JP5975462B2 - アブレーション装置及び3次元電子顕微鏡 - Google Patents
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Description
また、従来のレーザー光による平滑面の洗浄方法は、洗浄対象がハードディスク装置のディスクやシリコンウエハー等の高度な洗浄が要求される一方で非生体材質であり、細胞や脂肪及びタンパク質等を含む生体組織と比較して光による蒸発条件が著しく異なり(=高エネルギーを必要とし)、レーザー光の照射条件は生体の全面除去を満たせば良いため、生体試料(生体組織)の表層のみを切削するという目的には単純に転用することができないという課題がある。
また、従来の細胞活性アッセイ装置は、複数のオフアクシス孔を有する不透明膜に対してレーザーライトのビームを一方向から照射して直線状の孔を生成するものであり、不透明膜の切削面を1mm四方という広範な面積にわたり平滑かつ均一に切削することができないという課題がある。
アブレーション装置10は、図1に示すように、生体試料200を支持する支持部1と、生体試料200の切削面に垂直な方向に対して角度を付けた方向(斜め方向)を含み、生体試料200の切削面に対して複数の方向から、生体試料200の切削面に深紫外光を照射する光源2と、を備える。
また、本実施形態に係る駆動部4は、電気エネルギーを機械エネルギーに変換するモータである。
なお、生体試料200は、トリミング過程において、包埋の際に余った樹脂をカプセルに流し込んで製作した略円柱状の台座201に、導電性両面テープ、導電性接着剤又は瞬間接着剤を用いて接着される。
なお、深紫外光は、光子エネルギーが大きく、光子が生体試料200の切削面近傍で吸収され(浅浅度吸収)、原子間の結合を切断して(光解離)、分子を分解及び消滅させる(光蒸発)。
なお、第2の生体試料200は、電子顕微鏡で撮像した画像のコントラストの向上を図るために、4種の重金属により複合染色を行なったものである。
また、第2の生体試料200は、切削面の平坦化の確認を容易にするため、ガラスナイフ又はダイヤモンドナイフで切削した場合に生じるチャター(傷)を切削面に残したものである。
また、実験に使用した電子顕微鏡は、株式会社日立ハイテクノロジーズ製の卓上顕微鏡(Miniscope(登録商標)、TM3000)である。
そして、本実施形態に係るアブレーション装置10に第1の生体試料200をセットし、大気中において、第1の生体試料200の切削面全体に対して垂直方向から深紫外光を5分間(照射回数:300ショット)照射した。
そして、アブレーション後として、深紫外光を照射した第1の生体試料200を電子顕微鏡にセットし、アブレーション前の撮像範囲と同一の範囲について、第1の生体試料200の切削面を反射電子線像により撮像した(図2(c)、図2(d))。
また、第2の実験では、第2の生体試料200の切削面における各角度のArFエキシマレーザーのエネルギー密度(fluence:フルエンス)を一定に保つために、事前準備として、直径1mmのピンホールを開けた金属板を用いて、光学系3のレンズから第2の生体試料200の切削面までの距離と照射強度とを測定し、測定結果(下表1、図3)により、フルエンスを25μJ/cm2に決定した。
また、本実施形態に係るアブレーション装置10は、生体試料200の切削面に垂直な方向に対して斜め方向だけでなく、生体試料200の切削面に垂直な方向からも併せて、生体試料200の切削面に深紫外光を照射することにより、斜め照射による生体試料200の切削面の平滑化と、垂直照射による照射強度及び切削速度の向上とを図ることができる。
図9は第2の実施形態に係る3次元電子顕微鏡の概略構成を示す概念図である。図10は図9に示す3次元電子顕微鏡の処理動作を示すフローチャートである。図9及び図10において、図1と同じ符号は、同一または相当部分を示し、その説明を省略する。
なお、以下の説明においては、生体試料200の切削面を撮像する撮像手段として、走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope:以下、「SEM」と称す)を例に挙げて説明する。
また、電子顕微鏡部20は、生体試料200から放出された二次電子を検出し、当該検出した二次電子の光の強度を示す電気信号を出力する電子検出器25と、電子検出器25からの電気信号を増幅する増幅器26と、増幅器26からのアナログ信号をデジタル信号に変換してコンピュータ30に出力するA/D変換回路27と、走査コイル23を駆動させる走査信号を当該走査コイル23に出力して電子ビーム21aを走査する走査回路28と、を備える。
また、コンピュータ30は、制御部32からの制御信号、走査回路28からの走査信号及び電子検出器25からの電気信号値に基づき、生体試料200のSEM像を各層毎にそれぞれ構築し、当該各SEM像を重ね合わせた合成像である3次元のSEM像を構築する演算部33と、演算部33による演算結果を記憶する記憶部34と、演算部33によって構築された合成像を表示する表示部35と、を備える。
まず、使用者は、電子顕微鏡部20の試料室29b内のアブレーション装置10に生体試料200をセットする。
そして、使用者は、コンピュータ30の入力部31を用いて、生体試料200の撮像範囲(切削範囲)zを入力して設定する(ステップS1)。
アブレーション装置10の光源2及び光学系3並びに駆動部4は、コンピュータ30の制御部32からの制御信号に基づき、駆動部4が生体試料200の切削面に垂直な方向(中心軸O)を中心に当該支持部1を回転させ、光源2及び光学系3が生体試料200の切削面に垂直な方向(中心軸O)に対して斜め方向から生体試料200の切削面に深紫外光を所定の時間(例えば、5分間)だけ照射し(ステップS5)、ステップS2に戻る。
これに対し、第2の実施形態に係る3次元電子顕微鏡100は、生体試料200の厚さ方向の分解能がFIB−SEMに匹敵しつつ、比較的定真空で実施することができ、FIB−SEMと比較して非常に低コストである。
また、第2の実施形態に係る3次元電子顕微鏡100は、深紫外光の均一な強度照射により、生体試料200の広い面出し(1cm角以上)を可能にして、FIB−SEMの観察可能な面積の制限を取り除くことができる。
また、第2の実施形態に係る3次元電子顕微鏡100は、深紫外光の照射により、生体試料200の切削面を高速に切削することができ、画像データの取得時間の短縮を図ることができるという作用効果を奏する。
なお、第2の実施形態においては、第1の実施形態に係るアブレーション装置10を、SEMに組み合わせた応用例について説明したが、この応用例に限られるものではなく、以下の応用例も考えられる。
この3次元蛍光観察SEMは、免疫蛍光染色にて標識した生体組織をTechnovit(登録商標)8000のような無蛍光プラスチック樹脂で包埋した生体試料200に対して、蛍光染色された生体組織の蛍光像とSEM像とが融合した3次元画像を取得することができ、生体組織の機能を立体的に把握することが可能になる。
これに対し、3次元蛍光観察SEMは、蛍光部位の表示に対してより高分解能なSEM像による補助観察機能を追加しており、蛍光像及びSEM像の2つの合成像により、一般的な光学顕微鏡単体の分解能を超えた領域の立体再構築を行なうことができ、細胞や膜の詳細な同定が可能になると共に、標識した生体組織中のより高分解能な3次元における細胞間のネットワーク等の研究も可能になる。
また、3次元蛍光観察SEMは、生体試料200の厚さ方向(切削の深さ方向)であるZ軸方向へのアブレーション装置10による切削に追従して、Z軸方向の蛍光像を表示することができ、従来の共焦点レーザー顕微鏡におけるZ軸方向への表示制限を無くすことができる。
これに対し、第1の実施形態に係るアブレーション装置10は、厚切片の包埋試料の超薄切片化が自動化でき、高額な消耗品等が不要になることで、電子顕微鏡用のTEM試料の作製における障壁が取り除かれ、安い製作費での超薄切片の作製が可能になる。
2 光源
3 光学系
4 駆動部
4a シャフト
10 アブレーション装置
20 電子顕微鏡部
21 電子銃
21a 電子ビーム
22 集束レンズ
23 走査コイル
24 対物レンズ
25 電子検出器
26 増幅器
27 A/D変換回路
28 走査回路
29a 鏡筒
29b 試料室
30 コンピュータ
31 入力部
32 制御部
33 演算部
34 記憶部
35 表示部
100 3次元電子顕微鏡
200 生体試料,第1の生体試料,第2の生体試料
200a 試料
200b 試料
200c 試料
200d 試料
201 台座
Claims (5)
- 生体試料を支持する支持部と、
前記生体試料の切削面に垂直な方向に対して角度を付けた方向を含み、前記生体試料の切削面に対して複数の方向から、前記生体試料の切削面に深紫外光を照射する光源と、
を備え、
前記生体試料の切削面に垂直な方向に対する前記光源の照射方向の中に、50度以上であり、80度以下である角度となる方向を含むことを特徴とするアブレーション装置。 - 前記請求項1に記載のアブレーション装置において、
前記支持部の支持方向を中心に当該支持部を回転させる駆動部を備え、
前記駆動部が前記支持部を回転させることにより、前記光源が前記生体試料の切削面に対して複数の方向から前記生体試料の切削面に深紫外光を照射することになることを特徴とするアブレーション装置。 - 前記請求項1又は2に記載のアブレーション装置において、
前記深紫外光の波長が、193nm以下であることを特徴とするアブレーション装置。 - 前記請求項1乃至3のいずれかに記載のアブレーション装置と、
前記生体試料の切削面を撮像する撮像手段と、
前記アブレーション装置及び撮像手段を交互に駆動させる制御部と、
前記撮像手段により撮像された画像を記憶する記憶部と、
前記記憶部に記憶された連続する複数の画像に基づいて合成像を構築する演算部と、
を備えることを特徴とする3次元電子顕微鏡。 - 前記請求項4に記載の3次元電子顕微鏡において、
前記撮像手段が、
電子ビームを放出する電子銃と、
前記電子ビームを前記生体試料に集光する対物レンズと、
前記電子ビームを偏向して前記生体試料に対して走査する走査コイルと、
前記生体試料から放出された二次電子を検出し、当該検出した二次電子の光の強度を示す電気信号を出力する電子検出器と、
前記走査コイルを駆動させる走査信号を当該走査コイルに出力する走査回路と、
を備え、
前記演算部が、前記制御部からの制御信号、前記走査回路からの走査信号及び前記電子検出器からの電気信号値に基づき、前記生体試料のSEM像を各層毎にそれぞれ構築し、当該各SEM像を重ね合わせた合成像である3次元のSEM像を構築することを特徴とする3次元電子顕微鏡。
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