JP5941405B2 - 薄層クロマトグラフィーによる試料の検出方法、薄層クロマトグラフィープレート、及びその製造方法 - Google Patents

薄層クロマトグラフィーによる試料の検出方法、薄層クロマトグラフィープレート、及びその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性が異なる二種の分離剤層を有する薄層クロマトグラフィープレート（以下、「ＴＬＣプレート」とも言う）、その製造方法、及びその使用方法に関する。
混合物中から特定の成分を分離、検出する方法としては、薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」とも言う）が知られている。ＴＬＣによる成分の分離は、例えば、分離剤層と検出対象成分との光学的な応答性の相違に基づいて、試料の展開によるスポットへの紫外線の照射や発色試薬の発色処理によって検出される。
一方で、光学異性体用分離剤には、多糖のフェニルエステル等の多糖誘導体を含有する分離剤が知られている。このような芳香族環を含む分離剤は、ＴＬＣプレートの分離剤層に用いた場合、紫外線の照射や発色試薬の発色処理では検出対象成分を検出することができないことがある。
このようなＴＬＣプレートとしては、例えば、平板上の支持体の一部表面に光学分割用充填剤層を設けてなるＴＬＣプレートが知られている（例えば、特許文献１参照。）。このＴＬＣプレートでは、光学分割用充填剤層とシリカゲル系充填剤層とを一枚の支持体の表面に形成し、光学分割用充填剤層で分離した成分（スポット）をさらにシリカゲル系充填剤層まで展開させ、シリカゲル系充填剤層において紫外線を照射し、又は発色試薬の発色処理を行うことによって、検出対象成分が検出される。
このＴＬＣプレートでは、光学分割用充填剤層により吸着されやすいエクストラクト成分は、該充填剤層により吸着されにくいラフィネート成分に比べて、光学分割用充填剤層からシリカゲル系充填剤層へ十分に移動せず、シリカゲル系充填剤層で十分に検出することができないことがあり、光学分割用充填剤層での分離状態を確認することができないことがある。このため前記のＴＬＣプレートは、カラムクロマトグラフィー等の他のクロマトグラフィーによる光学分割の条件の検討の用途では必要な情報を得ることができないことがあり、このような点について検討の余地が残されている。
特許第３１４０１３８号公報
本発明は、光学的な応答では試料中の成分の分離を検出することができない分離剤層による試料中の成分の分離を検出することが可能なＴＬＣプレート及びＴＬＣを提供する。
本発明者らは、紫外線や発色試薬に対する光学応答性を有する分離剤のＴＬＣでの使用を鋭意検討し、特定の前記光学応答性を有する第一の分離剤層での展開によるスポットを、この展開方向とは異なる方向に展開させ、第一の分離剤層に隣接する、前記の光学応答性を有さない第二の分離剤層までさらに展開させることによって、第一の分離剤層での展開方向におけるスポットの位置関係を第二の分離剤層において保存する方法を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、第一の分離剤層とこれに隣接する第二の分離剤層とを有するＴＬＣプレートを用いて、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する試料中の成分を検出する方法であって、第一の分離剤層において、第一及び第二の分離剤層の境界に沿う方向へ試料を展開させる工程と、少なくとも第二の分離剤層の移動相を乾燥させる工程と、前記ＴＬＣプレートの向きを変えて第一の分離剤層におけるスポットを第二の分離剤層に展開させる工程と、第二の分離剤層に移動したスポットを紫外線の照射又は発色試薬の発色処理によって検出する工程と、を含み、第一の分離剤層は、前記光学応答性を有する第一の分離剤で形成され、第二の分離剤層は、第一の分離剤とは異なる前記光学応答性を有する第二の分離剤で形成され、前記成分の光学応答性が、第一の分離剤の光学応答性と同じである方法を提供する。
また本発明は、第一の方向を展開方向とする第一の分離剤層と、第一の方向に直交する第二の方向において第一の分離剤層に隣接する第二の分離剤層とを有するＴＬＣプレートにおいて、第一の分離剤層が、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する第一の分離剤で形成され、第二の分離剤層が、第一の分離剤とは異なる前記光学応答性を有する第二の分離剤で形成され、第一の分離剤層で第一の方向にスポットを展開させたときに、第一の分離剤層での第一の方向におけるスポットの移動距離Ｗ１に対する、第一の分離剤層での第二の方向におけるスポットの移動距離Ｗ２の比が±０．５以下となるＴＬＣプレートを提供する。
また本発明は、第一の分離剤が光学異性体用分離剤である前記の方法及びＴＬＣプレートを提供する。
また本発明は、前記光学異性体用分離剤が、多糖と多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、芳香族エーテル基、及びカルボニル基のいずれかとからなる多糖誘導体を含む前記の方法及びＴＬＣプレートを提供する。
また本発明は、第一の分離剤層とこれに隣接する第二の分離剤層とを有するＴＬＣプレートを製造する方法であって、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する第一の分離剤と塗布用溶剤とを含有する第一のスラリーを支持体に塗布して第一の分離剤層を形成する工程と、第一の分離剤とは異なる前記光学応答性を有する第二の分離剤と塗布用溶剤とを含有する第二のスラリーを支持体に塗布して第一の分離剤層に隣接する第二の分離剤層を形成する工程とを含み、第一及び第二のスラリーにおいて、同じ種類の塗布用溶剤を用いる方法を提供する。
本発明では、第一の分離剤層において第一の方向へ展開したスポットが、第一の方向におけるスポットの位置関係を維持して第二の分離剤層に移されることから、光学的な応答では試料中の成分の分離を検出することができない分離剤層による試料中の成分の分離を検出することができる。
また本発明は、ＴＬＣプレートの第一の分離剤層における、展開方向に対して許容されるスポットの移動幅が所定の範囲に特定されていることから、第一の分離剤層における展開方向への成分の分離状態を、第二の分離剤層において正確に把握することができる。
また本発明は、第一及び第二のスラリーの塗布用溶剤の種類を揃えることから、第一の分離剤層から第二の分離剤層へのスポットの移動性が良好なＴＬＣプレートを提供することができる。
本発明のＴＬＣプレートの一例に試料溶液を点着した状態を示す図である。 図１のＴＬＣプレートの第一の分離剤層１に試料を展開した状態を示す図である。 図１のＴＬＣプレートにおいて、第一の分離剤層１に展開したスポットを第二の分離剤層２に向けて展開させる状態を示す図である。 図１のＴＬＣプレートにおいて、第一の分離剤層１におけるスポットを第二の分離剤層２に向けて展開させた状態を示す図である。 図１のＴＬＣプレートにおいて、第二の分離剤層２にスポットが移動したＴＬＣプレートに紫外線を照射した状態を示す図である。
本発明における試料の検出方法は、第一の分離剤層とこれに隣接する第二の分離剤層とを有するＴＬＣプレートを用いて、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する試料中の成分を検出する方法である。本発明の検出方法は、第一の分離剤層において、第一及び第二の分離剤層の境界に沿う方向へ試料を展開させる工程と、少なくとも第二の分離剤層の移動相を乾燥させる工程と、前記ＴＬＣプレートの向きを変えて第一の分離剤層におけるスポットを第二の分離剤層に展開させる工程と、第二の分離剤層に移動したスポットを紫外線の照射又は発色試薬の発色処理によって検出する工程と、を含む。
第一の分離剤層において、第一及び第二の分離剤層の境界に沿う方向へ試料を展開させる工程（第一の工程）は、第二の分離剤層に沿って第一の分離剤層内のみで試料を展開させる以外は通常のＴＬＣと同様に行うことができる。すなわち、前記第一の工程は、第一の分離剤層に試料を点着し、必要に応じて試料のスポットを乾燥させ、第一及び第二の分離剤層との境界に沿う方向（「第一の方向」とも言う）を縦方向とし、試料を点着した分離剤層の端部を下にして第一及び第二の分離剤層の端部を移動相に浸し、第一の分離剤層において試料を展開させることによって行うことができる。
少なくとも第二の分離剤層の移動相を乾燥させる工程（第二の工程）は、通常のＴＬＣにおける移動相の乾燥と同様に行うことができる。第二の工程では、第二の分離剤層を乾燥させれば、その後の第二の分離剤層へのスポットの移動を行うことが可能であるが、第二の分離剤層のみならず第一の分離剤層の移動相も乾燥させることが、第一の分離剤層におけるスポットの拡大防止や位置関係の保存の観点から好ましい。第二の工程は、移動相が可燃性の有機溶剤を含有する場合は、火災や中毒を予防する観点から、局所排気装置の近傍で風乾させることが好ましい。第二の工程は、減圧下で実施してもよい。
前記ＴＬＣプレートの向きを変えて第一の分離剤層におけるスポットを第二の分離剤層に展開させる工程（第三の工程）は、第一の分離剤層におけるスポットを第二の分離剤層へ展開させる以外は通常のＴＬＣと同様に行うことができる。すなわち、前記第三の工程は、第一及び第二の分離剤層の境界を横断する方向（「第二の方向」とも言う）に移動相が展開するようにＴＬＣプレートの向きを変えて、該プレートの端部を移動相に浸し、第一の分離剤層における前記スポットが前記境界を越えて第二の分離剤層に移るように移動相を展開させることによって行うことができる。
第二の方向は、第一の方向に対して０°より大きく９０°以下までの範囲から決めることができ、第一の移動相におけるスポットの位置関係の保存の正確さの観点から、４５〜９０°であることが好ましく、６０〜９０°であることがより好ましく、９０°であることがさらに好ましい。
第一の工程における移動相と第三の工程における移動相とは同じであってもよいし異なっていてもよい。例えば第三の工程において、第一の工程の移動相よりも極性の高い移動相を用いると、第一の分離剤層から第二の分離剤層へのスポットの移動をより迅速に行うことができる。
移動相（展開液）には、水、塩の水溶液、有機溶剤、及びこれらの混合溶剤を用いることができる。有機溶剤は一種でも二種以上でもよい。塩の水溶液としては、例えば硫酸銅水溶液及び過塩素酸塩が挙げられる。有機溶剤としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、スルホラン等のスルホン類、酢酸エチル等のエステル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、ペンタン、ヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等、芳香族炭化水素類、及び、塩化メチレン、クロロホルム、ブロモホルム、クロロベンゼン、ブロモベンゼン等の含ハロゲン化合物類が挙げられる。また移動相には、検出しようとする成分の安定化の観点から、酸やアルカリを適量混合してもよい。酸としては、例えば酢酸、プロピオン酸、及びテトラフルオロ酢酸が挙げられ、アルカリとしては、例えばジエチルアミン、モノエタノールアミン、及びトリエチルアミンが挙げられる。
第二の分離剤層に移動したスポットを紫外線の照射又は発色試薬の発色処理によって検出する工程（第四の工程）は、第二の分離剤層におけるスポットを検出対象とする以外は、ＴＬＣにおいて、紫外線の照射や発色試薬の発色処理によってスポットを検出する通常の方法と同様に行うことができる。
第一の分離剤層は、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する第一の分離剤で形成される。ここで紫外線に対する光学応答性とは、蛍光等の紫外線による発光、又は紫外線の吸収を言う。また発色試薬に対する光学応答性とは、発色試薬による発色を言う。
第一の分離剤層は、第一の分離剤で形成されている以外は、通常のＴＬＣプレートの薄層と同様に形成することができる。
第一の分離剤は、前記光学応答性を有する分離剤成分を含む。このような第一の分離剤としては、例えば、担体と、担体に担持又は結合された前記分離剤成分とからなる担持型の分離剤や、前記分離剤成分からなる粒子が挙げられる。本発明においては、第一の分離剤は、分離剤の性能及び物性からＴＬＣによる試料の簡易な検出が一般に困難とされている光学異性体用分離剤であることが好ましい。
前記担体は、多孔質体であることが、分離性能を高める観点から好ましい。前記担体としては、例えば架橋ポリスチレン、架橋アクリル系ポリマー、エポキシ重合物等の合成高分子、セルロースやそれを架橋によって強化した架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、及び架橋マンナン架橋体等の多糖、及び、アルミナ、シリカゲル、メソポーラスシリカゲル、ゼオライト、珪藻土、溶融シリカ、粘度鉱物、ジルコニア、金属等の無機物、が挙げられる。
第一の分離剤における前記分離剤成分には、前記光学応答性を有する低分子系の分離剤や高分子系の分離剤のいずれも用いることができる。低分子系の分離剤としては、例えば、配位子交換型の分離剤、電化移動（π−π）型の分離剤、水素結合型の分離剤、包接型の分離剤、イオン結合型の分離剤、インターカレート型の分離剤、クラウンエーテル又はその誘導体、及び、シクロデキストリン又はその誘導体、が挙げられる。高分子系の分離剤としては、例えば多糖誘導体、ポリアミド、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、タンパク質、及び酒石酸誘導体が挙げられる。前記多糖誘導体としては、例えば光学異性体用分離剤に用いられる、多糖と多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、芳香族エーテル基、及びカルボニル基のいずれかとからなる多糖誘導体が挙げられ、例えばセルロースのフェニルカルバメート誘導体、セルロースのフェニルエステル誘導体、アミロースのフェニルカルバメート誘導体、及びアミロースのフェニルエステル誘導体が挙げられる。これらの誘導体におけるフェニル基は炭素数１〜２０の炭化水素、及びハロゲンからなる群から選ばれる一以上の置換基を有していてもよい。
第二の分離剤層は、第一の分離剤とは異なる光学応答性を有する第二の分離剤で形成される。ここで異なる光学応答性とは、紫外線の照射又は発色試薬の発色処理による一方の光学的応答と他方の光学的応答とが、色や明るさによって光学的に識別できる程度に異なることを言う。第二の分離剤は、試料中の成分に対する分離能を有していてもよいし、有していなくてもよい。第一の分離剤層におけるスポットの位置関係の正確な検出の観点から、第二の分離剤は試料中の成分に対する分離性を有していないことが好ましい。このような第二の分離剤としては、前述した担体や分離剤が挙げられるが、担体であることが好ましい。
第一及び第二の分離剤の粒径は、本発明の検出方法の目的に応じて決めることができ、例えば中圧カラムクロマトグラフィーの条件検討のためであれば、中圧クロマトグラフィーに適用可能な結果を得る観点から、１０μｍ以上であることが好ましく、１０〜１００μｍであることがより好ましく、２０〜１００μｍであることがさらに好ましい。各分離剤の粒径は、同じであってもよいし異なっていてもよい。各分離剤の粒径は、通常の粒径測定装置で測定される平均粒径を採用することができるが、カタログ値であってもよい。
前記第四の工程において、紫外線の照射による光学応答性によって前記成分を検出する場合には、第二の分離剤は、蛍光指示薬をさらに含有することが、より明確な検出の観点から好ましい。このような蛍光指示薬としては、公知の蛍光指示薬を用いることができ、例えば、タングステン酸マグネシウムや、マンガン含有ケイ酸亜鉛等が挙げられる。蛍光指示薬の含有量は、前記成分の分離が可能な範囲で決めることができ、一般には第二の分離剤１００質量部に対して０．１〜５質量部である。
また前記第四の工程において、発色試薬による光学応答性によって前記成分を検出する場合には、発色試薬及びその発色処理については公知の技術を採用することができる。このような発色試薬としては、例えば、アニスアルデヒド溶液、リンモリブデン酸溶液、ヨウ素、ニンヒドリン溶液、カメレオン溶液、ＤＮＰＨ溶液、塩化マンガン溶液、及びブロモクレゾールグリーン溶液が挙げられる。発色処理としては、例えば、発色試薬をＴＬＣプレートへ塗布、散布、又は暴露によって付着させ、必要に応じてＴＬＣプレートを加熱して発色させる処理が挙げられる。
本発明において、前記試料中の成分の光学応答性は、第一の分離剤の光学応答性と同じである。ここで光学応答性が同じとは、一方の光学応答性と他方の光学応答性とが、色や明るさによって光学的に区別できないことを言う。このような本発明の検出方法によれば、少なくとも第一の分離剤によって分離されるが、第一の分離剤上では光学的に検出することができない試料中の成分の、ＴＬＣでの第一の分離剤による分離を簡便に検出することができる。
本発明の検出方法におけるＴＬＣプレートには、後述する本発明のＴＬＣプレートを好適に用いることができる。
本発明のＴＬＣプレートは、平板状の支持体と、この支持体の表面に形成される第一の分離剤層及びこれに隣接する第二の分離剤層と、を有する。
支持体には、一般にＴＬＣプレートで用いられている平板を用いることができる。このような支持体としては、例えば、ガラス製、樹脂製、金属製、又は紙製の平板が挙げられる。支持体の形状は、特に限定されないが、第一の分離剤層での試料の展開と、その後の第一から第二の分離剤層へのスポットの展開とを好ましい向きで簡潔に行う観点から、長方形又は正方形であることが好ましい。また前記平板の大きさとしては特に限定されないが、取扱いの簡便さや展開時間、経済的な観点から１〜６，０００ｃｍ2であることが好ましく、２〜４１０ｃｍ2であることがより好ましく、５〜７５ｃｍ2であることがさらに好ましい。前記平板の厚さとしては、本発明の検出方法に適用できる範囲において特に限定はない。
前記第一及び第二の分離剤には、前述したように、粒径が１０μｍ以上の粒子状の分離剤の中から、光学応答性の異なる二種以上の分離剤を用いることができる。第一の分離剤層は、第一の分離剤と塗布用溶剤とを含有する第一のスラリーを支持体に塗布することによって形成し、必要に応じて形成された層をさらに乾燥させることによって形成することができる。また第二の分離剤層は、第二の分離剤と塗布用溶剤とを含有する第二のスラリーを支持体に塗布することによって形成し、必要に応じて形成された層をさらに乾燥させることによって形成することができる。
前記第一及び第二の分離剤層は、ＴＬＣプレートを作製する公知の方法を用いて形成することができる。すなわち、前記第一及び第二の分離剤層は、スプレッダを用いて、前記第一及び第二のスラリーを支持体の表面に塗布することによって、又は前記第一及び第二のスラリーを支持体の表面に噴霧することによって、形成することができる。第一及び第二の分離剤層を形成する順序は特に限定されず、一方の層を形成した後に他方の層を形成してもよいし、両方の層を同時に形成してもよい。
前記塗布用溶剤には、水、有機溶剤、及びこれらの混合溶剤を用いることができる。有機溶剤としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、スルホラン等のスルホン類、酢酸エチル等のエステル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、ペンタン、ヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等、芳香族炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム、ブロモホルム、クロロベンゼン、ブロモベンゼン等の含ハロゲン化合物類が挙げられる。
塗布用溶剤としては、好ましくは水溶性の有機溶剤と水との混合溶剤であり、より好ましくはアルコールと水の混合溶剤、さらに好ましくはエタノールと水との混合溶剤である。前記混合溶剤におけるアルコールの含有量は、０．１〜５０質量％であることが好ましく、１０〜４０質量％であることがより好ましく、２０〜３０質量％であることがさらに好ましい。第一及び第二のスラリーにおいて、第一及び第二の分離剤層の境界の乱れを防止し、第一の分離剤層から第二の分離剤層へのスポットの良好な移動を実現する観点から、塗布用溶剤の種類が同じであることが好ましく、塗布用溶剤の組成が同じであることがより好ましい。
第一及び第二のスラリーにおける塗布用溶剤の含有量は、形成される分離剤層の均一性、層の厚さ、及び、経済的な観点、から決定することができ、第一及び第二のスラリーのいずれも、第一又は第二の分離剤１００質量部に対して１０〜５，０００質量部であることが好ましく、５０〜１，０００質量部であることがより好ましく、１００〜３００質量部であることがさらに好ましい。
第一及び第二のスラリーは、形成される分離剤層の強度の向上の観点から、バインダをさらに含有することが好ましい。前記バインダには、支持体の表面において分離剤の層を形成する結着性をもたらす成分を用いることができる。このようなバインダとしては、石膏やコロイダルシリカ等の無機系バインダ、ミクロフィブリル化セルロース等の有機繊維、及び、アルカリ水溶性共重合体、ヒドロキシエチルセルロースやカルボキシメチルセルロース等の増粘剤、ポリビニルアルコール、アクリル酸等の有機系バインダが挙げられる。バインダは一種でも二種以上でもよい。
第一及び第二のスラリーにおけるバインダの含有量は、形成される分離剤層の強度の他、第一又は第二の分離剤層における移動相の上昇速度の観点から決定することができる。形成される分離剤層の強度の向上の観点からは、バインダの量としては多いことが好ましいが、バインダの添加量の増加に比例して、一般に、分離剤層における移動相の上昇速度は遅くなる。前記第一の工程において、第一の分離剤層での移動相の上昇速度に対して第二の分離剤層での移動相の上昇速度が著しく小さい場合、試料のスポットが、第一の方向に対して第二の分離剤層に近づきながら上昇する現象が発生し、第一の分離剤層による試料の分離を正しく分析できないことがある。反対に、第一の分離剤層での移動相の上昇速度に対して第二の分離剤層での移動相の上昇速度が著しく大きい場合、試料のスポットが、第一の方向に対して第二の分離剤層から遠ざかりながら上昇する現象が発生し、やはり第一の分離剤層による試料の分離を正しく分析できないことがある。第一の分離剤層での分離状態を正しく把握する観点からは、第一の分離剤層で試料を展開させた時に、試料のスポットは、可能な限り第一の方向（例えば垂直）へ上昇することが好ましい。
一方、前記第三の工程において、スポットが第一及び第二の分離剤層の境界を横断する時に、第一の分離剤層での移動相の上昇速度よりも第二の分離剤層での移動相の上昇速度が著しく大きい場合、スポットのテーリングが発生し、第二の分離剤層での成分の検出が困難になることがある。このような現象を抑制し、第一の分離剤層での展開方向におけるスポットの位置関係、形状を第二の分離剤層においても保存する観点から、第一の分離剤層での移動相の上昇速度は、第二の分離剤層での移動相の上昇速度と等しくするか、又は第一の分離剤層での移動相の上昇速度に対して第二の分離剤層での移動相の上昇速度をやや小さくすることが好ましい。
前記の観点から、本発明におけるＴＬＣプレートは、第一の分離剤層で第一の方向にスポットを展開させたときに、第一の分離剤層での第一の方向におけるスポットの移動距離Ｗ１に対する、第一の分離剤層での第二の方向におけるスポットの移動距離Ｗ２の比（Ｗ２／Ｗ１）が±０．５以下となる。Ｗ１は、第一の分離剤層における試料の点着位置からスポットの先端までの距離で表される。Ｗ２は、第二の方向における、前記点着位置から前記スポットの先端までの距離で表される。Ｗ２／Ｗ１は、第一の分離剤層での分離状態を正しく把握する観点から±０．３以下であることが好ましく、さらにテーリングを抑制する観点から正の値であることがより好ましく、０．１以下であることがさらに好ましい。なお、Ｗ２は試料の点着位置を０とし、点着位置よりも第二の分離剤層側を正とし、点着位置よりも第二の分離剤層とは反対側を負として表される。
前記バインダには、層の強度向上と、移動相の上昇速度の制御との観点から、第一及び第二のスラリーの両方において、無機系バインダと有機系バインダとを併用することが好ましい。無機系バインダとしては石膏を用いることが好ましく、有機系バインダとしてカルボキシメチルセルロースを用いることが好ましい。
第一及び第二のスラリーにおける前記バインダの含有量は、形成される層の強さと前述のＷ２／Ｗ１の適切な範囲を得る観点から決めることができる。例えば、第一のスラリーにおける石膏の含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して０．１〜５０質量部であることが好ましく、５〜３０質量部であることがより好ましく、１０〜２０質量部であることがさらに好ましい。また、第一のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して０．１〜５０質量部であることが好ましく、０．５〜１０質量部であることがより好ましく、１〜３質量部であることがさらに好ましい。
また例えば、第二のスラリーにおける石膏の含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して０．１〜５０質量部であることが好ましく、１〜３０質量部であることが好ましく、２〜８質量部であることがさらに好ましい。また、第二のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して０．１〜５０質量部であることが好ましく、０．５〜１０質量部であることがより好ましく、２〜４質量部であることがさらに好ましい。
なお、第一及び第二の分離剤層の強度は、ＴＬＣの保存や使用に耐え得る程度、例えば保存時や使用時において分離剤層の剥離や崩壊が生じない程度、の強度であればよい。Ｗ２／Ｗ１は、第一の分離剤層において、例えば有色の試料を点着し展開させることによって確認することができる。さらに、分離剤層が厚いと移動相の上昇速度は遅くなり、分離剤層が薄いと移動相の上昇速度が速くなることから、Ｗ２／Ｗ１は、バインダの種類や配合量の他に、第一及び第二の分離剤層の厚さによって調整することも可能である。
また、第一及び第二のスラリーは、バインダを分散剤の表面に均一に分散させる観点から、分散剤をさらに含有していてもよい。このような分散剤としては、例えばスチレン・無水マレイン酸ポリマーが挙げられる。
第一及び第二の分離剤層の厚さは、ＴＬＣプレートの使用目的に応じて適宜に決めることができる。例えば、分離剤層の厚さは、得られた結果を中圧カラムクロマトグラフィーに適用したり、得られた結果を不斉合成反応の反応モニターや化合物の分取に用いる観点であれば、０．０１〜１００ｍｍであることが好ましく、０．０３〜１０ｍｍであることがより好ましく、０．０５〜２ｍｍであることがさらに好ましい。
前記ＴＬＣプレートの大きさは、特に限定されないが、分離剤、試料、及び移動相に応じて適宜に決めることができ、成分の分離の観点によれば大きいことが望ましく、取り扱いの容易さや検出の簡便さの観点によれば大きすぎないことが望ましい。このような観点から、第一及び第二の分離剤層の大きさを適宜に決めることができる。
例えば、第一の方向における第一の分離剤層の長さ（Ｂ）は、第一の方向に試料を展開させるのに十分な長さであればよく、第一の分離剤、試料、及び移動相に応じて適宜に決めることができる。第一の方向における第一の分離剤層の長さＢは、操作性や検出の確実さの観点から１〜３０ｃｍであることが好ましく、３〜２０ｃｍであることがより好ましく、５〜１２ｃｍであることがさらに好ましい。
また、第一の分離剤層における第二の方向における長さ（Ａ１）は、操作性や検出の確実さの観点から０．０１〜２００ｃｍであることが好ましく、０．０１〜２０ｃｍであることがより好ましく、０．０２〜５ｃｍであることがさらに好ましい。
また、第二の方向における第二の分離剤層の長さ（Ａ２）は、操作性や検出の確実さの観点から、０．１〜３０ｃｍであることが好ましく、０．５〜２０ｃｍであることがより好ましく、１〜５ｃｍであることがさらに好ましい。
また、Ａ１に対するＡ２の比（Ａ２／Ａ１）は、第一の分離剤層から第二の分離剤層へスポットを移動相の展開によって移動させる観点からは大きいことが望ましいが、取り扱いの容易さや検出の簡便さの観点によれば小さいことが望ましく、これらの観点から、０．１〜２０であることが好ましく、０．１〜１０であることがより好ましく、０．１〜５であることがさらに好ましい。
また、Ａ１に対するＢの比（Ｂ／Ａ１）は、第一の分離剤層おける試料中の成分の分離の観点からは大きいことが望ましく、操作性の観点からはある程度小さいことが望ましい。これらの観点から、Ｂ／Ａ１は、０．０１〜９，０００であることが好ましく、０．２〜４，０００であることがより好ましく、１〜６００であることがさらに好ましい。
またＡ１とＡ２の和に対するＢの比（Ｂ／（Ａ１＋Ａ２））は、第一の分離剤層における試料中の成分の分離の観点からは大きいことが望ましく、第一の分離剤層から第二の分離剤層へのスポットの移動、特にエクストラクト成分の移動の観点及び操作性の観点からは小さいことが望ましい。これらの観点から、Ｂ／（Ａ１＋Ａ２）は、０．０１〜３０であることが好ましく、０．１〜３０であることがより好ましく、０．８〜１２であることがさらに好ましい。
第一及び第二の分離剤層のそれぞれの形状は、互いに隣接しており、前述した長さの条件を満たしていれば特に限定されない。第一及び第二の分離剤層の形状は、操作性、第一の分離剤層におけるスポットの位置関係の表示の明確化、及び各層の形成の容易性の観点から、それぞれ矩形であることが好ましく、第一の分離剤層の形状は第一の方向を長手方向とする矩形であり、第二の分離剤層は第一の方向において第一の分離剤層の長さと同じ長さを有し、かつ前記のＡ２／Ａ１の比を満たす大きさの矩形であることがより好ましい。
本発明を、図を示しながらさらに説明する。以下では光学異性体の分離、検出用の形態等を例に本発明を説明する。
本発明のＴＬＣプレートは、図１に示すように、四角形の不図示の支持体の表面に隣接して併設された第一の分離剤層１と第二の分離剤層２とを有する。支持体には例えばガラス板が用いられ、第一の分離剤層１を構成する第一の分離剤には、試料中の成分の分離能を有する分離剤、例えばアミロースの３，５−ジメチルフェニルカルバメート誘導体をシリカゲルに担持或いは化学結合させてなる光学異性体用分離剤、が用いられ、第二の分離剤層２を構成する第二の分離剤には、第一の分離剤とは異なる光学応答性を有する分離剤、例えばシリカゲル、セルロース、或いはシリカゲルの表面をオクタデシル基で修飾したオクタデシルシリル化シリカゲル、が用いられる。
第一の分離剤層１は、第一の分離剤と、エタノール水溶液と、石膏及びカルボキシメチルセルロースとからなる第一のスラリーを支持体の表面に塗布することによって形成される。また第二の分離剤層２は、第二の分離剤と、エタノール水溶液と、石膏及びカルボキシメチルセルロースと、蛍光指示薬とからなる第二のスラリーを、支持体の表面における第一の分離剤層１に隣接する位置に塗布することによって形成される。第一及び第二のスラリーにおけるバインダの配合比（石膏及びカルボキシメチルセルロースのそれぞれの配合量）は、第一の分離剤層１において、スダンや１，４−アミノアゾベンゼンを標準試料として展開させたときの、第一の方向における点着位置からラフィネート成分のスポットの先端までの距離Ｗ１に対する、第二の方向における点着位置からラフィネート成分のスポットの先端までの距離Ｗ２の比（Ｗ２／Ｗ１）が±０．５以下となるように調整されている。標準試料は、スダンや１，４−アミノアゾベンゼン以外にも、公知物質の中から、ＴＬＣプレートによる分析対象となる試料に類似又は特徴的な構造（例えば同じ又は類似の骨格の構造等）を有する有色の化合物を適宜に選ぶことができる。
第一及び第二の分離剤の粒径はそれぞれ２０μｍであり、第一及び第二のー分離剤層の厚さはそれぞれ１５０μｍである。このＴＬＣプレートにおける第一の方向は、第一及び第二の分離剤層１、２の境界に沿う方向（図１中の矢印Ｘで示す方向）であり、第二の方向は、Ｘ方向に直交する方向（図１中の矢印Ｙで示す方向）である。
第一の分離剤層１は、Ｘ方向を長手方向とする矩形に形成されている。第二の分離剤層２は、第一の分離剤層１の一長辺を共有する矩形に形成されている。Ｘ方向における第一及び第二の分離剤層１、２の長さＢは１０ｃｍであり、Ｙ方向における第一の分離剤層１の長さＡ１は２ｃｍであり、同方向における第二の分離剤層２の長さＡ２は２．５ｃｍである。
まず、Ｘ方向を前記ＴＬＣプレートの縦方向とし、第一の分離剤層１の下部に試料溶液を点着する。試料溶液は例えば紫外線吸収性を有する光学異性体のラセミ体の揮発性溶剤の溶液である。試料溶液の点着は、例えばＴＬＣプレートの下側縁及びＴＬＣプレートにおける第二の分離剤層２とは隣接していない第一の分離剤層１の側縁からそれぞれ１．５ｃｍの位置に、スポットの直径が２ｍｍ以下となるように、キャピラリーやマイクロピペットを用いて行われる。点着後、試料溶液のスポット３を乾燥させる。
試料溶液を点着したＴＬＣプレートは、ＴＬＣプレートを収容することができ、１ｃｍ未満の深さで移動相（展開液）を収容可能な容器（展開槽）に収容される。移動相には例えばｎ−ヘキサンとエタノールの混合溶剤、或いはｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶剤等が用いられる。移動相は、Ｘ方向へ、第一及び第二の分離剤層１、２に吸い上げられ、移動相の吸い上げに伴って、試料溶液中のラフィネート成分とエクストラクト成分とが第一の分離剤層１において展開し、図２に示すように、目視では確認できないものの、ラフィネート成分のスポットＲとエクストラクト成分のスポットＥとが形成される。
図２に示すように、移動相がＸ方向におけるＴＬＣプレートの上端部まで達したときにＴＬＣプレートを前記密閉容器から取り出し、冷風によって、第一及び第二の分離剤層１、２の移動相を乾燥させる。図２に示すように、Ｗ１は、第一の分離剤層１での第一の方向Ｘにおけるスポットの移動距離であり、第一の方向におけるスポットの先端と試料溶液の点着位置との距離で表される。また、Ｗ２は、図２に示すように、第一の分離剤層１での第二の方向Ｙにおけるスポットの移動距離であり、前記のスポットの先端と点着位置との第二の方向における距離で表される。
次いで図３に示すように、第一の分離剤層１を下とし、Ｙ方向をＴＬＣプレートの縦方向として、ＴＬＣプレートを前記密閉容器に収容する。この時の移動相は、先の試料の展開に用いた移動相と同じであってもよいし、異なっていてもよい。移動相は、Ｙ方向へ、第一の分離剤層１から第二の分離剤層２へ吸い上げられ、この移動相の吸い上げに伴って、図４に示すように、第一の分離剤層１のラフィネート成分とエクストラクト成分が第二の分離剤層２に移動し、目視では確認できないものの、第二の分離剤層２にラフィネート成分のスポットＲとエクストラクト成分のスポットＥとが形成される。
図４に示すように、移動相がＹ方向におけるＴＬＣプレートの上端部まで達したときにＴＬＣプレートを前記密閉容器から取り出し、冷風によって、第一及び第二の分離剤層１、２の移動相を乾燥させ、第二の分離剤層２における各スポットＲ及びＥを固定する。このＴＬＣプレートに紫外線を照射、或いは発色試薬を付着、場合により加熱することによって、図５に示すように、スポットＲ、Ｅ、及び第一の分離剤層１が同様の光学的応答によって（例えば紫外線の吸収による暗い領域や、発色試薬の発色による有色領域として）観測される。
なお、第一の分離剤層における試料中の成分の分離状態が第二の分離剤層に維持又は反映される場合には、前記第三の工程においてＴＬＣプレートの向きを変えずに第一の分離剤層のスポットを第二の分離剤層に展開させる（すなわち第三の工程において、前記第二の方向を前記第一の方向に対して０°以上９０°以下までの範囲から決めて第一の分離剤層のスポットを第二の分離剤層に展開させる）ことによっても、光学的な応答では試料中の成分の分離を検出することができない第一の分離剤層による試料中の成分の分離を検出することが可能である。このような場合では前記第二の工程を省略することができ、本発明はこのような場合も含む。
実施例１：ＴＬＣプレートの作製
（第一分離剤層の調整）
ダイセル化学工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＡ（同社の登録商標）の充填剤（「ＩＡ充填剤」とも言う）６ｇと、石膏０．８９ｇと、２％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）１１１０（ダイセル化学工業株式会社製）水溶液６ｇとを、水３．０３ｇ、エタノール３．０１ｇの混合溶液に添加し、超音波を照射しながら十分に攪拌してスラリーを得た。
（第二分離剤層の調整）
シリカゲル１０．０１ｇ（ダイソー株式会社製液体クロマトグラフィー用、ＩＲ−６０−５／２０−Ｕ）、石膏０．５０ｇ、２％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）１１１０（ダイセル化学工業株式会社製）水溶液１４．９９ｇ、マンガン含有ケイ酸亜鉛０．１ｇとを、水４．７９ｇ、エタノール６．５１ｇの混合溶液に添加し、超音波を照射しながら十分に攪拌してスラリーを得た。
（塗布）
これらのスラリーを、仕切り板を装着したＴＬＣプレート作製用スプレッダを用いてガラス板の表面に均一に塗布し、図１におけるＡ１が２ｃｍ、Ａ２が２．５ｃｍ、Ｂが１０ｃｍ、厚さがそれぞれ１５０μｍの分離剤層を形成した。なお、ＩＡ充填剤の平均粒径は２０μｍである。また、シリカゲルの平均粒径は１４．４μｍである。
（乾燥）
スラリーを塗布したＴＬＣプレートを風乾し、真空ポンプで引きながら６０℃で３時間真空乾燥し、ＩＡ充填剤の層を第一の分離剤層とし、前記シリカゲルの層を第二の分離剤層とするＴＬＣプレートを得た。
実施例２：トランス−スチルベンゼンオキシドの光学分割例
トランス−スチルベンゼンオキシド（ｔ−ＳＯ）の１％の酢酸エチル溶液の約１μＬを、実施例１で作製したＴＬＣプレートの長手方向を縦とした時の下から約１．５ｃｍの位置に点着した。ｎ−ヘキサンとエタノールを体積比で９：１で含有する混合溶剤を収容した展開槽内に、試料のスポットを下にしてＴＬＣプレートを収容し、ＩＡ分離剤層の長手方向に試料を展開させた。
この第一の展開後、一旦冷風でＴＬＣプレートを乾燥し、ＩＡ分離剤層が下になるように９０℃回転させてＴＬＣプレートを前記展開層内に収容し、エタノールを用いてＩＡ分離剤層からシリカゲル層へサンプルをさらに展開させた。
この第二の展開後、ＴＬＣプレートを冷風で乾燥し、紫外線を照射してシリカゲル層において、ラフィネート成分及びエクストラクト成分のスポットの位置をそれぞれ確認した。第一の分離剤層における、点着位置から展開液の到達位置までの距離と、第二の分離剤層における、第一の展開方向における試料の点着位置から各スポットの中心までの距離とから、各スポットのＲｆ値を求めたところ、ｔ−ＳＯのラフィネート成分のＲｆ値は０．６７であり、エクストラクト成分のＲｆ値は０．５８であった。
実施例３：フラバノンの光学分割例
フラバノン（ＦＬＶ）の１％の酢酸エチル溶液の約１μＬを実施例１で作製したＴＬＣプレートに点着し、実施例２の方法と同じ方法で展開した。
第二の展開後、ＴＬＣプレートを冷風で乾燥し、紫外線を照射してシリカゲル層において、ラフィネート成分及びエクストラクト成分のスポットの位置をそれぞれ確認した。実施例２と同様にＲｆ値を求めたところ、ＦＬＶのラフィネート成分のＲｆ値は０．４０であり、エクストラクト成分のＲｆ値は０．２９であった。
実施例４：ベンゾインエチルエーテルの光学分割例
ベンゾインエチルエーテルの１％の酢酸エチル溶液の約１μＬを実施例１で作製したＴＬＣプレートに点着し、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルを体積比で９：１で含有する混合溶剤を第一の展開における展開液に用い、酢酸エチルを第二の展開における展開液に用いた以外は、実施例２の方法と同じ方法で展開した。
第二の展開後、ＴＬＣプレートを冷風で乾燥し、紫外線を照射してシリカゲル層において、ラフィネート成分及びエクストラクト成分のスポットの位置をそれぞれ確認した。実施例２と同様にＲｆ値を求めたところ、ベンゾインエチルエーテルのラフィネート成分のＲｆ値は０．５７であり、エクストラクト成分のＲｆ値は０．３０であった。
実施例５：Ｈｅｘｏｂａｒｂｉｔａｌの光学分割例
Ｈｅｘｏｂａｒｂｉｔａｌの１％の酢酸エチル溶液の約１μＬを実施例１で作製したＴＬＣプレートに点着し、ｎ−ヘキサンとイソプロパノールを体積比で９：１で含有する混合溶剤を第一の展開における展開液に用い、イソプロパノールを第二の展開における展開液に用いた以外は、実施例２の方法と同じ方法で展開した。
第二の展開後、ＴＬＣプレートを冷風で乾燥し、紫外線を照射してシリカゲル層において、ラフィネート成分及びエクストラクト成分のスポットの位置をそれぞれ確認した。実施例２と同様にＲｆ値を求めたところ、Ｈｅｘｏｂａｒｂｉｔａｌのラフィネート成分のＲｆ値は０．３３であり、エクストラクト成分のＲｆ値は０．２１であった。
実施例６：トレガーベースの光学分割例
トレガーベース（ＴＢ）の１％の酢酸エチル溶液の約１μＬを実施例１で作製したＴＬＣプレートに点着し、実施例２の方法と同じ方法で展開した。
第二の展開後、ＴＬＣプレートを冷風で乾燥し、紫外線を照射してシリカゲル層において、ラフィネート成分及びエクストラクト成分のスポットの位置をそれぞれ確認した。実施例２と同様にＲｆ値を求めたところ、ＴＢのラフィネート成分のＲｆ値は０．５６であり、エクストラクト成分のＲｆ値は０．４１であった。
実験例：バインダ添加量の検討
ダイセル化学工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（同社の登録商標）の充填剤（「ＡＤ充填剤」とも言う）及び前記シリカゲル１００質量部に対して下記表１に記載の質量部数で石膏及びＣＭＣ１１１０を用いて、バインダの添加量を変えたＴＬＣプレート１〜６を作製し、作製したＴＬＣプレート１〜６を用い、スダンＩ及びｐ−アミノアゾベンゼンの各試料の１％の酢酸エチル溶液の約１μＬを、ＴＬＣプレートの長手方向を縦とした時の下から約１．５ｃｍの位置に点着し、アセトニトリルを収容した展開槽内に、試料のスポットを下にしてＴＬＣプレートを収容し、ＴＬＣプレートの長手方向に試料を展開させ、ＴＬＣプレートの長手方向における点着位置からスポットの先端までの距離Ｗ１、及び、前記長手方向に直交する方向における点着位置から前記スポット先端までの距離Ｗ２を測定し、Ｗ１に対するＷ２の比（Ｗ２／Ｗ１）を求めた。Ｗ２は、点着位置をゼロとし、第二の分離剤層側を正、その反対の、第一の分離剤層におけるＴＬＣプレートの端縁側を負とした。スダン及びｐ−アミノアゾベンゼンのスポットは元来固有の色を有することから、第一の分離剤層におけるスポットの検出は、肉眼での観察によって行った。結果を表１に示す。表１から、石膏及びＣＭＣ１１１０の添加量を変えることで、Ｗ２／Ｗ１がコントロールできるが明らかとなった。
Figure 0005941405
近年では製薬の有効成分やその原料として有用な光学異性体のさらなる開発が求められており、それに伴って、光学異性体の確認や光学異性体のより精密な分離の技術の開発も求められている。本発明によれば、多糖誘導体による光学異性体用分離剤のように紫外線応答性を有する分離剤による光学分割をＴＬＣによって簡便に確認することができ、液体クロマトグラフィーの条件の初期設定や最適化の有用な材料をより簡便に提供することができる。したがって、本発明によって、さらに有用な光学異性体の開発やより生産性に優れた光学異性体の製造方法の確立等の、クロマトグラフィーによる分離を伴う技術のさらなる発展が期待される。
１ 第一の分離剤層
２ 第二の分離剤層
３ 試料溶液のスポット
Ｅ エクストラクト成分のスポット
Ｒ ラフィネート成分のスポット
Ｘ 本発明における第一の方向を示す矢印
Ｙ 本発明における第二の方向を示す矢印

Claims (3)

  1. 第一の分離剤層とこれに隣接する第二の分離剤層とを有する薄層クロマトグラフィープレートを用いて、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する試料中の成分を検出する方法であって、
    第一の分離剤層において、第一及び第二の分離剤層の境界に沿う方向へ試料を展開させる工程と、
    少なくとも第二の分離剤層の移動相を乾燥させる工程と、
    前記薄層クロマトグラフィープレートの向きを変えて第一の分離剤層におけるスポットを第二の分離剤層に展開させる工程と、
    第二の分離剤層に移動したスポットを紫外線の照射又は発色試薬の発色処理によって検出する工程と、を含み、
    第一の分離剤層は、前記光学応答性を有する第一の分離剤で形成され、
    第二の分離剤層は、第一の分離剤とは異なる前記光学応答性を有する第二の分離剤で形成され、
    前記成分の光学応答性が、第一の分離剤の光学応答性と同じであり、
    前記第一の分離剤は、多糖と多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、芳香族エーテル基、及びカルボニル基のいずれかとからなる多糖誘導体を含み、
    前記第一の分離剤層と、第二の分離剤層は、それぞれ第一のスラリーと第二のスラリーを用いて形成されるものであり、第一のスラリーと第二のスラリーは、それぞれ石膏と有機系のバインダを含み、
    第一のスラリーにおける石膏の含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して１０〜２０質量部であり、第一のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して１〜３質量部であり、
    第二のスラリーにおける石膏の含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して２〜８質量部であり、第二のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して２〜４質量部である、
    ことを特徴とする試料の検出方法。
  2. 第一の方向を展開方向とする第一の分離剤層と、第一の方向に直交する第二の方向において第一の分離剤層に隣接する第二の分離剤層とを有する薄層クロマトグラフィープレー
    トにおいて、
    第一の分離剤層が、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する第一の分離剤で形成され、
    第二の分離剤層が、第一の分離剤とは異なる前記光学応答性を有する第二の分離剤で形成され、
    第一の分離剤層で第一の方向にスポットを展開させたときに、第一の分離剤層での第一の方向におけるスポットの移動距離Ｗ１に対する、第一の分離剤層での第二の方向におけるスポットの移動距離Ｗ２の比が±０．５以下となり、
    前記第一の分離剤は、多糖と多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、芳香族エーテル基、及びカルボニル基のいずれかとからなる多糖誘導体を含み、
    前記第一の分離剤層と、第二の分離剤層は、それぞれ第一のスラリーと第二のスラリーを用いて形成されるものであり、第一のスラリーと第二のスラリーは、それぞれ石膏と有機系のバインダを含み、
    第一のスラリーにおける石膏の含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して１０〜２０質量部であり、第一のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して１〜３質量部であり、
    第二のスラリーにおける石膏の含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して２〜８質量部であり、第二のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して２〜４質量部である、
    ことを特徴とする薄層クロマトグラフィープレート。
  3. 第一の分離剤層とこれに隣接する第二の分離剤層とを有する薄層クロマトグラフィープレートを製造する方法であって、
    紫外線又は発色試薬に対する光学応答性を有する第一の分離剤と塗布用溶剤とを含有する第一のスラリーを支持体に塗布して第一の分離剤層を形成する工程と、第一の分離剤とは異なる前記光学応答性を有する第二の分離剤と塗布用溶剤とを含有する第二のスラリーを支持体に塗布して第一の分離剤層に隣接する第二の分離剤層を形成する工程とを含み、
    第一及び第二のスラリーにおいて、同じ種類の塗布用溶剤を用い、
    前記第一の分離剤は、多糖と多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、芳香族エーテル基、及びカルボニル基のいずれかとからなる多糖誘導体を含み、
    前記第一の分離剤層と、第二の分離剤層は、それぞれ第一のスラリーと第二のスラリーを用いて形成されるものであり、第一のスラリーと第二のスラリーは、それぞれ石膏と有機系のバインダを含み、
    第一のスラリーにおける石膏の含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して１０〜２０質量部であり、第一のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第一の分離剤１００質量部に対して１〜３質量部であり、
    第二のスラリーにおける石膏の含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して２〜８質量部であり、第二のスラリーにおける有機系のバインダの含有量は、第二の分離剤１００質量部に対して２〜４質量部である、
    薄層クロマトグラフィープレートの製造方法。
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