 분비된 인자들을 포함한다. 특정 형태의 암세포들은 또 다른 특정 형태의 조건 배지 존재하에서는 성장할 수 없다는 사실은 2개의 상이한 프로그램들에 따라 세포들이 증식하고, 세포 자신의 증식 프로그램에 더하여 다른 세포의 증식 프로그램이 혼합된 신호를 세포가 받을 경우 세포는 증식을 멈추고 정지상태로 진입한다는 아이디어와 일치한다.

수년동안 사람들이 다수의 암형태를 동시에 갖고 있지 않다는 것을 관찰하였다. 즉, 대신에 하나의 암 형태가 전이된다. 본 발명자들의 실험 및 관찰과 함께 이와 같은 데이터는 신호가 상이한 증식 고조(plateau)의 조절 징표들의 일부를 구성하고 있는 근본적으로 혼합된 신호들로 암환자 또는 암 발생 위험이 있는 환자의 치료함으로써 암세포의 증식을 억제하고 강력한 항암 치료로 이용될 것이다 라는 결론을 유도한다.

지금까지, 암은 조직 기원, 암세포를 발현하는 분자 마커, 또는 암세포를 발현하는 성장 인자 수용체의 특징을 갖는다. 그러나, 현재의 연구자들은 어떠한 microRNA들이 다양한 암들을 과발현 또는 소발현 하는지를 관찰하고 있다. 여기서, 최초로 공동 배양되는 다른 암세포들에 따라서 암을 분류하는 암 특성화 방법이 기술된다. 다른 암의 조건 배지에서 함께 배양되거나 성장할 수 있는 암들은 암의 아형이 동일하며, 반대로 함께 배양될 수 없는 암세포들은 상이한 암 아형군에 속한다. 암들은 첫번째로 이와 같은 방식으로 아형으로 분류되어져야 하며, 이후 각각의 아형으로부터 대표적인 암들을 분석하여 각 아형에 특이적인 조절 인자들을 규명해야 한다. 특이하게는, 이는 조절 요소들의 발현 수준에 현저한 차이가 있다는 것을 의미한다. 특이적인 조절 인자들은 하나의 암 아형으로부터 다른 암 아형까지 현저하게 증가 또는 감소된 발현 수준을 갖는 조절 인자들이다. 하나의 암 아형에 특이적인 특이적 조절 인자들의 집합을 "암 아형 징표"로 부른다. 암 환자는 "외부 암 아형 징표"로 불리는 환자를 괴롭히는 암과는 상이한 암의 암 아형 징표를 환자에게 투여하여 치료될 수 있다.본 발명은 또한 하나 이상의 외부 암 아형 징표를 환자에게 투여하여 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 본 발명은 추가로 암을 예방하기 위하여 적어도 2개의 암 아형 징표들을 건강한 사람에게 투여하는 것을 고려하고 있다.

예를 들면, 만일 하나의 암 아형의 microRNA 징표 및 또 다른 암 아형의 또 다른 microRNA를 규명하였다면, 여기서 이들 2개의 암 아형에서 비교가능한 수준으로 존재하는 microRNA가 거의 없는 경우, microRNA의 2개의 클러스터들이 암환자 또는 암발생 위험이 있는 환자에게 투여되어 세포에게 혼합 신호를 전달함으로써 세포를 정지되고 비증식 상태로 되게 할 것이다. 유사한 접근으로서, 2개의 상이한 세포 형태를 유도하여 상이한 세포 운명으로 유도하는 적어도 2개의 상이한 microRNA 징표를 규명하였다. 즉, 첫번째 microRNA 세트는 세포를 신경세포로 분화하도록 유도하고, 두번째 microRNA 세트는 세포를 피부세포로 유도한다. 이들은 2개의 조절 신호들을 전달하여 암을 치료 또는 예방하기 위하여 환자에게 함께 투여되는 2개의 상이한 증식 고조 징표들일 수 있으며, 2개의 조절 신호들은 만일 미성숙한 분화중인 세포에게 전달될 경우 세포들을 정지 상태로 진행시켜 돌연변이종 발생을 예방한다. 또 다른 접근법으로서, 암을 치료 또는 예방하기 위해 전달되는 2개의 경쟁적인 조절 신호들은 만능성을 유도하는 microRNA의 첫번째 세트 및 분화를 유도하는 microRNA의 두번째 세트일 수 있다. 이들은 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 2개의 상이한 줄기세포 아형 징표들의 예이다. 또 다른 구현예에서, 환자는 오직 하나의 줄기세포 아형 징표, 예를 들면 이들의 줄기세포 유사 증식을 억제 가능한 환자 자신의 암세포의 암 아형 징표, 예를 들면 microRNA 징표와 대립하는 microRNA 세트를 구성하는 분자로 치료된다.

만능 줄기 세포는 궁극적으로 말기 분화된 성인 세포로 분화하는 세포들의 전구체인 전구세포들로 분화한다

본 발명자들은 만능 줄기세포에서 MUC1이 만능 성장 인자 수용체인 MUC1*에 클립(clip)되며, 상기 줄기세포들이 분화를 시작하자 마자 정지된 전장(full-length) MUC1로 전환된다는 것을 보고하였다. 본 발명자들은 또한 MUC1*으로의 MUC1 절단이 일부 중요한(key) 전구세포 단계에서 다시 재개하여 추가의 분화 이전에 특정 전구세포 개체를 확장시킨다는 것을 발견하였다. 예를 들면, 만능 성장 인자 수용체 MUC1*의 발현이 분화 개시 시점에 억제되지만, 조혈 줄기세포, 중성 줄기세포 및 망막세포를 포함한 기타 세포 상에서 다시 발현되며, 여기서 이들이 추가로 분화하기 이전에 중요한 하위 개체를 확장시킬 필요성이 있다. 전구세포 단계 이후의 다른 단계의 확장은 MUC1* 이외의 성장 인자 수용체들에 의해 조절된다.

전구세포들은 유한한 시간동안 분화를 중지시키고 추가 분화되기전에 이들의 하위 개체를 확장시킨다

본 발명자들은 이와 같은 줄기세포 유사 확장 기간을 "증식 고조(proliferation plateaus)"로 부른다. 줄기 세포 "증식 고조"는 줄기세포 또는 전구세포들의 아형 개체가 증가하는 특징을 갖는 성장을 의미하며, 여기서 보다 성장한 상태로의 분화는 일시적으로 정지된다. 상이한 하위 개체를 확장시키는 여러 증식 고조들이 존재하며, 각각의 증식 고조는 자가 복제 프로그램을 지시하는 조절 인자들의 세트로 특징된다. "증식 고조 아형 징표"는 증식 고조에서 줄기세포 또는 전구세포들의 아형에 특이적인 조절 인자들의 집합을 의미한다. MUC1*는 일부의 초기 전구세포들의 성장 및 분화 조절에 있어서 중요한 역할을 수행하지만, 다른 분화세포들은 그들 자신의 특이적인 증식 고조 아형 징표로 특징지워진다. 만능 줄기세포가 많은 수의 그들의 줄기세포 아형 징표를 MUC1*-포지티브 암세포의 암 아형 징표와 공유함에 따라, 다른 암 아형 징표들은 특이적인 증식 고조 아형 징표들과의 현저한 중첩을 갖게 될 것이다. 이의 성장 또는 분화경로가 거의 알려져 있지 않은경우 징표를 포함하는 조절 인자들을 규명하기 위하여 딥 시퀀싱 또는 총 전사체 분석과 같은 기술들이 징표를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명자들의 증거는 성숙 세포들이 증식 고조에서 잘못된 함정에 빠질때 암이 발생한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 암 아형 징표들은 암세포와 다양한 전구세포들 간의 분자 비교를 수행하여 규명될 수 있다. 각각의 암 아형 징표는 줄기세포 아형 징표 또는 증식 고조 아형 징표에 가까워질 것이다. 본 발명자들의 실험은 일부의 암세포 아형들이 또 다른 아형의 암세포 존재하에서 증식할 수 없다는 것을 보여준다. 각각의 특정 암세포 아형은 포획된 특정 증식 고조의 성장을 매개하는 프로그램을 시작하게 하는 제제를 분비한다. 암세포가 자체의 증식 고조, 이의 "증식 고조 아형 징표" 또는 이의 "암 아형 징표" 더하기 외부 증식 고조 또는 외부 암 아형 징표를 시작하게 하는 신호를 받으면, 세포들은 혼동스러워하면서 증식을 멈춘다. 이것은 세포(환자)들을 증식 고조 징표와 암 아형 징표 모두에게 공통되는 조절 인자를 갖거나 갖지 않는 외부 암 아형 징표 또는 증식 고조 징표로 처리할 경우 암 성장을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

MUC1*-포지티브 암세포들은 만능 줄기세포를 증식하게 하는 조절 네트워크에 포획된다. 그러므로, MUC1*-포지티브 암세포들의 암세포 아형 징표는 만능 줄기세포의 줄기세포 아형 징표와 매우 유사하다. 그러므로, MUC1*-포지티브 암 세포들이 만능성을 유도하는 조절 인자들을 분비하는 반면에, MUC1*-네거티브 암세포들은 상이한 전구세포 개체를 확장시키는 인자들을 분비하기 때문에 만능 유도 조절 인자들을 분비하지 않는다. MUC1*-네거티브 암세포의 암 아형 징표는 전구세포 개체 중 하나의 줄기세포 아형 징표와 매우 유사할 것이다. 2개의 줄기세포 형과 유사한 2개의 암세포 형들은 자가 복제 능력을 갖고 있지만, 이들은 상이한 조절 인자들에 의해 조절된다. 본 발명자들은 MUC1*-포지티브 암세포들의 층 또는 이들의 조건 배지(conditioned media)가 만능 줄기세포 성장을 위해 섬유아세포 피더 세포 또는 이들의 조건 배지 또는 bFGF의 필요성을 완전히 대체할 수 있다. 그러나, MUC1*-네거티브 암 세포들 또는 이들의 조건 배지들은 만능 줄기 세포의 성장을 지지할 수 없다. 이것은 MUC1*-네거티브 세포들의 암 아형 징표의 조절 인자들을 혼합하는 것이 만능 줄기 세포의 줄기세포 아형 징표의 인자들을 방해하며, 혼합 신호는 줄기세포를 정지상태 또는 사멸 상태로 유도한다는 것을 의미한다. 본 발명자들은 만능 줄기세포와 MUC1*-포지티브 암세포들이 함께 배양 가능하며, 각각은 상대방의 조건 배지에서 성장할 수 있고, 이들의 아형 징표들이 매우 가깝다는 것을 밝혀내었다. 그러므로, MUC1*-포지티브 암세포들의 암 아형 징표가 만능 줄기세포의 정지 및 사멸을 유발하기 때문에 이들은 MUC1*-포지티브 암세포의 정지 및 사멸을 유발할 것이다. 이와 같은 발견은 암들이 줄기세포 또는 전구세포 "증식 고조"에 포획된 성숙 세포 개체에 의해 유발된 집합이며, 암들은 상이한 암 아형 징표의 조절 인자 또는 상이한 줄기세포 아형 징표의 조절 인자들을 환자에게 투여하여 효과적으로 치료될 수 있다는 결론은 지지한다.

반대의 실험에서, 본 발명자들은 MUC1*-포지티브 암 세포들이 만능 중기 세포의 조건 배지에서 배양시 일반적으로 증식하지만, 새롭게 분화중인 줄기세포의 조건 배지에서 배양시 정지상태로 진행되며 증식하지 않는다는 것을 관찰하였다. 이와 같은 발견은 줄기세포를 역분화 암세포로 분화시킴으로써 조절 인자들이 발현되어 이들이 분화되고 자가 재생능력을 소실하기 때문에 이들이 증식하지 못한다는 생각과 일치한다.

이와 같은 발견은 또한, 돌연변이 발생을 억제하도록 자연이 기작을 발전시킨다, 즉 혼합된 신호를 받는 분화중인 줄기세포들이 정지 상태로 진입하고 증식을 하지 않는다는 생각과도 일치한다. 예를 들면, 혈액 세포가 되도록 지시하는 신호와 근육세포가 되도록 지시하는 또 다른 신호를 동시에 받은 줄기세포는 세포가 추가로 분열하지 못하도록 기본설정된(default) 프로그램을 유발시킨다. 암세포는 분화를 지시하는 프로그램을 소실한 줄기세포이기 때문에, "혼합" 증식 고조 신호를 세포에게 보내어 이와 같은 세포들을 정지상태로 진입시키고 증식을 멈추게 한다.

만능 줄기세포를 배양하는 본 기술분야의 현존 방법은 섬유아세포 "피더" 세포 더하기 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 조건 배지에서 또는 조절배지 층 상에서 이들을 증식시키는 것이다. 만일 암세포들이 줄기세포와 유사하고 이들의 성장 및 분화 상태가 만능성을 유지시키는 여러개의 제제들에 의해 조절된다는 것이 맞다면 본 발명자들은 줄기세포들이 암세포의 조절배지에서 또는 조절배지의 층 상에서 성장할 수 있다는 것을 도출하였다. MUC1*이 줄기세포 및 암세포의 성장과 분화의 주요한 조절자이기 때문에, 본 발명자들은 MUC1*-포지티브 암세포로부터의 조건 배지가 줄기세포를 만능 상태로 성장 및 유지시키는데 있어서 최선일 것이라고 예상했다. 본 발명자들의 실험은 만능 줄기세포가 MUC1*-포지티브 암세포로부터의 조건 배지에서 잘 성장하지만 MUC1*-네거티브 암세포로부터의 조건 배지에서는 성장하지 않는다는 것을 입증하였다. 이와 같은 발견은 암들이 전구세포 증식 고조에 포획된 성숙 세포들의 개체에 의해 기본적으로 유발된 질병들의 집합이라는 발명자들의 생각을 확인하였다.

자연은 돌연변이 유발을 예방하는 기작을 발달시켜왔다. 즉, 혼합 신호를 받은 분화중인 줄기세포들은 정지 상으로 진입하고, 복제하지 않는다. 예를 들면, 혈액세포로 되도록 하는 신호와 근육세포로 되도록 하는 또 다른 신호를 동시에 받은 줄기세포는 세포가 추가로 분열하지 못하도록 기본설정된 프로그램을 유발시킨다. 암세포들은 줄기세포와 유사하도록 역분화된 성숙 세포이기 때문에, 암세포에게 하향 작동하도록 하는 신호와 충돌하는 "혼합" 신호를 세포에게 전달함으로써 암세포를 정지상태로 가게 하고 복제를 중지시킬 수 있다. 이와 같은 가설을 뒷바침하는데 있어서, 연구자들은 만능 줄기세포로 동물을 면역화시키는 것이 이들의 대장암 형성을 억제한다는 사실을 최근에 보고하였다. 여기서, 만능 줄기 세포에 의해 주어진 만능 신호들은 기본적인 방법에 있어서 암세포들의 부분 분화 신호들과 충돌하였다.

본질적으로, 만능 줄기세포들이 증식한 후 자기네 방식대로 분화하여 완전한 성숙 세포가 되며, 이들은 최종적으로 분화가 완료된 세포들로 불린다. 이와 같은 만능성을 최종적으로 분화되도록 하는 경로에 따라서, 중요한 전구세포 단계에서 분화의 다음 단계로 진입하기 이전에 세포 개체를 확장시키기 위한 요구가 있는 증식 고조가 존재하는 것으로 보인다. 세포의 프로그래밍이 혼란스럽게 될 경우 암은 질병의 집합을 구성하고, 암은 다양한 줄기세포 유사 증식 고조중 하나에 포획된다는 것이 본 발명자들의 가설이다. 만일 이와 같은 가설이 사실일 경우, 그리고 암세포들이 줄기세포 유사 증식 신호를 동시에 전달하여 정지 상태로 진입할 수 있을 경우, 상이한 종류의 암세포들로부터의 조건 배지가 일부의 프로그래밍 인자들을 포함하고, 상이한 형태의 암세포들을 함께 배양하면 증식을 억제하는 혼합 신호들을 세포가 받게 할 것이다.

이와 같은 이론의 타당성을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 여러 형태의 암 세포들이 암세포의 다른 형태가 존재시 성장할 수 있다. 본 발명자들은 만능 줄기세포들이 성장을 위해 MUC1* 수용체를 통한 신호전달을 요구하기 때문에, MUC1*-포지티브 암들은 완전한 줄기세포 유사 행동에 대한 경로를 따라서 떨어져 있는 암들의 카테고리를 구성할 수 있고, MUC1*-네거티브 암들이 상이한 부류일 수 있다는 점을 해명하였다. 그러므로 본 발명자들은 암 세포의 반대 형태의 조건 배지에서 MUC1*-포지티브 또는 MUC1*-네거티브 암세포들을 성장시켰다. 도 12는 U87 세포(MUC1*-포지티브 신경교종)이 LnCAP 세포(MUC1*-네거티브 전립선암 세포)로부터의 조건 배지 존재하에서 성장할 수 없다는 것을 나타내고 있다. 그러나, U87는 MUC1*-포지티브 암 세포주 T47D의 조건 배지에서는 정상적으로 성장한다(실시예 8). 상기 세포들은 192시간(8일)동안 배양되었으며, 약 96시간(4일)째에 주목할만한 성장 차이가 나타났으며, 이는 변화 유발을 신호하는 microRNA 네트워크에 대해 필요한 시간에 관한 앞서 발표한 보고서들과 잘 부합된다. MUC1*-포지티브 암세포로부터의 조건 배지에서의 U87 성장과 MUC1*-네거티브 암세포에서의 U87 성장과는 10 이상의 차이가 있으며, 이는 하나의 암 아형에서 조절 신호를 전달하는 요소들이 이와는 상이한 암 아형의 성장을 억제한다는 것을 증명한다. 각 암세포 형태가 성장을 위해 자체의 추천 배지를 갖기 때문에 세포 성장에 대한 상이한 배지의 어떠한 효과를 보정함으로써 모든 암세포들이 동일한 배지에서 성장할 수 있었다는 점을 주지하여야 한다. 즉, 배지의 50%가 플레이트 상에서의 세포 성장을 위해 추천된 배지이고, 나머지 50%의 배지가 조건 배지와 같은 다른 세포 형태가 성장하는 배지이다.

분화를 개시하는 제제를 세포/환자에게 투여함으로써 자가 복제 공정을 중지시키고 암세포 성장을 중지시켜 암을 치료할 수 있다

도 13은 U87 세포(MUC1*-포지티브 신경교종)는 MUC1*로 감염될 경우(FLR) MUC1*-네거티브 대장암 세포 HCT-116으로부터의 조건 배지에서 성장하고, 공벡터(empty vector)로 형질감염될 경우 성장하지 않는다는 것을 나타내고 있다. 이와 같은 관점에 추가하여, 본 발명자는 U87 세포들을 MUC1*-네거티브 암세포의 조절배지에서 배양하거나 또는 MUC1* 암호화 유전자로 형질감염된 HCT-116 세포의 조건 배지에서 배양하였다. 도 13은 공벡터(empty vector)("HCT-벡터")로 형질감염된 MUC1*-네거티브 대장암 세포주 HCT-116의 조건 배지는 약 96시간 후에도 MUC1*-포지티브 U87 세포의 성장을 허락하지 않았으며, 96시간은 microRNA 조절 네트워크를 활성화시키기 위해 요구되는 시간이다. 대조적으로, MUC1* 암호화 벡터("HCT-MUC1*")로 형질감염된 것 이외에는 동일한 세포주 HCT-116으로부터의 조절배지는 U87의 성장을 허락하였다(도 13). 모든 세포들은 플레이트 상의 세포에게 추천되는 배지와 조건 배지에 기여하는 세포를 위해 사용되는 배지가 50/50으로 혼합된 동일한 배지에서 성장되었다는 점을 주지하여야 한다. "조절" 세포들은 U87 배지와 최소 줄기세포 배지가 50/50으로 혼합된 배지에서 배양된다.

도 14A-14B는 T47D 세포(MUC1*-포지티브)는 다른 MUC1*-포지티브 암세포의 조절배지에서 증식하고(도 14A), 이들은 새롭게 분화중인 줄기세포로부터의 조절배지에서는 증식하지 않는다(14B)는 것을 도시하고 있다. T47D 세포는 MUC1*-포지티브인 미분화된 줄기세포로부터의 조건 배지에서 배양후 6일째에 정지상태에 도달하였으며, 이는 암 및 만능성 신호의 혼합이 전달되어 성장 정지 상태를 유발시킨다.

*암세포에서 실종된 성숙한 또는 성숙중인 세포들의 조절 제제 규명

만능성을 주관하는 microRNA를 규명하기 위하여, 발명자는 만능 세포에서는 상향 조절되지만 분화된 세포에서는 하향 조절되는 microRNA를 규명하기 위해 딥 시퀀싱과 같은 표준 기술을 수행할 수 있다. 또한, microRNA들은 성숙 세포에서 상향 조절되면 안되고, 만능 줄기세포에서 이들 microRNA가 하향 조절되면 분화를 유도하여야 한다. 이와 같은 microRNA들은 공격적인 암에 존재할 수 있다. 분화를 주도하는 microRNA를 규명하기 위하여 본 발명자는 만능 상태에서는 존재하지 않지만 분화중인 줄기세포에서 높게 발현되거나 MUC1*과 같은 만능성 중재자가 길항될때 높게 발현되는 microRNA의 샹향 조절을 찾았다. 이와 같은 microRNA는 공격적인 암에서 하향조절되었다.

상이한 아형의 암을 특이적으로 규명하는 microRNA를 규명하기 위하여, 본 발명자는 암 아형에만 존재하고 건강한 성숙 세포에서는 존재하지 않으며, 하향 조절될때 특정 암 아형의 성장을 억제하는 microRNA를 규명하였다. 암 아형을 규명하는 microRNA는 증식중인 줄기세포 또는 전구세포에서도 존재할 수 있다. 전사체 분석, 딥 시퀀싱, ChIP 분석 뿐만 아니라 목표 유전자를 억제하는 microRNA의 서열을 예측하는 컴퓨터 방법 및 프로그램들이 microRNA를 규명하기 위해 사용 가능하다. 암들을 분류하는 한 방법으로는 암들이 MUC1*-포지티브 또는 네거티브인지를 규명하는 것이다. 미분화세포, 분화세포 및 암 아형들을 특이적으로 규명하는 유전자 및 유전자 산물들은 유사하게 규명된다. microRNA가 암의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 것 이외에, 특이적인 microRNA 식별자가 발현될때 발현되는 유전자 또는 단백질들이 microRNA 대신에 투여될 수 있다. 목표하는 microRNA를 상향조절시키는 소분자들, 유전자 또는 유전자 산물들이 치료제로서 대안으로 사용될 수 있다.

핵산, microRNA, 또는 단백질들과 같이 새롭게 분화중인 줄기세포에서 우세한 조절 클러스터 신호를 전달하는 인자들의 조합들이 새로운 종류의 암 백신으로서 투여될 수 있다. 상이한 암 아형에서 우세한 이와 같은 인자들의 조합들은 새로운 형태의 암 백신으로서 투여될 수 있다.

MUC1*로 형질감염된 MUC1-네거티브 암세포들은 이들이 혼합된 기초 신호들을 전달하기 때문에 암 백신으로서 투여될 수 있다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예들에 의해 범위를 제한하려는 의도는 없다. 실로, 본 명세서에 기술된 것들 이외의 본 발명에 대한 다양한 변형들은 기술되어질 내용들 및 첨부된 도면들로부터 당업자들에게 명백한 내용들일 것이다. 이와 같은 변형들은 첨부된 청구항들의 범위내에 포함될 것이다. 하기의 실시예들은 본 발명의 예시를 위해 제공되는 것으로, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.

실시예

실시예 1. MUC1 * 또는 NM23은 miR -145의 발현을 유도하고 분화를 유발시킨다.

인간 배아 줄기세포 H9를 마트리겔(Matrigel)상에서 a) 4ng/ml bFGF와 마우스 섬유아세포 피더 세포(MEF)로부터의 50% 조건 배지의 표준방법; 또는 b) 최소 줄기세포 배지에서 8nM NM23-S120G; 또는 c) 80ng/ml 토끼 폴리클로날 항-MUC1* 항체(완전 PSMGFR 서열에 대한 항체)에 의해 3회 계대배양하였다. 최소 줄기세포 배지(MM) 500 mL 조성은 400 ml DME/F12/GlutaMAX I(인비트로겐(invitrogen) #10565-018), 100 ml 넉아웃 혈청 대체(인비트로겐 #10828-028), 5 ml 100x MEM 비필수적 아미노산 용액(인비트로겐 #11140-050), 0.9 ml(0.1mM) 베타-머캡토에탄올(55mM 스탁, 인비트로겐 #21985-023-선택적), 2.5 ml PSA(페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신) MP 바이오켐(#1674049 선택적)이다.

이와 같은 3개의 방법을 사용하여 성장한 만능 줄기세포들은 각각 bFGF, NM23-S120G, 또는 항-MUC1* 항체를 억제함으로서 분화를 유도하였다. 또 다른 실험에서 M23-S120G를 억제하는 것 이외에, 합성 PSMGFR 펩티드를 (b) 방법에 따라 성장하는 세포에 첨가하여 NM23에 결합시키고 MUC1*과의 상호작용을 억제하였다. 각 조건들의 3회씩 배양하여 3개의 상이한 시간 지점; 48, 96, 144시간에서 RNA를 추출하였다. 세포들은 펠릿화되고 냉동되었다. 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 mirVana^TM 키트(Applied Biosystems, P/N: AM1561)를 사용하여 시료로부터 추출되었다. 각각의 총 RNA 시료를 위해서, TaqMan® MicroRNA 역 전사 키트(Applied Biosystems, P/N: 4366596) 및 내생성 조절을 위해 제공되는 miR-145와 소핵 RNA U6B(RNU6B)에 특이적인 2개의 상이한 스템-루프(stem-loop) 프라이머를 사용하여 2개의 cDNA 시료를 합성하였다. cDNA 시료내 miR-145 및 RNU6B의 정량은 제조사의 지침에 따라 TaqMan® MicroRNA 분석(Applied Biosystems, P/N: 4427975)을 사용하여 수행되었다. 실시간 PCR 데이터는 비교 Ct 방법을 사용하여 분석하였다. 각 시료내 miR-145의 상대양은 miR-145 Ct 및 해당 RNU6B Ct(ΔCt)간의 차이를 컴퓨터로 계산하여 수득되었다. 2차 표준화는 데이터 세트(ΔΔCt)에서 다른 것들 모두로부터 가장 작은 ΔCt를 추출하여 수행되었다.

표준과 비교하여 각 시간 지점에서의 miR-145의 발현양을 도 1의 그래프로 나타내었다. microRNA miR-145가 만능성을 분화되게 하는 분화를 조절하는 주요한 microRNA인 것을 상기하고자 한다. 상기 그래프는 NM23에 결합하여 이의 작용을 억제하는 PSMGFR 펩티드를 첨가하여 보통 상태보다 발현을 현저히 높은 수준의 발현으로 miR-145의 발현을 증가시키고, 일반적인 방법의 상태에서 일반적인 144시간 때 보다는 오히려 96시간때에 가장 높았다는 것을 나타내고 있다. 이와 같은 조기 향상된 miR-145의 발현은 줄기세포의 분화를 촉진하고, 이들의 분화를 동시발생적으로 만들며, 이는 기능 세포의 개체를 수득하기 위한 분화를 지시하는데 있어서 중요하다. NM23 또는 항-MUC1*의 억제는 공지의 FGF 성장 방법의 상태를 조절하는 것 보다 빨리 miR-145 발현을 유발시켰다는 점을 주지해야 한다.

실시예 2. 특이적인 다량체 특성을 갖는 NM23 야생형 및 변형체들의 발현 및 특징화

NM23-S120G 클로닝

WT NM23-H1 cDNA를 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 증폭하였다: 5'-atc gat gga tcc gat ggc caa ctg tga gcg tac c-3'(서열번호 2) 및 5'-gtg gtg ctc gag ttc ata gat cca gtt ctg agc-3'(서열번호 3)(통합 DNA 기술). BamHI과 XhoI 제한효소(New England Biolabs)로 절단후, 정제된 분획을 동일한 제한효소로 절단된 pET21b 벡터(Novagen)로 클로닝하였다. pET21b 벡터는 N-말단 T7-태그 서열, C-말단 HiTag® 서열 및 T7 프로모터로 유도된 클로닝 목표 발현물을 포함한다. 서열 확인 후, 본 발명자들은 하기의 제조사 지침에 따라 GeneTailor^TM 위치-지시 돌연변이유발 시스템(Invitrogen)을 사용하여 NM23H1 돌연변이 S120G(세린 #120이 글리신으로 돌연변이됨)을 생성하였다. 돌연변이 생성 반응은 다음의 프라이머를 이용한 31.25ng의 메틸화 DNA 주형을 사용하여 수행되었다: 프라이머: 5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'(서열번호 4) 및 5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'(서열번호 5). PCR 반응은 95℃에서의 2분의 변성 단계 이후 다음의 3단계 사이클링(x35)dmfh 구성된다: 95℃에서 15초동안의 변성, 58℃에서 30초동안의 어닐링 및 68℃에서 10분동안의 연장. 증폭된 단편은 DH5α^TM-T1^R 세포(Invitrogen)로 클로닝되고, 플라스미드 추출 및 서열 분석을 위해 다수의 클론들이 선택되었다. 돌연변이를 포함하는 포지티브 클론은 재조합 단백질 발현을 위해 BL21(DE3) 세포(Invitrogen)로 최종적으로 형질전환되었다.

NM23-WT(야생형) 클로닝

WT NM23-H1 cDNA를 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 증폭하였다: 5'-atc gat gga tcc gat ggc caa ctg tga gcg tac c-3'(서열번호 2) 및 5'-gtg gtg ctc gag ttc ata gat cca gtt ctg agc-3'(서열번호 3)(통합 DNA 기술). BamHI과 XhoI 제한효소(New England Biolabs)로 절단후, 정제된 분획을 동일한 제한효소로 절단된 pET21b 벡터(Novagen)로 클로닝하였다. pET21b 벡터는 N-말단 T7-태그 서열, C-말단 HiTag® 서열 및 T7 프로모터로 유도된 클로닝 목표 발현물 I을 포함한다. 플라스미드 추출 및 서열 분석을 위해 여러개의 클론들이 선택되었다. 포지티브 클론은 재조합 단백질 발현을 위해 BL21(DE3) 세포(Invitrogen)로 형질전환되었다. 야생형 단백질이 발현되고, 분비된 단백질이 수집된 후 His Gravitrap^TM 1mL 컬럼(GE healthcare) 상에서 친화 정제되었다.

NM23-S120G 및 NM23-WT 발현/정제

500 mL LB 브로스(Luria-Bertani 브로스)에 하나의 콜로니를 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 다음날 1L의 LB에 100 mL의 배양액을 접종하고, OD600이0.5에 다다를때까지 37℃에서 배양하였다. 이 시점에, 0.4mM 이소프로필-β-D-티오-갈락토시드(IPTG, Sigma)를 사용하여 재조합 단백질 발현을 유도한 후 4시간째에 배양을 정지하였다.

정제 프로토콜#1: 발현 단백질의 수집 및 정제

원심분리(4℃, 6000 rpm에서 10분)를 통해 세포 수확후, 세포 균체를(350mL 배양액으로부터) 100 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 100 mM 벤즈아미딘 함유 BugButerTM mater 혼합물 30 mL에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 회전 플랫폼(275 rpm)상에서 25℃에서 10분동안 배양한 후 불용성 세포 잔해를 원심분리(4℃, 20000rpm에서 30분)로 제거하였다. 맑게 정제된 용해물을 40 mM 이미다졸로 보충하고, 하기의 런닝 버퍼(running buffer)로 평형화된 His Gravitrap^TM lmL 컬럼(GE healthcare) 상에 로딩하였다: pH 7.4의 포스페이트 버퍼 식염수(PBS), 40mM 이미다졸 및 0.05% 트윈 20. 이후, 280nm에서 흡광도가 0.01 이하일때까지 컬럼을 런닝 버퍼로 세척하였다, 이후, 500 mM 이미다졸을 함유하고 있는 PBS pH 7.4로 컬럼을 용출하여 2mL 단백질 함유 분획을 수득하였다. 단백질 함유 분획을 결합하고, 0.1mg/mL의 PBS pH7.4로 희석한 후 PBS pH7.4에 대해 투석을 실시하였다. 이후 단백질을 정제하고 80℃에서 저장하였다.

이와 같은 프로토콜은 다양한 결과들을 야기하였다. 2개의 일반적인 결과물중 어떤 결과물이 발생했는지를 측정하기 위하여 각 배치로부터의 단백질은 FPLC와 천연 겔을 통해 특성을 파악할 필요가 있었다. 2개의 일반적인 결과물은 1) 약 50% 이량체 더하기 일부의 4량체 및 6량체; 또는 2) 10% 헥사머이다.

정제 프로토콜 #2: 재접힙(refolding) 및 정제된 프로토콜은 100% 이량체인 NM23-S120G를 생성한다.

원심분리(4℃, 6000 rpm에서 10분)를 통해 세포 수확후, 세포 균체를(350mL 배양액으로부터) PBS pH 7.4, 360mM NaCl 및 80mM 이미다졸로 구성된 런닝 버퍼로 재현탁하였다. 이후, 리소자임(1mg/mL, Sigma), MgCl₂(5mM) 및 DNAse(5μg/ml)를 첨가하였다. 세포현탁액을 회전 플랫폼(275 rpm)상에서 37℃ 하에 30분동안 배양한 후 5분동안 얼음 상에서 초음파처리(30%에서 5초동안 전기를 제공하고 10초동안 전기를 차단하여)하였다. 불용성 세포 잔여물을 원심분리(4℃, 20000rpm에서 30분)를 통해 제거하였다. 이후 세정 용해물은 런닝버퍼로 평형화된 NiNTA 컬럼(5 mL, Qiagen)에 적용된다. 420 mM 이미다졸이 보충된 런닝버퍼 8CV를 이용하여 단백질(5mL 분획)을 용출하기 이전에 6CV(컬럼 용적)의 런닝 버퍼로 컬럼을 세척하였다. 용출 분획은 비환원 SDS-PAGE 상에서 분석하고, 단백질 함유 분획을 혼합하고 7.5 mL까지 농축하였다. 7.5 mL의 변성 버퍼(100 mM Tris pH 8.0 및 8M 우레아)를 단백질에 첨가한 후 생성된 분획을 반으로 농축시켰다. 이 공정을 2회 반복하여 최종적으로 7M 농도의 우레아를 수득하였다. 이후, 변성 단백질을 투석하여 재구성하였다. 단백질은 다음과 같은 용액에 대해 24시간동안 연속적으로 투석되었다: 1) 100mM Tris pH8.0, 4M 우레아, 250mM 이미다졸, 0.4M L-아르기닌, 1mM EDTA 및 5% 글리세롤, 2) 100mM Tris pH8.0, 2M 우레아, 100 mM 이미다졸, 0.4M L-아르기닌, 1mM EDTA 및 5% 글리세롤 및 3) 100mM Tris pH8.0, 1M 우레아, 100 mM 이미다졸, 0.4M L-아르기닌, 1mM EDTA 및 5% 글리세롤. 이후 단백질을 100mM Tris pH8.0, 100 mM 이미다졸, 0.4M L-아르기닌, 1mM EDTA 및 5% 글리세롤 용액에 대하 9시간동안 및 25mM Tris pH8.0, 100 mM 이미다졸, 0.1M L-아르기닌, 1mM EDTA 및 5% 글리세롤 용액에 대해 하룻밤동안 투석하였다. 마지막으로, 단백질을 PBS pH7.4, 100 mM 이미다졸, 1mM EDTA 및 5% 글리세롤 용액에 대해 하나의 버퍼만 교환하면서 24시간동안 투석하였다.

재구성된 단백질은 비환원 SDS-PAGE 상에서 분석되었고, 이량체(~37KDa)의 존재가 관찰되었지만, 고분자량 올리고머 또는 존재가 관찰되었다. 런닝버퍼로서 PBS pH7.4를 사용하여 Akta 정제기 10(GE healthcare) 상에서 Superdex 200 10/300 Gl 컬럼(GE healthcare)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 이량체를 추가로 정제하였다. 이와 같은 정제단계는 100% 이량체 형태에 근접하는 순도를 갖는 재구성된 NM23-H1 S120G 이량체를 분리하는데 있어서 매우 효율적이다.

NM23-야생형 및 S120G 돌연변이체의 FPLC 특성화

각각의 다량체화 상태, 특히 이량체의 백분율을 측정하기 위하여 NM23-S120G 또는 NM23-WT의 여러개의 상이한 프렙 정제물들을 시험하였으며, 이는 이의 세포외 도메인의 이량체화를 통해서 MUC1* 성장 인자 수용체 경로를 활성화시키기 때문이다.

500 μl의 각 시료를 Superdex 200 10/300 GL FPLC 장치에 로딩하였다. NM23-WT는 0.17 mg/ml로, NM23-S120G(6량체 배치)는 0.19 mg/ml로 로딩되고, NM23-S120G(이량체 배치)는 0.15 mg/ml로 로딩되었다.

도 2는 FPLC 미량물질의 오버레이를 도시하고 있다. NM23-WT는 95 Kda에서 주요한 피크를 갖고 있으며 이는 주로 6량체로 구성되어 있음을 의미하고; 분비된 단백질로부터 수집된 NM23-S120G의 배치(batch)는 6량체에 대응하는 95 Kda에서 주요한 피크를 가지며, 또 다른 NM23-S120G의 배치는 30 Kda에서 주요 피크를 갖고 66Kda(4량체) 및 95Kda(6량체)에서 작은 피크를 나타내어 약 50%의 이량체로 구성되는 것을 나타내며; 변성된 재구성 NM23-S120G(프로토콜 #2)는 30KDa(이량체)에서 주요 피크를 생산하고, 15KDa(단량체)에서 작은 피크를 생산하였다. 재조합 단백질은 친화 태크(affinity tag)의 중량을 포함하여 19.1KDa의 산출 분쟈량을 갖는다.

비변셩의 비환원성 겔 분석은 상이한 NM23-S120G의 프렙과 비교하여 NM23-WT(야생형)의 다중체화 상태를 나타낸다.

NM23-WT 및 NM23-S120G 프렙들(분비된 것 대 재구성된 것)의 다양한 시료들을 비변성겔 또는 비환원겔 상에서 분석하여 다양한 발현 또는 재구성 방법들의 다중체화 상태를 측정하였다. 비변성 겔 상에서 다양한 NM23 다중체들의 분자량들이 직접 시각화된다. 비환원 겔 상에서, 이량체는 이황화결합에 의해 온전하게 유지되며 약 37KDa의 겉보기 분자량으로 전진하며, 반면에 6량체는 약 200KDa의 겉보기 분자량으로 전진한다(이황화 결합의 소실로 인한 단량체). 도 3A에 도시된 모체겔(native gel)은 NM23-WT가 주로 6량체로 구성되어 있고, 분비된 NM23-S120G의 1 배치가 본질적으로 100% 6량체로 구성되어 있는 반면에 다른 배치는 일부 4량체와 단량체를 포함하여 약 50%의 이량체로 구성되어 있는 것을 나타낸다. 변성 후 재구성된 프로토콜은 일부의 4량체, 6량체 및 단량체가 존재하고, 70-80%의 이량체로 구성된 NM23-S120G를 생성하였다. 약 70-80% 이량체를 유발한 변성 및 재구성 NM23-S120G 프렙은 겔 여과를 통해 100% 이량체로 정제되었다. 도 3B 참조. 4mg/ml-0.1mg/ml로 시료가 로딩된 농도는 NM23이 세포에 존재하거나, 섬유아세포로부터의 조건배지에 존재하거나, 또는 미분화 줄기세포의 성장을 촉진하는 생리적으로 관련된 농도에 비해 수천배 더욱 농축되어 있다는 것을 주지해야 한다. 그러므로, 6량체 프랩 및 야생형 프랩은 이들이 겔이 나타내는 것보다 더욱 많은 이량체들을 포함하도록 보다 낮은 농도하에서 평형을 이룰 수 있다. 하기 실시예에서 기술된 2개의 SPR 시험들이 이와 같은 결론을 뒷바침한다.

칩상에 고정된 MUC1* 세포외 도메인 펩티드(PSMGFR)에 결합한 다양한 NM23 다중체들의 표면 플라즈마 공명(SPR) 측정.

바이오칩은 Bamdad, C.의 방법에 따라 표면이 벗겨지고 자기조립단층박막(self-assembled monolayers)(SAMs)으로 코팅되었다. 다양한 밀도의 자기조립단층박막은 목표 분자의 구조를 탐침하기 위해 사용된다. Biophys J. 1998 Oct;75(4):1989-96. NTA-Ni-트리-에틸렌 글리콜 SAM은 3.8% NTA-Ni를 나타내도록 형성되었다. 히스티딘 태깅된 PSMGFR 펩티드는 칩 표면 상으로 유동되고 포화될때까지 고정화되었다. 이후, NM23-WT 또는 NM23-S120G(60% 이량체)의 각각의 상이한 프렙들을 안정한 펩티드 표면상으로 주입하였다. NM23-WT 또는 NM23-S120G는 4, 8, 16, 32 및 64 nM의 5개 농도로 펩티드 표면상으로 유동하였다. 도 4에 도시된 생성된 결합 커브는 결합양이 NM23의 농도가 증가함에 따라 선형적으로 증가한다는 것을 도시하고 있다. 그러나, 야생형(WT) 단백질은 가장높은 농도에서 150RU 결합을 보인(도 4A) 반면에 60% 이량체 프렙은 거의 400RU를 나타내었다(도 4B). 이와 같은 결과는 NM23의 이량체 형이 MUC1* 세포외 도메인 펩티드에 우선적으로 결합한다는 것을 나타낸다. 추가의 분석은 NM23 6량체가 MUC1* 펩티드와 전혀 결합하지 않으며, 100RU의 결합은 이량체로 존재하는 프랩의 소분자를 나타낸다는 것을 의미한다. 이와 같은 해석과 동일하게, 동적 분석도 2개의 상이한 프렙들로부터 결합된 종들(species)에 대해서 매우 유사한 온앤오프(on and off) 비율을 나타내었다.

상이한 이량체 분율을 나타낸 다른 NM23-S120G 프렙들은 히스티딘 태깅된 PSMGFR 펩티드 층이 고정화된 트리에틸렌 글리콜 종결된 C11 티올의 배경에 3.8%(도 5A) 또는 5.7%(도 5B)의 NTA로 구성된 SAM으로 코팅된 SPR 칩에 대한 결합에 대해 분석되었다. 도 5는 100% 6량체를 생성하는 프랩들이 60% 이량체(408RU) 및 70% 이량체(547RU) 프렙들과 비교하여 매우 적게 결합된다는 것을 도시하고 있다. 이와 같은 결과들은 MUC1* 세포외 도메인 펩티드(PSMGFR) 층에 결합하는 양이 순수하게 이량체 농도의 함수라는 것을 추가로 증명한다. 삽입물은 각각의 NM23 프렙에 존재하는 이량체의 양을 정량하는 비환원성 겔을 나타낸다(도 5C).

대조 실험에서, 무관한 펩티드가 동일한 칩 상에 고정되고, 최소량의 결합 배경이 생성되며, 이는 도시된 측정으로부터 추출되어졌다.

실시예 3. 인간 배아 줄기세포의 분화 상태 상에서의 상이한 NM23 다중체 상태의 효과: 이량체는 만능 성장을 촉진시키고, 돌연변이 NM23 또는 야생형 NM23으로부터의 6량체는 분화를 유도한다.

만능 줄기세포 성장에 대한 NM23의 다중체화 상태 효과를 시험하였다. 재조합 NM23-S120G는 발현, 재구성 또는 정제되어 1) 100% 이량체; 2) 100% 6량체; 또는 3) 50% 이량체로 구성된 개체를 수득할 수 있다. 직접 결합 데이터는 6량체 형태가 MUC1*의 세포외 도메일 서열을 갖는 합성 펩티드와 결합하지 않는다는 것을 나타내고 있다는 것을 기억하라(실시예 2). 또한, 상기 S120G 돌연변이체의 3개 프렙들에 대해 NM23-WT(야생형)는 FPLC 및 모체겔(native gel)에 의해 제조 및 특징화된다. NM23-WT는 대부분 6량체로 구성되어 있음을 나타낸다. 그러나, 이와 같은 분석들이 줄기세포에 의해 분비되는 농도보다 더 높은 농도에서 수행되었음을 기억한다면, 본 발명자들은 그러므로 농도가 증가함에 따라 개체가 6량체 형태로 빠르게 이동할때까지 야생형은 단량체, 이량체, 4량체 및 6량체로 구성되어 있을 것으로 예상한다.

4개의 NM23 프렙들이 줄기세포 최소 배지에 독립적으로 첨가되었으며, 12.5μg의 항-MUC1* 세포외 도메인 항체로 코팅된 Vita(Thermo Fisher, Waltham, MA) 세포 배양 플레이트 상에 도말된 인간 H9 배아 줄기세포를 배양하기 위해 사용되었다. 또한, NM23에 대한 결합에 의해 NM23 및 MUC1* 수용체간의 상호작용을 억제하기 위하여 MUC1* 세포외 도메인 펩티드(PSMGFR) 서열을 갖는 합성 펩티드가 NM23-S120G 100% 이량체 프렙을 수용하는 세포에게 첨가되었다. 유사하게, MUC1* 수용체에 결합하여 NM23 및 MUC1*간의 상호작용을 경쟁적으로 억제하기 위하여 항-MUC1* 항체의 Fab가 NM23-S120G 100% 이량체 프렙에서 배양된 또 다른 세포 정제물에 첨가되었다.

3일째 취해진 줄기세포의 사진이 도 6에 도시되어 있다. 결과적으로, 3일후 NM23-S120G 100% 이량체 프렙은 줄기세포를 가장 빠르게 성장시키고 완전히 미분화된 상태로 성장시킨다는 것을 보여준다(도 6A). PSMGFR 펩티드(도 6B) 또는 항-MUC1* Fab(도 6C)에 의해 상호작용이 억제될 경우 줄기세포들은 매우 빨리 분화된다. 즉, NM23을 억제하는 효과 또는 MUC1* 세포외 도메인을 억제하는 효과는 동등하고, 이와 같은 줄기세포 배치들간에 차이가 없게 검출되었다. NM23-S120G의 100% 6량체 프랩(도 6D)에서 성장하는 세포는 거의 분화되지 않았으며, 이는 NM23-WT(야생형)(도 6E)에서의 성장 효과와 구별할 수 없었다. 50% 이량체인 NM23-S120G 프랩에서 배양된 줄기세포들은 일부의 분화를 갖고 있지만(도 6F), 야생형 NM23의 6량체에 의해 유발된 것처럼 적극적으로 분화되지는 않았다.

이와 같은 결과들은 이량체 NM23이 MUC1* 수용체를 활성화하여 만능 성장을 촉진하고 분화를 억제하는 형태라는 것을 확인시켜준다. 또한 이와 같은 결과는 상기 상호작용을 억제시키는 것이 분화를 개시한다는 것을 나타내고 있다. 또한, 이와 같은 결과들은 야생형 NM23이 자가조절 피드백 루프에 포함되어 있으며, 자가조절 피드백 루프에서 예를 들면 단백질을 분비하는 모든 줄기세포의 수가 증가함으로써 NM23 농도가 증가할 수록 MUC1* 수용체에 결합하지 않고 대신 분화를 유발하는 6량체를 형성한다. 안정한 이량체를 생성하는 NM23 단백질의 돌연변이, 변형체 키메라, 또는 심지어 재구성 프로토콜들도 줄기세포 성장 및 만능 신호를 전달하는데 가치가 있다. 대안으로 안정한 6량체를 생성하는 NM23 단백질들의 돌연변이, 변형체, 키메라 또는 심지어 재구성 프로토콜들도 분화를 유도하는 신호들을 전달하는데 도움이 되며, 결국 암의 치료 및 예방에 유용하다.

실시예 4. NM23 및 MUC1 *는 세포 표면에 함께 편재된(co-localize) 후 핵으로 전치된다(translocate).

MUC1* 및/또는 이의 리간드 NM23이 핵으로의 세포소기관내 이동(subcellular trafficking) 및 편재되는 것을 규명하기 위하여 면역형광검사 실험들이 수행되었다. MUC1*-포지티브 세포주인 인간 유방암 세포 T47D를 American Type Culture Collection(ATCC)에서 수득한 후 10% FBS를 함유한 RPMI 배지에서 유지시켰다. 세포 부착을 용이하게 하기 위하여 8-웰 챔버 글라스 슬라이드(Lab-Tek #154534)를 타입 1 콜라겐 용액으로 사전 코팅시켰다. 1.25 x 10⁵ 세포/ml의 T47D 세포를 예비코팅된 Lab-Tek 8-웰 챔버 슬라이드에 도말하고, 1% FBS를 포함하는 RPMI 존재하에 24-48시간동안 혈청을 공급하지 않았다.

NM23-S120G(50% 이량체 프랩, 실시예 2 및 3 참조) 또는 NM23-WT(야생형)을 다양한 농도로(8, 16, 32, 64, 128 nM) 30, 60 및 120분동안 첨가하였다. 고정화 후 인산염 완충용액(PBS)에서 1회 세척시 5분동안 3회에 걸쳐 세포를 세척하였다. 0.1% 소혈청 알부민(BSA), 0.05% 사포닌 및 5% 노르말 염소혈청을 포함한 PBS 함유 블로킹 완충액(blocking buffer)에서 실온하에 한시간동안 배양하여 비특이적 염색 및 세포 투과를 차단한다. 블로킹 완충액 존재하에 실온에서 한시간동안 MUC1*(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(서열번호 6)에 대항하여 양육한 C3 mab, Minerva Biotechnologies) 및 NM23(C20, Santa Cruz Antibodies, CA)의 세포외 도메인에 대한 일차 항체를 첨가하였다. 1% BSA 및 0.05% 사포닌 함유 인산염 완충용액(PBS)에서 1회 세척시 5분동안 3회에 걸쳐 세포를 세척하였다. 이차 항체(Alexa-fluor 488 및 Alexa-fluor 555, Invitrogen)는 최종 희석율 1:100으로 블로킹 완충액에 적용한 후 암실의 실온에서 1시간동안 배양되었다. 이후 세포를 1회세척시 5분씩 PBS로 2회 세척하고 2분동안 물로 1회 세척하였다. 이후 핵 염색시약 DAPI(Invitrogen)을 함유하는 Prolong Gold에 세포를 위치시키고, 커버 글라스(1.5 크기)를 적용하였다.

공초점 이미지를 얻기 위하여 Zeiss LSM 510 공초점 현미경을 사용하였다.(Havard Digestive Disease Confocal Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA). Lab-Tek 8 웰 챔버 슬라이드를 Zeiss LSM 510 공초점 현미경의 스테이지 위에 위치시켰다. 대표적인 세포들은 Plan Neofluar x40/1.3 오일 담금 렌즈 또는 Plan Neofluar x20/0.50 렌즈를 사용하여 초점을 맞추었다. Alexa-488 라벨링은 25 mW Argon 여기(excitation) 공급원의 488 nm 레이저 라인을 사용하여 여기되고, Alexa-555 라벨링은 1mW HeNe 레이저의 543 nm 레이저 라인을 사용하여 여기되며, DAPI 라벨링은 405 nm 레이저 라인을 사용하여 여기되었다. 8비트 이미지를 수집하였고, 핀홀(pinhole)은 모든 3개 파장에 대하여 1개의 Airy 유닛 또는 76μm로 설정되었으며, 이미지들은 0.11 μm/픽셀 해상도로 수집되었다. 게인(gain)과 오프셋(offset)은 8 비트 데이터 범위의 255 회색 값 규모상에서 이미지화된 세포로부터의 신호를 확장하기 위해 설정되었다. 총 5-7분동안 1-2분 간격으로 Z-스택(세포 바닥부로부터 상부까지 0.5-1.0 μm 간격)을 수득하였다. 실험 결과는 도 7에 도시되어 있다. 도 7(상부열)은 대부분이 6량체인 NM23-WT(야생형)가 제공된 NM23-WT의 농도를 증가시킴으로써 MUC1*과의 공동 편재화 또는 핵으로의 전치(translocation)를 증가시키지 못한다는 것을 나타내고 있다. 반대로 NM23-S120G(이량체)는 30분 배양 기간 이후 농도 의존적 방식으로 핵으로 편재되었다. 핵 편재는 흰색 화살표로 표시된 것과 같이 8nM에서 가장 높았다.

NM23은 MUC1*의 리간드이다.

NM23 돌연변이인 S120G는 주로 이량체로 존재하며, MUC1*에 대한 결합은 수용체를 이량체화한다. MUC1*-NM23 복합물이 핵으로 편재됨을 보여주기 위하여, 본 발명자들은 앞서 기술된대로 수행되는 또 다른 실험을 수행하였다. T47D 세포들은 다양한 농도의 S120G-NM23 존재하에 60분동안 배양되었다. 도 8은 노란색으로 표시된 바와 같이 MUC1* 및 NM23이 공동으로 편재되며, S120G-NM23과 함께 배양후 세포질에서 핵으로 위치를 이동한 것을 도시하고 있다. 이와 같은 결과들은 MUC1*-NM23 수용체 복합물이 핵으로 이동하여 전사를 조절한다는 생각과 일치한다. 실험된 NM23-S120G의 농도들을 주지하여야 한다. 본 발명자들은 인간 줄기세포 성장을 자극시키고 분화를 억제하기 위해서는 16nM NM23-S120G가 가장 이상적이라는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 64nM 이상의 NM23-120G의 농도에서 줄기세포 성장이 억제되고 분화가 진행된다는 것도 관찰하였다. 이와 같은 결과들은 MUC1* 수용체가 이량체화에 의해 활성화된 클래스 I 성장인자 수용체라는 사실과 일치한다. 64nM 이상의 농도에서는 하나의 NM23 이량체가 2개의 MUC1* 수용체와 결합하기 보다는 오히려 하나의 NM23 이량체가 각각의 MUC1* 수용체와 결합한다.

본 발명자들은 NM23-MUC1* 상호작용이 암세포 성장 뿐만아니라 만능 줄기세포 성장을 촉진한다는 것을 알고 있기 때문에, NM23 및 MUC1*은 만능성 및 암성 성장을 촉진하는 인자의 전사를 조절한다는 것으로 결론을 내린다.

실시예 5. NM23 및 MUC1 *의 핵으로의 전치는 만능성을 촉진하는 유전자들을 상향 조절하고, 분화를 유도하는 유전자들을 하향 조절한다.

NM23, 특히 이량체화를 선호하는 프랩들 또는 변형체들로 MUC1*을 자극한 후, NM23 및/또는 MUC1*의 핵으로의 전치에 반응하여 상향조절 또는 하향조절되는 유전자, 유전자산물, microRNA 및 기타 조절 핵산들을 규명하기 위한 분석들이 수행되었다. 항-PSMGFR 항체와 같은 NM23에 대한 항체 및 MUC1*의 세포외 도메인에 대한 항체 또는 MUC1 세포질 미부(tail)에 대한 항체들이 핵 프랩에 첨가되며, MUC1* 또는 NM23 복합체와 연관된 모든 핵산들 및 모든 단백질들이 면역 침전되도록 풀다운(pull-down) 분석을 수행한다. 핵산 서열들은 서열분석을 통해 용이하게 결정되고, 단백질 규명은 당업자에게 알려진 항체 탐침(antibody probing), 질량 q분석법(mass spec), MALDI 질량 분석법 등으로 측정된다. ChIP 분석, ChIP SEQ, PCR, RT-PCR 및 딥 시퀀싱 방법이 이와 같은 분석에 이상적이다.

예를 들면, 크로마틴 면역침전(ChIP) 분석은 항-NM23, 항-MUC1* 또는 항-MUC1-CT(세포질 미부) 항체를 이용하여 수행된다. 이와 같은 기술을 이용하여 분리된 프로모터 서열은 면역강화(immunoenriched) DNA 서열의 증폭 및 라벨링을 통하거나 프로모터 어레이 칩으로의 교잡(hybridization)을 통해 규명되거나, SOLiD3 분석기를 이용하여 직접 증폭 및 서열분석된다. 직접 서열분석은 MUC1에 의해 직접 또는 간접적으로 조절되는 유전자의 프로모터 결합 위치를 규명하게 할 것이다. NM23 및/또는 MUC1에 의해 조절되는 유전자들이 상향 또는 하향조절되는지 여부를 측정하기 위하여, 핵 MUC1* 또는 MUC1-CT에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 결합된, 규명된 프로모터 위치의 하류에 위치한 유전자들만을 증폭하는 RT-PCR과 함께 SOLiD3 분석기가 사용될 수 있다. 총 mRNA의 정량 및 데이터 분석 방법들이 대안 방법으로 사용될 수 있다.

대안으로, NM23으로 자극시킨 후 총 전사체 분석을 수행하고, NM23으로 자극되지 않은 세포를 이용하여 수행된 총 전사체 분석과 비교한다.

NM23으로 자극되거나 자극되지 않은 세포들을 비교하는 것 이외에, 상이한 세포형태들을 비교하는 것도 수행된다. 예를 들면, 자극 및 비자극된 MUC1*-포지티브 암세포들을 MUC1*-네거티브 암세포와 비교함으로써 MUC1*-매개 성장에 참여하는 기능으로 작용이 한정된 유전자들, 핵산들, microRNA 및 단백질들을 규명할 수 있다. 또 다른 측면에서, 자극된 세포들은 새롭게 분화중인 줄기세포와 MUC1*-포지티브 암세포 모두와 비교되는 만능 줄기세포이다. 이와 같은 방법에 따라 분석되어질 바람직한 세포들은 MUC1*-포지티브 세포들이다.

실시예 6. FGF 부재하에 또는 마우스 피더 세포 부재하에 NM23- S120G에서 배양된 인간 줄기세포는 진정한 인간 만능 줄기세포 상태인 미접촉 상태의 마커에 대해 양성으로 염색한다.

인간 또는 마우스 피더 세포상에서 NM23-S120(50% 이량체) 또는 FGF에서 배양된 인간 줄기세포는 미접촉 상태(진정한 만능 상태) 또는 초기항원인식 상태의 마커 존재를 탐침한다.

본 발명자들은 초기항원인식된 H9 배아 줄기세포를 이용하여 시작하였다. 초기항원인식된 H9 배아 줄기세포는 bFGF에서 배양되고 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 피더 세포상에서 약 30회 계대배양되었다. 첫번째 세포들의 세트는 MEF 상에서 bFGF에서 계속 배양되었다. 2번째 그룹은 인간 피더 세포(HS27)상으로 전치되었지만 여전히 4ng/ml의 bFGF에서 배양되었다. 3번째 세포 세트는 NM23-S120G에서 배양되었지만, 마우스 MEF 피더 세포 상에서 유지되었다. 4번째 세포 세트는 인간 피더 세포(HS27)상으로 전치되고 NM23-S120G에서 배양되었다. 모든 세포들은 추가로 6회 계대배양되는 동안 이와 같은 조건들에 따라서 배양되었다. 이후 세포들은 미접촉 줄기세포 상태에 대한 마커인 Klf4 및 초기항원인식 줄기세포 상태에 대한 마커인 Foxa2의 존재를 검출하기 위해 염색되었다. 도 9 및 10은 NM23에서 배양되고 인간 피더 세포에 노출된 세포들만이 미접촉 줄기세포 마커인 Klf4를 발현하고, 초기항원인식된 줄기세포 마커인 Foxa2는 발현하지 않았다는 것을 도시하고 있다.

실시예 7. NM23- S120G에서 배양되고 인간 피더세포 또는 MUC1 * 항체 표면상에서 성장한 인간 줄기세포가 미접촉 줄기세포로 기능한다.

Vita^TM (Thermo Fisher, Waltham, MA) 세포 배양 플레이트는 항-MUC1* 항체(6-웰 플레이트의 웰 당 12.5μg)로 코팅되고, 4℃에서 하룻밤동안 배양되었다. 실험들은 FGF에서 배양된 인간 줄기세포들이 NM23에서 일차로 예비 배양되지 않거나, Rho 키나제 억제제(Y-27632)가 첨가되지 않았을 경우 표면에 부착하지 못한다는 것을 보여주었다. 그러나, 만일 공급원 세포들이 인간 피더 세포상에서 또는 항-MUC1* 항체 층과 같은 한정된 표면상에서 NM23에서 배양되면 Rho 키나제 억제제에 대한 요구가 사라지고, 이들은 Vita-항-MUC1* 항체 표면에 효율적으로 결합하였다. 도 11은 HS27 인간 피더 세포상에서 NM23-S120G(최소 줄기세포 배지에서 8nM)에서 배양된(왼쪽 2개 컬럼, 도 11A, B, D, E, G 및 H) 또는 마우스 배아 섬유아세포(MEFs) 피더 세포상에서 bFGF에서 배양된(오른쪽 컬럼, 도 11C, F 및 I) 인간 H9 배아 줄기세포 사진을 도시하고 있다. 맨위쪽 열(도 11A, B, C)은 트립신 수확된 후 Vita-항-MUC1* 표면상에 도만된 세포들을 나타내고, 중간열(도 11D, E, F)은 EDTA 처리로 수확된 세포들을 나타내며, 마지막 열(도 11G, H, I)은 트립신으로 처리되어 수확되지만 Rho 키나제 억제제(ROCi) 존재하에 도말된 세포(Y-27632)를 나타낸다. 왼쪽 컬럼(도 11A, D, G) 및 오른쪽 컬럼(도 11C, F, I)에서 사진찍혀진 세포들은 플레이트 상에 존재하고, 플레이트는 표면으로 세포를 이동시키기 위해 1500rpm에서 5분동안 원심분리되었다. 중간 컬럼(도 11B, E, H)의 세포들은 원심분리되지 않았다. 도 11은 NM23 인간 피더 공급원으로부터의 세포들은 Rho 키나제 억제제로부터 혜택을 받지 않지만, FGF-MEF 공급원으로부터의 세포들은 Rho 키나제 억제제로 처리되고 도말하기 전에 30분동안 NM23(S120G 50-100% 이량체)으로 예비배양되지 않는다면 미분화 콜로니를 생산하지 않았다.

또한, 8nM NM23-S120G(50% 이량체 구성)에서 성장한 인간 iPS 세포들은 Rho 키나제 억제제의 부재하에 Vita-MUC1* 항체 표면에 용이하게 부착된다(도 17 참조). Vita-항-MUC1* 표면에서 2회 이상 계대배양을 통해 성장한 ES 또는 iPS 세포들은 Rho 키나제 억제제를 요구하지 않았다. 이와 같은 결과들은 1) Vita-항-MUC1* 표면이 미접촉 줄기세포에 우호적으로 결합하고; 2) 인간 피더 세포상에서 또는 Vita-항-MUC1* 표면상에서 NM23(이량체)으로 성장한 줄기세포들은 미접촉 상태로 전환되고; 및 3) NM23-S120G에서의 사전 배양 이외에 Rho 키나제 억제제는 초기항원인식 줄기세포를 미접촉 상태로 되돌린다는 사실과 일치한다. 결국, PSMGFR 펩티드에 대한 MUC1* 항체 또는 PSMGFR 펩티드로 코팅된 표면은 인간 미접촉 줄기세포를 선택적으로 구속하며, 초기항원인식 줄기세포로부터 미접촉 줄기세포를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 특히 바람직하게는 펩티드 GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(서열번호 6)에 대한 모노클로날 항체 C3 mab로 코팅된 Vita(ThermoFisher) 플레이트이다.

실시예 6에서 본 발명자들은 이와 같은 방법(인간 피더 세포상에서의 NM23)으로 성장한 인간 줄기세포가 미접촉 줄기세포의 마커들을 발현한다는 것을 나타냈었음을 상기하라. 이와 같은 결과들은 항-MUC1* 항체들을 표시하는 표면들, 특히 Vita 플레이트와 유사한 화학적 조성을 갖는 표면에 부착시 미접촉 줄기세포들을 선택적으로 구속한다는 것을 나타낸다. MEF 상의 FGF에서 배양된 인간 줄기세포는 Rho 키나제 억제제로 처리함으로써 보다 많은 콜로니와 우수한 성장 혜택을 크게 얻게 된다는 것이 보고되었다. 마우스 배아 줄기세포들은 Rho 키나제 억제제의 존재로 인한 성장 혜택은 받지 못하였지만, 외배엽(epiblast) 유래 마우스 줄기세포는 혜택을 받았다. Jaenisch 등이 마우스 배아 줄기세포들은 정의하기 어려운 인간 미접촉(naive) 줄기세포의 등가물인 반면에 외배엽 단계로부터 취득된 마우스 줄기세포는 인간 초기항원인식(Primed) 줄기세포의 등가물이라고 보고하였다는 점을 상기하라. 그러므로, 본 발명자들의 결과에 비추어 이와 같은 결과들은 초기항원인식 줄기세포들이 Rho 키나제 억제제 및/또는 NM23으로 처리하여 보다 미접촉인 상태가 되도록 강요될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 11 참조.

본 출원에서, 본 발명자들은 인간 줄기 세포들 및 특히 미접촉 줄기세포들이 항-MUC1* 항체 코팅된 표면에 우선적으로 결합한다는 것을 밝혔다. 본 명세서에 Vita^TM 표면의 개시로서 참조문헌으로 포함된 WO2009/105570의 Vita^TM 표면들이 이와 같은 예의 일부에서 사용될 수 있지만, 보다 일반적으로는 본 발명은 약 1.7-2.1% 질소, 26.4-28.7% 산소 및 28.2-30.7% 질소 및 산소 결합체로 구성되고, 14.3-18.8도의 물 접촉각을 갖는 표면에 코팅된 항-MUC1* 항체를 고려하고 있다.

실시예 8. 첫번째 아형에 속하는 암세포들은 두번째 아형의 암세포로부터의 조건 배지에서 성장할 수 없다.

MUC1*-포지티브 신경교종 세포주인 U87 세포는 MUC1*-포지티브 암세포주(유방암, T47D) 또는 MUC1*-네거티브 암세포주(전립선암, LnCAP)로부터의 조건배지에서 배양되었다. 본 발명자들은 상이한 배지들이 상이한 세포 형들을 성장하기 위해 추천된다는 것을 주지하고 있다. 나타난 차이점들이 세포가 성장한 상이한 배지에 기인하지 않다는 것을 입증하기 위하여, 모든 세포들을 추천된 배지들의 33/33/33 또는 50/50 조합인 동일한 배지에서 성장시켰다. 도 12는 U87 신경교종 세포들은 MUC1*-포지티브 세포들의 조건 배지에서 배양시 우수하게 성장하는 반면에, MUC1*-네거티브 세포들의 조건배지에서는 증식하지 않았다. 이와 같은 결과들은 첫번째 세포 형태에 의해 분비된 조절 인자들은 혼합 신호가 세포를 성장 정지 시키는 기본설정된 기작을 유발시키는 두번째 세포 형태의 내부 프로그래밍을 방해한다.

실시예 9. 외부 단백질로 형질감염된 세포들로부터의 조건배지는 두번째 세포형태의 성장을 억제하는 조절 징표의 혼합물로 구성된다.

앞서 기술된대로 실행된 또 다른 실험에서, U87 세포는 MUC1*-네거티브 암세포(HCT-116 대장암, "벡터")의 조건배지 또는 MUC1*이 형질감염된(FLR) 동일한 세포주의 조건배지에서 성장하였다. HCT-116 세포들 및 MUC1*-HCT-116 형질전환 세포들은 U87의 성장에 대해 추천된 배지와 최소 줄기세포 배지가 50/50으로 혼합된 혼합물에서 성장하였다. 도 13은 MUC1*-네거티브 세포로부터의 조건배지가 U87 암세포의 성장을 허용하지는 않았으며, 비록 MUC1*로 형질감염된 이들 세포들의 조건배지가 일부 성장을 허용할지라도 대조구 세포와 비교하여 성장이 억제된다. 이와 같은 결과는 MUC1* 형질감염된 MUC1-네거티브 세포는 일차 혼합 신호를 나타내며, 일차 혼합 신호는 이차 신호와 결합시 암세포 성장을 억제하는 2차 혼합 신호를 전달하며, 여기서 신호는 세포 아형에 특이적인 조절 인자들의 징표를 의미한다는 생각과 일치한다.

실시예 10. 인간 줄기세포로부터의 조건 배지는 자가 복제를 제한하도록 암세포를 역분화하는 징표를 갖는다.

MUC1*-포지티브 유방암 세포, T47D는 다른 MUC1*-포지티브 암세포로부터의 조건배지에서 성장하였다. 다른 MUC1*-포지티브 암세포로부터의 조건배지는 MUC1*-포지티브 세포의 성장에 나쁜 영향을 주지는 않았다. 도 14A.

유사한 실험에서 MUC1*-포지티브 유방암 세포 T47D는 미분화 인간 ES 세포(H9)로부터의 조건배지에서 또는 새롭게 분화중인 H9의 조건배지에서 배양되었다. 도 14B는 분화중인 줄기세포들로부터의 조건배지가 T47D의 성장을 즉각적으로 중지시킨다는 것을 나타내고 있다. 미분화 줄기세포로부터의 조건배지는 초기에 성장을 증가시키지만 이후 추정하건데 줄기 세포들은 보유하고 있지만 암세포들은 잃어버린 조절 인자들이 계획된 분화를 개시하는 시점인 144시간 후에 이들의 성장을 억제시켰다.

실시예 11. MUC1 *-포지티브 암세포들로부터의 조건 배지는 인간 줄기세포가 자가 복제가 가능한 미분화 상태를 유지할 수 있도록 인간 줄기세포를 프로그램한다. 즉 MUC1*-네거티브 암세포들은 줄기세포에게 혼합된 조절 신호를 전달하고 줄기세포를 정지상태로 유도한다.

본 실험에서, 2개의 상이한 성장 징표에 속하는 조절 인자들을 세포에 전달하여 줄기세포가 정지상태로 유도될 수 있다는 것을 입증하기 위하여 미분화 인간 줄기세포(BG01V/hOG(Invitrogen, Carlsbad, CA))를 다른 세포의 패널(panel)로부터의 조건배지에서 성장시켰다.

미분화 인간 줄기세포는 단일 세포(성장하기 어려움) 또는 콜로니 편(colony pieces)으로 a) 아무것도 없음(대조구); b) MUC1* 포지티브 T47D 유방암세포, c) MUC1*으로 형질감염된 HCT-116 세포(MUC1*-네거티브)로부터의 조건 배지(CM); 또는 d) HCT-116 세포(MUC1*-네거티브)로부터의 조건배지가 첨가된 최소 줄기세포 배지에서 8nM NM23-S120G(50% 이량체)에서 배양하였다. 도 15의 표는 최소 배지 및 MUC1*-포지티브 암세포로부터의 조건배지가 50/50으로 혼합된 최소 배지에서 배양된 줄기세포가 미분화 만능 줄기세포로서 잘 성장한다는 것을 나타내고 있다. 단일 세포로 도말된 줄기세포가 최소배지만에서 보다는 MUC1* 아멧포 조건배지에서 더욱 우수하게 성장한다는 점을 주지하여야 한다. 그러나, HCT-MUC1* 형질감염 세포로부터의 조건배지가 첨가될 경우 현저한 성장 감소가 있었다. 또한, HCT-공백(empty) 벡터 세포(MUC1*-네거티브)로부터의 조건 배지는 세포를 정지상태로 유도하였으며, 이들은 증식하지 않았다. 표시된 배지에서 5일 후 취해진 결과적인 세포들의 이미지는 도 16에 나타내었다.

요약하면, 만능 줄기세포는 MUC1*-네거티브 암세포(HCT)로부터의 조건 배지 존재하에서는 성장하지 않고 증식할 수 없지만, MUC1*-포지티브 세포(T47D 및 HCT-MUC1*)로부터의 조건배지 존재하에서 배양시 향상된 증식을 수행한다. 이와 같은 결과들은 인간 만능 줄기세포 및 MUC1*-포지티브 암세포들이 이와 같은 세포 형들 모두에서 분비되는 인자들에 의해 조절되는 공통의 증식 프로그램을 공유한다는 생각과 일치한다. MUC1*으로 형질감염된 MUC1*-네거티브 암세포들은 줄기세포 성장을 억제하는 인자들을 분비하며, 상이한 성장 징표들에 특이적인 조절 인자들의 혼합물로 세포를 치료하는 것이 세포 성장을 방해하고 세포를 정지상태로 유도한 후 사멸시키며, 이로서 항암 치료제로 사용될 수 있다는 것을 주장하게 한다.

실시예 12. 암 아형들을 카테고리화하여 이들의 성장 조절 인자들의 징표들이 명료하게 된다

성장 조절 인자들의 징표는 특정 세포 집합의 증식을 조절하는 핵산, microRNA, 유전자 또는 단백질들의 집합을 의미하며, 이들 조절 인자들의 발현 수준이 또 다른 세포 형태에서의 이들 발현 수준과 현저한 차이를 나타낸다. 예를 들면, 유방암 세포의 집합에 대한 성장 조절 인자들의 징표는 여러 다른 암 형태들로 구성된 그룹과 비교하여 현저하게 상향 조절되거나 하향조절되는 핵산, microRNA, 유전자 또는 단백질들의 집합일 수 있다. 암세포들은 세포를 공동 배양하거나 암세포의 제1형태를 암세포의 또 다른 형태로부터의 조건배지에서 배양하여 microRNA 클러스터와 같은 공통의 조절 인자들에 증식이 의해 조절되는 아형으로 분류될 수 있다. 두번째 암세포 형태의 조건배지에서 배양시 억제 또는 정지없이 증식하는 암세포들은 이들 두 암세포형태들이 동일한 카테고리에 속하는 것을 의미하며, 이들의 성장은 공통의 성장 조절 인자의 징표에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 첫번째 형태의 암세포가 두번째 형태의 암세포의 조건배지에서 배양될 수 없는 경우는 이들이 상이한 아형 그룹에 속하며, 이들의 성장은 상이한 microRNA 클러스터에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 각각의 아형의 성장을 조절하는 주요 microRNA는 딥 시퀀싱, RT-PCR, 총 전사체 분석 등을 사용하여 측정된다. 한 형태의 주요 microRNA 또는 microRNA 클러스터는 다른 형태의 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 문헌들은 전체가 참조문헌으로 포함된다.

본 기술분야의 당업자들은 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 상세하게 기술된 본 발명의 특정 구현예들과의 여러 등가물들을 이해하거나 확인할 수 있을 것이다. 이와 같은 등가물들은 청구항의 범위 내에 포함될 것이다.

Claims (11)

1. 만능(pluripotent) 줄기세포를 증식시키는 방법에 있어서,
   세포를 MUC1* 성장 인자 수용체 경로를 활성화시키는 제제와 함께 배양하는 단계를 포함하는, Rho 카이네이즈(kinase) 억제제에 대한 요구 없이 만능 줄기세포를 증식시키는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 NM23이고, 주로 이량체(dimer) 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는, 만능 줄기세포를 증식시키는 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 증식 방법은 인간 섬유아세포 피더층(feeder layer) 상에서 상기 만능 줄기세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 만능 줄기세포를 증식시키는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 증식 방법은 층이 없는 형태의 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포 성분 상에서 상기 만능 줄기 세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 만능 줄기세포를 증식시키는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 증식 방법은 MUC1* 항체 표면 상에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 만능 줄기세포를 증식시키는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 표면은 Vita^TM 세포 배양 플레이트인 것을 특징으로 하는, 만능 줄기세포를 증식시키는 방법.
7. 미접촉 줄기 세포를 증식 또는 유지시키는 방법에 있어서,
   마우스 피더 세포 또는 이들의 추출물의 부재하에서 MUC1* 경로를 자극하는 단계를 포함하는, 미접촉 줄기 세포를 증식 또는 유지시키는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 증식 또는 유지 방법은 MUC1* 항체 표면 상에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 미접촉 줄기 세포를 증식 또는 유지시키는 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 표면은 Vita^TM 세포 배양 플레이트인 것을 특징으로 하는, 미접촉 줄기 세포를 증식 또는 유지시키는 방법.
10. 혼합된 세포 집단으로부터 미접촉 줄기 세포를 분리하는 방법에 있어서,
    상기 혼합된 세포 집단을 MUC1* 항체로 코팅된 표면에 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 미접촉 줄기 세포는 MUC1* 항체의 표면에 결합하는, 혼합된 세포 집단으로부터 미접촉 줄기 세포를 분리하는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 MUC1* 항체의 표면은 Vita^TM 플레이트 상에 형성되는 것을 특징으로 하는, 혼합된 세포 집단으로부터 미접촉 줄기 세포를 분리하는 방법.
    

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