JP5981965B2 - 哺乳動物IgGと結合する単一ドメイン抗原結合タンパク質 - Google Patents
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Description
1)重鎖のみからなり、天然に軽鎖を欠く、ラクダ科動物及びサメから得ることができる抗体、
2)通常、VHHドメインと呼ばれる、1)で定義される抗体の可変ドメイン、
3)1)で定義される抗体又は2)中のドメインの遺伝子操作された形、例えば、ラクダ科動物(又はサメ)VHHドメインのフレームワーク配列がその他の供給源から得られたCDRでグラフトされている「ラクダ科動物化(camelidised)」抗体、
4)例えば、WO04/108749に記載されるような、様々な免疫グロブリン様分子由来のフレームワーク配列が、所与の標的分子に特異的なCDRと組み合わされている、免疫グロブリン様可変ドメインの遺伝子操作された形
を具体的に挙げられる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
[式中、FR1は、
a)[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAAS[25](配列番号197)、
b)a)中の配列と、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は
c)表1中に定義される1つ又は複数のアミノ酸置換を有するa)のアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
FR2は、アミノ酸配列:
d)[36]WFRQAPGKEREFVA[49](配列番号198)、
e)d)中の配列と、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は
f)表2に定義される1つ又は複数のアミノ酸置換を有するd)のアミノ酸配列
からなる群から選択され、
FR3は、アミノ酸配列:
g)[65]GRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYSCAA[94](配列番号199)、
h)g)中の配列と、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は
i)表3に定義される1つ又は複数のアミノ酸置換を有するg)のアミノ酸配列
からなる群から選択され、
FR4は、アミノ酸配列:
j)[103]WGQGTQVTVSS[113](配列番号200)、
k)j)中の配列と、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は
l)表4に定義される1つ又は複数のアミノ酸置換を有するj)のアミノ酸配列
からなる群から選択される]。
VHH断片と結合するIgG−Fcドメインの同定
VHH断片と結合するIgG−Fcドメインを、哺乳動物IgG抗体及び/又はそのFc断片で免疫化したラマから同定した。個々のVHH断片のスクリーニングは、様々な哺乳動物種由来のIgG並びに/又はそのFc断片及びFab断片、例えば、IgM及びIgAのような非IgG抗体を用いるELISAによって実施し、これから、哺乳動物IgG及び特にヒトIgGのFcドメインと結合するVHH断片のパネルが得られた。表5は、VHH断片の各々に含まれるCDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列、並びにフレームワーク領域を含むVHH断片の各々のアミノ酸配列も示す。
VHH断片と結合するIgG−Fcドメインの製造
本発明のIgG結合タンパク質を、van de Laarら、(2007年、Biotechnology and Bioengineering、第96巻、第3号:483〜494年)によって記載されるように、株及び発現構築物を用いて酵母において製造した。IgG結合タンパク質の製造は、10から10,000リットルの間の可動範囲の標準的バイオリアクターで実施した。溶存酸素(Ingold DO2電極、Mettler−Toledo)は、羽根車速度の自動調整によって制御した。pH(Mettler−Toledo Inpro3100ゲル電極又はBroadley James F635ゲル電極)は、リン酸及びアンモニアガス又はアンモニア溶液を用いて制御した。発泡は、泡レベルセンサー(Thermo Russell)によって検出し、5〜10%のStruktol J673の添加によって制御した。温度(PT100電極)は、冷却用ジャケット及び加熱用ジャケットによって制御した。オフガス(Prima 600質量分光光度計、VGガス分析システム)によって、エタノール濃度、rO2及びrCO2を分析した。3%〜8%の十分に増殖した接種菌液を添加することによって、バッチ相を開始した(30℃、0.3〜0.4VVM空気、DO2最小30%、pH5.0)。バッチ相においてオフガス中のエタノール濃度が低下している場合には、エタノール発酵は自動的に開始された。パルス化供給プロフィールに従って供給を適用し、要求される限界内にエタノールレベルを維持した。供給相は、21℃、0.7〜1.1VVM空気で実施した。エタノール発酵の間に、DO2が0%に低下し、蓄積されたエタノールをパルス化供給プロフィールによってさらに制御した。供給相は、エタノール供給が枯渇した時点で停止した。ブロスは、使用済みバイオマス回収の回収を含むさらなる処理まで5〜10℃の間の温度に冷却した。
発酵におけるVHH断片と結合するIgG−Fcドメインの発現レベル
例1.1に記載されるエタノールを供給された発酵における、VHH断片と結合するIgG−Fcの発現レベルを、アフィニティークロマトグラフィーカラムに基づく定量HPLCアッセイを用いて調べた。サンプルを、IgGがカップリングされたアフィニティーカラムにロードした。結合していないサンプルを洗い出した後、結合しているIgG−Fc VHH断片を低pHで溶出した。溶出ピークの面積を、ピーク積分によって求めた。このピーク面積に基づいて、サンプル中のVHH断片濃度を標準曲線を用いて算出した。
*濃度は、EoFでの上清1リットルあたりのVHH断片のgである。
ELISA及びBiacore分析
ELISAでの結合分析のために、Nunc Maxisorp結合プレートを、様々な種の抗体抗原でコーティングし、続いて、PBS中、2%(w/v)ゼラチンでブロッキングした。結合しているVHH断片を、ポリクローナルヤギ抗マウス−HRPコンジュゲート(Bio−Rad、172−1011)と組み合わせたマウス抗His mAb又はポリクローナルブタ抗ウサギIgG−HPOコンジュゲート(Dako、P217)と組み合わせたポリクローナルウサギ抗ラマVHH血清のいずれかによって検出した。
抗IgG−Fc VHH断片36、38〜41、43〜46は、ELISAにおいてヒトIgG−Fcドメインに対して結合を示すが、その他のIgG種に対するさらなる分析は実施しなかった。
VHH断片IgG−Fc−16と結合するIgG−FcドメインのBiacore分析
VHH断片IgG−Fc−16の広い結合反応性を、BiaCore3000での表面プラズモン共鳴分析(SPR)を用いて調べた。この目的で、精製されたVHH断片IgG−Fc−16を、CM5センサーチップの表面上に固定化し、続いて、HBS−EPバッファー中で様々な種に由来する精製されたIgG抗体(50μg/ml)とともにインキュベートした。5μl/分で1分間結合させ、5μl/分で2.5分間の解離ステップを続けた。結合シグナル(レゾナンスユニット)を、HBS−EPバッファーのみを用いて測定されたバックグラウンドシグナルと比較した。結果は、表8に要約されている。比較のために、様々なIgG種に対するプロテインA及びGの相対的な反応性も示されている。
それぞれ、+++、++、+、−:強力な結合、中程度の結合、弱い結合、結合なし
Biacoreでの結合親和性測定値
抗IgG−Fc VHH断片の結合親和性定数を、BiaCore3000での表面プラズモン共鳴分析(SPR)を用いて求めた。この目的で、精製されたVHH断片をCM5センサーチップの表面上に固定化し、続いて、HBS−EPバッファー中、様々な濃度の精製されたIgG抗体とともにインキュベートした。30μl/分で3分間結合させ、30μl/分で15分間の解離ステップを続けた。Biacoreソフトウェアを用い1:1Langmuir結合モデルに従って結合曲線を適合させた。算出された親和性データの全体像が表9に示されている。
クロマトグラフィー試験
WO2006/059904に記載されるとおり、供給業者のプロトコール(GEHC)に従って、精製された抗IgG−Fc VHH断片を、NHSカップリングバッファーに対して透析し、NHS活性化セファロース4Bファーストフローにカップリングした。カラムは、HR5/5カラム(GEHC)を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。400μlのカラム容量を用いた。すべてのクロマトグラフィー実験は、Akta explorer100で実施した。IgGサンプルは、PBS pH7.4中でロードし、例えば、pH2.1となるよう8MのHClを添加したPBS又はpH2又は3の0.1M グリシン−HClを用いて溶出した。タンパク質検出は、OD214及びOD280のシグナルをモニタリングすることによってオンラインで実施した。クロマトグラフィーにおいて試験された抗IgG−Fcセファロース担体の結合分析の全体像が、表10に示されている。
VHH断片と結合するIgG−Fcドメインの動的結合能
NHSセファロース上に固定化されているVHH断片と結合するIgG−Fcドメインの動的結合能(DBC)を試験した。PBS pH7.4中の1.0mg/mlのヒトIgG10mlを、150cm/時間の直線流を用いて400μlカラムにロードした。10カラム容積のPBS pH7.4で洗浄した後、0.1M グリシンバッファーpH3.0でカラムを溶出した。フロースルー及び溶出ピークのOD280シグナルの統合に基づいて、カラムの動的結合能を算出した(表11)。
クロマトグラフィーにおいてVHH断片IgG−Fc−1と結合するIgG−Fcドメインの溶出プロフィール
WO2006/059904に記載されるとおり、供給業者のプロトコール(GEHC)に従って、精製されたVHH断片IgG−Fc−1を、NHSカップリングバッファーに対して透析し、NHS活性化セファロース4Bファーストフローにカップリングした。カラムは、HR5/5カラム(GEHC)を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。400μlのカラム容量を用いた。比較のために、プロテインA HiTrapカラム(1ml)を用いた。すべてのクロマトグラフィー実験は、Akta explorer100で実施した。IgGサンプル(1mg/ml)は、PBS pH7中でロードし(IgG−Fc−1セファロースに10ml、プロテインA HiTrapに20ml)、以下の種類の第1の溶出バッファーを用いて溶出した:
− 様々なpH値を含むミリQ中、0.2Mグリシン
− 様々なpH値を含むミリQ中、0.1M酢酸
− 様々なpH値を含むミリQ中、0.1Mクエン酸。
第2の溶出バッファー(再生)としてPBS、pH2を使用した。
クロマトグラフィーにおけるVHH断片IgG−Fc−16と結合するIgG−Fcドメインの溶出プロフィール
WO2006/059904に記載されるとおり、供給業者のプロトコール(GEHC)に従って、精製されたVHH断片IgG−Fc−16を、NHSカップリングバッファーに対して透析し、NHS活性化セファロース4Bファーストフローにカップリングした。カラムは、HR5/5カラム(GEHC)を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。400μlのカラム容量を用いた。すべてのクロマトグラフィー実験は、Akta explorer100で実施した。IgGサンプル(1mg/ml)は、PBS pH7中でロードし(VHHセファロースに10ml)、以下の種類の第1の溶出バッファーを用いて溶出した:
− 様々なpH値を含むミリQ中、0.1Mグリシン
− 様々なpH値を含むミリQ中、0.1Mアルギニン
第2の溶出バッファー(再生)としてPBS、pH2を使用した。
クロマトグラフィーにおけるVHH断片IgG−Fc−1の腐食安定性
供給業者のプロトコールに従って、精製されたVHH断片IgG−Fc−1を、NHSカップリングバッファーに対して透析し、NHS活性化アガロースにカップリングした。カラムは、HR5/5カラム(GEHC)を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。PBS pH7.4中1.0mg/mlヒトIgG10mlを、150cm/時間の直線流を用いて400μlカラムにロードした。10カラム容積のPBS pH7.4で洗浄した後、8M HClでpH2.1に調整したPBSでカラムを溶出した。フロースルー及び溶出ピークのOD280シグナルの統合に基づいて、カラムの動的結合能(DBC)を算出した。次いで、カラムを0.1M又は0.2M NaOHとともに、150cm/時間の直線流で15分間インキュベートし、続いて、10カラム容積のPBS pH7.4で平衡化した。各サイクルの後、動的結合能を上記のとおりに調べた。0.1M及び0.2M NaOHを用いたサイクル後に残存するDBCが図1に示されている。
Claims (31)
- 軽鎖の欠く、重鎖のみの抗体又はその可変ドメイン断片であって、
ヒトIgG分子のFcドメインと特異的に結合するが、ネズミ起源又はウシ起源のIgG分子に結合せず;
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4の順で作動可能に連結している、4種のフレームワーク領域であるFR1からFR4と、3種の相補性決定領域であるCDR1からCDR3とを含むアミノ酸配列を含み、
a)CDR1が、配列番号1のアミノ酸配列を有し、
b)CDR2が、配列番号50のアミノ酸配列を有し、そして
c)CDR3が、配列番号99のアミノ酸配列を有し、
各フレームワーク領域が、配列番号148のフレームワークアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有しており;
I)抗体又はその可変ドメイン断片が、NHS樹脂1mlあたり20mgの抗体又はその可変ドメイン断片の密度でNHS活性化担体にカップリングされると、20回の定置洗浄サイクル後に少なくとも70%の残存動的結合能を保持するものであり、
ここでこの各定置洗浄サイクルにおいては、NHS樹脂にカップリングされた可変ドメインが、0.05M NaOH及び0.5M NaClと150cm/hの流速で15分間接触するものである;及び、
II)I)に定義されるようにNHS樹脂にカップリングされると、抗体又はその可変ドメイン断片に結合しているヒトIgG分子が、
i)0.1Mグリシン、pH2.0を用いて、少なくとも90%の収率で;及び/又は
ii)0.1Mグリシン、pH3.0を用いて、少なくとも70%の収率で、
抗体又はその可変ドメイン断片から回収されるものである;
上記抗体又はその可変ドメイン断片。 - a)抗体又はその可変ドメイン断片が、ポリクローナルヒトIgGを用いて表面プラズモン共鳴により分析されると、少なくとも10−7Mの結合親和性でヒトIgG分子と結合すること;
b)抗体又はその可変ドメイン断片が、NHS樹脂1mlあたり20mgの抗体又はその可変ドメイン断片の密度で150cm/hの流速を用いてNHS活性化担体にカップリングされると、少なくとも2mgのヒトIgG/樹脂1mlの動的結合能を有すること、
からなる群から選択される1つ又は複数の特性を有する、請求項1に記載の抗体又はその可変ドメイン断片。 - ヒトIgGが、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4分子である、請求項1又は2に記載の抗体又はその可変ドメイン断片。
- さらにヤギ起源のIgG分子と結合しない、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片。
- さらにラット、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ又はヒツジを起源とするIgG分子と結合しない、請求項3に記載の抗体又はその可変ドメイン断片。
- 抗体又はその可変ドメイン断片が、ポリクローナルヒトIgGを用いて表面プラズモン共鳴により分析されると、少なくとも5nMの結合親和性でヒトIgG分子と結合する、請求項5に記載の抗原結合タンパク質。
- 配列番号148のアミノ酸配列を有する、請求項5に記載の抗体又はその可変ドメイン断片。
- 少なくとも2種の請求項1から6までのいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片のアミノ酸配列を含む、多価抗体又はその可変ドメイン断片。
- 治療タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列をさらに含む融合タンパク質の部分である、請求項1から8までのいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片。
- 抗体がラクダ科動物又はサメの抗体である、請求項1から9までのいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片。
- 請求項1から10までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- ヌクレオチド配列が、プロモーターと作動可能に連結している、請求項11に記載の核酸。
- ヌクレオチド配列が、さらにその他の調節エレメントと作動可能に連結している、請求項12に記載の核酸。
- 請求項11から13のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 酵母である、請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記酵母がサッカロミセス・セレビシエである、請求項15に記載の宿主細胞。
- a)請求項14から16のいずれか一項に記載の宿主細胞を、抗体又はその可変ドメイン断片の発現につながる条件下で培養するステップ
を含む、請求項1から10までのいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片を製造する方法。 - b)宿主細胞及び培養培地のうち少なくとも一方から抗体又はその可変ドメイン断片を精製するステップ
をさらに含む、請求項17に記載の方法。 - 請求項1から10までのいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片を含む組成物。
- 請求項1から10までのいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片を含む免疫吸着物質。
- 抗体又はその可変ドメイン断片が担体上に固定化されている、請求項20に記載の免疫吸着物質。
- 抗体又はその可変ドメイン断片が、共有結合によって担体上に固定化されている、請求項21に記載の免疫吸着物質。
- 担体が、セファロースを含む、請求項20から22のいずれか一項に記載の免疫吸着物質。
- 哺乳動物IgG分子の検出及び/又は精製のための、請求項1から10までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
- 哺乳動物IgG分子を精製する方法であって、
a)哺乳動物IgG分子を含むサンプルを、請求項20から23までのいずれか一項に記載の免疫吸着物質と、哺乳動物IgG分子と免疫吸着物質の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
b)結合している哺乳動物IgG分子を、哺乳動物IgG分子と免疫吸着物質との親和性を低下させる条件下で溶出するステップと、
を含む方法。 - 洗浄ステップを実施するステップをa)とb)のステップの間にさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 哺乳動物IgG分子をさらに処理するステップをb)のステップの後にさらに含む、請求項25又は26に記載の方法。
- 体液中の哺乳動物IgGを除去、枯渇又は不活化する方法であって、請求項20から22までのいずれか一項に記載の免疫吸着物質を、被験体の体液と体外接触させる方法。
- 前記被験体がヒト被験体である、請求項28に記載の方法。
- 被験体の体液中の哺乳動物IgGの体外除去又は枯渇のための、請求項1から10までのいずれか一項に記載の抗体又はその可変ドメイン断片を含む薬剤。
- 前記被験体がヒト被験体である、請求項30に記載の薬剤。
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