JP5954640B2 - 感染評価系モデル - Google Patents
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Description
本発明の第二の構成は,さらに,挿入された生体内留置物の挿入位置を変更する位置変更工程を含むことを特徴とする第一の構成に記載の感染評価方法である。
本発明の第四の構成は,前記ゲル状培地の形状が,多角体状,球状,楕円体状のいずれかであることを特徴とする第三の構成に記載の感染評価モデルである。
本発明の第五の構成は,前記ゲル状培地が呈色試薬を含み,細菌と基質との反応によるpH変化により,呈色試薬の色が変化し,外観変化の評価が可能となることを特徴とする第三ないし第四の構成に記載の感染評価モデルである。
また,本発明において生体内留置物とは,現在,生体内に留置して用いられている器具,もしくは将来的に生体内に留置することを目的として設計・開発等された器具として定義される。
ゲル状培地としては,寒天培地を用いることが好ましい。これにより,オートクレーブによる滅菌処理を行うことができ,かつ,固形状にすることが容易になるため,ゲル状培地の取扱い性を向上させるという効果を有する。
これらの組み合わせについては,検討を行う細菌に対し,通常用いられるゲル状培地を選択すればよい。
別の例として,細菌として病原性ブドウ球菌を用い,ゲル状培地としてDNase寒天培地を用いる。この場合,基質としてデオキシリボ核酸が含まれており,呈色試薬としてトルイジンブルーやメチルグリーンなどを用いる。この場合,トルイジンブルーやメチルグリーンはデオキシリボ核酸と複合物を形成しており,病原性ブドウ球菌から産生されたDNaseにより,デオキシリボ核酸が加水分解され,複合物の構造が変化することにより,トルイジンブルーやメチルグリーンの色調が変化し目視で確認できることから,ゲル状培地中の病原性ブドウ球菌の広がりが確認できる。
また,例に挙げたような,呈色試薬による外観変化だけでなく,当然のことではあるが,細菌のコロニー形成による外観変化を直接評価することもできる。これらの評価方法では,肉眼で外観変化をとらえることが可能となるため,細菌の広がりの評価をより簡便に行うことができるという効果を有する。この他の外観変化として,例えば,UV照射による色彩の変化や顕微鏡観察による外観変化などが挙げられる。
位置の変更について,変更の回数や程度など特に限定する必要はなく,細菌の生体内侵入をより適切に評価するため,生体内留置物で想定される適切な位置の変更を行えばよい。
例えば,感染評価モデルAについては,生体内留置物として針を用いており,血管等に留置した針を想定している。通常,留置された針はシール等で固定されているため,大きく針の位置が変わることは無く,変わっても数mm程度であるが,この位置変更が繰り返される可能性がある。同様に,感染評価モデルBについても,硬膜外カテーテルを想定しているが,位置の変更は数mm程度であり,位置変更が繰り返される可能性がある。これらのことから,針ないしカテーテルの位置を数mm程度変更する,もしくはその位置変更を往復して繰り返すことにより,生体内留置物の位置の変更が及ぼす細菌侵入の程度を評価することができる。
1.メチシリン耐性黄色ブドウ球菌,Fu10株を用いた(Haraga et al. N Engl J Med 1999; 23: 2028)。
2.Fu10株は,福岡大学病院にて分離された細菌株であり,以下の全ての実験でFu10株を用いた。なお,以下の実験で,「細菌」もしくは「MRSA」というときは,このFu10株を指す。
細菌濃度が異なる溶液を付着させた針を,寒天培地に挿入することにより,細菌濃度の違いが寒天培地の細菌発育深度に及ぼす影響を調べることを目的として,下記の検討を行った。
1.マンニット食塩寒天培地のオートクレーブを行った。その後,無菌で長方形のペトリシャーレ中に58℃のマンニット食塩寒天培地を入れて静置し,固形化させた。固形化したマンニット食塩寒天培地の半分を切除したもの(以下,「寒天培地モデルA」と略する)を,検討に用いた。
2.MRSAの培養を行い,それぞれ104,105,107,109cfu/mLの濃度に調整したMRSA溶液を作製した。
3.調整したそれぞれのMRSA溶液を,図1−aに示すように,無菌綿棒を用いて寒天培地モデルAの挿入面に塗布を行い,1時間乾燥させた。なお,対照溶液として生理食塩液を用いて,同様の操作を行った。
4.乾燥後,寒天培地モデルAを水平に置き,挿入面に垂直に18Gの針(長さ37mm,直径1.41mm)を挿入した(図1−a)。針の挿入の際は,ペトリシャーレの底に針の先が接触しないように慎重に挿入を行い,寒天培地の挿入面が崩れないようにした。また,挿入した針は,抜き去らず,そのままの状態にした。
5.針を挿入後,37℃で72時間の条件で,寒天培地モデルAの培養を行った。サンプル数は,各濃度,7で行い,寒天培地モデルAにおける細菌の発育深度の測定および写真撮影を行った。
6.なお,寒天培地モデルAには,マンニトールとフェノールレッドが含まれている。寒天培地モデルAに浸食したMRSAはマンニトールを発酵することにより酸性物質を産生する。この産生された酸性物質により,寒天培地モデルA中のフェノールレッドが,赤から黄色へ変色する。この黄色への変色範囲は,寒天培地モデルAにおけるMRSAのコロニーの広がりの評価を行いやすくする。
1.図5に写真撮影の結果を示す。
2.MRSAの濃度が上昇するにつれ,黄色への変色範囲が針の方向に沿って深く,そして広くなっていた。
3.また,黄色への変色度合いについて,挿入面からの鉛直方向への深度(細菌発育深度)を測定したところ,生理食塩液では0mm,104cfu/mL
MRSA溶液では0mm,105cfu/mL MRSA溶液では0mm,107cfu/mL MRSA溶液では9mm,109cfu/mL
MRSA溶液では35mmであった。
4.細菌発育深度の測定結果を,針の長さとの比率として,プロットした結果を図6に示す。このプロットした結果から回帰直線(Y=-22.5+9.18X,相関係数0.76,寄与率0.57)が得られ,強い正の相関があることが分かった(p<0.001)。
5.これらの結果から,MRSAの細菌濃度が濃くなれば濃くなるほど,針に沿ってMRSAが本件培地モデルに,より深く浸透していくことが分かった。
細菌濃度を同一濃度に揃え,異なる直径の針を,寒天培地に挿入することにより,針の直径の違いが寒天培地の細菌発育深度に及ぼす影響を調べることを目的として,下記の検討を行った。
1.実験1と同様の手技で行った。すなわち,塗布するMRSA溶液を,107cfu/mLとし,挿入する針をそれぞれ,27G(長さ19mm,直径0.94mm),25G(長さ24mm,直径1.02mm),23G(長さ24mm,直径1.10mm),22G(長さ31mm,直径1.16mm),18G(長さ37mm,直径1.41mm)とした。
2.サンプル数は,各濃度,7で行い,寒天培地モデルAにおける細菌の発育深度の測定および写真撮影を行った。
結果を図7に示す。このプロット結果から,回帰直線(Y=-79.7+99.4X,相関係数0.38,寄与率0.14)が得られた。また,針の直径が大きくなるほど,MRSAの発育深度が深くなっているように思われたが,統計学的に有意な相関ではなかった(P=0.0062)。
実験1と類似の実験条件において,針の移動(位置変更)が寒天培地の細菌発育深度に及ぼす影響を調べることを目的として,下記の検討を行った。
1.図1を用いながら,方法について説明を行う。
2.マンニット食塩寒天培地50mLのオートクレーブを行った。その後,無菌で長方形のペトリシャーレ中に58℃のマンニット食塩寒天培地を入れて静置し,固形化させた(図1−b)。
3.固形化したマンニット食塩寒天培地上に,硬膜外麻酔用カテーテル(長さ100mm,直径1.0mm,Hakko社製)を置いた(図1−c)。このカテーテルには,10mm毎にマークが施してあり,滅菌済みのものである。
4.カテーテルが動かないよう,滅菌済みのスライドガラスをカテーテルの両側に置き,緩やかに固定した。この状態のものに,58℃のマンニット食塩寒天培地を入れて静置し,固形化させた(図1−d)。
5.カテーテルに沿った鉛直方向の長さがおよそ50mmとなるよう,固形化したものの両端を,マンニット食塩寒天培地およびスライドガラスごと切除した(図1−e)。この際,カテーテルについては切除しないよう,マンニット食塩寒天培地およびスライドガラスの切除を行った。加えて,切除した断面において,細かなでこぼこが生じたところについては,その上からオートクレーブしたマンニット食塩寒天培地を,ピペットで塗りつけ固形化することにより,平滑化した(図1−f)。以下,これら一連の操作により作製したものを,寒天培地モデルBとする。
6.寒天培地モデルBの,カテーテル挿入口付近に,各濃度(104,105,107,109cfu/mL)に調整したMRSA溶液500μLをピペットで塗布し,塗布面が下側に来るよう斜めに置いた(図1−g)。これにより,MRSAが,重力により,カテーテル表面を通じて寒天培地モデルB内に侵入することを避けることが可能となる。また,MRSA溶液の塗布操作の際,カテーテル表面にMRSA溶液が付着しないよう,無菌綿棒にて拭取りを行った。
7.塗布操作を行い斜めに1時間静置した後,カテーテルを上側(寒天培地モデルB内部側)に3cm移動させた(図1−h,1−i)。なお,この際,カテーテルが屈折することにより寒天培地モデルBにヒビ等が生じないよう,上側から引っ張ることにより,カテーテルを移動させた。
8.移動操作の後,37℃で72時間の条件で,寒天培地モデルBの培養を行い,実験1と同様の手法により,評価を行った。
1.細菌発育深度の測定結果を,針の長さとの比率として,プロットした結果を図8に示す。このプロットした結果から回帰直線(Y=-19.9+11.3X,相関係数0.87,寄与率0.75)が得られ,強い正の相関があることが分かった(p<0.001)。
2.MRSAの細菌濃度が濃くなれば濃くなるほど,カテーテルに沿ってMRSAが寒天培地モデルBにより深く浸透していくことが分かった。
実験例3と同様の手技で,カテーテルを頻回に移動させることが,細菌発育深度にどのような影響を及ぼすかを調べるために行った。
1.寒天培地モデルBの,カテーテル挿入出口付近に,109cfu/mLに調整したMRSA溶液500μLをピペットで塗布し,塗布面が下側に来るよう斜めに置いた(図1−g)。
2.MRSA溶液の塗布を行い斜めにした後,37℃で24時間,寒天培地モデルBの培養を行った。この際,カテーテルの移動操作は行わず,培養を行った。培養操作が終了した後,細菌発育深度の測定と写真撮影を行った。また,この24時間培養操作の時点をT0(0時間)として,以下の検討をさらに行った。
3.2の後,継続して培養操作を行い,12時間毎に下記の一連の移動操作を行った。
(1) カテーテルを上側に引いて,5mm移動させる(図1−j→1−k)。
(2) 移動させたカテーテルを5mm押して,元の位置に戻す(図1−k→1−l)。
(3) さらに,カテーテルを5mm押す(図1−l→1−m)。
(4) 移動させたカテーテルを5mm引いて,元の位置に戻す(図1−m→1−j)。
4.上記移動操作を,84時間後まで7回行い,各時点において細菌発育深度の測定と写真撮影を行った。
1.鉛直方向への深度の測定結果を,針の長さとの比率として,プロットした結果を図9に示す。このプロットした結果から回帰直線(Y=-5.88+6.68X,相関係数0.95,寄与率0.91)が得られ,強い正の相関があることが分かった(p<0.001)。
2.また,カテーテルの移動有無を同一サンプルで比較した結果を,図10に示す。カテーテルの往復移動回数が増えれば増えるほど,黄色変色部分が,カテーテル軸方向に深く広がっていることが分かった。加えて,カテーテルの往復移動が無いサンプルでは,時間が経過しても,その黄色変色部位はMRSA塗布面近傍に留まり,カテーテル軸方向への黄色部分の広がりはほとんど見られなかった。
3.これらの結果より,移動回数が増えるにつれ,カテーテルに沿ってMRSAが寒天培地モデルBにより深く浸透していくことが分かった。
実験例4と同様の手技で,カテーテルを頻回に移動させることが,細菌発育深度にどのような影響を及ぼすかを調べるために行った。
1.寒天培地モデルBの,カテーテル挿入口付近に,109cfu/mLに調整したMRSA溶液500μLをピペットで塗布し,塗布面が下側に来るよう斜めに置いた(図1−g)。
2.MRSA溶液の塗布を行い斜めにした後,37℃で24時間,寒天培地モデルBの培養を行った。この際,カテーテルの移動操作は行わず,培養を行った。培養操作が終了した後,細菌発育深度の測定と写真撮影を行った。また,この24時間培養操作の時点をT0(0時間)として,以下の検討をさらに行った。
3.2の培養操作の後,下記の一連の移動操作を5秒間の間に行った。
(1) カテーテルを上側に引いて,5mm移動させる(図1−j→1−k)。
(2) 移動させたカテーテルを5mm押して,元の位置に戻す(図1−k→1−l)。
(3) さらに,カテーテルを5mm押す(図1−l→1−m)。
(4) 移動させたカテーテルを5mm引いて,元の位置に戻す(図1−m→1−j)。
4.上記移動操作を,行わなかったサンプル,3回行ったサンプル,6回行ったサンプルを作製し,72時間後の細菌発育深度の測定と写真撮影を行った。
1.鉛直方向への深度の測定結果を,針の長さとの比率として,プロットした結果を図11に示す。このプロットした結果から回帰直線(Y=-1.61+1.5X,相関係数0.86,寄与率0.75)が得られ,強い正の相関があることが分かった(p<0.001)。
2.このことから,移動回数が増えるにつれ,カテーテルに沿ってMRSAが寒天培地モデルBにより深く浸透していくことが分かった。
Claims (2)
- ゲル状培地に,針やカテーテルなどの生体内留置物を挿入する挿入工程と,
挿入された生体内留置物の挿入個所近傍もしくは出口個所近傍に細菌を塗布する塗布工程と,
塗布工程後にゲル状培地を培養する培養工程と,
培養工程後のゲル状培地の外観変化を評価する評価工程と,
を含むことを特徴とする感染評価方法
- さらに,挿入された生体内留置物の挿入位置を変更する位置変更工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の感染評価方法
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