JP2005127759A - ｐＨ指示薬を利用した糖質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を確実、かつ簡便に検出するための方法を見出すと共に、ＣＧＴａｓｅや澱粉分解酵素、並びにこれらの産生菌を検出するための手段を開発すること。
【解決手段】 特定のｐＨ領域の緩衝液およびｐＨ指示薬を被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を検出する方法；特定のｐＨ領域の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを濾紙に含ませてなる、サイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用試験紙；特定のｐＨ領域の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせと、可溶性澱粉または澱粉と、サイクロデキストリン合成酵素または澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地、並びに寒天またはジェランガムとを混合してなるＣＧＴａｓｅおよび／または澱粉部分分解酵素、或いはＣＤおよび／または澱粉部分分解物の検出用培地。
【選択図】 なし
【解決手段】 特定のｐＨ領域の緩衝液およびｐＨ指示薬を被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を検出する方法；特定のｐＨ領域の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを濾紙に含ませてなる、サイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用試験紙；特定のｐＨ領域の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせと、可溶性澱粉または澱粉と、サイクロデキストリン合成酵素または澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地、並びに寒天またはジェランガムとを混合してなるＣＧＴａｓｅおよび／または澱粉部分分解酵素、或いはＣＤおよび／または澱粉部分分解物の検出用培地。
【選択図】 なし
Description
本発明は、澱粉から生産される各種糖質、特にサイクロデキストリン（以下、ＣＤと略称する）、澱粉部分分解物等の検出方法に関し、詳しくはｐＨ領域を調整するための緩衝液と特定のｐＨ指示薬を用いてＣＤ、澱粉部分分解物等を検出する方法、並びに該緩衝液と該ｐＨ指示薬を用いてＣＤ合成酵素や澱粉分解酵素を検出するための試験紙、並びに培地に関する。
ＣＤは、グルコースが６個（Ｇ６）以上環状に結合した化学構造を持ち、普通環ＣＤとして６グルコース環のα−ＣＤ、７グルコース環のβ−ＣＤ、８グルコース環のγ−ＣＤがあり、これ以上のグルコースからなる大環状ＣＤとして、δ、ε−ＣＤなどがある。さらに、これらの環にグルコース、マルトースなどの枝を付けた分岐ＣＤもある。
これらのＣＤはいずれもドーナツ状の空洞を有し、この空洞内は、疎水性（油に馴染みやすい性質）で各種の疎水性物質（油性物質）を取り込み、包接体を形成することができる。
この疎水性物質には多くのものがあり、通常の包接体形成にはテトラクロロエタン，トリクロロエタン，ブロムベンゼン（β−ＣＤ，γ−ＣＤと沈殿形成），フロロベンゼン，シクロヘキサンなどが知られている。
これらのＣＤはいずれもドーナツ状の空洞を有し、この空洞内は、疎水性（油に馴染みやすい性質）で各種の疎水性物質（油性物質）を取り込み、包接体を形成することができる。
この疎水性物質には多くのものがあり、通常の包接体形成にはテトラクロロエタン，トリクロロエタン，ブロムベンゼン（β−ＣＤ，γ−ＣＤと沈殿形成），フロロベンゼン，シクロヘキサンなどが知られている。
このようなＣＤの検出方法については、従来より各種の方法が用いられている。
例えば旧くは、上記疎水性物質を被検液に混合して振り、生じた濁りからＣＤの存在を確認していた（例えば、非特許文献１参照）。
また、ＣＤ水溶液に蛍光試薬や２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートを加えると、蛍光強度が増加し、その増加度はＣＤ環の大きさに依存するため、この性質を利用した分析方法もある（例えば、非特許文献２参照）。
最近では、主として高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する）が用いられている。
例えば旧くは、上記疎水性物質を被検液に混合して振り、生じた濁りからＣＤの存在を確認していた（例えば、非特許文献１参照）。
また、ＣＤ水溶液に蛍光試薬や２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートを加えると、蛍光強度が増加し、その増加度はＣＤ環の大きさに依存するため、この性質を利用した分析方法もある（例えば、非特許文献２参照）。
最近では、主として高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する）が用いられている。
しかし、これらの方法は極めて煩雑で，多くのプロセスと時間がかかる上に、高価な測定機器も必要である。また、多くの方法は、ＣＤのみに適用される方法であり、他の糖質、例えば澱粉部分分解物には適用できなかった。
このようなことから、糖質の簡便な検出方法の開発が望まれていた。
このようなことから、糖質の簡便な検出方法の開発が望まれていた。
一方、呈色変化により微生物を検出する方法について、極めて多数の報告がある。例えば、マンニット食塩培地には、マンニットの他にｐＨ指示薬のフェノールレッド（ｐＨ域は６．８〜８．４で黄〜赤）が含まれており、病原性黄色ブドウ球菌がマンニットを資化・生育して酸を生成し、コロニー周縁部を黄色に変化させることを利用して病原性黄色ブドウ球菌を検出する。
ＥＢＭ培地（Eosin Methylene Blue）には、酸性色素のエオジンが含まれており、大腸菌などの乳糖分解菌が、培地中の乳糖を分解して酸を産生し、コロニーが酸性となり酸性色素のエオジンを黒褐色に変化させることを利用して大腸菌群を検出する。
ＢＴＢ−ＭＲ試薬は、ブロモチモールブルーとメチルレッドを組み合わせた、酸産生微生物の検出用試薬である。被検微生物が、糖質の発酵により酢酸、乳酸などの有機酸を産生すると赤〜橙色となり、一方、被検微生物が有機酸を産生しなければ、黄〜緑色となる。
ＥＢＭ培地（Eosin Methylene Blue）には、酸性色素のエオジンが含まれており、大腸菌などの乳糖分解菌が、培地中の乳糖を分解して酸を産生し、コロニーが酸性となり酸性色素のエオジンを黒褐色に変化させることを利用して大腸菌群を検出する。
ＢＴＢ−ＭＲ試薬は、ブロモチモールブルーとメチルレッドを組み合わせた、酸産生微生物の検出用試薬である。被検微生物が、糖質の発酵により酢酸、乳酸などの有機酸を産生すると赤〜橙色となり、一方、被検微生物が有機酸を産生しなければ、黄〜緑色となる。
ブロモクレゾールグリーンを含むＬＩＭ培地（例えば、栄研化学株式会社製）は、腸内細菌が生育するとアルカリとなり、ブランクより明瞭な紫色になるので、腸内細菌の検出が可能である。ブロモクレゾールグリーンの代わりにブロモクレゾールパープルを含む場合も、アルカリ性で黄色→紫に変化することから、同様に検出が可能である。
ＴＳＩ寒天培地はフェノールレッドを含む腸内細菌確認用培地である。即ち、フェノールレッドが、腸内細菌の生成した有機酸により赤→黄色へ呈色変化するので、検出できる。
ＴＳＩ寒天培地はフェノールレッドを含む腸内細菌確認用培地である。即ち、フェノールレッドが、腸内細菌の生成した有機酸により赤→黄色へ呈色変化するので、検出できる。
更に、日水製薬株式会社製ＧＡＭ寒天培地や、ブロモチモールブルーとメチルレッドを組み合わせた例もある。
他に、グラム鑑別用としてビクトリアブルーを用い、陽性は青、陰性は赤として検出するもの、β−ラクタマーゼが、ヨウ素を還元して澱粉反応を起こさなくすることを利用して検出するヨードメトリック法などもある。
アゾ色素については、各種物質の相互作用についての研究例が報告されているが、検出に用いられた例は特にない。
他に、グラム鑑別用としてビクトリアブルーを用い、陽性は青、陰性は赤として検出するもの、β−ラクタマーゼが、ヨウ素を還元して澱粉反応を起こさなくすることを利用して検出するヨードメトリック法などもある。
アゾ色素については、各種物質の相互作用についての研究例が報告されているが、検出に用いられた例は特にない。
一方、呈色変化によるＣＤの検出方法に関し、フェノールフタレインを用いてアルカリ側でβ−ＣＤを検出する方法（非特許文献３参照）が知られている。フェノールフタレインエタノール溶液の変色域は、（無）７．８〜１０．０（紅）であるが、β−ＣＤの検出は、この変色域外のｐＨ１０を超えた領域で行う。しかし、フェノールフタレインではβ−ＣＤしか検出することができず、他のＣＤを検出することができない。
また、γ−ＣＤの検出が可能なｐＨ指示薬もあり、この指示薬によれば、β−ＣＤのみならず、グルコース９個以上のＣＤであるδ−、ε−ＣＤなどの大環状ＣＤも、β−ＣＤと同様の呈色変化を示すので検出することができる。しかし、これは呈色変化の程度が小さいため、明確な検出を行うことは困難である。
また、γ−ＣＤの検出が可能なｐＨ指示薬もあり、この指示薬によれば、β−ＣＤのみならず、グルコース９個以上のＣＤであるδ−、ε−ＣＤなどの大環状ＣＤも、β−ＣＤと同様の呈色変化を示すので検出することができる。しかし、これは呈色変化の程度が小さいため、明確な検出を行うことは困難である。
ところで、ＣＤ産生菌のスクリーニングには、ＣＤ産生菌がＣＤ合成酵素を有することを利用したＣＤ合成酵素（以下、ＣＧＴａｓｅと略記する。）の検出法を適用することが必要である。
該検出法として、これまでに、Tilden-Hudson法（例えば、非特許文献４参照）、糊精化力測定法に準じた方法（例えば、非特許文献５参照）など様々な方法が用いられてきた。
また、本発明者らは、澱粉と培養基を混合して作製した寒天平板培地に、土壌などの懸濁液を散布して一定期間培養した後、０．１％ヨウ素−１％ヨウ化カリ溶液で未反応の澱粉を染色する操作を行い、染色されないコロニー（α−アミラーゼなど澱粉分解酵素を産生する菌）を拾って、これを培養し、得られた培養液を澱粉溶液に加えて反応させた後、ＨＰＬＣ，ペーパークロマトグラフィーなどの手段で生成したＣＤを検出する方法を利用していた。
なお、別法として、生成ＣＤに包接体形成試薬を加えて攪拌し、濁度を検出する方法も用いられている。
該検出法として、これまでに、Tilden-Hudson法（例えば、非特許文献４参照）、糊精化力測定法に準じた方法（例えば、非特許文献５参照）など様々な方法が用いられてきた。
また、本発明者らは、澱粉と培養基を混合して作製した寒天平板培地に、土壌などの懸濁液を散布して一定期間培養した後、０．１％ヨウ素−１％ヨウ化カリ溶液で未反応の澱粉を染色する操作を行い、染色されないコロニー（α−アミラーゼなど澱粉分解酵素を産生する菌）を拾って、これを培養し、得られた培養液を澱粉溶液に加えて反応させた後、ＨＰＬＣ，ペーパークロマトグラフィーなどの手段で生成したＣＤを検出する方法を利用していた。
なお、別法として、生成ＣＤに包接体形成試薬を加えて攪拌し、濁度を検出する方法も用いられている。
しかし、これらの方法は極めて煩雑で、多くのプロセスと時間がかかる上に、高価な測定機器も必要である。また、多くの方法は、ＣＧＴａｓｅ産生菌のみに適用される方法であり、他の糖質合成酵素産生菌や澱粉部分分解酵素産生菌などの検出には適用できなかった。
このようなことから、糖質合成酵素産生菌などのスクリーニング法の開発が強く求められている。
このようなことから、糖質合成酵素産生菌などのスクリーニング法の開発が強く求められている。
S．Kitahata and S．Okada：Agr．Biol．Chem.，34，954（1975）
H．Kondo et al.：Carbohyd．Res.，52，1（1976）
Mauri Maekelae，Timo Korpela and S．Laakso："Colorimetric determination of β-cyclodextrin：two assay modifications based on molecular complexation of phenolphatalein"Journal of Biochemical and Biophysical Methods，14，Issue 2，April 1987，Pages 85-92
E．B．Tilden and C．S．Hudson：J．Bacteriol.，43，527（1942）
S．Kitahata et al.：Agr．Biol．Chem.，38，384（1974）
そこで、本発明は、上記従来の問題点を解消し、ＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を確実、かつ簡便に検出するための方法を見出すと共に、ＣＧＴａｓｅや澱粉分解酵素、並びにこれらの産生菌を検出するための手段を開発することを目的としている。
上記の課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討した。その結果、特定のｐＨ領域の緩衝液および特定のｐＨ指示薬を被検試料に加えると、その呈色変化から、被検試料中のＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を検出できることを見出した。
また、このような特定の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを濾紙に含ませて得られる試験紙は、ＣＤや澱粉部分分解物等の糖質の検出を極めて簡便に行うことができ、しかも該試験紙の保存、取り扱い等の煩雑さが解消されることを見出した。
さらに、このような特定の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを、特定微生物の培養用培地成分として活用することにより、ＣＤや澱粉部分分解物等の糖質の他、これらを生産するためのＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、並びにこれらの酵素の産生菌のスクリーニングを行うことができることも見出した。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
また、このような特定の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを濾紙に含ませて得られる試験紙は、ＣＤや澱粉部分分解物等の糖質の検出を極めて簡便に行うことができ、しかも該試験紙の保存、取り扱い等の煩雑さが解消されることを見出した。
さらに、このような特定の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを、特定微生物の培養用培地成分として活用することにより、ＣＤや澱粉部分分解物等の糖質の他、これらを生産するためのＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、並びにこれらの酵素の産生菌のスクリーニングを行うことができることも見出した。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
請求項１に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルイエローを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のα−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項２に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルオレンジを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のα−サイクロデキストリン，β−サイクロデキストリンおよびγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項３に記載の本発明は、ｐＨ領域９〜１１の緩衝液およびメタクレゾールパープルを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のβ−サイクロデキストリンおよびγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項４に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜８の緩衝液およびメチルレッドを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項５に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびブロモクレゾールグリーンを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項６に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜６の緩衝液およびコンゴーレッドを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のβ−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリンまたは澱粉部分分解物を検出する方法である。
請求項２に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルオレンジを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のα−サイクロデキストリン，β−サイクロデキストリンおよびγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項３に記載の本発明は、ｐＨ領域９〜１１の緩衝液およびメタクレゾールパープルを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のβ−サイクロデキストリンおよびγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項４に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜８の緩衝液およびメチルレッドを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項５に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびブロモクレゾールグリーンを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のγ−サイクロデキストリンを検出する方法である。
請求項６に記載の本発明は、ｐＨ領域４〜６の緩衝液およびコンゴーレッドを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のβ−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリンまたは澱粉部分分解物を検出する方法である。
請求項７に記載の本発明は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを濾紙に含ませてなる、サイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用試験紙である。
請求項８に記載の本発明は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせ、並びに可溶性澱粉または澱粉を濾紙に含ませてなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素の検出用試験紙である。
請求項９に記載の本発明は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせと、可溶性澱粉または澱粉と、サイクロデキストリン合成酵素または澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地、並びに寒天またはジェランガムとを混合してなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素、或いはサイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用培地である。
請求項８に記載の本発明は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせ、並びに可溶性澱粉または澱粉を濾紙に含ませてなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素の検出用試験紙である。
請求項９に記載の本発明は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせと、可溶性澱粉または澱粉と、サイクロデキストリン合成酵素または澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地、並びに寒天またはジェランガムとを混合してなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素、或いはサイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用培地である。
本発明の検出方法によれば、特定のｐＨ指示薬および緩衝液の組み合わせにより、α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ等のＣＤの他、澱粉部分分解物などの糖質を極めて簡便に検出できるので、ＣＤ関連分野における研究に幅広く利用できる。
また、本発明の試験紙は、ＣＤや澱粉部分分解物などを極めて簡便に検出できる上に、その保存、取り扱い等の煩雑さも解消されるため、糖質の予備的な一般分析用として利用できる。
また、本発明の試験紙は、ＣＤや澱粉部分分解物などを極めて簡便に検出できる上に、その保存、取り扱い等の煩雑さも解消されるため、糖質の予備的な一般分析用として利用できる。
さらに、本発明の各種酵素や糖質の検出用培地は、ＣＤ合成酵素、澱粉部分分解酵素やＣＤ、澱粉部分分解物等を極めて簡便に検出できるので、使用する培地と培養条件を選択すれば、ＣＤや澱粉部分分解物の他、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、およびこれらの酵素産生菌の一次スクリーニングに用いることができる。特に、本発明の検出用培地により、食品として望ましい安全性の高い微生物がスクリーニングされれば、当該微生物を食品としての利用可能性を開くことができるので、食品産業において極めて有用である。
まず、請求項１〜６に係る本発明の検出方法について説明する。請求項１〜６に係る本発明の検出方法は、特定のｐＨ領域の緩衝液および特定のｐＨ指示薬を被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のＣＤ、澱粉部分分解物等の糖質を検出する方法である。即ち、請求項１〜６に係る本発明の検出方法は、特定のｐＨ領域の緩衝液および特定のｐＨ指示薬を用いる点で相違し、また、検出の対象であるＣＤや澱粉部分分解物の種類も相違するが、その他の点については共通であるので、共通点についてはまとめて説明する。
請求項１〜６に係る本発明の検出方法では、まず、特定のｐＨ領域の緩衝液および特定のｐＨ指示薬を被検試料に加える。
ここで被検試料としては、ＣＤ、澱粉部分分解物等の糖質が含まれているかどうかを確認したい試料、或いは糖質が含まれることは分かっているが、その糖質がＣＤ、澱粉部分分解物のいずれであるかを確認したい試料であれば、どのようなものであっても良い。例えば、天然澱粉、小麦、トウモロコシ、米、馬鈴薯、甘藷などの植物又は植物由来成分、澱粉を部分水解した製品、澱粉を物理的加工した製品、分離生産した製品、ＣＤ製品、化学修飾された澱粉製品、その他の糖質製品を用いることができる。被検試料の形態としては、緩衝液に溶解可能であれば、液体、固体等のいずれであっても良い。
ここで被検試料としては、ＣＤ、澱粉部分分解物等の糖質が含まれているかどうかを確認したい試料、或いは糖質が含まれることは分かっているが、その糖質がＣＤ、澱粉部分分解物のいずれであるかを確認したい試料であれば、どのようなものであっても良い。例えば、天然澱粉、小麦、トウモロコシ、米、馬鈴薯、甘藷などの植物又は植物由来成分、澱粉を部分水解した製品、澱粉を物理的加工した製品、分離生産した製品、ＣＤ製品、化学修飾された澱粉製品、その他の糖質製品を用いることができる。被検試料の形態としては、緩衝液に溶解可能であれば、液体、固体等のいずれであっても良い。
特定のｐＨ領域の緩衝液としては、請求項１〜６に係る本発明の検出方法においてそれぞれ特定しているｐＨ領域を満足する緩衝液の中から適宜選択して用いることができる。
即ち、請求項１に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜１１、好ましくは５〜１０の緩衝液を用い、請求項２に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜１１、好ましくは５〜１０の緩衝液を用い、請求項３に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域９〜１１、好ましくは９．５〜１０．５の緩衝液を用い、請求項４に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜８、好ましくは４．５〜７．５の緩衝液を用い、請求項５に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜１１、好ましくは５〜１０の緩衝液を用い、請求項６に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜６、好ましくは４．５〜５．５の緩衝液を用いる。
ｐＨ領域が上記範囲を逸脱すると、ｐＨ指示薬による特異的な呈色変化が起こらず、正確な検出ができなくなるので、好ましくない。なお、ｐＨ領域が上記範囲を逸脱しても、呈色変化すれば検出は可能である。
即ち、請求項１に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜１１、好ましくは５〜１０の緩衝液を用い、請求項２に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜１１、好ましくは５〜１０の緩衝液を用い、請求項３に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域９〜１１、好ましくは９．５〜１０．５の緩衝液を用い、請求項４に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜８、好ましくは４．５〜７．５の緩衝液を用い、請求項５に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜１１、好ましくは５〜１０の緩衝液を用い、請求項６に係る本発明の検出方法では、ｐＨ領域４〜６、好ましくは４．５〜５．５の緩衝液を用いる。
ｐＨ領域が上記範囲を逸脱すると、ｐＨ指示薬による特異的な呈色変化が起こらず、正確な検出ができなくなるので、好ましくない。なお、ｐＨ領域が上記範囲を逸脱しても、呈色変化すれば検出は可能である。
このような緩衝液としては、ｐＨ指示薬のｐＨ領域調整のために通常用いられる緩衝液、例えば酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液等の酢酸緩衝液、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液等のリン酸緩衝液、ＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液等のアルカリ緩衝液等を用いることができる。
本発明においては、特定のｐＨ領域に調整のために用いられる場合よりも濃度のやや高いもの、換言すれば所定のｐＨ領域よりもやや高い領域に調整される緩衝液を選択することが好ましい。具体的には、例えば０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合してｐＨ４〜６に調整した酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ６〜８に調整したリン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合してｐＨ９．５〜１１に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液は、被検試料を溶解してもｐＨ領域が殆ど変化しないので好ましい。
このようにして得られた緩衝液とｐＨ指示薬に被検試料を加えて溶解することにより、検出作業の全過程中、ｐＨ変化が抑えられ、ｐＨを一定に保つことができるので、被検試料中に含まれる糖質による呈色の変化を確実に知ることができる。
本発明においては、特定のｐＨ領域に調整のために用いられる場合よりも濃度のやや高いもの、換言すれば所定のｐＨ領域よりもやや高い領域に調整される緩衝液を選択することが好ましい。具体的には、例えば０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合してｐＨ４〜６に調整した酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ６〜８に調整したリン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合してｐＨ９．５〜１１に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液は、被検試料を溶解してもｐＨ領域が殆ど変化しないので好ましい。
このようにして得られた緩衝液とｐＨ指示薬に被検試料を加えて溶解することにより、検出作業の全過程中、ｐＨ変化が抑えられ、ｐＨを一定に保つことができるので、被検試料中に含まれる糖質による呈色の変化を確実に知ることができる。
請求項１〜６に係る本発明の検出方法において用いられる特定のｐＨ指示薬とは、以下に示すものを意味する。
請求項１に係る本発明の検出方法においては、メチルイエロー（ＭＹ）を用いる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメチルイエローの変色域は、（薄赤）２．９〜４．０（薄赤黄）であるが、請求項１に係る本発明の検出方法においては、その範囲外の領域で検出を行う。
請求項１に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にα−ＣＤが含まれる場合は、白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）に色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のα−ＣＤを検出することができる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメチルイエローの変色域は、（薄赤）２．９〜４．０（薄赤黄）であるが、請求項１に係る本発明の検出方法においては、その範囲外の領域で検出を行う。
請求項１に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にα−ＣＤが含まれる場合は、白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）に色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のα−ＣＤを検出することができる。
請求項２に係る本発明の検出方法においては、メチルオレンジ（ＭＯ）を用いる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメチルオレンジの変色域は、（黄赤）３．１〜４．４（赤黄）であるが、請求項２に係る本発明の検出方法においては、その範囲外の領域で検出を行う。
請求項２に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にα−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤのうち少なくとも１つが含まれる場合は、橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）に色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のα−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤを検出することができる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメチルオレンジの変色域は、（黄赤）３．１〜４．４（赤黄）であるが、請求項２に係る本発明の検出方法においては、その範囲外の領域で検出を行う。
請求項２に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にα−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤのうち少なくとも１つが含まれる場合は、橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）に色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のα−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤを検出することができる。
請求項３に係る本発明の検出方法においては、メタクレゾールパープル（ＭＰ）を用いる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメタクレゾールパープルの変色域は、（赤）１．２〜２．８（黄）、（黄）７．４〜９．０（紫）であるが、請求項３に係る本発明の検出方法においては、その範囲外の領域で検出を行う。
請求項３に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にβ−ＣＤが含まれる場合は、紫色（Ｐｕ）から紫がかった青色（Ｐ´Ｂｌ）へ、γ−ＣＤが含まれる場合は、紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）へ色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のβ−ＣＤおよびγ−ＣＤを検出することができる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメタクレゾールパープルの変色域は、（赤）１．２〜２．８（黄）、（黄）７．４〜９．０（紫）であるが、請求項３に係る本発明の検出方法においては、その範囲外の領域で検出を行う。
請求項３に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にβ−ＣＤが含まれる場合は、紫色（Ｐｕ）から紫がかった青色（Ｐ´Ｂｌ）へ、γ−ＣＤが含まれる場合は、紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）へ色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のβ−ＣＤおよびγ−ＣＤを検出することができる。
請求項４に係る本発明の検出方法においては、メチルレッド（ＭＲ）を用いる。
請求項４に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にγ−ＣＤが含まれる場合は、ｐＨが低い領域（例えば、ｐＨ４〜５．５）では混濁した赤色（ＴＲｅ）からワイン赤色（Ｗ´Ｒｅ）へ色調が変化し、ｐＨが高い領域（例えば、ｐＨ５．５〜８）では黄色（Ｙｅ）から赤みがかった黄色（ＲＹｅ）へ色調が変化する。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを検出することができる。
尚、通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメチルレッドの変色域は、（紫赤）４．２〜６．２（黄）であるが、請求項４に係る本発明の検出方法における呈色変化は、色調が若干異なる。
請求項４に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にγ−ＣＤが含まれる場合は、ｐＨが低い領域（例えば、ｐＨ４〜５．５）では混濁した赤色（ＴＲｅ）からワイン赤色（Ｗ´Ｒｅ）へ色調が変化し、ｐＨが高い領域（例えば、ｐＨ５．５〜８）では黄色（Ｙｅ）から赤みがかった黄色（ＲＹｅ）へ色調が変化する。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを検出することができる。
尚、通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のメチルレッドの変色域は、（紫赤）４．２〜６．２（黄）であるが、請求項４に係る本発明の検出方法における呈色変化は、色調が若干異なる。
請求項５に係る本発明の検出方法においては、ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）を用いる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のブロモクレゾールグリーンの変色域は、（黄）３．８〜５．４（青）であるが、請求項５に係る本発明においては、その範囲外の領域である。
請求項５に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にγ−ＣＤが含まれる場合は、ｐＨが低い領域（例えば、ｐＨ４〜６）では緑がかった青（ＧＢｌ）から青（Ｂｌ）へ色調が変化し、ｐＨが高い領域（例えば、ｐＨ６〜１１）では青（Ｂｌ）から僅かにくすんで白みがかった青（ＬＰＢｌ）へ色調が変化する。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを検出することができる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のブロモクレゾールグリーンの変色域は、（黄）３．８〜５．４（青）であるが、請求項５に係る本発明においては、その範囲外の領域である。
請求項５に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にγ−ＣＤが含まれる場合は、ｐＨが低い領域（例えば、ｐＨ４〜６）では緑がかった青（ＧＢｌ）から青（Ｂｌ）へ色調が変化し、ｐＨが高い領域（例えば、ｐＨ６〜１１）では青（Ｂｌ）から僅かにくすんで白みがかった青（ＬＰＢｌ）へ色調が変化する。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを検出することができる。
請求項６に係る本発明の検出方法においては、コンゴーレッド（ＣＲ）を用いる。
請求項６に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にβ−ＣＤ、γ−ＣＤおよび澱粉部分分解物のうち少なくとも１つが含まれる場合は、暗褐色（くすんだ褐色：ＤＢｒ）から褐橙色（鮮明な褐色：ＢＢｒ）へ色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のβ−ＣＤ、γ−ＣＤおよび澱粉部分分解物を検出することができる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のコンゴーレッドの変色域は、（紫）３．０〜５．０（暗黄赤）であるが、請求項６に係る本発明の検出方法における呈色変化は、色調が若干異なる。
請求項６に係る本発明の検出方法によれば、被検試料中にβ−ＣＤ、γ−ＣＤおよび澱粉部分分解物のうち少なくとも１つが含まれる場合は、暗褐色（くすんだ褐色：ＤＢｒ）から褐橙色（鮮明な褐色：ＢＢｒ）へ色調が変化し、このような呈色変化から、被検試料中のβ−ＣＤ、γ−ＣＤおよび澱粉部分分解物を検出することができる。
通常、ｐＨ指示薬として用いられる場合のコンゴーレッドの変色域は、（紫）３．０〜５．０（暗黄赤）であるが、請求項６に係る本発明の検出方法における呈色変化は、色調が若干異なる。
請求項１〜６に係る本発明の検出方法において、特定のｐＨ領域の緩衝液および特定のｐＨ指示薬を被検試料に加える際の条件については、特に制限はない。例えば、緩衝液およびｐＨ指示薬を被検試料に加える際の手順については、緩衝液を被検試料に溶解してからｐＨ指示薬を加えてミキサー等を用いて攪拌しても良いし、緩衝液をｐＨ指示薬に溶解してから被検試料を加えて攪拌しても良い。また、溶解する際の温度についても特に限定はなく、室温で溶解しても良いし、沸騰浴中で溶解した後、室温まで放冷しても良い。
ｐＨ指示薬は、あらかじめエタノール、エタノール水溶液等の適当な溶媒に常法により溶解したものを用いても良い。その際のｐＨ指示薬の濃度は、標準的には０．５〜１．０％であるが、呈色変化が明確でない場合は、濃度を適宜高めることができる。
被検試料に対する緩衝液およびｐＨ指示薬の配合割合については、呈色変化が得られやすい条件を選定すれば良い。
尚、被検試料を緩衝液に溶解することにより、検出作業の全過程中ｐＨ変化が抑えられ、ｐＨを一定に保つことができるが、緩衝液およびｐＨ指示薬を被検試料に加えた後の試料溶液のｐＨが一定であるかどうかをｐＨメーター等で確認してもよい。
ｐＨ指示薬は、あらかじめエタノール、エタノール水溶液等の適当な溶媒に常法により溶解したものを用いても良い。その際のｐＨ指示薬の濃度は、標準的には０．５〜１．０％であるが、呈色変化が明確でない場合は、濃度を適宜高めることができる。
被検試料に対する緩衝液およびｐＨ指示薬の配合割合については、呈色変化が得られやすい条件を選定すれば良い。
尚、被検試料を緩衝液に溶解することにより、検出作業の全過程中ｐＨ変化が抑えられ、ｐＨを一定に保つことができるが、緩衝液およびｐＨ指示薬を被検試料に加えた後の試料溶液のｐＨが一定であるかどうかをｐＨメーター等で確認してもよい。
請求項１〜６に係る本発明の検出方法においては、上述のように、特定のｐＨ領域の緩衝液および特定のｐＨ指示薬を被検試料に加えた後、或いは被検試料を緩衝液とｐＨ指示薬に加えた後、その呈色変化から、被検試料中のＣＤ、澱粉部分分解物等の糖質を検出する。
呈色変化の観察は、デジタルカメラによる撮影、吸光度の測定等により行うことができる。ここで、試験区（被検試料をｐＨ緩衝液に溶解させたものと、ｐＨ指示薬（色素）液の混合液）、対照試験区（被検試料に代えて呈色変化を示さないマルトースなどの糖質を緩衝液に溶解させたものと色素および緩衝液の混合液）および空試験区（被検試料を含まない、色素とｐＨ緩衝液との混合液）の比較目視観察で評価することが望ましい。その理由は、呈色変化前後の色調が同系色の場合も、呈色変化を確実に観察できるからである。
呈色変化の観察は、デジタルカメラによる撮影、吸光度の測定等により行うことができる。ここで、試験区（被検試料をｐＨ緩衝液に溶解させたものと、ｐＨ指示薬（色素）液の混合液）、対照試験区（被検試料に代えて呈色変化を示さないマルトースなどの糖質を緩衝液に溶解させたものと色素および緩衝液の混合液）および空試験区（被検試料を含まない、色素とｐＨ緩衝液との混合液）の比較目視観察で評価することが望ましい。その理由は、呈色変化前後の色調が同系色の場合も、呈色変化を確実に観察できるからである。
請求項１〜６に係る本発明の検出方法の検出対象は、ＣＤおよび澱粉部分分解物である。
ＣＤには、普通環ＣＤとして６グルコース環のα−ＣＤ、７グルコース環のβ−ＣＤ、８グルコース環のγ−ＣＤがあり、これ以上のグルコースからなる大環状ＣＤとして、δ、ε−ＣＤなどがある。さらに、これらの環にグルコース、マルトースなどの枝を付けた分岐ＣＤもある。
分岐ＣＤは、非分岐ＣＤと同様に呈色変化するが、一般に、分岐ＣＤはβ−ＣＤでもα−ＣＤに近似した呈色変化を示す。また、γ−ＣＤやε−ＣＤなどの大環状ＣＤはγ−ＣＤに準じた呈色変化を示すが、γ−ＣＤより強い呈色変化は見られない。
従って、α−ＣＤおよび一部の分岐ＣＤは、請求項１または２に係る本発明の検出方法により検出することができ、β−ＣＤは、請求項２、３、５または６に係る本発明の検出方法により検出することができ、γ−ＣＤおよび一部の大環状ＣＤは請求項２〜６のいずれかに記載の方法により検出することができる
ＣＤには、普通環ＣＤとして６グルコース環のα−ＣＤ、７グルコース環のβ−ＣＤ、８グルコース環のγ−ＣＤがあり、これ以上のグルコースからなる大環状ＣＤとして、δ、ε−ＣＤなどがある。さらに、これらの環にグルコース、マルトースなどの枝を付けた分岐ＣＤもある。
分岐ＣＤは、非分岐ＣＤと同様に呈色変化するが、一般に、分岐ＣＤはβ−ＣＤでもα−ＣＤに近似した呈色変化を示す。また、γ−ＣＤやε−ＣＤなどの大環状ＣＤはγ−ＣＤに準じた呈色変化を示すが、γ−ＣＤより強い呈色変化は見られない。
従って、α−ＣＤおよび一部の分岐ＣＤは、請求項１または２に係る本発明の検出方法により検出することができ、β−ＣＤは、請求項２、３、５または６に係る本発明の検出方法により検出することができ、γ−ＣＤおよび一部の大環状ＣＤは請求項２〜６のいずれかに記載の方法により検出することができる
一方、澱粉部分分解物とは、澱粉のα−１，４結合やα−１，６結合が酵素や加熱その他の手段により部分的に分解されたものを意味する。
ここで、澱粉としては、小麦澱粉、トウモロコシ澱粉、非糯米澱粉、糯米澱粉、緑豆澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、ワキシーコーン澱粉、タピオカ澱粉等の天然澱粉や、分岐デキストリン、限界デキストリン等の合成澱粉を挙げることができる。
澱粉部分分解物の分解の程度は、天然澱粉を含む非処理澱粉は、本呈色変化を示さないが、ＣＧＴａｓｅやα−アミラーゼを澱粉に作用させたとき、その反応初期の反応物でも（例えば、アミロースであっても）本呈色変化を示すことから、極く僅かでも部分水解した部分があれば良いものと推測される。逆に、分解しすぎると、呈色変化が見られないため、ある程度の高分子であることが必要である。具体的には、部分水解物、高度分岐環状デキストリン（クラスターデキストリン）等の７糖類（Ｇ７）以上であれば、呈色変化が起こるが、グルコース，マルトース，トレハロース，パノース等６糖類（Ｇ６）以下であると、呈色変化が起こらないおそれがある。
尚、後述の実施例９に示すように、ＤＥ２〜４０のデキストリンでも呈色変化が見られることから、高度に分解された澱粉部分分解物は、ある程度長鎖のデキストリンが僅かでも残っていれば、その存在により呈色変化するものと推測される。
ここで、澱粉としては、小麦澱粉、トウモロコシ澱粉、非糯米澱粉、糯米澱粉、緑豆澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、ワキシーコーン澱粉、タピオカ澱粉等の天然澱粉や、分岐デキストリン、限界デキストリン等の合成澱粉を挙げることができる。
澱粉部分分解物の分解の程度は、天然澱粉を含む非処理澱粉は、本呈色変化を示さないが、ＣＧＴａｓｅやα−アミラーゼを澱粉に作用させたとき、その反応初期の反応物でも（例えば、アミロースであっても）本呈色変化を示すことから、極く僅かでも部分水解した部分があれば良いものと推測される。逆に、分解しすぎると、呈色変化が見られないため、ある程度の高分子であることが必要である。具体的には、部分水解物、高度分岐環状デキストリン（クラスターデキストリン）等の７糖類（Ｇ７）以上であれば、呈色変化が起こるが、グルコース，マルトース，トレハロース，パノース等６糖類（Ｇ６）以下であると、呈色変化が起こらないおそれがある。
尚、後述の実施例９に示すように、ＤＥ２〜４０のデキストリンでも呈色変化が見られることから、高度に分解された澱粉部分分解物は、ある程度長鎖のデキストリンが僅かでも残っていれば、その存在により呈色変化するものと推測される。
このように、請求項１〜６に係る本発明の検出方法により、被検試料中のＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を正確に検出することができる。
即ち、被検試料（例えば、１００ｍｇ）中にＣＤや澱粉部分分解物が５％含まれている場合（例えば、５ｍｇ）であっても、呈色変化を検出することができるので、被検試料にｐＨ緩衝液５ｍｌおよびｐＨ指示薬０．１％（ｗ／ｖ）を溶解したとすると、試料溶液全体に含まれるＣＤや澱粉部分分解物が僅か０．１％であっても検出が可能である。
即ち、被検試料（例えば、１００ｍｇ）中にＣＤや澱粉部分分解物が５％含まれている場合（例えば、５ｍｇ）であっても、呈色変化を検出することができるので、被検試料にｐＨ緩衝液５ｍｌおよびｐＨ指示薬０．１％（ｗ／ｖ）を溶解したとすると、試料溶液全体に含まれるＣＤや澱粉部分分解物が僅か０．１％であっても検出が可能である。
また、請求項１〜６に係る本発明の検出方法を組み合わせることにより、被検試料中の各種ＣＤ（特に、α−ＣＤおよびγ−ＣＤの別）や澱粉部分分解物等の糖質を検出することができる。
ただし、β−ＣＤについては、請求項１〜６に係る本発明の検出方法だけでは検出できないが、既に知られているフェノールフタレインの呈色変化を組み合わせて利用することにより、検出することができる。すなわち、被検試料にβ−ＣＤが含まれていれば、アルカリ側で赤色が無色へと色調が変化し、このような呈色変化から検出が可能である。尚、α−ＣＤおよびγ−ＣＤにおけるフェノールフタレインの呈色変化については従来知られていなかったが、本発明者らの検討の結果、α−ＣＤは呈色変化に影響せず、γ−ＣＤはα−ＣＤとβ−ＣＤの中間の呈色変化を示すことが明らかとなった。
ただし、β−ＣＤについては、請求項１〜６に係る本発明の検出方法だけでは検出できないが、既に知られているフェノールフタレインの呈色変化を組み合わせて利用することにより、検出することができる。すなわち、被検試料にβ−ＣＤが含まれていれば、アルカリ側で赤色が無色へと色調が変化し、このような呈色変化から検出が可能である。尚、α−ＣＤおよびγ−ＣＤにおけるフェノールフタレインの呈色変化については従来知られていなかったが、本発明者らの検討の結果、α−ＣＤは呈色変化に影響せず、γ−ＣＤはα−ＣＤとβ−ＣＤの中間の呈色変化を示すことが明らかとなった。
請求項１〜６に係る本発明の検出方法に、フェノールフタレインによる呈色変化を組み合わせる場合には、請求項１〜６に係る本発明の検出方法による検出を行った後に、緩衝好ましくはｐＨ１０〜１１液に溶解した被検試料にフェノールフタレインをｐＨ４〜１１、の条件下で加えて、無色から赤色への呈色変化が観察されるか否かにより、被検試料中のβ−ＣＤを検出することができる。
また、請求項１〜６に係る本発明の検出方法、好ましくは請求項１，２，４又は６に係る本発明の検出方法においては、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ１０〜１１の条件下で、それぞれのｐＨ指示薬にフェノールフタレインを組み合わせて、呈色変化が観察されるか否かにより、被検試料中のβ−ＣＤを検出することができる。特に、請求項２および５に係る本発明の検出方法において、それぞれメチルオレンジ＋フェノールフタレイン、ブロモクレゾールグリーン＋フェノールフタレインの組み合わせで作用させることにより、より鮮明な呈色変化を示すので、好ましい。
また、請求項１〜６に係る本発明の検出方法、好ましくは請求項１，２，４又は６に係る本発明の検出方法においては、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ１０〜１１の条件下で、それぞれのｐＨ指示薬にフェノールフタレインを組み合わせて、呈色変化が観察されるか否かにより、被検試料中のβ−ＣＤを検出することができる。特に、請求項２および５に係る本発明の検出方法において、それぞれメチルオレンジ＋フェノールフタレイン、ブロモクレゾールグリーン＋フェノールフタレインの組み合わせで作用させることにより、より鮮明な呈色変化を示すので、好ましい。
このように、請求項１〜６に係る本発明の検出方法により、被検試料中のＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を正確に検出することができるが、各請求項に記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを濾紙に含ませてなる試験紙を用いることにより、より簡便な操作で糖質を正確に検出することができる。このような試験紙を提供するのが請求項７に係る本発明である。
即ち、請求項７に係る本発明の試験紙は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを濾紙に含ませてなる、サイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用試験紙である。
即ち、請求項７に係る本発明の試験紙は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを濾紙に含ませてなる、サイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用試験紙である。
請求項７に係る本発明の試験紙は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを含むものである。
即ち、請求項１に係る本発明のｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルイエローの組み合わせ、請求項２に係る本発明のｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルオレンジの組み合わせ、請求項３に係る本発明のｐＨ領域９〜１１の緩衝液およびメタクレゾールパープルの組み合わせ、請求項４に係る本発明のｐＨ領域４〜８の緩衝液およびメチルレッドの組み合わせ、請求項５に係る本発明のｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびブロモクレゾールグリーンの組み合わせ、請求項６に係る本発明のｐＨ領域４〜６の緩衝液およびコンゴーレッドの組み合わせ、ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせである。
即ち、請求項１に係る本発明のｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルイエローの組み合わせ、請求項２に係る本発明のｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルオレンジの組み合わせ、請求項３に係る本発明のｐＨ領域９〜１１の緩衝液およびメタクレゾールパープルの組み合わせ、請求項４に係る本発明のｐＨ領域４〜８の緩衝液およびメチルレッドの組み合わせ、請求項５に係る本発明のｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびブロモクレゾールグリーンの組み合わせ、請求項６に係る本発明のｐＨ領域４〜６の緩衝液およびコンゴーレッドの組み合わせ、ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせである。
ここで、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、好ましくは請求項１，２，４または６に記載の組み合わせにおいては、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ１０〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを用いて、呈色変化が観察されるか否かにより、被検試料中のβ−ＣＤを検出することができる。特に、請求項２および５に記載の組み合わせにおいて、ｐＨ４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを用いることにより、より鮮明な呈色変化を示すので、好ましい。
請求項７に係る本発明の試験紙において、どの組み合わせを選択するかは、検出したいＣＤや澱粉部分分解物の種類により適宜決定することができる。
即ち、α−ＣＤを検出したい場合は、請求項１または２に記載の緩衝液およびｐＨ指示薬を選択することができ、β−ＣＤを検出したい場合は、請求項２、３、５または６に記載の緩衝液およびｐＨ指示薬を選択することができ、γ−ＣＤを検出したい場合は、請求項２〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬を選択することができる。
即ち、α−ＣＤを検出したい場合は、請求項１または２に記載の緩衝液およびｐＨ指示薬を選択することができ、β−ＣＤを検出したい場合は、請求項２、３、５または６に記載の緩衝液およびｐＨ指示薬を選択することができ、γ−ＣＤを検出したい場合は、請求項２〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬を選択することができる。
このような緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを含ませるための濾紙は、特に限定はなく通常用いるものであれば良い。紙の種類は特に問わず、例えば丸形濾紙、角形濾紙を使用できる。厚さについても特に限定はないが、やや厚めのものが好ましい。具体的には、やや厚めの東洋濾紙Ｎｏ．４０が適当であり、厚めのＮｏ．５０を用いることもできる。濾紙のサイズに関しては、検出容易な大きさに適宜切り抜いて用いることができる。
緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを濾紙へ含ませる方法は任意であり、例えば緩衝液にｐＨ指示薬を溶解して得られる色素−緩衝液に、濾紙を含浸（浸漬）させる方法により行うことができる。また、濾紙に含浸させて湿めらせた状態のまま検出に用いることもできるし、操作性を向上するために風乾等の方法により乾燥させてから用いることもできる。さらには、ｐＨが酸性やアルカリ性に偏らないように管理すれば、保存することも可能である。一般的な保存条件はｐＨ４〜１０で、室温で、１〜６ヶ月間である。
請求項７に係る本発明の試験紙の被検対象となる被検試料としては、請求項１〜６に係る本発明の検出方法における被検試料と同様に、ＣＤ、澱粉部分分解物等の糖質が含まれているかどうかを確認したい試料、或いは糖質が含まれることは分かっているが、その糖質がＣＤ、澱粉部分分解物のいずれであるかを確認したい試料であれば、どのようなものであっても良い。例えば、天然澱粉、小麦、トウモロコシ、米、馬鈴薯、甘藷などの植物または植物由来成分、澱粉を部分的に加水分解した製品、澱粉を物理的加工した製品、分離生産した製品、ＣＤ製品、化学修飾された澱粉製品、その他の糖質製品を用いることができる。被検試料の形態としては、緩衝液に溶解可能であれば、液体、固体等のいずれであっても良い。
さらに、被検試料が培地であっても良い。例えば、ＣＧＴａｓｅの基質である可溶性澱粉や澱粉部分分解酵素の基質である澱粉を含む培地とし、該培地中のＣＤや澱粉部分分解物を検出することにより、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、或いはそれら酵素の産生菌のスクリーニングも可能である。
さらに、被検試料が培地であっても良い。例えば、ＣＧＴａｓｅの基質である可溶性澱粉や澱粉部分分解酵素の基質である澱粉を含む培地とし、該培地中のＣＤや澱粉部分分解物を検出することにより、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、或いはそれら酵素の産生菌のスクリーニングも可能である。
呈色変化の観察は、特に呈色変化前後の色調が同系色の場合、試験区（被検試料）および対照試験区（被検試料に代えて呈色変化を示さないマルトースなどの糖質）をそれぞれ請求項７に係る本発明の試験紙につけて、比較目視観察で評価することにより、呈色変化を確実に観察できるので望ましい。
上述のように、被検試料を可溶性澱粉や澱粉を含む培地とし、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、或いはそれら酵素の産生菌をスクリーニングしたい場合、請求項７に係る本発明の試験紙を培地中のコロニーの上に静かに乗せてレプリカを取り、呈色変化をしたコロニーを探せばよい。
上述のように、被検試料を可溶性澱粉や澱粉を含む培地とし、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、或いはそれら酵素の産生菌をスクリーニングしたい場合、請求項７に係る本発明の試験紙を培地中のコロニーの上に静かに乗せてレプリカを取り、呈色変化をしたコロニーを探せばよい。
このように、請求項７に係る本発明の試験紙を用いることにより、より簡便な操作で各種糖質を正確に検出することができる。さらに、このような試験紙にＣＧＴａｓｅの基質である可溶性澱粉や澱粉部分分解酵素の基質である澱粉を含ませておくことにより、これらの酵素や酵素産生菌の簡便な検出も可能である。このような試験紙を提供するのが請求項８に係る本発明である。
即ち、請求項８に係る本発明の試験紙は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせ、並びに可溶性澱粉または澱粉を濾紙に含ませてなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素の検出用試験紙である。
請求項８に係る本発明の試験紙は、請求項７に係る本発明の試験紙において、さらに可溶性澱粉または澱粉を含ませてなるものである。
したがって、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを含むこと、並びにｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインを組み合わせても良いことについては、請求項７に係る本発明の試験紙で説明したのと同様であるので、ここでは説明を省略する。
請求項８に係る本発明の試験紙は、請求項７に係る本発明の試験紙において、さらに可溶性澱粉または澱粉を含ませてなるものである。
したがって、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを含むこと、並びにｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインを組み合わせても良いことについては、請求項７に係る本発明の試験紙で説明したのと同様であるので、ここでは説明を省略する。
可溶性澱粉としては、市販の可溶性澱粉、メルク社製の高溶解性可溶性澱粉、通常可溶性澱粉等を挙げることができる。
澱粉としては、小麦澱粉、トウモロコシ澱粉、非糯米澱粉、糯米澱粉、緑豆澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、ワキシーコーン澱粉、タピオカ澱粉等の天然澱粉や、分岐デキストリン、限界デキストリン等の澱粉誘導体を挙げることができる。
可溶性澱粉および澱粉のいずれを含ませるかについては、ＣＧＴａｓｅやその産生菌を検出したい場合は、該酵素の基質である可溶性澱粉を、澱粉部分分解酵素や該酵素の産生菌を検出したい場合は、該酵素の基質である澱粉を含ませることになる。
澱粉としては、小麦澱粉、トウモロコシ澱粉、非糯米澱粉、糯米澱粉、緑豆澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、ワキシーコーン澱粉、タピオカ澱粉等の天然澱粉や、分岐デキストリン、限界デキストリン等の澱粉誘導体を挙げることができる。
可溶性澱粉および澱粉のいずれを含ませるかについては、ＣＧＴａｓｅやその産生菌を検出したい場合は、該酵素の基質である可溶性澱粉を、澱粉部分分解酵素や該酵素の産生菌を検出したい場合は、該酵素の基質である澱粉を含ませることになる。
請求項８に係る本発明の試験紙の被検対象となる被検試料としては、特にＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、或いはこれらを産生する微生物の有無を確認したい物質、好ましくは培地を挙げることができる。
呈色変化の観察は、試験紙を培地中のコロニーの上に静かに乗せてレプリカを取り、好ましくは一定温度（３５〜４５℃）で反応させて、検出を行っていない試験紙と比較目視観察して評価する方法は、呈色変化前後の色調が同系色の場合であっても、呈色変化を確実に観察できるので望ましい。
上述のように、被検試料を可溶性澱粉や澱粉を含む培地とし、ＣＧＴａｓｅ産生菌や澱粉部分分解酵素産生菌をスクリーニングしたい場合は、請求項７に係る本発明の試験紙を培地中のコロニーの上に静かに乗せてレプリカを取り、呈色変化をしたコロニーを探せばよい。
上述のように、被検試料を可溶性澱粉や澱粉を含む培地とし、ＣＧＴａｓｅ産生菌や澱粉部分分解酵素産生菌をスクリーニングしたい場合は、請求項７に係る本発明の試験紙を培地中のコロニーの上に静かに乗せてレプリカを取り、呈色変化をしたコロニーを探せばよい。
また、請求項１〜６のいずれかに記載の方法で用いるｐＨ指示薬のうち、請求項６に係るコンゴーレッドと共に澱粉を含ませてなる請求項８に係る本発明の試験紙に、被検試料（または被検試料を緩衝液に溶解させたもの）を接触させて、請求項６に記載のｐＨ条件下、即ちｐＨ４〜６の条件下で、かつ３５〜５０℃で反応させ、呈色変化をみれば、澱粉分解酵素または澱粉分解酵素産生菌を検出することができる。
請求項１〜６に係る本発明の検出方法により、被検試料中のＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を正確に検出することができるが、各緩衝液およびｐＨ指示薬を可溶性澱粉または澱粉と共に混合させた検出用培地を用いれば、各種のＣＤや澱粉部分分解物等の糖質の他、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、或いはそれらの産生菌を簡便に検出することができる。このような検出用培地を提供するのが請求項９に係る本発明である。
即ち、請求項９記載の本発明の検出用培地は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせと、可溶性澱粉または澱粉と、サイクロデキストリン合成酵素または澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地、並びに寒天またはジェランガムとを混合してなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素、或いはサイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用培地である。
請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを含むこと、可溶性澱粉または澱粉を含むこと等については、請求項８に係る本発明の試験紙について説明したのと同様であるので、ここでは説明を省略する。
即ち、請求項９記載の本発明の検出用培地は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせと、可溶性澱粉または澱粉と、サイクロデキストリン合成酵素または澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地、並びに寒天またはジェランガムとを混合してなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素、或いはサイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用培地である。
請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを含むこと、可溶性澱粉または澱粉を含むこと等については、請求項８に係る本発明の試験紙について説明したのと同様であるので、ここでは説明を省略する。
ＣＧＴａｓｅまたは澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地とは、該微生物の培養に通常用いられる各種培地を使用することができるが、特にＣＧＴａｓｅ産生菌や澱粉部分分解酵素産生菌が良好に生育できる培地、例えばポテトデキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製）等であって、ｐＨ指示薬および緩衝液を加えて溶解したときに、鮮明な色調を保ち色素の呈色を妨害しないものであることが好ましい。
寒天やジェランガムとしては、培地用のゲル化剤として通常用いられるものを用いることができ、請求項１〜６に記載のｐＨ領域の範囲でゲル化するものであれば良い。
配合割合は、寒天の場合は１．５〜３％、ジェランガムの場合は０．５〜１．０％
（目安を教えてください）であることが好ましい。
寒天やジェランガムとしては、培地用のゲル化剤として通常用いられるものを用いることができ、請求項１〜６に記載のｐＨ領域の範囲でゲル化するものであれば良い。
配合割合は、寒天の場合は１．５〜３％、ジェランガムの場合は０．５〜１．０％
（目安を教えてください）であることが好ましい。
請求項９記載の検出用培地は、請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせ、可溶性澱粉または澱粉、上記微生物培養用培地、寒天またはジェランガムとを混合して作成することができる。例えば、これらの材料を溶解して、必要に応じてオートクレーブにより加熱殺菌した後、粗熱を取ってからデスポシャーレに入れて平板培地とすることができる。
培地の形態は、ｐＨ緩衝液の種類により適宜変更することが可能である。例えば、リン酸緩衝液は粉末化できるので粉末培地とすることが可能であるが、酢酸緩衝液、アルカリ緩衝液等の場合は、ゲル培地として利用することができる。
培地の形態は、ｐＨ緩衝液の種類により適宜変更することが可能である。例えば、リン酸緩衝液は粉末化できるので粉末培地とすることが可能であるが、酢酸緩衝液、アルカリ緩衝液等の場合は、ゲル培地として利用することができる。
請求項９に係る本発明の培地の対象となる被検試料としては、特にＣＤや澱粉部分分解物の存在の有無を確認したい物質や、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、或いはこれらを産生する微生物の有無を確認したい物質、好ましくは培養液を挙げることができる。
請求項９記載の検出用培地による検出は、培地表面に被検試料を塗布または数箇所に滴下して、１〜２日一定温度（例えば、１５〜４５℃）で培養し、ＣＤや澱粉部分分解物の場合は全体的な呈色変化が、またＣＧＴａｓｅ、澱粉部分分解酵素、並びにそれらの産生菌の場合はコロニーと思われる箇所の色調変化の有無を確認することにより、検出が可能である。
尚、乳酸菌、アミン生成菌などのコロニーが出現すると、培地が酸性またはアルカリ性となるので、培地のｐＨを常に確認する必要がある。
請求項９記載の検出用培地による検出は、培地表面に被検試料を塗布または数箇所に滴下して、１〜２日一定温度（例えば、１５〜４５℃）で培養し、ＣＤや澱粉部分分解物の場合は全体的な呈色変化が、またＣＧＴａｓｅ、澱粉部分分解酵素、並びにそれらの産生菌の場合はコロニーと思われる箇所の色調変化の有無を確認することにより、検出が可能である。
尚、乳酸菌、アミン生成菌などのコロニーが出現すると、培地が酸性またはアルカリ性となるので、培地のｐＨを常に確認する必要がある。
培地に緩衝液およびｐＨ指示の組み合わせを含ませずに基質としての澱粉または可溶性澱粉平板培地を作成し、培養開始後コロニーの出現を待って、緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせを少量、例えば２ｍｌ程度流し込んで、呈色変化を観察することにより酵素の検出が可能である。
尚、請求項１〜６に係る本発明の検出方法は、ｐＨ指示薬以外の多種類の色素、例えば食用化学合成色素、化学合成色素などの中で、糖質に対し呈色変化を示すものも応用可能である。一般に水溶性の色素、例えばアントシアン系色素などでは、糖質の種類による呈色変化を示さない。しかし、脂溶性色素では呈色変化をする色素もあり、例えばラック色素は水解程度が進んだ澱粉系水解物（高溶解性デキストリンなど）では、ブランクでの褐色が、糖質の存在で暗褐色に呈色変化する。
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（ｐＨ５．０における呈色変化）
ｐＨ指示薬の呈色変化により各種試料中のＣＤまたは澱粉部分分解物の検出を試みた。
被検試料として、小麦澱粉（wheat starch）、トウモロコシ澱粉（corn starch）、非糯米澱粉（nonglutinus rice starch）、糯米澱粉（Glutinous rice starch）、緑豆澱粉（green bean starch）、馬鈴薯澱粉（potato starch）、甘藷澱粉（sweet potato starch）、トウモロコシ澱粉酵素分解物ＤＥ３０（corn starch enzyme degraded DE30）、トウモロコシ澱粉酵素分解物ＤＥ２２（corn starch enzyme degraded DE22）、トウモロコシ澱粉酸分解物ＤＥ２２（corn starch acid degraded DE22）ワキシーコーン澱粉酵素分解物ＤＥ５（waxy corn starch degraded enzyme DE5）、タピオカ澱粉酵素分解ＤＥ１４（tapioca starch enzyme degraded DE14）、ＣＣＤ（クラスターデキストリン；高度分岐環状デキストリン）、分岐デキストリンＤＥ８（branching dextrin DE8）、トウモロコシ澱粉α−限界デキストリン（corn starch α-limit dextrin）、難消化性澱粉（商品名：NISYOKU ROAD STAR、日本食品化工株式会社製）、アミロース（Amylose）、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤの各純品製品（株式会社横浜国際バイオ研究所製）、ＣＤ混合物（α−ＣＤ６０％、β−ＣＤ３０％、その他のＣＤ１０％、商品名：Ｋ−１００、株式会社横浜国際バイオ研究所製）、ＣＤ５０％含有品（商品名：Ｋ−５０、株式会社横浜国際バイオ研究所製）、分岐ＣＤ（商品名：Ｇ２−α−ＣＤ、Ｇ２−β−ＣＤ、株式会社横浜国際バイオ研究所製）、カルボキシメチル澱粉（carboxymethyl starch）、リン酸澱粉（phosphoric acid starch）、スルホン酸澱粉（sulfonic acid starch）、酢酸澱粉（acetic acid starch）、澱粉以外の多糖製品（商品名：ＧＸＧ−ＴＧ、大日本製薬株式会社製）、（商品名：ＫＥＬＺＡＮ、大日本製薬株式会社製）および（商品名：ＴＡＲＡＧＵＭ、大日本製薬株式会社製）を用いた。
実施例１（ｐＨ５．０における呈色変化）
ｐＨ指示薬の呈色変化により各種試料中のＣＤまたは澱粉部分分解物の検出を試みた。
被検試料として、小麦澱粉（wheat starch）、トウモロコシ澱粉（corn starch）、非糯米澱粉（nonglutinus rice starch）、糯米澱粉（Glutinous rice starch）、緑豆澱粉（green bean starch）、馬鈴薯澱粉（potato starch）、甘藷澱粉（sweet potato starch）、トウモロコシ澱粉酵素分解物ＤＥ３０（corn starch enzyme degraded DE30）、トウモロコシ澱粉酵素分解物ＤＥ２２（corn starch enzyme degraded DE22）、トウモロコシ澱粉酸分解物ＤＥ２２（corn starch acid degraded DE22）ワキシーコーン澱粉酵素分解物ＤＥ５（waxy corn starch degraded enzyme DE5）、タピオカ澱粉酵素分解ＤＥ１４（tapioca starch enzyme degraded DE14）、ＣＣＤ（クラスターデキストリン；高度分岐環状デキストリン）、分岐デキストリンＤＥ８（branching dextrin DE8）、トウモロコシ澱粉α−限界デキストリン（corn starch α-limit dextrin）、難消化性澱粉（商品名：NISYOKU ROAD STAR、日本食品化工株式会社製）、アミロース（Amylose）、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤの各純品製品（株式会社横浜国際バイオ研究所製）、ＣＤ混合物（α−ＣＤ６０％、β−ＣＤ３０％、その他のＣＤ１０％、商品名：Ｋ−１００、株式会社横浜国際バイオ研究所製）、ＣＤ５０％含有品（商品名：Ｋ−５０、株式会社横浜国際バイオ研究所製）、分岐ＣＤ（商品名：Ｇ２−α−ＣＤ、Ｇ２−β−ＣＤ、株式会社横浜国際バイオ研究所製）、カルボキシメチル澱粉（carboxymethyl starch）、リン酸澱粉（phosphoric acid starch）、スルホン酸澱粉（sulfonic acid starch）、酢酸澱粉（acetic acid starch）、澱粉以外の多糖製品（商品名：ＧＸＧ−ＴＧ、大日本製薬株式会社製）、（商品名：ＫＥＬＺＡＮ、大日本製薬株式会社製）および（商品名：ＴＡＲＡＧＵＭ、大日本製薬株式会社製）を用いた。
ｐＨ指示薬としては、メチルオレンジ（ＭＯ）、メチルイエロー（ＭＹ）、コンゴーレッド（ＣＲ）、メチルレッド（ＭＲ）、ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）、メタクレゾールパープル（ＭＰ）およびフェノールフタレイン（ＰＰ）を用いた。このうち、メチルイエロー、メチルレッドおよびフェノールフタレインについてはエタノール原液（試薬特級、和光純薬工業（株））を、他のｐＨ指示薬は２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を、用いて０．１％（ｗ／ｖ）に調整し、ｐＨ指示薬溶液とした。
試験管にｐＨ緩衝液として０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合してｐＨ５．０に調整した酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液５ｍＬと上記各試料１００ｍｇを入れ、沸騰水浴中で溶解し、室温まで放冷した。この試料溶液に、０．１％（ｗ／ｖ）に調整したｐＨ指示薬溶液を２５０μＬ加え、ミキサーを用いて撹拌した後、目視観察した。試料溶液のｐＨは、ｐＨメータ（ＫＳ７２３，親電元工業（株））で測定した。さらに、試料溶液をデジタルカメラ（CAMEDIA，C-730 Ultra Zoom，オリンパス光学工業（株））で撮影し、色調・呈色の変化を判定し、各試料間で比較した。
色調・呈色変化の判定は、撮影された写真とｐＨ指示薬の元の色調（Original color）と比較して、−（変化を認めず）、●（僅かな変化を認める）および◎（顕著な変化を認める）の３段階に分類するとともに、◎の場合はどのような色に変化したかを具体的に提示して行った。
表１〜４に、各種試料における各種ｐＨ指示薬の色調・呈色変化をまとめた。
表１〜４に、各種試料における各種ｐＨ指示薬の色調・呈色変化をまとめた。
表１〜４中、Ｏｒは橙色、Ｙｅは黄色、ＷＹｅは白みがかった黄色、ＬＹｅは鮮明な黄色、ＳＹｅは薄い黄色、ＤＢｒはくすんだ褐色、ＢＢｒは鮮明な褐色、ＴＲｅは混濁した赤色、Ｗ´Ｒｅはワイン赤色、ＧＢｌは緑がかった青、Ｂｌは青、ＣＬは無色、ＲＹｅは赤みがかった黄色、ＬＰＢｌは僅かにくすんで白みがかった青、Ｐｕは紫色、Ｐ´Ｂｌは紫がかった青色、ＲＰｕは赤みがかった紫色、ＰＲＰｕはくすんで赤みがかった紫色を示す。尚、これらの色調に関する略記は、後述する表５〜１２でも同様である。
表１〜４から、以下のことが分かる。
メチルイエロー（ＭＹ）は、α−ＣＤについて白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるα−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルオレンジ（ＭＯ）は、全てのＣＤについて橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルレッド（ＭＲ）は、γ−ＣＤについて混濁した赤色（ＴＲｅ）からワイン赤色（Ｗ´Ｒｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）は、γ−ＣＤについて緑がかった青（ＧＢｌ）から青（Ｂｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
コンゴーレッド（ＣＲ）は、β−ＣＤ、γ−ＣＤおよび各種澱粉部分分解物について暗褐色（くすんだ褐色：ＤＢｒ）から褐橙色（鮮明な褐色：ＢＢｒ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルイエロー（ＭＹ）は、α−ＣＤについて白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるα−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルオレンジ（ＭＯ）は、全てのＣＤについて橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルレッド（ＭＲ）は、γ−ＣＤについて混濁した赤色（ＴＲｅ）からワイン赤色（Ｗ´Ｒｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）は、γ−ＣＤについて緑がかった青（ＧＢｌ）から青（Ｂｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
コンゴーレッド（ＣＲ）は、β−ＣＤ、γ−ＣＤおよび各種澱粉部分分解物について暗褐色（くすんだ褐色：ＤＢｒ）から褐橙色（鮮明な褐色：ＢＢｒ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ５．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
一方、メタクレゾールパープル（ＭＰ）やフェノールフタレイン（ＰＰ）の場合は、数種の天然澱粉や澱粉部分分解物で僅かな色調変化が見られたに過ぎず、ＣＤについては色調変化が見られなかったことから、ｐＨ５．０では検出が困難であることが明らかとなった。
実施例２（ｐＨ７．０における呈色変化）
ｐＨ緩衝液として０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ７．０に調整したリン酸緩衝液を用いた他は、実施例１と同様にしてｐＨ指示薬の呈色変化により各種試料中のＣＤまたは澱粉部分分解物の検出を試みた。
表５〜８に、各種試料における各種ｐＨ指示薬の色調・呈色変化をまとめた。
ｐＨ緩衝液として０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ７．０に調整したリン酸緩衝液を用いた他は、実施例１と同様にしてｐＨ指示薬の呈色変化により各種試料中のＣＤまたは澱粉部分分解物の検出を試みた。
表５〜８に、各種試料における各種ｐＨ指示薬の色調・呈色変化をまとめた。
表５〜８から、以下のことが分かる。
メチルイエロー（ＭＹ）は、α−ＣＤについて白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるα−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルオレンジ（ＭＯ）は、全てのＣＤについて橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルレッド（ＭＲ）は、γ−ＣＤについて黄色（Ｙｅ）から赤みがかった黄色（ＲＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）は、γ−ＣＤについて青（Ｂｌ）から僅かにくすんで緑がかった青（ＬＰＢｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルイエロー（ＭＹ）は、α−ＣＤについて白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるα−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルオレンジ（ＭＯ）は、全てのＣＤについて橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルレッド（ＭＲ）は、γ−ＣＤについて黄色（Ｙｅ）から赤みがかった黄色（ＲＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）は、γ−ＣＤについて青（Ｂｌ）から僅かにくすんで緑がかった青（ＬＰＢｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ８．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
一方、コンゴーレッド（ＣＲ）やメタクレゾールパープル（ＭＰ）やフェノールフタレイン（ＰＰ）の場合は、数種の天然澱粉や澱粉部分分解物で僅かな色調変化が見られたに過ぎず、ＣＤについては色調変化が見られなかったことから、ｐＨ８．０では検出が困難であることが明らかとなった。
実施例３（ｐＨ１０．０における呈色変化）
ｐＨ緩衝液としてＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合してｐＨ１０．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液を用いた他は、実施例１と同様にしてｐＨ指示薬の呈色変化により各種試料中のＣＤまたは澱粉部分分解物の検出を試みた。
表９〜１２に、各種試料における各種ｐＨ指示薬の色調・呈色変化をまとめた。
ｐＨ緩衝液としてＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合してｐＨ１０．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液を用いた他は、実施例１と同様にしてｐＨ指示薬の呈色変化により各種試料中のＣＤまたは澱粉部分分解物の検出を試みた。
表９〜１２に、各種試料における各種ｐＨ指示薬の色調・呈色変化をまとめた。
表９〜１２から、以下のことが分かる。
メチルイエロー（ＭＹ）は、α−ＣＤについて白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるα−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルオレンジ（ＭＯ）は、全てのＣＤについて橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）は、γ−ＣＤについて青（Ｂｌ）から僅かにくすんで白みがかった青（ＬＰＢｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メタクレゾールパープル（ＭＰ）は、β−ＣＤについて紫色（Ｐｕ）から紫がかった青色（Ｐ´Ｂｌ）への顕著な色調変化が認められ、γ−ＣＤについて紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
フェノールフタレイン（ＰＰ）は、β−ＣＤについて青みがかった赤色（ＲＰｕ）から無色（Ｃｌ）への顕著な色調変化が認められ、γ−ＣＤは青みがかった赤色（ＲＰｕ）からくすんで赤みがかった紫色（ＰＲＰｕ）への顕著な色調変化が認められた。α−ＣＤについて色調変化は認められなかった。
これらのことから、フェノールフタレインは従来報告されているようにβ−ＣＤの検出に用いることができることが改めて示されると共に、α−ＣＤは呈色へ何関与しないことおよびγ−ＣＤはα−ＣＤとβ−ＣＤの中間の呈色変化を示すことが明らかとなった。
メチルイエロー（ＭＹ）は、α−ＣＤについて白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるα−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メチルオレンジ（ＭＯ）は、全てのＣＤについて橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるα−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
ブロモクレゾールグリーン（ＢＧ）は、γ−ＣＤについて青（Ｂｌ）から僅かにくすんで白みがかった青（ＬＰＢｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
メタクレゾールパープル（ＭＰ）は、β−ＣＤについて紫色（Ｐｕ）から紫がかった青色（Ｐ´Ｂｌ）への顕著な色調変化が認められ、γ−ＣＤについて紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）への顕著な色調変化が認められたことから、ｐＨ１０．０におけるγ−ＣＤの検出が可能であることが明らかとなった。
フェノールフタレイン（ＰＰ）は、β−ＣＤについて青みがかった赤色（ＲＰｕ）から無色（Ｃｌ）への顕著な色調変化が認められ、γ−ＣＤは青みがかった赤色（ＲＰｕ）からくすんで赤みがかった紫色（ＰＲＰｕ）への顕著な色調変化が認められた。α−ＣＤについて色調変化は認められなかった。
これらのことから、フェノールフタレインは従来報告されているようにβ−ＣＤの検出に用いることができることが改めて示されると共に、α−ＣＤは呈色へ何関与しないことおよびγ−ＣＤはα−ＣＤとβ−ＣＤの中間の呈色変化を示すことが明らかとなった。
一方、メチルレッド（ＭＲ）やコンゴーレッド（ＣＲ）の場合は、数種の天然澱粉や澱粉部分分解物で僅かな色調変化が見られたに過ぎず、ＣＤについては色調変化が見られなかったことから、ｐＨ８．０では検出が困難であることが明らかとなった。
実施例４（メチルイエローの呈色変化）
メチルイエローをエタノール原液に０．１％（ｗ／ｖ）濃度に溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合して各ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０に調整した０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍｌに加え、被検試料としてα−、β−、γ−ＣＤの各純品製品（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、α−ＣＤ１％水溶液のみで白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）に色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のα−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
メチルイエローをエタノール原液に０．１％（ｗ／ｖ）濃度に溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合して各ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０に調整した０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍｌに加え、被検試料としてα−、β−、γ−ＣＤの各純品製品（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、α−ＣＤ１％水溶液のみで白みがかった黄色（ＷＹｅ）から鮮明な黄色（ＬＹｅ）に色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のα−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
実施例５（メチルオレンジの呈色変化）
メチルオレンジを２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に０．１％（ｗ／ｖ）濃度に溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合して各ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０に調整した０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍｌに加え、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、α−、β−、γ−ＣＤ溶液で橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）に色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のα−、β−、γ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
メチルオレンジを２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に０．１％（ｗ／ｖ）濃度に溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合して各ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０に調整した０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍｌに加え、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、α−、β−、γ−ＣＤ溶液で橙色（Ｏｒ）から黄色（Ｙｅ）に色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のα−、β−、γ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
実施例６（メタクレゾールパープルの呈色変化）
メタクレゾールパープルを実施例５と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍＬに加え、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各純品製品（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍｌを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、β−ＣＤ溶液で紫色（Ｐｕ）から紫がかった青色（Ｐ´Ｂｌ）に、γ−ＣＤ溶液で紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）に色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のβ−、γ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
なお、ｐＨ９．０のＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液で同様の実験を行ったところ、同様な結果であった。
メタクレゾールパープルを実施例５と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍＬに加え、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各純品製品（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍｌを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、β−ＣＤ溶液で紫色（Ｐｕ）から紫がかった青色（Ｐ´Ｂｌ）に、γ−ＣＤ溶液で紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）に色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のβ−、γ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
なお、ｐＨ９．０のＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液で同様の実験を行ったところ、同様な結果であった。
実施例７（メチルレッドの呈色変化）
メチルレッドを実施例４と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液５ｍＬに加えた。また、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、γ−ＣＤ溶液でｐＨが低い領域（例えば、ｐＨ４〜５．５）では混濁した赤色（ＴＲｅ）からワイン赤色（Ｗ´Ｒｅ）へ色調が変化し、ｐＨが高い領域（例えば、ｐＨ５．５〜８）では黄色（Ｙｅ）から赤みがかった黄色（ＲＹｅ）へ色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
メチルレッドを実施例４と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液５ｍＬに加えた。また、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、γ−ＣＤ溶液でｐＨが低い領域（例えば、ｐＨ４〜５．５）では混濁した赤色（ＴＲｅ）からワイン赤色（Ｗ´Ｒｅ）へ色調が変化し、ｐＨが高い領域（例えば、ｐＨ５．５〜８）では黄色（Ｙｅ）から赤みがかった黄色（ＲＹｅ）へ色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
実施例８（ブロモクレゾールグリーンの呈色変化）
ブロモクレゾールグリーンを実施例５と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合して各ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０に調整した０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍＬに加え、さらに被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、γ−ＣＤ溶液で、ｐＨ４．０〜６．０で緑がかった青（ＧＢｌ）から青（Ｂｌ）に、ｐＨ６．０〜１１．０で青（Ｂｌ）から僅かにくすんで白みがかった青（ＬＰＢｌ）へ色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
ブロモクレゾールグリーンを実施例５と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合して各ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０に調整した０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合して各ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、１１．０に調整したＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液５ｍＬに加え、さらに被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質（株式会社横浜国際バイオ研究所製）１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
その結果、γ−ＣＤ溶液で、ｐＨ４．０〜６．０で緑がかった青（ＧＢｌ）から青（Ｂｌ）に、ｐＨ６．０〜１１．０で青（Ｂｌ）から僅かにくすんで白みがかった青（ＬＰＢｌ）へ色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のγ−ＣＤを明確に検出することができることが明らかとなった。
実施例９（コンゴーレッドの呈色変化）
コンゴーレッドを実施例５と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液５ｍＬに加え、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質（株式会社横浜国際バイオ研究所製）の他、ＣＧＴａｓｅおよびα−アミラーゼを澱粉に反応させて得られた澱粉部分分解物、澱粉水解物由来の成分であるグルコース，マルトース，トレハロース，パノース，マルトヘキサオース（Ｇ６）、ＤＥ２〜４０のデキストリンの各糖質１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
澱粉部分分解物及び各糖質については、以下の方法により得た。即ち、市販酵素ＣＧＴａｓｅ（商品名：コンチザイム、天野エンザイム株式会社製、液状６００ＴＨＵ／ｍｌ）を酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１００倍希釈した酵素溶液、および市販酵素アミラーゼ（商品名：アミラーゼＡＤ［アマノ］１、天野エンザイム株式会社製、１０，０００Ｕ／ｇ粉末 糊精化力測定天野法）の０．１ｍｇ／１０ｍＬ 酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）の酵素溶液各５０μＬを馬鈴薯澱粉１５０ｍｇ／５ｍＬ同緩衝液に添加した酵素溶液を、それぞれ４５℃で、１、６または１２時間作用させて、澱粉部分分解物および各糖質を得た。
その結果、β−、γ−ＣＤ溶液で暗褐色（くすんだ褐色：ＤＢｒ）から褐橙色（鮮明な褐色：ＢＢｒ）になり明確に判別することができた。
コンゴーレッドを実施例５と同様にして溶解し、その５００μＬを、０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合して各ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０に調整した０．２Ｍ 酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液５ｍＬに加え、被検試料液としてα−、β−、γ−ＣＤの各糖質（株式会社横浜国際バイオ研究所製）の他、ＣＧＴａｓｅおよびα−アミラーゼを澱粉に反応させて得られた澱粉部分分解物、澱粉水解物由来の成分であるグルコース，マルトース，トレハロース，パノース，マルトヘキサオース（Ｇ６）、ＤＥ２〜４０のデキストリンの各糖質１％水溶液５ｍＬを加えて、その呈色変化を目視で観察した。
澱粉部分分解物及び各糖質については、以下の方法により得た。即ち、市販酵素ＣＧＴａｓｅ（商品名：コンチザイム、天野エンザイム株式会社製、液状６００ＴＨＵ／ｍｌ）を酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１００倍希釈した酵素溶液、および市販酵素アミラーゼ（商品名：アミラーゼＡＤ［アマノ］１、天野エンザイム株式会社製、１０，０００Ｕ／ｇ粉末 糊精化力測定天野法）の０．１ｍｇ／１０ｍＬ 酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）の酵素溶液各５０μＬを馬鈴薯澱粉１５０ｍｇ／５ｍＬ同緩衝液に添加した酵素溶液を、それぞれ４５℃で、１、６または１２時間作用させて、澱粉部分分解物および各糖質を得た。
その結果、β−、γ−ＣＤ溶液で暗褐色（くすんだ褐色：ＤＢｒ）から褐橙色（鮮明な褐色：ＢＢｒ）になり明確に判別することができた。
しかし、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉他、非処理または天然澱粉は本呈色変化を示さなかった。また、澱粉水解物由来の成分であるグルコース，マルトース，トレハロース，パノース，マルトヘキサオース（Ｇ６）などは呈色変化を示さなかった。
澱粉部分分解物は、酵素反応初期の反応物でも本呈色変化を示し、またＤＥ２〜４０までのデキストリンでも本呈色変化を示すことから、極く僅かに部分水解した澱粉分解物でもβ−、γ−ＣＤと同様に呈色変化する一方、高度に加水分解したデキストリンでも、その中にある程度長鎖のデキストリンの存在により呈色変化するものと推測される。
澱粉部分分解物は、酵素反応初期の反応物でも本呈色変化を示し、またＤＥ２〜４０までのデキストリンでも本呈色変化を示すことから、極く僅かに部分水解した澱粉分解物でもβ−、γ−ＣＤと同様に呈色変化する一方、高度に加水分解したデキストリンでも、その中にある程度長鎖のデキストリンの存在により呈色変化するものと推測される。
以上の実施例の結果から明らかなように、各種のｐＨ指示薬を特定のｐＨ条件下で被検試料に加えることにより、呈色変化を示すことが明らかとなり、各種糖質製品に含まれるＣＤや澱粉部分分解物等の糖質を検出することができた。
実施例１０（試験紙）
東洋濾紙Ｎｏ．４０を２×５ｃｍの大きさに切り、実施例６のメタクレゾールパープル−リン酸緩衝液を漬け、風乾して試験紙を作製した。
この試験紙にＣＤを含む溶液と、対照試験としてマルトース溶液を滴下して呈色変化を比較したところ、対照試験区は紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）へ色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のβ、γ−ＣＤの検出ができることが明らかとなった。
本実施例の結果と実施例４〜９の結果を勘案すると、他のｐＨ指示薬および緩衝液の組み合わせにおいても同様に、各種ＣＤ、澱粉分解物等の糖質を検出できることが明らかとなった。
東洋濾紙Ｎｏ．４０を２×５ｃｍの大きさに切り、実施例６のメタクレゾールパープル−リン酸緩衝液を漬け、風乾して試験紙を作製した。
この試験紙にＣＤを含む溶液と、対照試験としてマルトース溶液を滴下して呈色変化を比較したところ、対照試験区は紫色（Ｐｕ）から青色（Ｂｌ）へ色調が変化した。このような呈色変化から、被検試料中のβ、γ−ＣＤの検出ができることが明らかとなった。
本実施例の結果と実施例４〜９の結果を勘案すると、他のｐＨ指示薬および緩衝液の組み合わせにおいても同様に、各種ＣＤ、澱粉分解物等の糖質を検出できることが明らかとなった。
実施例１１（ＣＤ検出用培地）
ポテトデキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製）３．９ｇと、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ６．５に調整した９０ｍｌの０．２Ｍ リン酸緩衝液、各５ｍＬの０．１％ メチルオレンジ溶液とフェノールフタレイン溶液を混合して、加温溶解して作成したメチルオレンジ＋フェノールフタレイン緩衝液（ｐＨ６．５）のシャーレ平板上に、ＣＤ製品（商品名：Ｋ−１００、株式会社横浜国際バイオ研究所製）の１％溶液を５０μＬずつ４カ所に滴下し、室温で一夜放置した後の呈色変化を観察した。
その結果、橙色の背景に、黄色のハローが現れた。さらに、この呈色平板に１Ｎ ＮａＯＨを２ｍｌずつ均等に行き渡るように流し込んだ場合、背景は橙赤色でハローは黄色で、呈色変化は鮮明となった。一方、対照として、ＣＤの代わりに、１％マルトース溶液を５０μｌ滴下した場合は、呈色変化を示さなかった。
ポテトデキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製）３．９ｇと、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ６．５に調整した９０ｍｌの０．２Ｍ リン酸緩衝液、各５ｍＬの０．１％ メチルオレンジ溶液とフェノールフタレイン溶液を混合して、加温溶解して作成したメチルオレンジ＋フェノールフタレイン緩衝液（ｐＨ６．５）のシャーレ平板上に、ＣＤ製品（商品名：Ｋ−１００、株式会社横浜国際バイオ研究所製）の１％溶液を５０μＬずつ４カ所に滴下し、室温で一夜放置した後の呈色変化を観察した。
その結果、橙色の背景に、黄色のハローが現れた。さらに、この呈色平板に１Ｎ ＮａＯＨを２ｍｌずつ均等に行き渡るように流し込んだ場合、背景は橙赤色でハローは黄色で、呈色変化は鮮明となった。一方、対照として、ＣＤの代わりに、１％マルトース溶液を５０μｌ滴下した場合は、呈色変化を示さなかった。
実施例１２（ＣＧＴａｓｅ検出用培地）
ポテトデキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製）３．９ｇと、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ６．５に調整した９２．５ｍｌの０．２Ｍ リン酸緩衝液、７．５ｍＬの０．１％ メチルオレンジ溶液を混合して加温溶解し、シャーレ中に注いで橙色の平板を作成した。この平板上にＣＧＴａｓｅ（アマノエンザイム（株）製、Bacillus macerans由来の液体コンチザイム）０．０５％（ｗ／ｖ）溶液１滴を滴下し、室温で一夜放置後、肉眼観察したところ、滴下箇所が黄色に変化した。
ポテトデキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製）３．９ｇと、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を混合してｐＨ６．５に調整した９２．５ｍｌの０．２Ｍ リン酸緩衝液、７．５ｍＬの０．１％ メチルオレンジ溶液を混合して加温溶解し、シャーレ中に注いで橙色の平板を作成した。この平板上にＣＧＴａｓｅ（アマノエンザイム（株）製、Bacillus macerans由来の液体コンチザイム）０．０５％（ｗ／ｖ）溶液１滴を滴下し、室温で一夜放置後、肉眼観察したところ、滴下箇所が黄色に変化した。
実施例１３（検出用培地に後からｐＨ指示薬および緩衝液を流し込んだ場合）
実施例１１と同様に作成した平板を用い、これにＣＧＴａｓｅ産生菌を含む希薄な懸濁液を塗布し、２日間、４０℃で放置したところ、橙色の背景に黄色の細かいハローが現れた。この平板にさらに、０．１％ フェノールフタレイン溶液５００μＬと１．０Ｍ ＮａＯＨ溶液１．５ｍＬの混合液を、平板全体に流し込んだところ、コロニーは黄色のままで、背景は赤橙色になり呈色変化が明確になった。
実施例１１と同様に作成した平板を用い、これにＣＧＴａｓｅ産生菌を含む希薄な懸濁液を塗布し、２日間、４０℃で放置したところ、橙色の背景に黄色の細かいハローが現れた。この平板にさらに、０．１％ フェノールフタレイン溶液５００μＬと１．０Ｍ ＮａＯＨ溶液１．５ｍＬの混合液を、平板全体に流し込んだところ、コロニーは黄色のままで、背景は赤橙色になり呈色変化が明確になった。
実施例１４（澱粉部分分解酵素検出用培地）
ポテトデキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製）３．９ｇと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合してｐＨ５．０に調整した９２．５ｍｌの酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、７．５ｍｌの０．１％コンゴーレッド溶液を混合して加温溶解し、シャーレ中に注いで暗褐色の平板を作成した。この平板上に０．０５％（ｗ／ｖ）α−アミラーゼ（生化学工業（株））水溶液１滴を滴下し、室温で一夜放置後、肉眼観察したところ、滴下箇所が褐橙色に変化した。
ポテトデキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製）３．９ｇと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨと０．２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを混合してｐＨ５．０に調整した９２．５ｍｌの酢酸／酢酸Ｎａ緩衝液、７．５ｍｌの０．１％コンゴーレッド溶液を混合して加温溶解し、シャーレ中に注いで暗褐色の平板を作成した。この平板上に０．０５％（ｗ／ｖ）α−アミラーゼ（生化学工業（株））水溶液１滴を滴下し、室温で一夜放置後、肉眼観察したところ、滴下箇所が褐橙色に変化した。
実施例１５（ジェランガムを溶解した検出用培地）
馬鈴薯２００ｇを細かく砕いて、固形分を取り除き、そのエキス分と馬鈴薯澱粉１００ｇ、ショ糖２０ｇ、ジェランガム５ｇを溶解して作成した平板に、ＣＧＴａｓｅ産生菌を含む希薄な懸濁液を塗布し、２日間、４０℃で放置したところ、コロニーが現れた。この平板に、０．１％フェノールフタレイン溶液５００μＬと１．０Ｍ ＮａＯＨ溶液１．５ｍｌの混合液を平板全体に流し込んだところ、コロニーは無色で、背景は赤紫色になった。
馬鈴薯２００ｇを細かく砕いて、固形分を取り除き、そのエキス分と馬鈴薯澱粉１００ｇ、ショ糖２０ｇ、ジェランガム５ｇを溶解して作成した平板に、ＣＧＴａｓｅ産生菌を含む希薄な懸濁液を塗布し、２日間、４０℃で放置したところ、コロニーが現れた。この平板に、０．１％フェノールフタレイン溶液５００μＬと１．０Ｍ ＮａＯＨ溶液１．５ｍｌの混合液を平板全体に流し込んだところ、コロニーは無色で、背景は赤紫色になった。
実施例１６（寒天を溶解した検出用培地）
寒天（伊那寒天株式会社製）２ｇと０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合してｐＨ１９に調整した９０ｍＬのＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液、１０ｍｌの０．１％ フェノールフタレイン溶液と可溶性澱粉１ｇを混合してオートクレーブで加熱溶解し、粗熱をとった後、シャーレ中に注いで赤紫色の平板を作成した。この平板上にＣＤ製品（商品名：Ｋ−１００）の１％溶液５０μＬを４カ所に滴下し、室温で一夜放置すると、滴下箇所は無色に呈色変化した（図１）。一方、同平板に対照として１％マルトース溶液５０μＬを４カ所に滴下し、同様に室温で一夜放置すると、滴下箇所は呈色変化しなかった（図２）。
更に、同様にしてＣＧＴａｓｅ（アマノエンザイム（株）製、Bacillus macerans由来の液体コンチザイム）０．０５％（ｗ／ｖ）溶液５０μｌを滴下し、室温で一夜放置すると、滴下箇所が無色に変化した（図３）。一方、同平板に対照として失活処理したＣＧＴａｓｅ０．０５％（ｗ／ｖ）溶液５０μＬを４カ所に滴下し、同様に室温で一夜放置すると、滴下箇所は呈色変化しなかった（図４）。
寒天（伊那寒天株式会社製）２ｇと０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．１Ｍ ＮａＯＨを混合してｐＨ１９に調整した９０ｍＬのＮａＨＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液、１０ｍｌの０．１％ フェノールフタレイン溶液と可溶性澱粉１ｇを混合してオートクレーブで加熱溶解し、粗熱をとった後、シャーレ中に注いで赤紫色の平板を作成した。この平板上にＣＤ製品（商品名：Ｋ−１００）の１％溶液５０μＬを４カ所に滴下し、室温で一夜放置すると、滴下箇所は無色に呈色変化した（図１）。一方、同平板に対照として１％マルトース溶液５０μＬを４カ所に滴下し、同様に室温で一夜放置すると、滴下箇所は呈色変化しなかった（図２）。
更に、同様にしてＣＧＴａｓｅ（アマノエンザイム（株）製、Bacillus macerans由来の液体コンチザイム）０．０５％（ｗ／ｖ）溶液５０μｌを滴下し、室温で一夜放置すると、滴下箇所が無色に変化した（図３）。一方、同平板に対照として失活処理したＣＧＴａｓｅ０．０５％（ｗ／ｖ）溶液５０μＬを４カ所に滴下し、同様に室温で一夜放置すると、滴下箇所は呈色変化しなかった（図４）。
本発明の検出方法によれば、特定のｐＨ指示薬およびｐＨ緩衝液の組み合わせにより、α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ等のＣＤの他、澱粉部分分解物を極めて簡便に検出できるので、ＣＤ関連研究に幅広く利用できる。
また、本発明の試験紙は、ＣＤや澱粉部分分解物を極めて簡便に検出できる上に、その保存、取り扱い等の煩雑さも解消され、糖質の予備的な一般分析用として利用できる。
また、本発明の試験紙は、ＣＤや澱粉部分分解物を極めて簡便に検出できる上に、その保存、取り扱い等の煩雑さも解消され、糖質の予備的な一般分析用として利用できる。
さらに、本発明の検出用培地は、ＣＤや澱粉部分分解物を極めて簡便に検出できるので、培地と培養条件を適切に選択すれば、ＣＧＴａｓｅや澱粉部分分解酵素、およびこれらの酵素産生菌の一次スクリーニングに用いることができる。特に、本発明の検出用培地により食品として望ましい安全な微生物がスクリーニングされれば、これを食品として利用する可能性を拓くことができるので、食品産業において極めて有用である。
Claims (9)
- ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルイエローを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のα−サイクロデキストリンを検出する方法。
- ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびメチルオレンジを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のα−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、並びにγ−サイクロデキストリンを検出する方法。
- ｐＨ領域９〜１１の緩衝液およびメタクレゾールパープルを被検試料に加え、その呈色変化から、被検試料中のβ−サイクロデキストリンおよびγ−サイクロデキストリンを検出する方法。
- ｐＨ領域４〜８の緩衝液およびメチルレッドを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のγ−サイクロデキストリンを検出する方法。
- ｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびブロモクレゾールグリーンを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のγ−サイクロデキストリンを検出する方法。
- ｐＨ領域４〜６の緩衝液およびコンゴーレッドを被検試料に加え、その呈色変化から被検試料中のβ−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリンまたは澱粉部分分解物を検出する方法。
- 請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせを濾紙に含ませてなる、サイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用試験紙。
- 請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせ、並びに可溶性澱粉または澱粉を濾紙に含ませてなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素の検出用試験紙。
- 請求項１〜６のいずれかに記載の緩衝液およびｐＨ指示薬の組み合わせ、および／またはｐＨ領域４〜１１の緩衝液およびフェノールフタレインの組み合わせと、可溶性澱粉または澱粉と、サイクロデキストリン合成酵素または澱粉部分分解酵素産生能を有する微生物の培養用培地、並びに寒天またはジェランガムとを混合してなるサイクロデキストリン合成酵素および／または澱粉部分分解酵素、或いはサイクロデキストリンおよび／または澱粉部分分解物の検出用培地。
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| JP2003361433A JP2005127759A (ja) | 2003-10-22 | 2003-10-22 | ｐＨ指示薬を利用した糖質の検出方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101247642B1 (ko) | 2011-06-28 | 2013-04-01 | 동국대학교 산학협력단 | 시간-온도 지시계, 시간-온도 지시계의 제조방법, 시간-온도 지시계를 이용한 품질보증 시스템 및 품질보증 시스템을 이용한 품질보증 방법 |
| WO2014065191A1 (ja) * | 2012-10-25 | 2014-05-01 | 学校法人 福岡大学 | 感染評価系モデル |
-
2003
- 2003-10-22 JP JP2003361433A patent/JP2005127759A/ja active Pending
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