JP5948139B2 - サーチュイン１（ｓｉｒｔ１）遺伝子活性化剤 - Google Patents

Description

本発明は、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤に関する。

サーチュインは、SIRT1〜7からなる脱アセチル化酵素である。近年、サーチュインの機能に関する研究が盛んになり、特に、サーチュイン１（SIRT1）は、抗老化作用、糖尿病改善作用、心血管保護作用、腎疾患改善作用、炎症性サイトカイン産生の抑制作用、神経保護作用等、様々な機能を有することが明らかになった。
これらのSIRT1脱アセチル化活性を増強する因子として、レスベラトロールやケルセチンなどの化合物が開発され、抗老化剤（アンチ・エージング剤）、糖尿病治療薬、心血管疾患治療薬、神経系疾患治療薬、抗炎症剤などに利用すべく、活発な研究が行われている（例えば、非特許文献１参照）。

実験医学 ２０１０年２８巻１９号 ３０６８−３０７６頁

本発明は、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤を提供することを目的とする。

本発明の一実施形態は、下記式で表されるトロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有するサーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤である。

（式中、R₁〜R₄基は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アラケニル、アラルシニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、及びヘテロアラルキニル基からなる群から選択される。）上記トロポロンまたはその誘導体が、トロポロン、α−ツヤプリシン、β−ツヤプリシン、γ−ツヤプリシン、ITM-109、ITM-110、ITM-111からなる群より選択されてもよい。
本発明の他の実施形態は、アンチ・エージング剤、糖尿病治療剤及び予防剤、心血管疾患治療剤及び予防剤、神経系疾患治療剤及び予防剤、腎疾患治療剤及び予防剤、並びに抗炎症剤のうちのいずれか１つ以上として用いられる医薬であって、上記トロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有する。前記糖尿病が２型糖尿病であってもよく、前記心血管疾患が心筋梗塞または動脈硬化であってもよく、前記神経系疾患が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、または認知症であってもよく、前記腎疾患が、ネフローゼまたは腎機能障害であってもよく、前記炎症が、肺炎、肝炎、膵炎、または潰瘍性大腸炎などの大腸炎であってもよい。この医薬は、皮膚外用剤であってもよい。

本発明の他の実施形態は、上記トロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有するNF-kappaB阻害剤である。

本発明の他の実施形態は、上記トロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有するアンチ・エージング用化粧品である。この化粧品は、塗布剤であってもよい。

本発明の他の実施形態は、上記トロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有し、他のサーチュイン１（SIRT1）活性化剤と併用されることを特徴とするサーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤である。

本発明の他の実施形態は、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化能を調べる方法であって、トロポロン骨格を有する化合物が、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化能を有するかどうかを調べる工程を含む。また、本発明の他の実施形態は、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子の活性化物質をスクリーニングする方法であって、一以上のトロポロン骨格を有する化合物が、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化能を有するかどうかを調べる工程と、前記転写活性化能を有する化合物を、前記活性化物質として特定する工程と、を含む。これらの方法において、トロポロン骨格を有する化合物が、上記トロポロンまたはその誘導体であってもよい。

なお、本明細書で、SIRT1活性と称する場合、SIRT1脱アセチル化活性を意味するものとする。

本発明によって、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤を提供することが可能になった。

本発明のサーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤に含まれるトロポロン及びその誘導体の例を構造式で表した図である。 本発明のサーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤に含まれるトロポロン誘導体comp-01〜16を構造式で表した図である。 本発明のサーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤に含まれるトロポロン誘導体comp-17〜30を構造式で表した図である。 本発明の一実施例において、トロポロン及びその誘導体のSIRT1遺伝子プロモーター活性化能を測定した結果を示すグラフである。 本発明の一実施例において、β−ツヤプリシンのSIRT1遺伝子プロモーター活性化能について、その濃度依存性効果を調べた結果を示すグラフである。

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

（１）トロポロン及びその誘導体
本発明のサーチュイン１（SIRT1）遺伝子活性化剤に含まれる化合物は、トロポロン及びその誘導体であって、例えば、下記式で表されるものである。

（式中、R₁〜R₄基は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アラケニル、アラルシニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、及びヘテロアラルキニル基からなる群から選択される。）

上記式中で、アルキル基、アルケニル基、及び、アルキニル基の炭素数は、特に限定されないが、１〜６個であることが好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがさらに好ましい。例えば、C_1-4アルキル基として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、及び、ｔ−ブチル基が挙げられ、C_1-4アルケニル基として、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、及び、２−メチルアリル基が挙げられ、そして、C_1-4アルキニル基として、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、及び、３−ブチニル基が挙げられる。また、アリール基、並びに、アラルキル基、アラケニル基、及び、アラキニル基が含有するアリール基の炭素数は、特に限定されないが、６〜１８個であることが好ましく、６〜１０個であることがより好ましく、６個であることがさらに好ましい。例えば、C_6-10アリール基として、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アズレニル基、２−アズレニル基、４−アズレニル基、５−アズレニル基、及び、６−アズレニル基が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基、並びに、ヘテロアラルキル基、ヘテロアラケニル基、及び、ヘテロアラキニル基が含有するヘテロアリール基の炭素数とヘテロ原子数との合計値は、特に限定されないが、５〜１８個であることが好ましく、５〜１０個であることがより好ましく、９個であることがさらに好ましい。例えば、このようなヘテロアリール基として、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、１−ピロリル基、２−ピロリル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、１−インドール基、２−インドール基、３−インドール基、４−インドール基、５−インドール基、６−インドール基、７−インドール基、１−イソインドール基、２−イソインドール基、３−イソインドール基、４−イソインドール基、５−イソインドール基、６−イソインドール基、７−イソインドール基、１−インドリジン基、２−インドリジン基、３−インドリジン基、５−インドリジン基、６−インドリジン基、７−インドリジン基、８−インドリジン基、２−キノリン基、３−キノリン基、４−キノリン基、５−キノリン基、６−キノリン基、７−キノリン基、８−キノリン基、１−イソキノリン基、３−イソキノリン基、４−イソキノリン基、５−イソキノリン基、６−イソキノリン基、７−イソキノリン基、及び、８−イソキノリン基が挙げられるが、これらに限定されない。上述したアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラケニル基、アラキニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアラルキル基、ヘテロアラケニル基、及び、ヘテロアラキニル基は、置換基で置換されていても良く、置換されていなくても良い。置換基の種類は、特に限定されないが、上述のC_1-4アルキル基、アミノ基、アセトアミド基、または、ベンズアミド基であることが好ましい。

トロポロン（２−ヒドロキシ−２,４,６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、α−ツヤプリシン（２−ヒドロキシ−３−イソプロピル−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、β−ツヤプリシン（ヒノキチオール；または２−ヒドロキシ−４−イソプロピル−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、γ−ツヤプリシン（２−ヒドロキシ−５−イソプロピル−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ITM-109、ITM-110、ITM-111、comp-01〜30が好ましく、図１及び図２には、それらの構造式が示されている。

それら化合物の製造方法は、公知の方法を用いればよく、例えば、ヒバの材部を水蒸気蒸留して得られる精油であるヒバ油から分離してもよく、工業的には、シクロペンタジエンを出発原料とし、これにイソプロピル化剤を反応させてイソプロピルシクロペンタジエンを得、更にジクロロケテンを反応させてケテン付加体を得、これを加溶媒分解して得た粗トロポロン化合物の混合物を精製してトロポロン化合物混合物とし、これから目的のトロポロン化合物を分離してもよい。

例えば、ヒノキチオールの場合、シクロペンタジエンとアルカリ金属とからシクロペンタジエニル金属を調製する工程、得られたシクロペンタジエニル金属とイソプロピル化剤とを反応させて、イソプロピルシクロペンタジエンを取得する工程、得られたイソプロピルシクロペンタジエン中の５−イソプロピルシクロペンタジエンを１−イソプロピルシクロペンタジエンへ選択的に異性化する工程、得られた１−イソプロピルシクロペンタジエンとジハロケテンとを反応させてケテン付加体を得る工程、及び得られたケテン付加体を分解する工程、からなるヒノキチオールの製造方法が開示されている（米国特許第6310255号明細書）

（２）SIRT1遺伝子活性化剤
トロポロン及びその誘導体は、SIRT1遺伝子の発現を活性化することができるので、薬品組成物（医薬品組成物及び試薬品組成物）、食品組成物、または化粧品組成物として利用することができ、これら組成物を剤形化することにより、SIRT1遺伝子活性化剤として使用することができる。なお、本明細書で「遺伝子活性化」というのは、「遺伝子発現増強」と同義であるとする。ここで、SIRT1遺伝子の由来は、ヒトであっても、ヒト以外のほ乳類であっても良い。

SIRT1は、老化予防（アンチ・エージング）作用、糖尿病改善作用、心血管保護作用、腎疾患改善作用、炎症性サイトカイン産生の抑制作用、神経保護作用等、様々な機能を有するため、生体内で、SIRT1遺伝子を活性化し、SIRT1の体内濃度を上げることによって、抗老化作用、糖尿病改善作用、心血管保護作用、炎症性サイトカインの抑制作用、神経保護作用等を発揮させることができる。従って、トロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有するSIRT1遺伝子活性化剤は、アンチ・エージング（老化予防）剤、糖尿病治療剤及び予防剤、心血管疾患治療剤及び予防剤、神経系疾患治療剤及び予防剤、腎疾患治療剤及び予防剤、並びに抗炎症剤などに使用することができる。具体的な対象疾患としては、例えば、２型糖尿病などの糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞などの心血管疾患、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、または認知症などの神経系疾患、ネフローゼまたは腎機能障害などの腎疾患、肺炎、肝炎、膵炎、潰瘍性大腸炎などの様々な炎症性疾患などを挙げることができる。特に、これらの対象疾患が、同時に複数生じるような、多臓器（心臓、肝臓、膵臓、腎臓など）の機能低下による全身性の疾患である「老年病」に対して有効に作用し、複数の疾患を一元的に治療または予防できるという点で、極めて有効である。このように、トロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有するSIRT1遺伝子活性化剤は、高齢者医療のあり方を根本的に変えることが期待される。

なお、SIRT1は、NF-kappaB抑制作用を有するため、トロポロン及びその誘導体は、NF-kappaB抑制剤としても用いることができる。トロポロン及びその誘導体は、NF-kappaB抑制を通じて、ＮＯシグナルを活性化し、TNF-alfa、ICAM-1、IL-6、IL-1などの炎症性サイトカインや誘導型NOS(i-NOS)を抑制することができるので、心血管保護作用や抗炎症作用の少なくとも一部は、このNF-kappaB抑制作用によるものと考えられる。

（３）トロポロン及びその誘導体の用途
トロポロン及びその誘導体は、薬品組成物（医薬品組成物及び試薬品組成物）、飲食品組成物、または化粧品組成物などに用いることができ、それぞれ、当業者に周知の方法を用いて、飲食品、薬品（医薬及び試薬）、化粧品を製造するのに使用することができる。これらの組成物の原料として、事実上純化されたトロポロンまたはその誘導体を用いても良いが、不純物が混入したヒバ油などの抽出物を用いても良い。ここで、ヒバ油の由来である樹木は、トロポロンまたはその誘導体を含有するヒノキ科の植物であれば特に限定されないが、特にヒノキチオールを多量に含有する青森産ヒバが好ましい。

トロポロンまたはその誘導体を含有する飲食品としては、特に制限はないが、簡便性からは、添加物として、既存の飲食品に添加するのが好ましい。なお、トロポロンまたはその誘導体を含有する飲食品を製造するに当たって、通常用いられる他の添加物などを使用してもよい。

飲食品としてのトロポロンまたはその誘導体は、SIRT1遺伝子活性化効果を有する、サプリメント、栄養補助食品、健康補助食品、機能性食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品などとして用いることも可能であるが、特に、サプリメントや補助食品として用いることが好ましい。飲食品としては、例えば、チョコレート、ビスケット、ガム、キャンディー、クッキー、グミ、打錠菓子等の菓子類、シリアル、粉末飲料、清涼飲料、乳飲料、栄養飲料、炭酸飲料、ゼリー飲料等の飲料、アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓が挙げられる。また、特定保健用食品や栄養補助食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット、糖衣錠等いずれの形態であってもよい。

トロポロンまたはその誘導体を含有する医薬としては、（２）に記載した疾患のいずれをも対象にすることができる。医薬の製造は、当業者に周知の方法を用いればよく、形状は特に限定されず、錠剤、カプセル、袋詰め、シロップ、坐薬、瓶詰め、軟膏、クリーム、スプレー、ローションなどでもよいが、いずれの形状であっても皮膚外用薬であることが好ましい。

トロポロンまたはその誘導体を含有する試薬は、in vitroまたはin vivoにおける様々な研究用試薬として用いることもできる。その目的は限定されず、例えば、医薬開発であってもよく、基礎研究であってもよい。また、用いる対象も限定されず、例えば、細胞から抽出したものであっても、細胞であっても、生体であってもよい。

また、トロポロンまたはその誘導体を含有し、それによってSIRT1遺伝子活性化効果を有する化粧品を製造することもできるが、その形状は特に制限されず、乳化剤、ゲル、ローションまたは粉末等が挙げられるが、いずれの形状であっても塗布剤であることが好ましい。その化粧料には、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、化粧料の製造に通常使用される各種主剤及び助剤、その他の成分を使用することができる。

（４）SIRT1活性化剤とSIRT1遺伝子活性化剤の併用
SIRT1のより強い活性を得るためには、SIRT1活性化剤とSIRT1遺伝子活性化剤を併用すればよい。メカニズムの異なる薬剤を併用することによって、SIRT1の効果は相乗的に増強されるからである。例えば、SIRT1遺伝子活性化剤である、トロポロンまたはその誘導体と、SIRT1活性化剤である、レスベラトロール、ケルセチン、プテイン、ピロロキノザリン、オキサゾロピリジン、またはＳＲＴ１７２０との併用が考えられる。
ここで、SIRT1活性化剤とSIRT1遺伝子活性化剤は、単剤として併用してもよく、複合剤として併用しても良い。単剤として併用する場合、SIRT1活性化剤とSIRT1遺伝子活性化剤を同時に投与するのが好ましいが、「同時」とは、時間的に全く同じであっても同じでなくてもよく、一方の効果がある間に、他方を投与することを意味する。

（５）飲食品、薬品（医薬及び試薬）、及び化粧品の使用方法
トロポロンまたはその誘導体を含有する飲食品は、ヒトの食事またはヒト以外の哺乳類のための食餌であって、通常の食事や食餌と同様に、飲んだり食べたりすることができる。補助食品としては、通常の食事や食餌以外に、定期的に適量を摂取しても良い。なお、飲食するヒトやヒト以外の哺乳類は、健常体（本明細書では、（２）に記載の疾患のいずれにも罹患していないヒトを意味する。他の疾患に罹患していてもよい。）であっても、（２）に記載の疾患に罹患している患者でもよい。
トロポロンまたはその誘導体を含有する医薬品の投与対象は、（２）に記載の疾患に罹患したヒトまたはヒト以外の哺乳類である。投与方法は限定されず、経口であっても非経口であっても、全身投与であっても局部投与であってもよいが、吸収性の点から経皮投与であることが好ましい。
トロポロンまたはその誘導体を含有する試薬品は、ヒト以外の哺乳類生体内などのin vivoでも、培養細胞や培養組織などのin vitroでも用いることができる。
トロポロンまたはその誘導体を含有する化粧品は、通常の化粧品と同様に使用できる。使用するヒトは、健常体であっても、（２）に記載の疾患のいずれかに罹患している患者でもよいが、本化粧品はアンチ・エージング用に用いられることが好ましい。

（６）SIRT1遺伝子を活性化する化合物のスクリーニング方法
実施例で示すように、α−ツヤプリシン、β−ツヤプリシン、γ−ツヤプリシン、ITM-109、ITM-110、ITM-111は、SIRT1遺伝子を活性化することができるので、トロポロン骨格を有する化合物は、SIRT1遺伝子を活性化する可能性が高いと考えられる。従って、SIRT1遺伝子を活性化する化合物を得ようとすると、トロポロン骨格を有する化合物について、SIRT1遺伝子の転写活性化能を有するかどうかを調べるほうが、他の化合物を調べるより、そのような化合物を容易に得ることができる。

そこで、SIRT1遺伝子を活性化する化合物をスクリーニングするには、まず、一以上のトロポロン骨格を有する化合物が、SIRT1遺伝子の転写活性化能を有するかどうかを調べるのがよい。このためのアッセイ系はin vivoでもin vitroでもよく、特に限定されないが、簡便さの点からは、培養細胞を用いて、SIRT1遺伝子のプロモーターを導入したレポータープラスミドを利用したレポーターアッセイを行うのが好ましい。そして、転写活性化能を有する化合物が得られれば、それを活性化物質として特定し、その後、α−ツヤプリシン、β−ツヤプリシン、γ−ツヤプリシン、ITM-109、ITM-110、ITM-111などと同様に、SIRT1遺伝子活性剤として、本明細書で述べた用途に用いることができる。

なお、トロポロン骨格を有する化合物とは、トロポロンを骨格として有する化合物全てを指すものとする。そして、本方法で用いる化合物は、トロポロン骨格を有する化合物であれば限定されないが、下記式で表される化合物であることが好ましい。

（式中、R₁〜R₄基は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アラケニル、アラルシニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、及びヘテロアラルキニル基からなる群から選択される。）

上記式中で、アルキル基、アルケニル基、及び、アルキニル基の炭素数は、特に限定されないが、１〜６個であることが好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがさらに好ましい。例えば、C_1-4アルキル基として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、及び、ｔ−ブチル基が挙げられ、C_1-4アルケニル基として、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、及び、２−メチルアリル基が挙げられ、そして、C_1-4アルキニル基として、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、及び、３−ブチニル基が挙げられる。また、アリール基、並びに、アラルキル基、アラケニル基、及び、アラキニル基が含有するアリール基の炭素数は、特に限定されないが、６〜１８個であることが好ましく、６〜１０個であることがより好ましく、６個であることがさらに好ましい。例えば、C_6-10アリール基として、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アズレニル基、２−アズレニル基、４−アズレニル基、５−アズレニル基、及び、６−アズレニル基が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基、並びに、ヘテロアラルキル基、ヘテロアラケニル基、及び、ヘテロアラキニル基が含有するヘテロアリール基の炭素数とヘテロ原子数との合計値は、特に限定されないが、５〜１８個であることが好ましく、５〜１０個であることがより好ましく、９個であることがさらに好ましい。例えば、このようなヘテロアリール基として、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、１−ピロリル基、２−ピロリル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、１−インドール基、２−インドール基、３−インドール基、４−インドール基、５−インドール基、６−インドール基、７−インドール基、１−イソインドール基、２−イソインドール基、３−イソインドール基、４−イソインドール基、５−イソインドール基、６−イソインドール基、７−イソインドール基、１−インドリジン基、２−インドリジン基、３−インドリジン基、５−インドリジン基、６−インドリジン基、７−インドリジン基、８−インドリジン基、２−キノリン基、３−キノリン基、４−キノリン基、５−キノリン基、６−キノリン基、７−キノリン基、８−キノリン基、１−イソキノリン基、３−イソキノリン基、４−イソキノリン基、５−イソキノリン基、６−イソキノリン基、７−イソキノリン基、及び、８−イソキノリン基が挙げられるが、これらに限定されない。上述したアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラケニル基、アラキニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアラルキル基、ヘテロアラケニル基、及び、ヘテロアラキニル基は、置換基で置換されていても良く、置換されていなくても良い。置換基の種類は、特に限定されないが、上述のC_1-4アルキル基、アミノ基、アセトアミド基、または、ベンズアミド基であることが好ましい。

（１）トロポロン誘導体の合成
ITM-109〜111は、下式に従い、以下のように合成した。

ITM-109 の合成方法
5-ブロモトロポロン溶液にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）を加えた後、インド−ル-6-ボロン酸溶液に炭酸セシウムを加えた溶液を混合し、120℃で攪拌した。その後、ジオキサンで前処理したカラムに有機層を通した。流出液を回収し、カラムをジオキサン洗浄した後、流出液と洗浄液を合わせて濃縮した。濃縮後、LC/MS で精製し、11.0 mgのITM-109（LC/MS 純度98.6 %）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ11.23 (1H, s), 7.72 (2H, d, J = 11.9), 7.63 (1H, d, J = 8.3), 7.57 (1H, d, J = 0.9), 7.43 (1H, m), 7.32 (2H, d, J = 11.9), 7.22 (1H, dd, J = 1.7, 8.3), 6.47 (1H, m), 3.34 (1H, brs)

ITM-110 の合成方法
5-ブロモトロポロン溶液にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）を加えた後、3-アセトアミドフェニルボロン酸溶液に炭酸セシウムを加えた溶液を混合し、120℃で攪拌した。その後、ジオキサンで前処理したカラムに有機層を通した。流出液を回収し、カラムをジオキサン洗浄した後、流出液と洗浄液を合わせて濃縮した。濃縮後、LC/MS で精製し、13.5 mgのITM-110（LC/MS 純度100 %）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ10.08 (1H, s), 7.83 (1H, s), 7.59 (3H, m), 7.33 (4H, m), 3.37 (1H, brs), 3.25 (3H, s)

ITM-111 の合成方法
5-ブロモトロポロン溶液にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）を加えた後、3-メチルフェニルボロン酸溶液に炭酸セシウムを加えた溶液を混合し、80℃で攪拌した。その後、ジオキサンで前処理したカラムに有機層を通した。流出液を回収し、カラムをジオキサン洗浄した後、流出液と洗浄液を合わせて濃縮した。濃縮後、LC/MS で精製し、16.0 mgのITM-111（LC/MS 純度95.8 %）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD): δ7.71 (2H, d, J = 11.9), 7.37 (5H, m), 7.20 (1H, m), 2.38 (3H, s)

（２）サーチュイン１（SIRT1）遺伝子のプロモーターを用いたルシフェラーゼアッセイ
まず、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドpGL4.10[Luc2]（Promega社）を制限酵素Kpn Iと制限酵素Xho Iで消化し、そのサイトに、NT_030059.13中の20448573番から20448961番までのヒトSIRT1遺伝子プロモーターに相当する塩基配列または、NT_006576.16中の1285126番から1285385番までのヒトTERT遺伝子プロモーターに相当する塩基配列を挿入することによって、SIRT1遺伝子プロモーターまたはTERT遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポータープラスミドを作成した。

次に、培養液に１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）を用いて、HeLa S3細胞を１０ｃｍディッシュに2x10⁶個播種し、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で、２４時間培養した。この細胞に、各レポータープラスミドを４μｇ、「FuGENE ＨＤトランスフェクション試薬」（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて導入した。さらに、２４時間培養した後、細胞を回収し、1x10^４個／ｍＬになるように同じ培養液に懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６穴ディッシュに播種した。その後２４時間培養した後、α−ツヤプリシン、β−ツヤプリシン、γ−ツヤプリシン、ITM-109、ITM-110、ITM-111（構造式は図１参照）をそれぞれ最終濃度３０μＭで含有した培養液、またはこれらのトロポロン誘導体を含有しない培養液（コントロール）に置換し、さらに２４時間培養した。そして、培養液を除去した後、溶解用試薬「Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ」（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３０μＬ／ウェル添加し、３回凍結融解を繰り返した後、細胞溶解液を回収し、遠心分離で残渣を除去し、上清を回収した。得られた上清２０μＬに対し、「ルシフェラーゼアッセイ試薬（ＩＩ）」（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１００μＬ加え、発光強度を測定した。その結果を図３に示す。

さらに、β−ツヤプリシンについては、最終濃度を１、３、１０、３０、１００μＭとし、β−ツヤプリシンの濃度依存性効果を調べた。その結果を図４に示す。

（３）結果
図３に示すように、ここで用いたトロポロン誘導体は全て（１．５倍から２．２倍程度）、SIRT1遺伝子の転写活性を増強した。このように、トロポロン及びその誘導体は、SIRT1遺伝子の転写活性化剤として有効である。
また、図４に示すように、この転写増強活性は、β−ツヤプリシンの濃度に依存的に増強した。従って、当業者は、トロポロン及びその誘導体の濃度を適宜選択することにより、その転写増強活性をコントロールすることができ、目的の転写増強活性を得ることが可能になる。

Claims (4)

1. トロポロンまたはその誘導体を有効成分として含有する、in vitroで用いられるサーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化剤であって、前記トロポロンまたはその誘導体が、トロポロン、α−ツヤプリシン、β−ツヤプリシン、γ−ツヤプリシン、並びに下記式で表されるITM-109、ITM-110、及びITM-111からなる群より選択される、サーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化剤。
   
2. サーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化能を調べる方法であって、
   トロポロン骨格を有する化合物が、in vitroでサーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化能を有するかどうかを調べる工程を含む方法。
3. サーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化物質をスクリーニングする方法であって、
   一以上のトロポロン骨格を有する化合物が、in vitroでサーチュイン１（SIRT1）遺伝子の転写活性化能を有するかどうかを調べる工程と、
   前記転写活性化能を有する化合物を、前記転写活性化物質として特定する工程と、
   を含む方法。
4. 前記トロポロン骨格を有する化合物が、下記式で表されるトロポロンまたはその誘導体である、請求項２または３に記載の方法。
   （式中、R₁〜R₅基は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アラケニル、アラルシニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、及びヘテロアラルキニル基からなる群から選択される。）