WO2020218504A1 - 観察システム、観察方法 - Google Patents

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WO2020218504A1
WO2020218504A1 PCT/JP2020/017681 JP2020017681W WO2020218504A1 WO 2020218504 A1 WO2020218504 A1 WO 2020218504A1 JP 2020017681 W JP2020017681 W JP 2020017681W WO 2020218504 A1 WO2020218504 A1 WO 2020218504A1
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WO
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pipette
observation system
observation
sample
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/017681
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English (en)
French (fr)
Inventor
秀実 重川
淳 谷中
Original Assignee
バイオ・アクセラレーター株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/44—SICM [Scanning Ion-Conductance Microscopy] or apparatus therefor, e.g. SICM probes

Definitions

  • the present invention relates to an observation system and an observation method.
  • Patent Document 1 is a method of examining the surface of a sample immersed in an electrolytic solution by using a scanning ion conductance microscopy, in order to induce an ion current in the electrolytic solution by using a spectral diffusion modulation signal.
  • the potential between the first electrode immersed in the electrolytic solution in the micropipette and the second electrode outside the micropipette is controlled so that the micropipette moves with respect to the stage supporting the sample.
  • Disclosed is a method of recording the ion current during control, demodating the recorded ion current, and determining the surface height profile of the sample from the demodulated ion current and calibration data. ..
  • the observation system includes a metal-added pipette, an arithmetic device for measuring an ion current that increases or decreases according to the distance between the pipette and a sample, a light source for irradiating excitation light, and the excitation. It is provided with a detector which is Raman spectroscopy obtained by irradiating the sample with light and detects Raman spectroscopy locally enhanced by the metal.
  • the observation method according to the second aspect of the present invention is a pipette to which a metal is added, an excitation light irradiation unit that irradiates excitation light, and Raman spectroscopy obtained by irradiating the sample with the excitation light, which is locally enhanced by the metal.
  • An observation method performed using an observation system including a detector for detecting the Raman spectroscopy, wherein the pipette is used to suck up the cytoplasm of cells and the tip of the pipette is irradiated with the excitation light. Includes detecting Raman spectroscopy with the detector.
  • Configuration diagram of the observation system according to the first embodiment Conceptual diagram showing the tip of a pipette Diagram showing a technique for fixing diamond particles to a pipette without a metal coating Diagram showing how diamond particles are fixed to a metal-coated pipette
  • the figure which shows an example of the measurement result Diagram illustrating a series of observations of cells using an observation system Flowchart showing the processing of the calculation unit Configuration diagram of the observation system according to the second embodiment
  • FIG. 1 is a block diagram of the observation system S1.
  • the observation system S1 includes a pipette 11, a first electrode 12, an IV conversion circuit 13, a second electrode 14, a constant voltage source 15, an XY scanner 21, a Z scanner 22, an HV amplifier 23, and a PC 24.
  • a controller 26, a cofocal measuring unit 51, and a Raman measuring unit 52 are provided.
  • a transparent container L is arranged on the XY scanner 21. In the container L, cells 900 immersed in an electrolyte Q such as physiological saline are arranged.
  • Pipette 11 is a hollow glass pipette.
  • the inside of the pipette 11 is filled with the solution Q, and the first electrode 12 is inserted into the inside of the pipette 11.
  • the pipette 11 is fixed to the scanner 22 and moved in the vertical direction shown by the Z scanner 22.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing the tip of the pipette 11.
  • the tip of the pipette 11 has a diameter of about several nanometers to several hundreds of nm, for example, 100 nm, and the diamond particles 112 are fixed by the cross-linking agent 111.
  • Various cross-linking agents 111 can be used.
  • the diamond particles 112 can be fixed to the pipette 11 by the method shown in FIG.
  • These diamond particles include a diamond nitrogen-vacancy center (Diamond Nitrogen Vacancy Center), which is a type of lattice defect.
  • the diamond nitrogen-vacancy center is also called the nitrogen-vacancy center or NV center. In the present specification, the diamond nitrogen-vacancy center is referred to as "diamond NV”.
  • a metal coating 112A is attached to the tip of the pipette 11.
  • the metal coating 112A may be applied not only to the tip of the pipette 11 but also to a region on the side surface of the pipette 11 and close to the tip.
  • the metal coating 112A may not be applied to a part of the tip of the pipette 11.
  • the metal coating 112A is, for example, gold, silver, and platinum.
  • the metal coating 112A can be applied to the pipette 11 by any method.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a method of fixing the diamond particles 112 to the pipette 11.
  • the example shown in FIG. 3 shows a case where the metal coating 112A does not exist between the diamond particles 112 and the pipette 11.
  • the carbodiimide cross-linking agent 113 is bound to diamond, and the aminosilane coupling agent 114 is bound to the tip of the pipette 11.
  • the diamond particles 112 are fixed to the pipette 11 by binding the carbodiimide cross-linking agent 113 and the aminosilane coupling agent 114.
  • the explanation will be continued by returning to FIG.
  • the above method may be changed as follows. That is, an amino-terminal alkanethiol may be used instead of the aminosilane coupling agent 114. Other points are the same as in the case where the metal coating 112A is not present between the diamond particles 112 and the pipette 11.
  • FIG. 4 shows an example in which 6-amino and 1-hexanethiol are used, and the metal coating 112A in FIG. 4 is gold.
  • the first electrode 12 is inserted into the pipette 11 and is immersed in the solution Q filled inside the pipette 11.
  • the IV conversion circuit 13 converts a weak current flowing between the first electrode 12 and the second electrode 14, that is, an ionic current, into a voltage and outputs it to the controller 26.
  • the second electrode 14 is immersed in a solution Q filled in a container L placed on the XY scanner 21.
  • the constant voltage source 15 applies a constant voltage.
  • the XY scanner 21 has a built-in piezo element.
  • the XY scanner 21 moves in the X direction and the Y direction, that is, in the left-right direction and the depth direction shown by driving the piezo element by the high voltage output from the HV amplifier 23.
  • a container L containing the cells 900 and the second electrode 14 is arranged on the XY scanner 21.
  • a pipette 11 is inserted into the container L, and a current flows between the first electrode 12 and the second electrode 14 by the solution Q in the container L and the solution Q in the pipette 11.
  • a microwave generator 25 is attached to the XY scanner 21.
  • the microwave generation unit 25 outputs microwaves used in the measurement of the diamond NV mode described later.
  • the XY scanner 21 has a hole or a transparent plate in the central portion, and enables observation of the cells 900 from the lower portion by the confocal microscope 30.
  • the HV amplifier 23 is a high voltage amplifier that outputs a high voltage.
  • the HV amplifier 23 is connected to the controller 26, the XY scanner 21, and the Z scanner 22.
  • the HV amplifier 23 supplies a high voltage to the XY scanner 21 and the Z scanner 22 based on an operation command by the controller 26, specifically, a voltage signal or a current signal which is an operation command signal. Since the Z scanner 22 and the XY scanner 21 determine the positional relationship between the pipette 11 and the cell 900, the Z scanner 22 and the XY scanner 21 can be collectively referred to as a “moving unit”.
  • the controller 26 includes an AD / DA converter 27.
  • the controller 26 operates the AD / DA converter 27 based on the operation command of the PC 24. Specifically, the controller 26 acquires the value of the voltage output from the IV conversion circuit 13 from the AD / DA converter 27 and outputs it to the PC 24. Further, the controller 26 outputs an analog signal of current or voltage to the HV amplifier 23 in accordance with the operation command of the PC 24. For example, when the controller 26 receives a movement command of +10 nm in the Z-axis direction from the PC 24, the controller 26 outputs a voltage corresponding to +10 nm to the channel corresponding to the Z-axis of the HV amplifier 23.
  • the objective lens 41, the beam splitter 42, the Dyquilock mirror 43, the low-pass filter 44, the first pinhole plate 45, the second pinhole plate 46, and the third pinhole A plate 47, a notch filter 48, a camera 31, a light source 32, and a detector 33 are arranged.
  • the objective lens 41, the beam splitter 42, the dichroic mirror 43, the second pinhole plate 46, the third pinhole plate 47, the notch filter 48, the camera 31, and the light source 32 are the confocal measuring unit 51.
  • the objective lens 41, the Dyquilock mirror 43, the third pinhole plate 47, the notch filter 48, the light source 32, and the detector 33 are Raman measuring units 52.
  • the light source 32 outputs a tunable wavelength laser.
  • the dichroic mirror 43 reflects the light of the laser wavelength output from the light source 32 and transmits the light of other wavelengths.
  • the laser light output from the light source 32 passes through the third pinhole plate 47 and the notch filter 48, is reflected by the dichroic mirror 43, passes through the beam splitter 42, and then irradiates the cells 900 through the objective lens 41.
  • the reflected light is split by the beam splitter 42 and detected by the camera 31 and the detector 33. Since the dichroic mirror 43 transmits light having a wavelength other than the wavelength of the laser output by the light source 32, the detector 33 can measure the Raman spectrum.
  • the detector 33 is a spectroscope, and can disperse, for example, about 500 nm to about 1000 nm.
  • the first pinhole plate 45, the second pinhole plate 46, and the third pinhole plate 47 are plates having pinholes and allow scattered light to pass only from the focal position.
  • the objective lens 41 has a built-in servomotor, for example, and moves in the vertical direction shown in the drawing according to an operation instruction of the PC 24. By moving the objective lens 41 in the vertical direction shown in the drawing, an image of the cell 900 at an arbitrary depth can be obtained. Further, the confocal measuring unit 51 can acquire an image of an arbitrary depth in the entire area of the cell 900 by operating the XY scanner 21 to change the positional relationship between the optical axis and the cell 900.
  • the PC 24 includes a calculation unit 241 and a storage unit 242.
  • the arithmetic unit 241 includes, for example, a CPU, a ROM, and a RAM (not shown), and the CPU expands the program stored in the ROM into the RAM and executes the program to realize the functions described later.
  • the arithmetic unit 241 is realized by FPGA (Field Programmable Gate Array), which is a rewritable logic circuit instead of a combination of CPU, ROM, and RAM, and ASIC (Application Specific Integrated Circuit), which is an integrated circuit for specific applications. May be good.
  • the arithmetic unit 241 may be realized by a combination of different configurations, for example, a combination of a CPU, a ROM, a RAM and an FPGA, instead of a combination of the CPU, the ROM, and the RAM.
  • the PC 24 is connected to a display and an input device (not shown), and transmits an operator's operation command input from the input device to the controller 26.
  • the PC 24 also transmits an operation command based on the calculation of the calculation unit 241 to the controller 26.
  • the captured image is input to the PC 24 from the detector 33. Further, in the PC 24, the coordinates of the pipette 11 are input from the controller 26.
  • the calculation unit 241 records a captured image input from the detector 33 and a Raman spectrum input from the detector 33.
  • the PC 24 always grasps the XYZ coordinates, which is the tip position of the pipette 11. For example, each time the PC 24 outputs a movement command to the controller 26, the PC 24 updates the XYZ coordinate values held inside the PC 24 based on the output movement command. However, the controller 26 may manage the XYZ coordinates, or the XY scanner 21 and the Z scanner 22 may each manage the coordinates.
  • the calculation unit 241 outputs a display as shown in FIG. 5 to a display (not shown) using the recorded XYZ coordinates and Raman spectrum.
  • a cross-sectional view of the height of the cell 900 in an arbitrary Z direction is displayed, and the height of the cross-sectional view can be changed by operating the slider 912.
  • the Raman spectrum at the selected position is displayed.
  • the calculation unit 241 identifies a protein or the like existing at that position based on the Raman spectrum.
  • the measurement system S1 can measure by four methods. Here, each measurement method will be described as a "mode".
  • the measurement system S has a confocal mode, a SIMM mode, a Raman mode, and an NV mode.
  • the confocal mode is a measurement using the confocal measuring unit 51 shown in the lower part of FIG.
  • the SIMM mode is a measurement using a function as a scanning ion-conductance microscope, that is, a scanning ion-conductance microscope.
  • the Raman mode is a measurement for observing Raman scattering using the Raman measuring unit 52.
  • the NV mode is a measurement for observing the cell 900 and the surrounding environment by exciting the diamond NV and observing the spin state.
  • Each mode is switched by PC24.
  • the mode may be switched by the operation of the operator, or may be switched automatically by the program built in the PC 24, for example, sequentially by batch processing.
  • the above-mentioned "mode" is conceptual, and a plurality of modes may be executed at the same time.
  • the frequency of the laser light output by the light source 32 may or may not be the same. Further, the frequency of the laser beam may be finely adjusted according to the characteristics of the equipment used.
  • the PC 24 irradiates a laser beam from the light source 32, moves the objective lens 41 to adjust the focal length, and observes the cells 900 at an arbitrary Z position.
  • an image obtained by shooting in the confocal mode will be referred to as a “captured image”.
  • the tip of the pipette 11 can be included in the captured image.
  • SIMM mode In the SIMM mode, it is utilized that the ion current flowing between the first electrode 12 and the second electrode 14 is reduced by narrowing the distance between the tip of the pipette 11 and the cell 900.
  • the PC 24 is located at the position of the Z scanner 22, that is, the pipette 11 so that the voltage value output by the IV conversion circuit 13 is constant, that is, the ion current flowing through the gap between the tip of the pipette 11 and the cell 900 is constant. Adjust the height. By moving the cells 900 located directly under the pipette 11 using the XY scanner 21, the shape of the entire surface of the cells 900 can be observed in detail in the SIMM mode without contact.
  • the following can be done by utilizing the fact that when the pipette 11 comes into contact with the cell 900, the ion current does not flow. That is, in the SIMM mode, the Z position of the pipette 11 in which the pipette 11 contacts the surface of the cell 900 can be measured with high accuracy.
  • the Raman mode In the Raman mode, the laser light output from the light source 32 is irradiated near the tip of the pipette 11, and the scattered light f2 is measured by the detector 33. Then, the composition of the substance existing at the tip of the pipette 11 is specified by the relationship between the frequency f1 of the laser light and the scattered light f2. However, scattered light f2 is used as a general term for light of various frequencies and various intensities. The scattered light f2 is detected by the detector 33.
  • the excitation light is scattered as Rayleigh scattering with no change in wavelength, but some scattered light is observed as Stokes scattering or anti-Stokes scattering due to energy reception.
  • the relationship between the frequency f2 of Stokes scattered light and anti-Stokes scattered light and the frequency f1 of laser light which is excitation light, that is, the Raman shift which is the wavelength shift amount of Raman scattering is known for each molecule. Therefore, by referring to a known molecular structure or Raman spectrum database, the structure and type of the molecule existing at the tip of the pipette 11 can be specified. Further, in the present embodiment, the scattered light is enhanced by the probe enhancing effect, facilitating detection, and enabling observation in a short time.
  • the laser beam output from the light source 32 is used to excite the diamond NV at the tip of the pipette 11. Further, the diamond NV is irradiated with the microwave output by the microwave generating unit 25 to control the spin. This spin is affected by the surrounding environment, and it can be confirmed by observing the emission of diamond NV with the camera 31 that the spin is in a specific state, so that the magnetic field, temperature, and the like can be measured by a known method. Further, since the diamond NV is added to the tip of the pipette 11, the spatial resolution is improved, and the signal strength is improved by the probe enhancing effect.
  • the laser light output from the light source 32 and the microwave output from the microwave generator 25 are irradiated to the tip of the pipette 11, and the spectrum obtained by the detector 33 is analyzed to measure the magnetic field, temperature, and the like.
  • the XY scanner 21 and the Z scanner 22 can be operated to measure the arbitrary position of the cell 900.
  • the PC 24 observes the Raman mode for the cell membrane of the cell 900, that is, acquires the Raman spectrum by the laser light output from the light source 32, and obtains the local vibration mode of the molecule existing in the cytoplasm. Make an observation. Further, the PC 24 measures the NV mode using the laser light output from the light source 32 and the microwave output from the microwave generating unit 25.
  • the PC 24 operates the Z scanner 22 to bring the pipette 11 closer to the cell 900 until the ion current becomes zero.
  • the ion current is zero
  • the tip of the pipette 11 is in contact with the surface of the cell 900.
  • the PC 24 moves the objective lens 41 so that the tip of the pipette 11 is included in the focus range.
  • the PC 24 continuously acquires captured images and controls the Z scanner 22 so that the tip of the pipette 11 is clearly captured in the captured image.
  • the tip of the pipette 11 When the tip of the pipette 11 is clearly photographed in the photographed image, the tip of the pipette 11 has reached the cytoplasm. Whether or not the tip of the pipette 11 is clearly displayed in the captured image may be determined by the operator operating the PC 24 or by a program. When making a judgment by a program, a method of using pattern matching with an image in which the pipette 11 is clearly photographed, a method of using machine learning using an image in which the pipette 11 is clearly photographed, or the like can be adopted.
  • the photographed image is focused in advance on the observation target existing inside the cytoplasm, and the pipette 11 is moved to a position where the tip of the pipette 11 is clearly photographed. You may let me.
  • the pipette 11 may be further invaded into the cell to observe the Raman mode and the NV mode again, or the invasion and the observation may be repeated a plurality of times. That is, Raman mode observation may be performed at a plurality of locations in the cytoplasm by changing the position in the Z direction. Then, the pipette 11 is pulled up using the Z scanner 22 and the tip of the pipette 11 is returned to the surface of the cell membrane of the cell 900, that is, to the outside of the cell 900. Then, the XY scanner 21 is operated to change the measurement position on the XY plane. By repeating the above treatment, the entire area of the cell 900 is observed as needed. Note that this iterative process is described only as an example, and observation may be performed only at necessary points.
  • FIG. 7 is a flowchart showing the processing of the calculation unit 241 corresponding to the above-mentioned operation example.
  • the execution subject of each step described below is the arithmetic unit 241.
  • the calculation unit 241 moves to a predetermined XY coordinate (S601).
  • the calculation unit 241 uses the Z scanner 22 to perform SIMM measurement, that is, measurement in the SIMM mode (S602).
  • SIMM mode the PC 24 moves the Z scanner 22 so that the ion current becomes a constant value A0.
  • the PC 24 sends the flagged XYZ coordinates to the PC 24. Therefore, the PC 24 recognizes that when the XYZ coordinates are (x1, y1, z1), the height of the surface of the cell 900 when the XY coordinates are (x1, y1) is z1.
  • the calculation unit 241 performs Raman measurement and NV measurement, that is, measurement in Raman mode and NV mode (S603).
  • the calculation unit 241 moves the objective lens 41 to focus on the cell to be observed inside the cytoplasm of the cell 900.
  • the calculation unit 241 moves the pipette so that the tip of the pipette 11 is in focus in the captured image of the camera 31 (S605).
  • the calculation unit 241 performs the measurement in the Raman mode and the NV mode (S606).
  • the calculation unit 241 may repeat the further movement of the pipette 11 in the Z direction and the measurement in the Raman mode and the NV mode one or more times before proceeding to the next S607.
  • the calculation unit 241 determines whether or not the measurement at all the measurement points has been completed (S607), and if it determines that the measurement has been completed, the process shown in FIG. 7 is terminated, and there are unmeasured points. When determining, the process returns to S601. When returning to S601, the calculation unit 241 moves the pipette 11 to any unmeasured point.
  • the observation system S1 irradiates the pipette 11 to which the metal 112A is added, the PC24 that measures the ion current that increases or decreases according to the distance between the pipette 11 and the cell 900 that is the sample, and the laser light that is the excitation light. It includes a light source 32 and a detector 33 that detects Raman spectroscopy obtained by irradiating cells 900 with excitation light and locally enhanced by metal 112A.
  • the observation system S1 can measure the shape of the surface of the cell 900 by acting as an ion conductance microscope for measuring the ion current, and further, the metal 112A attached to the surface of the pipette 11 non-invasively detects Raman spectroscopy with high sensitivity. The substance can be identified.
  • a diamond NV112 is attached to the tip of the pipette 11.
  • the camera 31 is provided as an observation unit for observing the spin state of the diamond NV112 affected by the cells 900. Therefore, the surface and internal environment of the cell 900 can be measured by observing the spin state.
  • the observation system S1 includes a moving unit that manipulates the positional relationship between the pipette 11 and the cell 900, that is, a Z scanner 22 and an XY scanner 21.
  • the detector 33 detects Raman spectroscopy on the surface of the cell 900 and inside the sample before and after the positional relationship operation by the Z scanner 22 and the XY scanner 21. Therefore, not only the surface of the cell 900 but also the inside of the cell can be observed.
  • the camera 31 observes the spin state affected by the surface of the cell 900 and the inside of the cell 900 before and after the operation of the positional relationship by the XY scanner 21 and the Z scanner 22. Therefore, not only the surface of the cell 900 but also the internal environment of the cell 900 can be measured.
  • the Z scanner 22 moves the pipette 11 from the position where the ion current becomes zero (S604 in FIG. 7) by an amount corresponding to the thickness of the cell membrane of the cell 900 (S607 in FIG. 7), thereby causing the pipette 11 to move.
  • the tip is moved inside the cell 900. Therefore, the position of the surface of the cell 900 can be specified by using the principle of the ion conductance microscope having high position resolution, and the tip of the pipette 11 can be inserted into the cell 900.
  • the observation target of the observation system S1 is not limited to cells.
  • the observation system S1 can observe various substances other than cells.
  • Modification 2 In the first embodiment described above, only the Z scanner 22 moves the pipette 11, and the XY scanner 21 moves the cell 900 to freely set the positional relationship between the pipette 11 and the cell 900 in three dimensions. did. However, the positional relationship between the pipette 111 and the cell 900 may be freely set in three dimensions, and the device configuration is arbitrary. For example, the pipette 11 may be arbitrarily movable in the XYZ direction without preparing a movement mechanism for the cells 900.
  • the metal coating 112A of the pipette 11 is not particularly limited.
  • the metal coating 112A may be limited to: That is, in this modification, the pipette 11 is first coated with silver and then coated with gold. Silver is useful when focusing only on the enhancing effect that causes Raman scattering. However, silver is toxic to cells and adversely affects the cells 900 to be observed. To prevent this, the silver surface is coated with gold, which has the effect of chemically inactivating it.
  • the light source 32 may be connected to the camera 31 and output the laser beam at the timing when the camera 31 takes a picture.
  • the observation system S1 has four measurement modes, but may not include either Raman mode or NV mode. If the observation system S1 does not have Raman mode, the pipette 11 may not have the metal coating 112A. If the observation system S1 does not have NV mode, the pipette 11 may not have diamond particles 112 attached.
  • FIGS. 8 to 9 A second embodiment of the observation system according to the present invention will be described with reference to FIGS. 8 to 9.
  • the same components as those in the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the differences will be mainly described.
  • the points not particularly described are the same as those in the first embodiment.
  • This embodiment differs from the first embodiment mainly in that the cytoplasm is sucked out and analyzed.
  • FIG. 8 is a block diagram of the observation system S2 according to the second embodiment.
  • the difference from the first embodiment is that a voltage source 15A is provided instead of the voltage source 15.
  • the voltage source 15A can apply not only a positive voltage but also a negative voltage.
  • the voltage source 15A outputs the voltage indicated by the PC 24 via the controller 26.
  • measurement is performed at a position where the tip of the pipette 11 is away from the XY scanner 21.
  • the microwave generator 25, the camera 31, the light source 32, and the detector 33 may be moved to appropriate positions.
  • a microwave generator, a camera, a light source, and a detector may be newly provided according to the position of the pipette 11 away from the XY scanner 21.
  • an optical system such as a mirror may be added to cope with the change in the position of the pipette 11.
  • FIG. 9 is a diagram showing an outline of operation of the observation system S2 according to the second embodiment.
  • the observation system S2 performs the following operation after acquiring the Raman spectrum in the entire area including the inside of the cell 900 by the operation in the first embodiment.
  • the operator determines the survey target point and inputs it to the PC 24 using an input device (not shown).
  • the calculation unit 241 of the PC 24 moves the tip of the pipette 11 to the input survey target point as shown in FIG. 9A.
  • the calculation unit 241 applies a negative voltage to the voltage source 15A via the controller 26, and sucks up the electrolyte at the investigation target point inside the pipette 11 as shown in FIG. 9B.
  • the calculation unit 241 operates the Z scanner 22 as shown in FIG. 9C to pull out the pipette 11 from the cell 900.
  • the calculation unit 241 pressurizes the solution inside the pipette 11 as shown in FIG. 9D to form a droplet 913 at the tip of the pipette 11.
  • the droplet 913 may be in a minute amount, for example, in picolitre units.
  • the calculation unit 241 irradiates the droplet 913 with a laser beam and a microwave, and measures the Raman mode and the NV mode.
  • the Raman mode and NV mode may be measured by irradiating the electrolyte attached to the tip of the pipette 11 with laser light and microwaves without applying a positive voltage to the voltage source 15A.
  • FIG. 9 (e) is an enlarged view of the droplet 913 formed at the tip of the pipette 11. Molecules in the droplet 913 are free to enter and exit the locally enhanced electric field region 914. By continuing the observation for a certain period of time, Raman mode and NV mode measurements are performed on all the molecules contained in the droplet.
  • the cell membrane is a lipid bilayer, by extracting the electrolyte from the outside of the cell 900 and then measuring it, the signal of the molecule to be observed is increased by the electric field region 914 without being affected by other signals such as the cell membrane. it can.
  • the IV conversion circuit 13A functions as a suction unit and a discharge unit described below.
  • the suction unit sucks a part of the sample 900 into the pipette 11 by applying a negative voltage.
  • the discharge unit discharges at least a part of the sample 900 sucked up by the suction unit to form a droplet 913.
  • the above-mentioned observation method is a pipette 11 having a metal added to the tip, a microwave generating unit 25 that irradiates microwaves as excitation light, and Raman spectroscopy obtained by irradiating cells 900 with excitation light.
  • This is an observation method performed using an observation system 1 including a detector 33 for detecting Raman spectroscopy locally enhanced by metal.
  • This observation method includes sucking up the cytoplasm of the cell 900 using the pipette 11A, irradiating the tip of the pipette 11A with excitation light, and detecting Raman spectroscopy using the detector 33. Therefore, the signal of the molecule to be observed can be increased and observed by the electric field region 914 without being affected by other signals such as the cell membrane.
  • the Raman spectrum of the droplet 913 was measured.
  • TOF mass spectrometry by laser ablation or the like may be performed.
  • FIG. 1 A third embodiment of the observation system according to the present invention will be described with reference to FIG.
  • the same components as those in the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the differences will be mainly described.
  • the points not particularly described are the same as those in the first embodiment.
  • the present embodiment differs from the first embodiment mainly in that the activity of cells is detected by using an oxygen isotope.
  • O-17 having 17 neutrons is used as an isotope of oxygen.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram showing the operation in the third embodiment.
  • the cells 900 are placed in an O-17 environment for a certain period of time.
  • the oxygen in glucose (C 6 H 12 O 6 ) accumulated in the cell 900 becomes O-17.
  • the cells 900 are placed in an O-16 environment. Since the cell 900 performs oxygen metabolism using glucose and discharges oxygen containing O-17, this O-17 is detected by measuring the NV mode using the pipette 11. To elaborate on the excretion of O-17, the CO 2 and H 20 excreted by the cell 900 by oxygen metabolism are produced from glucose containing O-17. Therefore, the oxygen constituting CO 2 and H 20 includes not only O-16 which is the same as in the atmosphere but also O-17 which is not contained in the atmosphere. Therefore, the degree of activity of the cell 900 can be evaluated by detecting the oxygen metabolism of the cell by detecting O-17 and evaluating the concentration of O-17.
  • Isotope detection Irradiation of cells 900 with microwaves causes spins in the electrons, and the spins differ for each isotope. Specifically, O-16 and O-17 have different spin modes. Therefore, it is possible to distinguish between O-16 and O-17 in Raman spectroscopy.
  • the sample to be observed in the observation system is cells 900.
  • the observation unit that is, the detector 33, which makes observations in the NV mode, detects O-17, which is an oxygen isotope related to the metabolism of cells 900. Therefore, O-17 can be used to non-invasively evaluate cell activity. For example, it is possible to observe the state of metabolism by using a fluorescent sample, but it is inevitable that the cells will be affected by administering the fluorescent sample to the cells. However, according to this embodiment, cell metabolism and activity can be measured non-invasively.
  • O-17 was taken up by cells 900 as a gas.
  • O-17 may be incorporated into cells 900 as a liquid, i.e. water.
  • time decomposition that is, measurement by the pump-probe method is possible in Raman mode and NV mode.
  • the operation of the confocal mode and the SIMM mode is the same as that of the first embodiment.
  • light of various frequencies can be used for the pump light and the probe light.
  • the pump light and the probe light may control the phase, or lock-in detection may be performed to improve the sensitivity of signal measurement.
  • the delay time which is the difference between the irradiation timing of the pump light and the irradiation timing of the probe light, is changed in a plurality of ways.
  • the optical path length may be changed by mechanical operation such as moving the stage for controlling the delay time or driving a mirror, or a Pockels cell is used. You may.
  • the delay time is increased by changing the timing of inputting the pulse signal to the two output sources. You may control it.
  • the Raman mode for example, ultraviolet rays may be used as the pump light, and laser light output by the light source 32 may be used as the probe light as in the first embodiment. Since the vibration mode in the cell 900 is changed by irradiating the pump light, the state of relaxation of the vibration mode can be observed by measuring the Raman spectrum. In NV mode, the state of spin relaxation can be observed.

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Abstract

観察システムは、金属を付加したピペットと、ピペットと試料との間隔に応じて増減するイオン電流を測定する演算装置と、励起光を照射する光源と、励起光を試料に照射して得られるラマン分光であって金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器と、を備える。

Description

観察システム、観察方法
　本発明は、観察システムおよび観察方法に関する。
　イオンコンダクタンス顕微鏡は、非接触で高精度に形状の情報を取得でき、特に生物試料などに対する非侵襲の測定手段として知られている。特許文献１には、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法を用いて、電解液に浸された試料の表面を調べる方法であって、スペクトル拡散変調信号を用いてイオン電流を前記電解液内に誘導するために、マイクロピペット内で前記電解液に浸された第１電極と、前記マイクロピペット外の第２電極との間の電位を制御し、前記試料を支持するステージに対して前記マイクロピペットが動くように制御している間の前記イオン電流を記録し、前記記録されたイオン電流を復調し、復調されたイオン電流及び較正データから、前記試料の表面高さプロファイルを決定する方法が開示されている。
日本国特表２０１７－５０８１６１号公報
　特許文献１に記載されている発明では、物質の同定ができない。
　本発明の第１の態様による観察システムは、金属を付加したピペットと、前記ピペットと試料との間隔に応じて増減するイオン電流を測定する演算装置と、励起光を照射する光源と、前記励起光を前記試料に照射して得られるラマン分光であって前記金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器と、を備える。
　本発明の第２の態様による観察方法は、金属を付加したピペット、励起光を照射する励起光照射部、前記励起光を前記試料に照射して得られるラマン分光であって前記金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器を備える観察システムを用いて実行される観察方法であって、前記ピペットを用いて細胞の細胞質を吸い上げることと、前記ピペットの先端に前記励起光を照射し、前記検出器を用いてラマン分光を検出することと、を含む。
　本発明によれば、測定対象の形状情報を取得するだけでなく物質を同定できる。
第１の実施の形態における観察システムの構成図 ピペットの先端を示す概念図 ダイヤモンド粒子を金属コーティングがないピペットに固定する手法を示す図 ダイヤモンド粒子を金属コーティングがされたピペットに固定する手法を示す図 測定結果の一例を示す図 観察システムを用いた細胞の一連の観察を説明する図 演算部の処理を示すフローチャート 第２の実施の形態における観察システムの構成図 第２の実施の形態における観察システムの動作概要を示す図 第３の実施の形態における観察システムの動作を示す概念図
―第１の実施の形態―
　以下、図１～図７を参照して、本発明に係る観察システムの第１の実施の形態を説明する。
（構成）
　図１は観察システムＳ１の構成図である。観察システムＳ１は、ピペット１１と、第１電極１２と、ＩＶ変換回路１３と、第２電極１４と、定電圧源１５と、ＸＹスキャナ２１と、Ｚスキャナ２２と、ＨＶアンプ２３と、ＰＣ２４と、コントローラ２６と共焦点測定部５１とラマン測定部５２とを備える。ＸＹスキャナ２１の上には、透明な容器Ｌが配される。容器Ｌには、生理食塩水などの電解質Ｑに浸された細胞９００が配置される。
　ピペット１１はガラス製の中空ピペットである。ピペット１１の内部は、溶液Ｑで満たされ、ピペット１１の内部には第１電極１２が挿入される。ピペット１１はスキャナ２２に固定され、Ｚスキャナ２２により図示上下方向に移動される。
　図２はピペット１１の先端を示す概念図である。ピペット１１の先端部は直径が数ナノｍ～数１００ｎｍ程度、たとえば１００ｎｍであり、架橋剤１１１によりダイヤモンド粒子１１２が固定される。架橋剤１１１は様々なものが使用できるが、たとえば図３に示す手法でダイヤモンド粒子１１２をピペット１１に固定できる。このダイヤモンド粒子は、格子欠陥の一種であるダイヤモンド窒素－空孔中心（Diamond　Nitrogen　Vacancy　Center）を含む。ダイヤモンド窒素－空孔中心は、窒素－空孔中心やＮＶセンターとも呼ばれる。本明細書では、ダイヤモンド窒素－空孔中心を「ダイヤモンドＮＶ」と呼ぶ。
　ピペット１１の先端部分には、金属コーティング１１２Ａが付されている。金属コーティング１１２Ａは、ピペット１１の先端だけでなくピペット１１の側面であって先端に近い領域にも付されてもよい。金属コーティング１１２Ａはピペット１１の先端部の一部の領域には付されていなくてもよい。この金属コーティング１１２Ａはたとえば、金、銀、およびプラチナなどである。この金属コーティング１１２Ａは任意の方法でピペット１１に塗布できる。
　図３はダイヤモンド粒子１１２をピペット１１に固定する手法の一例を示す図である。ただし図３に示す例では、ダイヤモンド粒子１１２とピペット１１との間に金属コーティング１１２Ａが存在しない場合を示している。図３に示すように、ダイヤモンドにカルボジイミド架橋剤１１３を結合させ、ピペット１１の先端にアミノシランカップリング剤１１４を結合させる。そしてカルボジイミド架橋剤１１３とアミノシランカップリング剤１１４とを結合させることで、ピペット１１にダイヤモンド粒子１１２を固定する。図１に戻って説明を続ける。
　ダイヤモンド粒子１１２とピペット１１との間に金属コーティング１１２Ａが存在する場合は、上述した手法を次のように変更すればよい。すなわち、アミノシランカップリング剤１１４の代わりに、アミノ末端アルカンチオールを用いればよい。その他の点は、ダイヤモンド粒子１１２とピペット１１との間に金属コーティング１１２Ａが存在しない場合と同様である。図４は、６－アミノ、１－ヘキサンチオールを用いる場合を示す例であり、図４における金属コーティング１１２Ａは金である。
　第１電極１２は、ピペット１１に挿入され、ピペット１１の内部に満たされた溶液Ｑに浸されている。ＩＶ変換回路１３は、第１電極１２と第２電極１４の間に流れる微弱な電流、すなわちイオン電流を電圧に変換してコントローラ２６に出力する。第２電極１４は、ＸＹスキャナ２１の上に設置された容器Ｌに満たされた溶液Ｑに浸されている。定電圧源１５は一定の電圧を印加する。
　ＸＹスキャナ２１には、ピエゾ素子が内蔵される。ＸＹスキャナ２１は、ＨＶアンプ２３から出力される高電圧によりピエゾ素子が駆動されることで、Ｘ方向とＹ方向、すなわち図示左右方向および奥行き方向に移動する。ＸＹスキャナ２１の上には細胞９００および第２電極１４が入った容器Ｌが配される。容器Ｌにはピペット１１が差し込まれ、容器Ｌ内の溶液Ｑおよびピペット１１内の溶液Ｑにより、第１電極１２および第２電極１４の間に電流が流れる。ＸＹスキャナ２１にはマイクロ波発生部２５が取り付けられる。マイクロ波発生部２５は、後述するダイヤモンドＮＶモードの測定において利用するマイクロ波を出力する。ＸＹスキャナ２１は、中央部に穴または透過性の板を有し、共焦点顕微鏡３０による下部からの細胞９００の観察を可能としている。
　ＨＶアンプ２３は高電圧を出力するハイボルテージアンプである。ＨＶアンプ２３は、コントローラ２６、ＸＹスキャナ２１、およびＺスキャナ２２と接続される。ＨＶアンプ２３はコントローラ２６による動作指令、具体的には動作指令信号である電圧信号または電流信号に基づきＸＹスキャナ２１およびＺスキャナ２２に高電圧を供給する。なお、Ｚスキャナ２２およびＸＹスキャナ２１は、ピペット１１と細胞９００との位置関係を決定するので、Ｚスキャナ２２およびＸＹスキャナ２１をまとめて「移動部」と呼ぶこともできる。
　コントローラ２６は、ＡＤ／ＤＡコンバータ２７を備える。コントローラ２６は、ＰＣ２４の動作指令に基づきＡＤ／ＤＡコンバータ２７を動作させる。具体的にはコントローラ２６は、ＩＶ変換回路１３から出力される電圧の値をＡＤ／ＤＡコンバータ２７から取得してＰＣ２４に出力する。またコントローラ２６は、ＰＣ２４の動作指令に従い、電流または電圧のアナログ信号をＨＶアンプ２３に出力する。たとえばコントローラ２６は、ＰＣ２４からＺ軸方向に＋１０ｎｍの移動指令を受けると、ＨＶアンプ２３のＺ軸に対応するチャンネルに＋１０ｎｍに対応する電圧を出力する。
　ＸＹスキャナ２１の下部には、対物レンズ４１と、ビームスプリッタ４２と、ダイクイロックミラー４３と、ローパスフィルタ４４と、第１ピンホール板４５と、第２ピンホール板４６と、第３ピンホール板４７と、ノッチフィルタ４８と、カメラ３１と、光源３２と、検出器３３とが配される。このうち、対物レンズ４１、ビームスプリッタ４２、ダイクロイックミラー４３、第２ピンホール板４６、第３ピンホール板４７、ノッチフィルタ４８、カメラ３１、および光源３２が共焦点測定部５１である。また、対物レンズ４１、ダイクイロックミラー４３、第３ピンホール板４７、ノッチフィルタ４８、光源３２、および検出器３３がラマン測定部５２である。
　光源３２は可変波長のレーザーを出力する。ダイクロイックミラー４３は、光源３２が出力するレーザーの波長の光を反射し、それ以外の波長の光を透過させる。光源３２が出力するレーザー光は、第３ピンホール板４７およびノッチフィルタ４８を通過し、ダイクロイックミラー４３で反射され、ビームスプリッタ４２を透過した後に対物レンズ４１を介して細胞９００に照射される。その反射光がビームスプリッタ４２で分岐されて、カメラ３１および検出器３３により検出される。ダイクロイックミラー４３では光源３２が出力するレーザーの波長以外の波長の光が透過するので、検出器３３ではラマンスペクトルを測定できる。なお検出器３３は分光器であり、たとえば約５００ｎｍ～約１０００ｎｍを分光できる。
　第１ピンホール板４５、第２ピンホール板４６、および第３ピンホール板４７は、ピンホールを有する板であり焦点位置からのみの散乱光を通過させる。対物レンズ４１はたとえばサーボモータを内蔵し、ＰＣ２４の動作指示により図示上下方向に移動する。対物レンズ４１が図示上下方向に移動することにより、細胞９００の任意の深度における像を取得できる。さらに共焦点測定部５１は、ＸＹスキャナ２１を動作させて光軸と細胞９００の位置関係を変化させることで、細胞９００の全域における任意の深度の像を取得できる。
　ＰＣ２４は、演算部２４１および記憶部２４２を備える。演算部２４１はたとえば、不図示のＣＰＵ、ＲＯＭ、およびＲＡＭを備え、ＲＯＭに格納されるプログラムをＣＰＵがＲＡＭに展開して実行することにより後述する機能を実現する。ただし演算部２４１は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、およびＲＡＭの組み合わせの代わりに書き換え可能な論理回路であるＦＰＧＡ（Field　Programmable　Gate　Array）や特定用途向け集積回路であるＡＳＩＣ（Application　Specific　Integrated　Circuit）により実現されてもよい。また演算部２４１は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、およびＲＡＭの組み合わせの代わりに、異なる構成の組み合わせ、たとえばＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭとＦＰＧＡの組み合わせにより実現されてもよい。
　ＰＣ２４は不図示のディスプレイおよび入力装置と接続され、入力装置から入力されたオペレータの動作指令をコントローラ２６に伝達する。またＰＣ２４は、演算部２４１の演算に基づく動作指令もコントローラ２６に伝達する。ＰＣ２４は、検出器３３から撮影画像が入力される。またＰＣ２４は、コントローラ２６からピペット１１の座標が入力される。演算部２４１は、検出器３３から入力される撮影画像、および検出器３３から入力されるラマンスペクトルを記録する。
　ＰＣ２４は、ピペット１１の先端位置であるＸＹＺ座標を常に把握している。ＰＣ２４はたとえば、コントローラ２６へ移動指令を出力するたびにＰＣ２４の内部に保持しているＸＹＺ座標値を、出力した移動指令に基づき更新する。ただしＸＹＺ座標の管理はコントローラ２６が行ってもよいし、ＸＹスキャナ２１およびＺスキャナ２２のそれぞれが行ってもよい。
　演算部２４１は、記録したＸＹＺ座標とラマンスペクトルを用いて図５のような表示を不図示のディスプレイに出力する。図５では、細胞９００の任意のＺ方向の高さの断面図を表示しており、スライダー９１２を操作することで断面図の高さを変更できる。オペレータが図５における細胞９００の任意の位置を選択すると、選択した位置におけるラマンスペクトルが表示される。さらに演算部２４１は、ラマンスペクトルに基づきその位置に存在するタンパク質などを同定する。
（動作）
　測定システムＳ１は、４つの手法で測定が可能である。ここではそれぞれの測定手法を「モード」として説明する。測定システムＳは、共焦点モード、ＳＩＣＭモード、ラマンモード、およびＮＶモードを有する。共焦点モードとは、図１の下部に示す共焦点測定部５１を用いる測定である。ＳＩＣＭモードとは、Scanning　ion-conductance　microscopeすなわち走査イオンコンダクタンス顕微鏡としての機能を用いる測定である。ラマンモードとは、ラマン測定部５２を用いてラマン散乱を観察する測定である。ＮＶモードとは、ダイヤモンドＮＶを励起させスピンの状態を観察することで細胞９００や周囲環境を観察する測定である。
　それぞれのモードの切り替えはＰＣ２４により行われる。ただしオペレータの操作によりモードが切り替えられてもよいし、ＰＣ２４に内蔵されるプログラムにより自動的に、たとえばバッチ処理により順次切り替えられてもよい。ただし上述した「モード」は概念的なものであり、複数のモードを同時に実行してもよい。なお光源３２が出力するレーザー光の周波数は同一でもよいし同一でなくてもよい。またレーザー光の周波数は、使用する機器の特性に合わせて微調整してもよい。
（動作　共焦点モード）
　ＰＣ２４は、共焦点モードでは、光源３２からレーザー光を照射し、対物レンズ４１を移動させて焦点距離を調整し、任意のＺ位置で細胞９００を観察する。以下では、共焦点モードにおいて撮影して得られる画像を「撮影画像」と呼ぶ。なお焦点距離を適切に設定することで、撮影画像にはピペット１１の先端を含めることができる。
（動作　ＳＩＣＭモード）
　ＳＩＣＭモードでは、ピペット１１の先端と細胞９００との間隔が狭くなることにより第１電極１２と第２電極１４との間に流れるイオン電流が減少することを利用する。ＰＣ２４は、ＩＶ変換回路１３が出力する電圧値が一定になるように、すなわちピペット１１の先端と細胞９００との隙間を流れるイオン電流が一定になるようにＺスキャナ２２の位置、すなわちピペット１１の高さを調整する。ＸＹスキャナ２１を用いてピペット１１の直下に位置する細胞９００を移動することで、ＳＩＣＭモードでは細胞９００の表面全体の形状を非接触で詳細に観察できる。ただしピペット１１が細胞９００に接触すると、第１電極１２と第２電極１４との間にはイオン電流が流れないので、ＳＩＣＭモードでの観察は、ピペット１１の先端が細胞９００と接触しない状態に限定される。
　なおＳＩＣＭモードにおいて、ピペット１１が細胞９００に接触するとイオン電流が流れなくなることを利用して、次のことが可能である。すなわちＳＩＣＭモードでは、ピペット１１が細胞９００の表面に接触するピペット１１のＺ位置を高精度に測定できる。
（動作　ラマンモード）
　ラマンモードでは、光源３２が出力するレーザー光をピペット１１の先端付近に照射し、散乱光ｆ２を検出器３３により測定する。そして、レーザー光の周波数ｆ１と散乱光ｆ２の関係によりピペット１１の先端に存在する物質の組成を特定する。ただし散乱光ｆ２は、様々な周波数および様々な強度の光の総称として用いている。散乱光ｆ２は、検出器３３により検出される。
　一般に、励起光の多くは波長の変化がないレイリー散乱として散乱されるが、一部の散乱光はエネルギーの収受によりストークス散乱やアンチストークス散乱として観察される。ストークス散乱光やアンチストークス散乱光の周波数ｆ２と、励起光であるレーザー光の周波数ｆ１との関係、すなわちラマン散乱の波長シフト量であるラマンシフトは分子ごとに既知である。そのため、既知の分子構造やラマンスペクトルデータベースを参照することで、ピペット１１の先端に存在する分子の構造や種類を特定できる。さらに本実施の形態では、探針増強効果により散乱光が増強されて検出が容易になり、短時間での観察を可能とする。
（動作　ＮＶモード）
　ＮＶモードでは、光源３２が出力するレーザー光を用いてピペット１１の先端のダイヤモンドＮＶを励起する。さらに、マイクロ波発生部２５が出力するマイクロ波をダイヤモンドＮＶに照射してスピンを制御する。このスピンは周囲環境の影響を受け、スピンが特定の状態にあることはカメラ３１でダイヤモンドＮＶの発光を観察することにより確認できるので、既知の手法により磁場や温度などを測定できる。さらに、ダイヤモンドＮＶはピペット１１の先端に付加されているので空間分解能が向上し、探針増強効果により信号強度が向上する。
　すなわちＮＶモードでは、光源３２が出力するレーザー光およびマイクロ波発生部２５が出力するマイクロ波をピペット１１の先端に照射し、検出器３３で得られるスペクトルを解析することで磁場や温度などを測定する。なお、他のモードと同様に、ＸＹスキャナ２１およびＺスキャナ２２を動作させることで、細胞９００の任意の位置を測定可能である。
（動作例）
　図６を参照して、観察システムＳを用いた細胞９００の一連の観察を説明する。ただし以下に説明する動作の順番は一例にすぎず、測定の順番をどのように変化させてもよい。図６（ａ）に示すように、ＰＣ２４は、ＸＹスキャナ２１を動作させてピペット１１の先端をＸＹ方向に移動させ、イオン電流が一定になるようにＺスキャナ２２を移動させる。すなわちＰＣ２４は、ＳＩＣＭモードにおいて細胞９００の表面を走査して詳細な三次元形状を取得する。またＰＣ２４は、図６（ｂ）に示すように細胞９００の細胞膜を対象としてラマンモードの観察、すなわち光源３２が出力するレーザー光によるラマンスペクトルを取得し、細胞質に存在する分子の振動モードの局所観察を行う。さらにＰＣ２４は、光源３２が出力するレーザー光およびマイクロ波発生部２５が出力するマイクロ波を用いてＮＶモードの測定を行う。
　次にＰＣ２４は、Ｚスキャナ２２を操作してイオン電流がゼロになるまでピペット１１をさらに細胞９００に接近させる。イオン電流がゼロとは、細胞９００の表面にピペット１１の先端が接触している状態である。そしてＰＣ２４は、ピペット１１の先端がフォーカス範囲に含まれるように対物レンズ４１を移動させる。そしてＰＣ２４は、撮影画像を連続的に取得して、ピペット１１の先端が撮影画像に鮮明に撮影されるようにＺスキャナ２２を制御する。
　撮影画像にピペット１１の先端が鮮明に撮影されると、ピペット１１の先端が細胞質に到達したことになる。撮影画像においてピペット１１の先端が鮮明に表示されているか否かは、ＰＣ２４を操作するオペレータが判断してもよいし、プログラムにより判断してもよい。プログラムにより判断する場合には、ピペット１１が鮮明に撮影された画像とのパターンマッチングを利用する方法や、ピペット１１が鮮明に撮影された画像を用いた機械学習を利用する方法などを採用できる。ただし、細胞質の膜が弾性変形する場合を想定し、たとえば予め細胞質の内部に存在する観察対象に撮影画像のピントを合わせておき、ピペット１１の先端が鮮明に撮影される位置までピペット１１を移動させてもよい。
　この状態で図６（ｃ）に示すように細胞質におけるラマンモードおよびＮＶモードの観察を行う。なお、ピペット１１をさらに細胞の内部に侵入させて再度ラマンモードおよびＮＶモードの観察を行ってもよく、侵入と観察を複数回繰り返してもよい。すなわち、Ｚ方向の位置を変えて細胞質の複数の個所においてラマンモードの観察を行ってもよい。その後、Ｚスキャナ２２を用いてピペット１１を引き上げてピペット１１の先端を細胞９００の細胞膜の表面、すなわち細胞９００の外部まで戻す。そしてＸＹスキャナ２１を動作させてＸＹ平面での測定位置を変更する。以上の処理を繰り返すことにより、必要に応じて細胞９００の全域を観察する。なおこの繰り返し処理は一例として記載しているにすぎず、必要な個所のみ観察を行ってもよい。
　ＳＩＣＭモードおよびラマンモードの観察結果は、ピペット１１の先端のＸＹＺ座標とともにＰＣ２４に保存されている。そのため、図５に示すように測定結果をわかりやすく図示することができる。
（フローチャート）
　図７は、上述した動作例に対応する演算部２４１の処理を示すフローチャートである。以下に説明する各ステップの実行主体は演算部２４１である。まず演算部２４１は、所定のＸＹ座標に移動する（Ｓ６０１）。次に演算部２４１は、Ｚスキャナ２２を用いてＳＩＣＭ測定、すなわちＳＩＣＭモードにおける測定を行う（Ｓ６０２）。ＳＩＣＭモードではＰＣ２４はイオン電流が一定値Ａ０になるようにＺスキャナ２２を移動させる。イオン電流が一定値Ａ０になると、ＰＣ２４はフラグを付したＸＹＺ座標をＰＣ２４に送る。そのためＰＣ２４は、このＸＹＺ座標が（ｘ１、ｙ１、ｚ１）の場合にＸＹ座標が（ｘ１、ｙ１）における細胞９００の表面の高さはｚ１であることを認識する。
　次に演算部２４１はラマン測定およびＮＶ測定、すなわちラマンモードおよびＮＶモードにおける測定を行う（Ｓ６０３）。次に演算部２４１は、対物レンズ４１を移動させ、細胞９００の細胞質の内部に存在する観察対象とする細胞に焦点をあわせる。次に演算部２４１は、ピペット１１の先端がカメラ３１の撮影画像において合焦するようにピペットを移動させる（Ｓ６０５）。次に演算部２４１は、ラマンモードおよびＮＶモードでの測定を行う（Ｓ６０６）。ただし演算部２４１は、次のＳ６０７に進む前に、ピペット１１のＺ方向へのさらなる移動とラマンモードおよびＮＶモードでの測定を、１回以上繰り返して実行してもよい。
　最後に演算部２４１は、全ての測定点での測定が終了したか否かを判断し（Ｓ６０７）、終了したと判断する場合は図７に示す処理を終了し、未測定の点があると判断する場合はＳ６０１に戻る。なおＳ６０１に戻った場合には、演算部２４１は未測定のいずれかの点にピペット１１を移動する。
　上述した第１の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）観察システムＳ１は、金属１１２Ａを付加したピペット１１と、ピペット１１と試料である細胞９００との間隔に応じて増減するイオン電流を測定するＰＣ２４と、励起光であるレーザー光を照射する光源３２と、励起光を細胞９００に照射して得られるラマン分光であって金属１１２Ａにより局所増強されたラマン分光を検出する検出器３３とを備える。そのため、観察システムＳ１は、イオン電流を測定するイオンコンダクタンス顕微鏡としての働きにより細胞９００の表面の形状を計測でき、さらにピペット１１の表面に付加した金属１１２Ａにより非侵襲にラマン分光を感度よく検出し物質を同定できる。
（２）ピペット１１の先端にはダイヤモンドＮＶ１１２が付されている。細胞９００の影響を受けているダイヤモンドＮＶ１１２のスピン状態を観察する観察部であるカメラ３１を備える。そのため、スピン状態を観察して細胞９００の表面や内部の環境を測定できる。
（３）観察システムＳ１は、ピペット１１と細胞９００との位置関係を操作する移動部、すなわちＺスキャナ２２およびＸＹスキャナ２１を備える。検出器３３は、Ｚスキャナ２２およびＸＹスキャナ２１による位置関係の操作の前後において、細胞９００の表面および試料の内部のラマン分光を検出する。そのため、細胞９００の表面だけでなく細胞の内部を観察できる。
（４）カメラ３１は、ＸＹスキャナ２１やＺスキャナ２２による位置関係の操作の前後において、細胞９００の表面および細胞９００の内部の影響を受けているスピン状態を観察する。そのため、細胞９００の表面だけでなく細胞９００の内部の環境も測定できる。
（５）Ｚスキャナ２２は、ピペット１１をイオン電流がゼロとなる位置（図７のＳ６０４）から細胞９００の細胞膜の厚みに相当する量以上移動させる（図７のＳ６０７）ことにより、ピペット１１の先端を細胞９００の内部に移動させる。そのため位置分解能が高いイオンコンダクタンス顕微鏡の原理を利用して細胞９００の表面の位置を特定し、細胞９００の内部にピペット１１の先端を挿入できる。
（変形例１）
　観察システムＳ１の観察対象は細胞に限定されない。観察システムＳ１は、細胞以外の様々な物質を観察対象とすることができる。
（変形例２）
　上述した第１の実施の形態では、ピペット１１を移動させるのはＺスキャナ２２のみであり、ＸＹスキャナ２１が細胞９００を移動させることでピペット１１と細胞９００の位置関係を三次元に自在に設定した。しかしピペット１１１と細胞９００の位置関係を三次元に自在に設定可能であればよく、装置の構成は任意である。たとえば細胞９００の移動機構を用意せず、ピペット１１をＸＹＺ方向に任意に移動可能な構成としてもよい。
（変形例３）
　上述した第１の実施の形態では、ピペット１１の金属コーティング１１２Ａは特に限定しなかった。しかし金属コーティング１１２Ａは次のものに限定してもよい。すなわち本変形例では、ピペット１１にまず銀をコーティングし、その上に金をコーティングする。ラマン散乱を生じさせる増強効果だけに注目すると銀が有用である。しかし銀は細胞に対する毒性があり、観察対象である細胞９００に悪影響を与える。これを防止するために、化学的に不活性にさせる効果を有する金を用いて銀の表面をコーティングする。
（変形例４）
　光源３２は、カメラ３１と接続され、カメラ３１が撮影を行うタイミングでレーザー光を出力してもよい。
（変形例５）
　上述した第１の実施の形態では、観察システムＳ１は４つの測定モードを有したが、ラマンモードおよびＮＶモードのいずれかを備えなくてもよい。観察システムＳ１がラマンモードを備えない場合は、ピペット１１に金属コーティング１１２Ａが付されなくてもよい。観察システムＳ１がＮＶモードを備えない場合は、ピペット１１にダイヤモンド粒子１１２が付されなくてもよい。
―第２の実施の形態―
　図８～図９を参照して、本発明に係る観察システムの第２の実施の形態を説明する。以下の説明では、第１の実施の形態と同じ構成要素には同じ符号を付して相違点を主に説明する。特に説明しない点については、第１の実施の形態と同じである。本実施の形態では、主に、細胞質を吸い出して解析する点で、第１の実施の形態と異なる。
（構成）
　図８は第２の実施の形態における観察システムＳ２の構成図である。第１の実施の形態との相違点は、電圧源１５の代わりに電圧源１５Ａが備えられる点である。電圧源１５Ａは、正の電圧だけでなく負の電圧も印加できる。本実施の形態では、電圧源１５Ａは、コントローラ２６を介してＰＣ２４から指示される電圧を出力する。
　なお本実施の形態では、後述するようにピペット１１の先端がＸＹスキャナ２１から離れた位置での計測を行う。この場合に、レーザー光やマイクロ波の照射、および試料９００の観察に支障がある場合には、適切な位置にマイクロ波発生部２５、カメラ３１、光源３２、および検出器３３を移動させてもよい。また、ＸＹスキャナ２１から離れたピペット１１の位置に応じて、新たにマイクロ波発生部、カメラ、光源、検出器を設けてもよい。さらにミラー等の光学系を追加してピペット１１の位置の変更に対応してもよい。
（動作概要）
　図９は、第２の実施の形態における観察システムＳ２の動作概要を示す図である。観察システムＳ２は、第１の実施の形態における動作により、細胞９００の内部も含めた全域におけるラマンスペクトルを取得した後に、次の動作を行う。まずオペレータが調査対象点を決定し、不図示の入力装置を用いてＰＣ２４に入力する。ＰＣ２４の演算部２４１は、図９（ａ）に示すように入力された調査対象点にピペット１１の先端を移動させる。そして演算部２４１は、コントローラ２６を介して電圧源１５Ａに負の電圧を印加させ、図９（ｂ）に示すようにピペット１１の内部に調査対象点の電解質を吸い上げる。
　そして演算部２４１は、図９（ｃ）に示すようにＺスキャナ２２を動作させてピペット１１を細胞９００から引き抜く。次に演算部２４１は、図９（ｄ）に示すようにピペット１１の内部の溶液を加圧して、ピペット１１の先端に液滴９１３を形成する。なお液滴９１３は微小量、たとえばピコリットル単位でよい。そして演算部２４１は、この液滴９１３にレーザー光およびマイクロ波を照射し、ラマンモードおよびＮＶモードの測定を行う。ただし電圧源１５Ａに正の電圧を印加させず、ピペット１１の先端に付着した電解質にレーザー光およびマイクロ波を照射し、ラマンモードおよびＮＶモードの測定を行ってもよい。
　図９（ｅ）は、ピペット１１の先端に形成された液滴９１３の拡大図である。液滴９１３の中の分子は、局所的に増強された電場領域９１４に自由に出入りする。一定の時間にわたって観察を続けることにより、液滴に含まれるすべての分子を対象としたラマンモードおよびＮＶモードの測定が行われる。
　細胞膜は脂質二重層なので、電解質を細胞９００の外部に抜き出してから測定することで、細胞膜などのほかのシグナルの影響を受けることなく、電場領域９１４により観察対象の分子のシグナルを増大させて観察できる。
　上述した第２の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（６）ＩＶ変換回路１３Ａは次に説明する吸引部および排出部として機能する。吸引部は、負の電圧を印加することでピペット１１の内部に試料９００の一部を吸い上げる。排出部は、正の電圧を印加することで吸引部が吸い上げた試料９００の一部の少なくとも一部を排出して液滴９１３を形成する。
（７）上述した観察方法は、先端に金属を付加したピペット１１、励起光であるマイクロ波を照射するマイクロ波発生部２５と、励起光を細胞９００に照射して得られるラマン分光であって金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器３３とを備える観察システム１を用いて実行される観察方法である。この観察方法は、ピペット１１Ａを用いて細胞９００の細胞質を吸い上げることと、ピペット１１Ａの先端に励起光を照射し、検出器３３を用いてラマン分光を検出することとを含む。そのため、細胞膜などのほかのシグナルの影響を受けることなく、電場領域９１４により観察対象の分子のシグナルを増大させて観察できる。
（第２の実施の形態の変形例）
　第２の実施の形態では、液滴９１３を対象としたラマンスペクトルの計測を行った。しかしラマンスペクトルの計測を行う代わりに、レーザーアブレーションによるＴＯＦ質量分析などを行ってもよい。
―第３の実施の形態―
　図１０を参照して、本発明に係る観察システムの第３の実施の形態を説明する。以下の説明では、第１の実施の形態と同じ構成要素には同じ符号を付して相違点を主に説明する。特に説明しない点については、第１の実施の形態と同じである。本実施の形態では、主に、酸素同位体を用いて細胞の活性を検出する点で第１の実施の形態と異なる。本実施の形態では、酸素の同位体として中性子が１７個であるＯ－１７を用いる。
（概念図）
　図１０は、第３の実施の形態における動作を示す概念図である。第３の実施の形態では、まず図１０（ａ）に示すように、細胞９００を一定時間にわたってＯ－１７環境下に置く。これにより、細胞９００に蓄積されるグルコース（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）中の酸素がＯ－１７となる。
　次に、図１０（ｂ）に示すように、細胞９００をＯ－１６環境下に置く。細胞９００はグルコースを用いた酸素代謝を行い、Ｏ－１７を含む酸素を排出するので、ピペット１１を用いてＮＶモードの測定をすることにより、このＯ－１７を検出する。Ｏ－１７の排出を詳述すると、細胞９００が酸素代謝により排出するＣＯ２およびＨ２０は、Ｏ－１７を含むグルコースから生成されたものである。そのため、このＣＯ２およびＨ２０を構成する酸素は、雰囲気中と同じＯ－１６だけでなく雰囲気中には含まれないＯ－１７も含まれる。したがって、Ｏ－１７を検出することで細胞の酸素代謝を検出し、Ｏ－１７の濃度を評価することで細胞９００の活性度合いを評価できる。
（構成）
　観察システムの構成は第１の実施の形態と同様なので説明を省略する。
（同位体の検出）
　細胞９００にマイクロ波を照射することで電子にスピンが生じ、同位体ごとにスピンが異なる。具体的にはＯ－１６とＯ－１７はスピンの態様が異なる。そのため、ラマン分光ではＯ－１６とＯ－１７を区別することが可能である。
　上述した第３の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（８）観察システムにおける観察対象の試料は細胞９００である。ＮＶモードにおける観察を行う観察部、すなわち検出器３３は、細胞９００の代謝に関する酸素同位体であるＯ－１７を検出する。そのため、Ｏ－１７を用いて非侵襲に細胞の活性度を評価できる。たとえば蛍光試料を用いることで代謝の様子を観察することも可能であるが、蛍光試料を細胞に投与することにより細胞が影響を受けることが避けられない。しかし本実施の形態によれば非侵襲で細胞の代謝や活性を測定できる。
（第３の実施の形態の変形例）
　上述した第３の実施の形態では、Ｏ－１７を気体として細胞９００に取り込ませた。しかしＯ－１７を液体、すなわち水として細胞９００に取り込ませてもよい。
―第４の実施の形態―
　本発明に係る観察システムの第４の実施の形態を説明する。以下の説明では、第１の実施の形態と同じ構成要素には同じ符号を付して相違点を主に説明する。特に説明しない点については、第１の実施の形態と同じである。本実施の形態では、主に、時間分解機能をさらに有する点で、第１の実施の形態と異なる。
　本実施の形態では、ラマンモードおよびＮＶモードでは時間分解、すなわちポンプ－プローブ法による測定が可能である。ただし共焦点モードおよびＳＩＣＭモードの動作は第１の実施の形態と同様である。ラマンモードおよびＮＶモードのいずれも、ポンプ光およびプローブ光には様々な周波数の光を用いることができる。ポンプ光およびプローブ光は、位相を制御してもよいし、信号測定の感度を向上させるためにロックイン検出を行ってもよい。ポンプ光の照射タイミングとプローブ光の照射タイミングの差である遅延時間を複数通りに変化させる。
　遅延時間の制御には様々な手法を用いることができ、たとえば遅延時間を制御するステージの移動やミラーの駆動などの機械的な動作により光路長を変化させてもよいし、ポッケルスセルを利用してもよい。また、ポンプ光の出力源およびプローブ光の出力源が、入力されるパルス信号に応じて光を出力する場合には、２つの出力源にパルス信号を入力するタイミングを変化させることで遅延時間を制御してもよい。
　ラマンモードでは、たとえばポンプ光として紫外線を用いて、プローブ光として第１の実施の形態と同様に光源３２が出力するレーザー光を用いてもよい。ポンプ光を照射することで細胞９００内の振動モードが変化するので、振動モードの緩和の様子がラマンスペクトルを測定することで観察できる。ＮＶモードでは、スピンの緩和の様子を観察できる。
　以上説明した第４の実施の形態では、局所領域における、ラマンモードおよびＮＶモードの時間分解測定ができる。
　上述した各実施の形態および変形例は、それぞれ組み合わせてもよい。上記では、種々の実施の形態および変形例を説明したが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
　次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
　日本国特許出願２０１９－８５７７４（２０１９年４月２６日出願）
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４…観察システム
１１…ピペット
１２…第１電極
１３、１３Ａ…ＩＶ変換回路
１４…第２電極
２１…ＸＹスキャナ
２２…Ｚスキャナ
２２…スキャナ
２６…コントローラ
２４…ＰＣ
２５…マイクロ波発生部
３０…共焦点顕微鏡
３１…光源
３２…カメラ
３３…検出器
１１２…ダイヤモンド粒子
１１２Ａ…金属片
２４１…演算部
２４２…記憶部
９００…細胞
９１３…液滴
９１４…電場領域

Claims (9)

  1. 　金属を付加したピペットと、
    　前記ピペットと試料との間隔に応じて増減するイオン電流を測定する演算装置と、
    　励起光を照射する光源と、
    　前記励起光を前記試料に照射して得られるラマン分光であって前記金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器と、
    　を備える観察システム。
  2. 　請求項１に記載の観察システムにおいて、
    　前記ピペットの先端にはダイヤモンドＮＶが付されており、
    　前記試料の影響を受けている前記ダイヤモンドＮＶのスピン状態を観察する観察部をさらに備える観察システム。
  3. 　請求項１または請求項２に記載の観察システムにおいて、
    　前記ピペットと前記試料との位置関係を操作する移動部をさらに備え、
    　前記検出器は、前記移動部による位置関係の操作の前後において、前記試料の表面および前記試料の内部のラマン分光を検出する観察システム。
  4. 　請求項２に従属する請求項３に記載の観察システムにおいて、
    　前記観察部は、前記移動部による位置関係の操作の前後において、前記試料の表面および前記試料の内部の影響を受けている前記スピン状態を観察する観察システム。
  5. 　請求項３または請求項４に記載の観察システムにおいて、
    　前記試料は細胞であり、
    　前記細胞の任意の深度における光学像である撮影画像を取得する共焦点測定部をさらに備え、
    　前記移動部は、前記撮影画像において前記細胞の内部に存在する観察対象に合焦している場合に、前記ピペットの先端が前記撮影画像において合焦するように移動させる観察システム。
  6. 　請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の観察システムにおいて、
    　前記ピペットの内部に前記試料の一部を吸い上げる吸引部と、
    　前記吸引部が吸い上げた前記試料の一部の少なくとも一部を排出する排出部とをさらに備える観察システム。
  7. 　請求項２、および請求項２に従属する請求項３から請求項６までのいずれか一項に記載の観察システムにおいて、
    　前記試料は細胞であり、
    　前記観察部は、前記細胞の代謝に関する酸素同位体であるＯ－１７を検出する観察システム。
  8. 　請求項１に記載の観察システムにおいて、
    　前記ピペットには銀および金がコーティングされ、銀は金に覆われている観察システム。
  9. 　金属を付加したピペット、励起光を照射する励起光照射部、前記励起光を細胞に照射して得られるラマン分光であって前記金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器を備える観察システムを用いて実行される観察方法であって、
    　前記ピペットを用いて前記細胞の細胞質を吸い上げることと、
    　前記ピペットの先端に前記励起光を照射し、前記検出器を用いてラマン分光を検出することと、を含む観察方法。
     
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