JP5918290B2 - 乳酸菌生産物質の製造方法及び乳酸菌生産物質並びにアレルギー性皮膚炎抑制剤及び全身性アレルギー反応抑制剤 - Google Patents
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、複数の乳酸菌を用いる乳酸菌生産物質の製造方法及び乳酸菌生産物質に関する。
近年の食生活の多様化・大量消費化が進行するのに伴い、食生活・食習慣の改善が謳われている。特に、栄養過多や運動不足を原因とする生活習慣病やメタボリック症候群等に注目が集まっているが、これらに対する有効な予防法が確立されておらず、生活習慣の改善以外に有効な打開策が存在しない状況にある。
この状況において、摂取することで健康増進につながる健康食品に注目が集まっており、そのような健康食品として特に乳酸菌を含有するものが着目されている。乳酸菌は、免疫力の向上、成人病の予防等、様々な健康維持にあたり有益な効果を得られることが期待されている。これは、外部から取り込んだ乳酸菌によって腸内環境が整えられ、腸管免疫機能が向上することから得られる効果であると考えられている（例えば特許文献１参照）。
この乳酸菌を摂取する方法としては、例えば乳酸菌の生菌を含有するヨーグルトなどの発酵食品や飲料、健康食品などの形で摂取する方法が知られている。しかし、実際には、乳酸菌を外部から摂取した場合であっても、その多くは例えば胃酸及び消化酵素の作用によって死滅し、小腸まで届くものはわずかであると言われている。そこで、本発明者らは乳酸菌の生菌を摂取するよりも、乳酸菌を培養することによって得られる物質（乳酸菌生産物質）を摂取することに着目した。
この状況において、摂取することで健康増進につながる健康食品に注目が集まっており、そのような健康食品として特に乳酸菌を含有するものが着目されている。乳酸菌は、免疫力の向上、成人病の予防等、様々な健康維持にあたり有益な効果を得られることが期待されている。これは、外部から取り込んだ乳酸菌によって腸内環境が整えられ、腸管免疫機能が向上することから得られる効果であると考えられている（例えば特許文献１参照）。
この乳酸菌を摂取する方法としては、例えば乳酸菌の生菌を含有するヨーグルトなどの発酵食品や飲料、健康食品などの形で摂取する方法が知られている。しかし、実際には、乳酸菌を外部から摂取した場合であっても、その多くは例えば胃酸及び消化酵素の作用によって死滅し、小腸まで届くものはわずかであると言われている。そこで、本発明者らは乳酸菌の生菌を摂取するよりも、乳酸菌を培養することによって得られる物質（乳酸菌生産物質）を摂取することに着目した。
上記の乳酸菌生産物質を摂取することで免疫力向上等の健康促進効果につなげるためには、まず、乳酸菌を効率よく培養して乳酸菌生産物質を大量に製造する方法を確立する必要がある。また、乳酸菌は数百種類が発見されているが、それぞれ性質が異なっており、得られる乳酸菌生産物質の効果にも大きな違いがある。そこで、本発明者らは、乳酸発酵に用いる乳酸菌の種類、組み合わせ、栄養源（培地）等を選択し、組み合わせてさまざまな研究を行った。
本発明は、より効率良く、高い健康増進効果を有する乳酸菌生産物質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、ラクトバシラス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌と、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌と、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌とを共棲培養する乳酸菌生産物質の製造方法であって、前記乳酸菌から選択した２、３または４種以上の乳酸菌を組み合わせて、その組み合わせに含まれる乳酸菌が異なる複数のグループを作り、そのグループごとに共棲培養する予備培養工程を含む乳酸菌生産物質の製造方法を提供する。
前記本発明は、ラクトバシラス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌とラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌を含むグループを作り、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌とエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌を含むグループを作り、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌とラクトバシラス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を含むグループを作り、それぞれのグループで共棲培養する予備培養工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記ラクトバシラス属に属する乳酸菌として、Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii）、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、Ｌ．ガセリ（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、Ｌ．プランタラム（Lactobacillus plantarum）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．サリバリウス（Lactobacillus salivarius）の何れかを用い、前記ラクトコッカス属に属する乳酸菌として、Ｌ．ガルビアエ（Lactococcus garvieae）、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の何れかを用い、前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌として、Ｅ．デュランス（Enterococcus durans）、Ｅ．フェカリス（Enterococcus faecalis）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）の何れかを用いるものとすることができる。
前記本発明は、前記Ｅ．フェシウムと前記ラクトバシラス属に属する乳酸菌とを含むグループを作り共棲培養する予備培養工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記Ｅ．デュランスと前記ラクトバシラス属に属する乳酸菌とを含むグループを作り共棲培養する予備培養工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記Ｅ．フェシウムと前記Ｅ．デュランスとを含むグループを作り共棲培養する予備培養工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記Ｅ．フェシウムと前記Ｅ．デュランスとを含むグループを作り、それとは別に前記Ｅ．フェシウムと前記Ｅ．デュランスとＬ．ガルビアエとを含むグループを作りそれぞれ共棲培養する予備培養工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記Ｅ．フェシウムを含み他に含まれる乳酸菌がそれぞれ異なる複数のグループを作ってそれぞれ共棲培養する予備培養工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記予備培養工程を、前記Ｅ．フェシウムと前記Ｅ．デュランスと前記Ｌ．ガルビアエとを含むグループは作らずに行うものとすることができる。
前記本発明は、豆乳を発酵させる工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、氷温保存した大豆を原料として用いるものとすることができる。
前記本発明は、用いる乳酸菌を全て含めた共棲培養を行う本培養工程を前記予備培養後に行うものとすることができる。
前記本発明は、前記本培養工程で得られた培養液を粉砕処理する粉砕処理工程を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記本培養工程で得られた培養液をろ過するろ過工程を含むものとすることができる。
本発明は、前記ろ過工程によって得られるろ過液を有効成分として含有する乳酸菌生産物質を提供する
前記本発明は、前記ろ過液が、前記大豆成分と、前記乳酸菌の菌体成分とを含有するものとすることができる。
前記本発明は、前記ろ過液が、前記乳酸菌の死菌に由来する菌体成分を含むものとすることができる。
前記本発明は、前記ろ過液が、前記乳酸菌の生菌を含まないものとすることができる。
本発明によれば、効率の良い乳酸菌生産物質の製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、免疫力の向上などの健康増進効果が高い乳酸菌生産物質を提供することができる。
本発明の乳酸菌生産物質の製造方法と、これによって得られる乳酸菌生産物質について、以下に詳細に説明する。
乳酸菌生産物質を製造する方法は、複数の乳酸菌を共棲培養する工程を含むものである。用いる乳酸菌としては、ラクトバシラス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌と、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌と、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌である。
上記乳酸菌としては、以下の乳酸菌を好適に例示することができる。
まずラクトバシラス属に属する菌としては、例えばＬ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii）、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、Ｌ．ガセリ（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、Ｌ．プランタラム（Lactobacillus plantarum）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．サリバリウス（Lactobacillus salivarius）を挙げることができる。
また、ラクトコッカス属に属する菌としては、例えばＬ．ガルビアエ（Lactococcus garvieae）、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を挙げることができる。
さらにエンテロコッカス属に属する菌としては、例えばＥ．デュランス（Enterococcus durans）、Ｅ．フェカリス（Enterococcus faecalis）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）を挙げることができる。
まずラクトバシラス属に属する菌としては、例えばＬ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii）、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、Ｌ．ガセリ（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、Ｌ．プランタラム（Lactobacillus plantarum）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．サリバリウス（Lactobacillus salivarius）を挙げることができる。
また、ラクトコッカス属に属する菌としては、例えばＬ．ガルビアエ（Lactococcus garvieae）、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を挙げることができる。
さらにエンテロコッカス属に属する菌としては、例えばＥ．デュランス（Enterococcus durans）、Ｅ．フェカリス（Enterococcus faecalis）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）を挙げることができる。
これらラクトバシラス属、ラクトコッカス属、エンテロコッカス属の各属から１種以上の乳酸菌を選択して用いる。同一種の乳酸菌でも株が異なるものを含んでいても良い。
これらの乳酸菌について、好気条件下において以下の１次培養〜４次培養を行う。
１次培養は、それぞれの乳酸菌を単独で培養する培養工程である。例えば乳酸菌を不活化させて保存している場合には、この１次培養によって活性化することができる。また、２次培養で使用するために必要な菌数になるまで増殖するものである。
１次培養は、それぞれの乳酸菌を単独で培養する培養工程である。例えば乳酸菌を不活化させて保存している場合には、この１次培養によって活性化することができる。また、２次培養で使用するために必要な菌数になるまで増殖するものである。
２次培養は、前記乳酸菌から２、３または４種以上選択して組み合わせたグループを複数作り、それぞれのグループで乳酸菌を共棲培養する培養工程である。これらの各グループに含まれる乳酸菌の組み合わせは、各乳酸菌を様々に組み合わせて共棲培養を行い、継代培養しても各乳酸菌の割合が一定に保たれ、生存競争によりいずれかが淘汰されるといった事態の生じないものの中から見出すことができる。また、このグループを複数作る際には、同一種の乳酸菌が複数のグループに含まれても良い。
したがって、こうしたグループ分けにより、単独では増殖しにくく他の乳酸菌との混合で増殖しやすくなる乳酸菌の培養に好適である。
また、グループ分けすれば、グループごとに適した原料培地、培養温度、培養時間、雰囲気条件等の培養環境下で培養することが可能となる。さらに、後述する３次培養を行う前に各乳酸菌を他の乳酸菌と培養する条件に慣らし、３次培養への移行をスムーズに行うことができる。
こうした２次培養までの工程が予備培養工程である。
また、グループ分けすれば、グループごとに適した原料培地、培養温度、培養時間、雰囲気条件等の培養環境下で培養することが可能となる。さらに、後述する３次培養を行う前に各乳酸菌を他の乳酸菌と培養する条件に慣らし、３次培養への移行をスムーズに行うことができる。
こうした２次培養までの工程が予備培養工程である。
より具体的な２次培養で行うグループ分けとして、以下のＡグループ〜Ｉグループの組み合わせを例として挙げることができる。下記グループは、発明者らが腸内環境における、複数種の乳酸菌が各細菌叢を形成し共棲した状態を再現するために組み合わせたものである。
この乳酸菌の組み合わせは、効率的に各乳酸菌を培養し、乳酸菌生産物質を得ることができるものである。しかし、継代培養しても各乳酸菌の割合が一定に保たれる組み合わせであれば、これらの組み合わせに限定されるものではない。
この乳酸菌の組み合わせは、効率的に各乳酸菌を培養し、乳酸菌生産物質を得ることができるものである。しかし、継代培養しても各乳酸菌の割合が一定に保たれる組み合わせであれば、これらの組み合わせに限定されるものではない。
まず、Ｌ．アシドフィラスを単独でＡグループとする。
またＬ．カゼイと、Ｌ．ラクティス亜種ラクティスの２種をＢグループとし、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクスと、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイの２種をＣグループとし、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの２種をＤグループとする。
さらに、Ｌ．ブレビスと、Ｌ．プランタラムと、Ｅ．フェシウムの３種をＥグループとし、Ｌ．デルブリッキィと、Ｌ．ヘルベティカスと、Ｅ．フェカリスの３種をＦグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．ラモナウサスと、Ｅ．フェシウムの３種をＧグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．サリバリウスと、Ｅ．デュランスの３種をＨグループとし、Ｌ．ガルビアエと、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの３種をＩグループとする。
これらの各組合せは以下の〔表１〕にまとめた。なお、表中のＡはＡグループを示し、Ｂ〜Ｉについても同様にＢグループ〜Ｉグループを示すものとする。
なお、グループＡは、Ｌ．アシドフィラスを単独で培養するものであり共棲培養ではないが、後述する３次培養以降でＬ．アシドフィラスの混合を忘れないために、一つのグループとしておくものである。
またＬ．カゼイと、Ｌ．ラクティス亜種ラクティスの２種をＢグループとし、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクスと、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイの２種をＣグループとし、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの２種をＤグループとする。
さらに、Ｌ．ブレビスと、Ｌ．プランタラムと、Ｅ．フェシウムの３種をＥグループとし、Ｌ．デルブリッキィと、Ｌ．ヘルベティカスと、Ｅ．フェカリスの３種をＦグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．ラモナウサスと、Ｅ．フェシウムの３種をＧグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．サリバリウスと、Ｅ．デュランスの３種をＨグループとし、Ｌ．ガルビアエと、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの３種をＩグループとする。
これらの各組合せは以下の〔表１〕にまとめた。なお、表中のＡはＡグループを示し、Ｂ〜Ｉについても同様にＢグループ〜Ｉグループを示すものとする。
なお、グループＡは、Ｌ．アシドフィラスを単独で培養するものであり共棲培養ではないが、後述する３次培養以降でＬ．アシドフィラスの混合を忘れないために、一つのグループとしておくものである。
上記のＩグループは、ＤグループにＬ．ガルビアエを加えた組み合わせである。このＬ．ガルビアエは豆乳培地の含有成分である大豆イソフラボンを分解し、高い健康増進効果を有するエクオールを産生することが知られている。そこで特にＬ．ガルビアエと共棲培養しやすいＥ．デュランス、Ｅ．フェシウム（Ｄグループの組み合わせ）にＬ．ガルビアエを追加することで、前記のエクオール含有量の多い乳酸菌生産物質を得やすいＩグループを設けた。
上記グループ分けによれば、全グループとも同一の培地を用い、全グループを３２℃〜３６℃で１２時間〜４８時間培養するという、同一の培養器で同条件で一度に培養できる組み合わせである。
また、上記グループ分けによれば、各グループから得られる乳酸菌数をほぼ同数とすることができる。したがって、後の３次培養で増殖させにくい菌株や含有量を多くしたい菌株は複数のグループに含ませておくことができる。また、各グループの等量を混合することで後の培養工程に移ることができるため、混合工程が容易で工程間の移行をスムーズに行うことができる。
また、上記グループ分けによれば、各グループから得られる乳酸菌数をほぼ同数とすることができる。したがって、後の３次培養で増殖させにくい菌株や含有量を多くしたい菌株は複数のグループに含ませておくことができる。また、各グループの等量を混合することで後の培養工程に移ることができるため、混合工程が容易で工程間の移行をスムーズに行うことができる。
２次培養では、各グループごとに培養した培養液の中からいくつかの培養液を混合してさらに培養する工程を設けることもできる。即ち、適宜グループの細分化も可能である。
上記グループ分けを用いて説明すれば、例えば、Ａ〜Ｉグループを別個に作製してそれぞれのグループを培養する方法に代えて、あらかじめＤグループを作って培養し、その一部を取り出してＬ．ガルビアエを加えてＩグループとすることができる。あるいは、後述する３次培養の前にＧグループとＩグループを混ぜたグループを作成し培養することでＥ．フェシウムの含有量を減らすことができる。
上記グループ分けを用いて説明すれば、例えば、Ａ〜Ｉグループを別個に作製してそれぞれのグループを培養する方法に代えて、あらかじめＤグループを作って培養し、その一部を取り出してＬ．ガルビアエを加えてＩグループとすることができる。あるいは、後述する３次培養の前にＧグループとＩグループを混ぜたグループを作成し培養することでＥ．フェシウムの含有量を減らすことができる。
３次培養は、２次培養で分けたグループごとに得られた培養液を混合し、全ての乳酸菌を同時に一つの培養器で培養する培養工程である。この３次培養は、前記選択した全ての乳酸菌を共棲培養するものであって、各種乳酸菌を環境に慣れさせて、後工程である４次培養でより効率よく培養するための中間培養段階である。
３次培養では、２次培養での各グループで培養した培養液を所定の割合、混合量で混合し、所定の培地のもとで培養を行う。
本来、２次培養で得られた乳酸菌を４次培養で用いる大量の培地に直接添加すると、乳酸菌液が薄まってしまい、培養の効率が悪くなる場合がある。そこで予備的培養として３次培養を行い、菌数を増やすことでスムーズに４次培養に移行することができる。
またこの場合、各グループの混合割合、混合量は、３次培養に必要な各乳酸菌の菌体数から導く等して適宜求めることができる。しかしながら作業の便宜のため、各グループの等量を混合することが好ましい。
３次培養工程では各乳酸菌を他の乳酸菌と混合した環境に慣れさせるため、３０℃〜３６℃の比較的低温で１２時間〜７２時間培養する。
本来、２次培養で得られた乳酸菌を４次培養で用いる大量の培地に直接添加すると、乳酸菌液が薄まってしまい、培養の効率が悪くなる場合がある。そこで予備的培養として３次培養を行い、菌数を増やすことでスムーズに４次培養に移行することができる。
またこの場合、各グループの混合割合、混合量は、３次培養に必要な各乳酸菌の菌体数から導く等して適宜求めることができる。しかしながら作業の便宜のため、各グループの等量を混合することが好ましい。
３次培養工程では各乳酸菌を他の乳酸菌と混合した環境に慣れさせるため、３０℃〜３６℃の比較的低温で１２時間〜７２時間培養する。
また、培地となる原料には、乳酸菌で発酵させ得る種々の原料を用いることができるが、豆乳を用いることが好ましい。こうすることで、乳酸菌を培養することで得られる乳酸菌生産物質に、生体にとって好ましい植物性の栄養成分である大豆由来成分を含有させることができる。したがって、栄養価が高く健康増進効果を得られやすい乳酸菌生産物質を得ることができる。
また、こうした豆乳も所定の大豆から得られた豆乳であることが好ましい。例えば、好ましい大豆として氷温保存を施した大豆が挙げられる。氷温保存とは、大豆が凍結せずに不凍液が漏出する低温で静置保存する処理である。温度としては、−３℃〜−１℃が好ましく、保存期間としては２日〜３日が好ましい。この氷温保存については様々な効果が知られている。例えば食パンであれば遊離アミノ酸量を従来品よりも約２倍に増加させることができ、納豆であればグルタミン酸などのアミノ酸含有量を従来品よりも増加させることができるといった報告もある。大豆については、氷温保存することで有害微生物の減少及び生物の呼吸代謝を抑制させ、長時間にわたって大豆の鮮度を保つことができるため、豆乳培地の品質を保持することができるといった利点がある。したがって、上記のような種々の効果を得るため本発明では氷温保存した大豆を用いた豆乳を使用することが好ましい。
豆乳の調製には、氷温保存した大豆を用いる場合は、その氷温庫から出した大豆を、氷温より高いが常温より低い５℃〜１５℃で６時間〜２４時間静置した後、常温に戻した大豆を用いることができる。
豆乳の調製には、氷温保存した大豆を用いる場合は、その氷温庫から出した大豆を、氷温より高いが常温より低い５℃〜１５℃で６時間〜２４時間静置した後、常温に戻した大豆を用いることができる。
培地には豆乳の他、必要に応じて種々の原料を加えることができる。例えば、ブドウ糖やグルコースなどの糖類、酵母エキス、脱脂乳等が挙げられる。
４次培養は、３次培養で得た培養液をさらに培養する本培養工程である。
４次培養としては、以下の３ステップを有していることが好ましい。まずステップ１は、３２℃〜３７℃において、２５時間〜３０時間培養する段階である。
ステップ１は、３次培養と同様に比較的低温で各乳酸菌を慣らすステップである。この４次培養でも３次培養と同様の工程を設けたのは、培地を３次培養とは変えることができ、その場合に各乳酸菌が環境に慣れない場合が生じるからである。
４次培養としては、以下の３ステップを有していることが好ましい。まずステップ１は、３２℃〜３７℃において、２５時間〜３０時間培養する段階である。
ステップ１は、３次培養と同様に比較的低温で各乳酸菌を慣らすステップである。この４次培養でも３次培養と同様の工程を設けたのは、培地を３次培養とは変えることができ、その場合に各乳酸菌が環境に慣れない場合が生じるからである。
その後ステップ２として、３８℃〜４３℃において、４６時間〜５１時間培養する。
このステップ２は、本格的に乳酸菌を増殖し、乳酸菌発酵を進めるステップである。したがって、培養に最も好ましい温度を設定し、最も乳酸菌が増える時間を設定する。
このステップ２は、本格的に乳酸菌を増殖し、乳酸菌発酵を進めるステップである。したがって、培養に最も好ましい温度を設定し、最も乳酸菌が増える時間を設定する。
最後にステップ３として、６３℃〜６７℃において、１６時間〜２１時間培養する。このステップ３は、熱処理により殺菌することで乳酸菌の培養を止める工程である。こうした４次培養を行って得た培養液が乳酸菌生産物質となる。
４次培養を経て得られた乳酸菌培養液は、例えばホモジナイザーによって粉砕処理（ホモジナイズ処理）することが好ましい。この処理により、乳酸菌を粉砕して死菌とし、より確実に培養を停止させることができる。また、前記４次培養におけるステップ３の結果、培養液中のタンパク質が熱変性し、部分的に固形化する場合がある。そこで、このホモジナイズ処理を行うことで均一な懸濁液とすることができる。得られた均一な懸濁液である乳酸菌生産物質は、生菌を含まず、変性の起こりにくい品質の安定した乳酸菌生産物質である。
その後、さらにこの懸濁液をろ過する工程を含めることができる。具体的には、前記ホモジナイズ処理を行った後の乳酸菌培養液をろ過布袋に入れて、重石を載せた状態で数日間（３日間から４日間）掛けてろ過する工程が挙げられる。これにより、上記の乳酸菌培養液はろ過液と醗酵残渣とに分離される。
ろ過液としての乳酸菌生産物質は、固形分を含まない透明な液体として得られることから見た目に優れ、これを摂取する者に不純物が含まれていないという安心感を与えることができる。一方、発酵残渣としての乳酸菌生産物質にはろ過液の乳酸菌生産物質及び大豆成分が含有されており、外用・服用の健康食品等として使用できる。
ろ過液としての乳酸菌生産物質は、固形分を含まない透明な液体として得られることから見た目に優れ、これを摂取する者に不純物が含まれていないという安心感を与えることができる。一方、発酵残渣としての乳酸菌生産物質にはろ過液の乳酸菌生産物質及び大豆成分が含有されており、外用・服用の健康食品等として使用できる。
ろ過液は更に次の工程へ導くことができる。即ち、小さな貫通孔が設けられているフィルターを用いてろ過を行うフィルターろ過処理工程である。このフィルターろ過処理工程は、十分に粉砕されなかった乳酸菌成分を除去する工程であり、生菌が残っていれば完全に取り除く工程である。その際、前記の貫通孔の大きさは乳酸菌を除去する程度の大きさとするが、より具体的には０．２μｍ〜０．３μｍ程度のフィルターを用いることができる。０．２μｍ〜０．３μｍとすれば、ろ過液からほとんどの乳酸菌を除去することができるからであり、０．２μｍより小さいとろ過効率が悪くなり、０．３μｍを超えると乳酸菌が分離できないからである。このフィルターろ過処理は、複数回繰り返して行うことで、より確実にろ過液から乳酸菌を除去することができる。
こうして得られる最終ろ過液が乳酸菌生産物質の中でも最高品質の最高級品であり、発明者が安心して提供することができる高品位乳酸菌生産物質または純乳酸菌生産物質とも呼べるものである。
こうして得られる最終ろ過液が乳酸菌生産物質の中でも最高品質の最高級品であり、発明者が安心して提供することができる高品位乳酸菌生産物質または純乳酸菌生産物質とも呼べるものである。
１．乳酸菌生産物質の生成
〔１次培養〕
本発明に係る乳酸菌生産物質を生成するため、まず、ラクトバシラス属と、ラクトコッカス属と、エンテロコッカス属とに属する乳酸菌を培養した
具体的には、ラクトバシラス属の乳酸菌としてはＬ．アシドフィラス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．デルブリッキィ、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクス、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイ、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ラモナウサス、Ｌ．サリバリウスの１１種類の乳酸菌を用いた。
また、ラクトコッカス属に属する乳酸菌としては、Ｌ．ガルビアエ、Ｌ．ラクティス亜種ラクティスの２種類の乳酸菌を用いた。
さらにエンテロコッカス属に属する乳酸菌としては、Ｅ．デュランス、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウムの３種類の乳酸菌を用いた。これらの各乳酸菌は、常法により得た各種乳酸菌を−８０℃で保存しておいたものである。
〔１次培養〕
本発明に係る乳酸菌生産物質を生成するため、まず、ラクトバシラス属と、ラクトコッカス属と、エンテロコッカス属とに属する乳酸菌を培養した
具体的には、ラクトバシラス属の乳酸菌としてはＬ．アシドフィラス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．デルブリッキィ、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクス、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイ、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ラモナウサス、Ｌ．サリバリウスの１１種類の乳酸菌を用いた。
また、ラクトコッカス属に属する乳酸菌としては、Ｌ．ガルビアエ、Ｌ．ラクティス亜種ラクティスの２種類の乳酸菌を用いた。
さらにエンテロコッカス属に属する乳酸菌としては、Ｅ．デュランス、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウムの３種類の乳酸菌を用いた。これらの各乳酸菌は、常法により得た各種乳酸菌を−８０℃で保存しておいたものである。
上記１６種類の各乳酸菌は１次培養として、ＭＲＳ培地に個別に植菌し、好気環境下において３４℃で単独培養し、ＯＤ６６０ｎｍ＝約１．３とした。
〔２次培養〕
続いて、２次培養として上記１６種類の乳酸菌を、１種または複数種の乳酸菌群からなる９つのグループを作った。そして、前記１種の乳酸菌でなるグループは乳酸菌を１種のみ単独で培養し、前記複数の乳酸菌群でなるグループではそれら複数の乳酸菌を共棲培養した。
続いて、２次培養として上記１６種類の乳酸菌を、１種または複数種の乳酸菌群からなる９つのグループを作った。そして、前記１種の乳酸菌でなるグループは乳酸菌を１種のみ単独で培養し、前記複数の乳酸菌群でなるグループではそれら複数の乳酸菌を共棲培養した。
２次培養における各グループに含まれる乳酸菌の組み合わせを示す。
まず、Ｌ．アシドフィラスをＡグループとした。
またＬ．カゼイと、Ｌ．ラクティス亜種ラクティスの２種をＢグループとし、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクスと、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイの２種をＣグループとし、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの２種をＤグループとした。
さらに、Ｌ．ブレビスと、Ｌ．プランタラムと、Ｅ．フェシウムの３種をＥグループとし、Ｌ．デルブリッキィと、Ｌ．ヘルベティカスと、Ｅ．フェカリスの３種をＦグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．ラモナウサスと、Ｅ．フェシウムの３種をＧグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．サリバリウスと、Ｅ．デュランスの３種をＨグループとし、Ｌ．ガルビアエと、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの３種をＩグループとした。
これらの各組合せは以下の〔表２〕にまとめた。なお、表中のＡはＡグループを示し、Ｂ〜Ｉについても同様にＢグループ〜Ｉグループを示すものとする。
まず、Ｌ．アシドフィラスをＡグループとした。
またＬ．カゼイと、Ｌ．ラクティス亜種ラクティスの２種をＢグループとし、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクスと、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイの２種をＣグループとし、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの２種をＤグループとした。
さらに、Ｌ．ブレビスと、Ｌ．プランタラムと、Ｅ．フェシウムの３種をＥグループとし、Ｌ．デルブリッキィと、Ｌ．ヘルベティカスと、Ｅ．フェカリスの３種をＦグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．ラモナウサスと、Ｅ．フェシウムの３種をＧグループとし、Ｌ．ガセリと、Ｌ．サリバリウスと、Ｅ．デュランスの３種をＨグループとし、Ｌ．ガルビアエと、Ｅ．デュランスと、Ｅ．フェシウムの３種をＩグループとした。
これらの各組合せは以下の〔表２〕にまとめた。なお、表中のＡはＡグループを示し、Ｂ〜Ｉについても同様にＢグループ〜Ｉグループを示すものとする。
この２次培養は、前記１次培養液を後述する豆乳培地に加えて混合した後、好気環境下において３２℃〜３６℃で約１日培養した。これにより得られた培養液を「２次培養液」とする。
ここで、２次培養で使用した豆乳培地の製造方法について説明する。
−３℃〜−１℃で２〜３日間静置保存して氷温保存した大豆を冷蔵庫にしばらく静置して常温に戻したものを使用して豆乳を調製した。こうして得られた豆乳は、１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌に供することで「培地用豆乳」とした。
そして、この培地用豆乳１００ｍｌを水で２倍に希釈し、脱脂粉乳、グルコース、酵母エキスを混合して、溶解させた後、１１５℃で１５分間高圧蒸気滅菌を行うことで、「２次培養用の豆乳培地」を得た。
−３℃〜−１℃で２〜３日間静置保存して氷温保存した大豆を冷蔵庫にしばらく静置して常温に戻したものを使用して豆乳を調製した。こうして得られた豆乳は、１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌に供することで「培地用豆乳」とした。
そして、この培地用豆乳１００ｍｌを水で２倍に希釈し、脱脂粉乳、グルコース、酵母エキスを混合して、溶解させた後、１１５℃で１５分間高圧蒸気滅菌を行うことで、「２次培養用の豆乳培地」を得た。
前記各２次培養液を希釈後、ＭＲＳ寒天プレート（φ９０ｍｍ）に播種した。３４℃で２４時間培養後に形成されたコロニー数から、前記Ａグループ〜Ｉグループの各２次培養液に含まれる乳酸菌数は平均で２．６×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
〔３次培養〕
前記１６種類の乳酸菌を全て混合し、共棲培養を行った。具体的には、前記Ａグループ〜Ｉグループの各２次培養液を等量ずつ混合した。この混合液を下記の「３次培養用の豆乳培地」に添加して、好気環境下において３２℃〜３６℃で１日培養し、「３次培養液」とした。この３次培養液は、ＭＲＳ寒天プレートに播種し、３４℃で２４時間培養後に形成されたコロニー数から、３次培養原液に含まれる乳酸菌数は約２．６×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
前記１６種類の乳酸菌を全て混合し、共棲培養を行った。具体的には、前記Ａグループ〜Ｉグループの各２次培養液を等量ずつ混合した。この混合液を下記の「３次培養用の豆乳培地」に添加して、好気環境下において３２℃〜３６℃で１日培養し、「３次培養液」とした。この３次培養液は、ＭＲＳ寒天プレートに播種し、３４℃で２４時間培養後に形成されたコロニー数から、３次培養原液に含まれる乳酸菌数は約２．６×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
なお、前記３次培養用の豆乳培地は、前記培地用豆乳１００ｍｌにその１／４量の水を加えて希釈し、脱脂粉乳、グルコース、酵母エキスを混合し、溶解させた後、１１５℃で１５分間、高圧蒸気滅菌を行うことで得たものである。
〔４次培養〕
引き続き４次培養を行った。具体的には、３次培養液を下記「４次培養用の豆乳培地」に添加し、好気環境下で培養を行った。この４次培養は、３２℃〜３７℃において、２５時間〜３０時間培養するステップ１と、３８℃〜４３℃において、４６時間〜５１時間培養するステップ２と、６３℃〜６７℃において、１６時間〜２１時間培養するステップ３との３段階で構成される。まずステップ１は、３次培養と同様に比較的低温で各乳酸菌を慣らすステップである。この４次培養でも３次培養と同様の工程を設けたのは、培地を３次培養とは変えることができ、その場合に各乳酸菌が環境に慣れない場合が生じるからである。その後のステップ２では、本格的に乳酸菌を増殖して乳酸菌発酵を進めることができる。最後にステップ３によって、タンパク質が変性することを防ぎながら乳酸菌の培養を止めることができる。また、前記ステップ１を開始して約２４時間後には、例えばスパチュラ等の棒状の器具を３次培養液の底部まで挿し入れ混和した。こうすることで、３次培養液の表面から離れた位置にあって空気に触れにくい乳酸菌を好気環境下においた。この操作によって、乳酸菌をより効率良く培養することができる。これらの操作の結果、「４次培養液」を得た。
ステップ１とステップ２の培養液を段階希釈して、ＭＲＳ寒天プレート（φ９０ｍｍ）に播種した。３４℃で２４時間培養後に形成されたコロニー数から、ステップ１で約１．５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ、ステップ２では約２．１×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。なお、ステップ３は、高温で処理することによる菌の不活性化工程であるため、生菌数の測定を行わなかった。
引き続き４次培養を行った。具体的には、３次培養液を下記「４次培養用の豆乳培地」に添加し、好気環境下で培養を行った。この４次培養は、３２℃〜３７℃において、２５時間〜３０時間培養するステップ１と、３８℃〜４３℃において、４６時間〜５１時間培養するステップ２と、６３℃〜６７℃において、１６時間〜２１時間培養するステップ３との３段階で構成される。まずステップ１は、３次培養と同様に比較的低温で各乳酸菌を慣らすステップである。この４次培養でも３次培養と同様の工程を設けたのは、培地を３次培養とは変えることができ、その場合に各乳酸菌が環境に慣れない場合が生じるからである。その後のステップ２では、本格的に乳酸菌を増殖して乳酸菌発酵を進めることができる。最後にステップ３によって、タンパク質が変性することを防ぎながら乳酸菌の培養を止めることができる。また、前記ステップ１を開始して約２４時間後には、例えばスパチュラ等の棒状の器具を３次培養液の底部まで挿し入れ混和した。こうすることで、３次培養液の表面から離れた位置にあって空気に触れにくい乳酸菌を好気環境下においた。この操作によって、乳酸菌をより効率良く培養することができる。これらの操作の結果、「４次培養液」を得た。
ステップ１とステップ２の培養液を段階希釈して、ＭＲＳ寒天プレート（φ９０ｍｍ）に播種した。３４℃で２４時間培養後に形成されたコロニー数から、ステップ１で約１．５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ、ステップ２では約２．１×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。なお、ステップ３は、高温で処理することによる菌の不活性化工程であるため、生菌数の測定を行わなかった。
また、前記４次培養用の豆乳培地は、前記培地用豆乳を約１／４の量の水で希釈し、脱脂粉乳、グルコース、酵母エキスを混合し、溶解させた後、１１５℃で１５分間、高圧蒸気滅菌を行うことで得たものである。
〔ホモジナイズ〕
４次培養液をホモジナイザーを用いて６，０００ｒｐｍで１５分間粉砕処理（ホモジナイズ処理）し、「４次培養懸濁液」を得た。この作業により、乳酸菌を粉砕し、培養を完全に停止させることができる。また、前記ステップ３の高温処理により熱変性が生じ、得られた培養液が部分的に固形化してくるが、このホモジナイズによって培養液を均一な懸濁液にすることができる。
４次培養液をホモジナイザーを用いて６，０００ｒｐｍで１５分間粉砕処理（ホモジナイズ処理）し、「４次培養懸濁液」を得た。この作業により、乳酸菌を粉砕し、培養を完全に停止させることができる。また、前記ステップ３の高温処理により熱変性が生じ、得られた培養液が部分的に固形化してくるが、このホモジナイズによって培養液を均一な懸濁液にすることができる。
〔ろ過〕
４次培養懸濁液の全量をろ過布袋に入れ、袋の口を封じた。これに重石（６ｋｇ）を載せて約３日間ろ過し、ろ過液と発酵残差とを得た。
４次培養懸濁液の全量をろ過布袋に入れ、袋の口を封じた。これに重石（６ｋｇ）を載せて約３日間ろ過し、ろ過液と発酵残差とを得た。
０．３μｍフィルターを用いて前記ろ過液をさらに２回フィルターろ過することで、最終ろ過液として「乳酸菌生産物質」を得た。この乳酸菌生産物質中には乳酸菌の死菌由来の菌体成分、乳酸菌による生成物、培地の原料である大豆や豆乳に由来する液状成分が含まれている。
２．試料の作製
２−１．実験動物の準備
本発明に係る乳酸菌生産物質の摂取による免疫力向上効果を検証するために、アレルギー性皮膚炎を誘導したモデルマウスを作製した。
具体的には、４週齢のＢＡＬＢ／ｃ 雄性マウスを用意し、各マウスの両耳介にアセトン溶解ジニトロフルオロベンゼン（以下、ＤＮＦＢ：ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を週２回（３日または４日に１回の頻度）、計１６回塗布した。こうすることで、接触性皮膚炎の症状を示すアレルギー性皮膚炎を誘導することができる。
２−１．実験動物の準備
本発明に係る乳酸菌生産物質の摂取による免疫力向上効果を検証するために、アレルギー性皮膚炎を誘導したモデルマウスを作製した。
具体的には、４週齢のＢＡＬＢ／ｃ 雄性マウスを用意し、各マウスの両耳介にアセトン溶解ジニトロフルオロベンゼン（以下、ＤＮＦＢ：ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を週２回（３日または４日に１回の頻度）、計１６回塗布した。こうすることで、接触性皮膚炎の症状を示すアレルギー性皮膚炎を誘導することができる。
飼育期間中、マウスは人工照明による明暗環境下（明期８：００〜２０：００、暗期２０：００〜８：００）、一定温度（２２℃±２℃）、湿度未調節の動物実験室内で飼育し、水及び飼料を自由摂取させた。通常飼料（ＣＥ−２：日本クレア社製）及び、この通常飼料に本発明の乳酸菌生産物質を含有させた飼料を与えた。
２−２．乳酸菌生産物質を含有する飼料の調製方法
上記通常飼料に粉末状の本発明に係る乳酸菌生産物質を質量比３％となるように混合し、３％乳酸菌生産物質含有飼料とした。また、これと同様に上記通常飼料に粉末状の本発明に係る乳酸菌生産物質を質量比５％となるように混合し、５％乳酸菌生産物質含有飼料とした。
上記通常飼料に粉末状の本発明に係る乳酸菌生産物質を質量比３％となるように混合し、３％乳酸菌生産物質含有飼料とした。また、これと同様に上記通常飼料に粉末状の本発明に係る乳酸菌生産物質を質量比５％となるように混合し、５％乳酸菌生産物質含有飼料とした。
２−３．アレルギー性皮膚炎モデル動物への乳酸菌生産物質の投与
実験に供する動物として、ＤＮＦＢ塗布開始２０日目から５２日目まで上記で得られた乳酸菌生産物質を３％含有する飼料を与えた治療群３％と、同様に乳酸菌生産物質を５％含有する飼料を与えた治療群５％と、ＤＮＦＢ塗布を開始する１４日前から塗布５２日目まで上記乳酸菌生産物質を３％含有する飼料を与えた予防群３％と、同様に本発明の乳酸菌生産物質を５％含有する飼料を与えた予防群５％と、ＤＮＦＢの塗布は行ったものの通常飼料のみを与えた対照群と、及びＤＮＦＢ塗布を行わず通常飼料のみを与えたＤＮＦＢ（−）群との計５つの群を用意した（ｎ＝５）。
本実験で使用した全マウスの平均体重は２７．３ｇであり、平均摂取食餌量は４．２ｇ／ｄａｙ程度であった。したがって前記治療群３％、予防群３％は１日に０．１２６ｇ程度の乳酸菌生産物質を摂取したものと考えられる。これに対し、前記治療群５％、予防群５％は１日に０．２１０ｇ程度の乳酸菌生産物質を摂取したものと考えられる。
治療群３％、治療群５％、予防群３％、予防群５％、対照群の各群はＤＮＦＢ塗布の開始から５２日目に採血し、耳介、脾臓を回収した。またＤＮＦＢ（−）群は他の群と同じ週齢で同様に採血し、耳介、脾臓を回収した。
実験に供する動物として、ＤＮＦＢ塗布開始２０日目から５２日目まで上記で得られた乳酸菌生産物質を３％含有する飼料を与えた治療群３％と、同様に乳酸菌生産物質を５％含有する飼料を与えた治療群５％と、ＤＮＦＢ塗布を開始する１４日前から塗布５２日目まで上記乳酸菌生産物質を３％含有する飼料を与えた予防群３％と、同様に本発明の乳酸菌生産物質を５％含有する飼料を与えた予防群５％と、ＤＮＦＢの塗布は行ったものの通常飼料のみを与えた対照群と、及びＤＮＦＢ塗布を行わず通常飼料のみを与えたＤＮＦＢ（−）群との計５つの群を用意した（ｎ＝５）。
本実験で使用した全マウスの平均体重は２７．３ｇであり、平均摂取食餌量は４．２ｇ／ｄａｙ程度であった。したがって前記治療群３％、予防群３％は１日に０．１２６ｇ程度の乳酸菌生産物質を摂取したものと考えられる。これに対し、前記治療群５％、予防群５％は１日に０．２１０ｇ程度の乳酸菌生産物質を摂取したものと考えられる。
治療群３％、治療群５％、予防群３％、予防群５％、対照群の各群はＤＮＦＢ塗布の開始から５２日目に採血し、耳介、脾臓を回収した。またＤＮＦＢ（−）群は他の群と同じ週齢で同様に採血し、耳介、脾臓を回収した。
各群をジエチルエーテルにより麻酔し、頸椎脱臼後、注射針を用いて心臓から採血を行った。採取した血液は４℃で一晩静置後、遠心（５℃、１０，０００ｒｐｍ×１０分）し、上清として血清を回収した。こうして得られた血清は解析時まで−２０℃で保管した。
耳介及び脾臓は後述のＲＴ−ＰＣＲで使用するためにＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（製品名：ＲＮＡ ｌａｔｅｒ Ｓｏｌｎ（登録商標）、Ａｍｂｉｏｎ社製）内で保存し、耳介は４℃で、脾臓は−８０℃で、解析時まで保管した。
３．アレルギー性の炎症抑制効果の検証
本発明に係る乳酸菌生産物質の、アレルギー性の炎症抑制効果を測定するために、上記各群の耳介肥厚の経時変化、各種サイトカイン及び炎症性メディエーター ｍＲＮＡ発現量を測定した。
本発明に係る乳酸菌生産物質の、アレルギー性の炎症抑制効果を測定するために、上記各群の耳介肥厚の経時変化、各種サイトカイン及び炎症性メディエーター ｍＲＮＡ発現量を測定した。
３−１．耳介肥厚の測定
上記の各マウスについて耳介肥厚をアレルギー症状の指標とし、ＤＮＦＢ塗布後の耳介肥厚の変化を測定することで、上記乳酸菌生産物質とアレルギー症状の関係を検証した。この測定は毎回のＤＮＦＢ塗布から２４時間後に行い、計１６回行った。またＤＮＦＢ（−）群についても、同時期に耳介肥厚の測定を行った。
上記の各マウスについて耳介肥厚をアレルギー症状の指標とし、ＤＮＦＢ塗布後の耳介肥厚の変化を測定することで、上記乳酸菌生産物質とアレルギー症状の関係を検証した。この測定は毎回のＤＮＦＢ塗布から２４時間後に行い、計１６回行った。またＤＮＦＢ（−）群についても、同時期に耳介肥厚の測定を行った。
ＤＮＦＢ感作によるアレルギー性皮膚炎への耳介肥厚の測定結果を図１に示す。対照群ではＤＮＦＢ塗布開始から１１日目以降に耳介の肥厚化が急速に進み、２０日目にピーク値（０．５７５ｍｍ）を示した。しかしその後は微減しほぼ一定の厚み（０．５５ｍｍ前後）を維持した。これに対して治療群３％及び治療群５％では、同じようにＤＮＦＢ塗布開始から１１日目以降に耳介の肥厚化が急速に進んだが、１９日目に上記乳酸菌生産物質を添加した飼料の摂取を開始すると、間もなく厚みが減少し始めた。その結果、治療群３％では２０日目にピーク値（０．５３２ｍｍ）を示し、治療群５％では２０日目でピーク値（０．５４３ｍｍ）を示した。したがって、いずれも対照群のピーク値よりも耳介の肥厚化が抑制された。
また、予防群３％及び予防群５％では他の群と同様にＤＮＦＢ塗布開始から１１日目以降に肥厚化が急速に進み始めたが、その進行は対照群、治療群３％及び治療群５％と比較して緩やかであり、１３日目以降ではさらに肥厚化が緩和された。また予防群３％、予防群５％のいずれにおいても２７日目にピーク値を示したが、予防群３％では０．５００ｍｍ、予防群５％では０．４５７ｍｍと、他の群よりもピーク値が低かった。
以上の結果より、本発明に係る乳酸菌生産物質の摂取がアレルギー性皮膚炎部位における炎症の抑制に有効であることが示唆された。また同時に、感作以前から上記の乳酸菌生産物質を摂取し続けることで、より高い炎症抑制効果を得られることが示唆された。
３−２．耳介におけるサイトカイン及び炎症性メディエータータンパク質のｍＲＮＡ発現量の測定
炎症性メディエータータンパク質として、現在、ペリオスチン、ＴＳＬＰが注目されている。ペリオスチンは慢性皮膚炎部位において高発現するタンパク質である。アレルゲンが皮膚組織に浸入すると２型ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ２細胞と略記する）が活性化され、活性化されたＴｈ２細胞はＩＬ−４やＩＬ−１３を産生する。ＩＬ−４やＩＬ−１３は線維芽細胞を刺激し、ペリオスチンの産生を促す。このペリオスチンは表皮細胞を刺激して、表皮細胞からＴＳＬＰなどの炎症性メディエーターが産生される。そして、ＴＳＬＰは樹状細胞を刺激し再びＴｈ２細胞が活性化することで上記のサイクルが繰り返され、慢性的にアレルギー性の皮膚炎が持続する原因となっている。従って、各群の耳介におけるペリオスチン及びＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現レベルの測定を行うことで、乳酸菌生産物質の慢性的なアレルギー性皮膚炎に対する影響を図ることができる。そこで、さらにアレルギー性皮膚炎への影響を図るべく、耳介におけるＩＬ−１３、ペリオスチン、ＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現量を測定した。
炎症性メディエータータンパク質として、現在、ペリオスチン、ＴＳＬＰが注目されている。ペリオスチンは慢性皮膚炎部位において高発現するタンパク質である。アレルゲンが皮膚組織に浸入すると２型ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ２細胞と略記する）が活性化され、活性化されたＴｈ２細胞はＩＬ−４やＩＬ−１３を産生する。ＩＬ−４やＩＬ−１３は線維芽細胞を刺激し、ペリオスチンの産生を促す。このペリオスチンは表皮細胞を刺激して、表皮細胞からＴＳＬＰなどの炎症性メディエーターが産生される。そして、ＴＳＬＰは樹状細胞を刺激し再びＴｈ２細胞が活性化することで上記のサイクルが繰り返され、慢性的にアレルギー性の皮膚炎が持続する原因となっている。従って、各群の耳介におけるペリオスチン及びＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現レベルの測定を行うことで、乳酸菌生産物質の慢性的なアレルギー性皮膚炎に対する影響を図ることができる。そこで、さらにアレルギー性皮膚炎への影響を図るべく、耳介におけるＩＬ−１３、ペリオスチン、ＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現量を測定した。
３−２−１．ＲＮＡの抽出
上述のように、回収したマウスの耳介からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
具体的には、まず上述のＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに保管されている耳介をセラミックビーズ（１．４ｍｍ：エムエス機器株式会社製）及びＴＲＩＺＯＬ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）入り容器内に移した。そして、これに遠心分離処理（６．３００ｒｐｍ、２３秒）を６回行うことで組織を破砕した。
こうして得られた耳介について、ＴＯＲＩＺＯＬ付属のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、−２０℃で保存した。
上述のように、回収したマウスの耳介からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
具体的には、まず上述のＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに保管されている耳介をセラミックビーズ（１．４ｍｍ：エムエス機器株式会社製）及びＴＲＩＺＯＬ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）入り容器内に移した。そして、これに遠心分離処理（６．３００ｒｐｍ、２３秒）を６回行うことで組織を破砕した。
こうして得られた耳介について、ＴＯＲＩＺＯＬ付属のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、−２０℃で保存した。
３−２−２．ＲＴ−ＰＣＲのためのｃＤＮＡの調製
上記で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡからＲｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。
具体的には、まず上記で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡの吸光度を測定し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ濃度が１μｇ／μｌとなるようにミリＱ水で希釈した。上記キット付属のＨ２Ｏ ６μｌに対しこのｔｏｔａｌ ＲＮＡを１μｌ加え、６５℃で５分間インキュベートした後、氷上に静置した。これに上記キット付属の５×Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ０．５μｌ及びＰｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ ０．５μｌからなるＭｉｘ溶液を３μｌ添加した後、３７℃で１５分間、さらに９８℃で５分間インキュベートし、その後、氷上に静置して反応を停止させた。こうして得られた濃度１０ｎｇ／μｌのｃＤＮＡ１０μｌに対し、ミリＱ水９０μｌを添加して全量が１００μｌのｃＤＮＡ溶液とし、−２０℃で保存した。
上記で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡからＲｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。
具体的には、まず上記で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡの吸光度を測定し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ濃度が１μｇ／μｌとなるようにミリＱ水で希釈した。上記キット付属のＨ２Ｏ ６μｌに対しこのｔｏｔａｌ ＲＮＡを１μｌ加え、６５℃で５分間インキュベートした後、氷上に静置した。これに上記キット付属の５×Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ０．５μｌ及びＰｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ ０．５μｌからなるＭｉｘ溶液を３μｌ添加した後、３７℃で１５分間、さらに９８℃で５分間インキュベートし、その後、氷上に静置して反応を停止させた。こうして得られた濃度１０ｎｇ／μｌのｃＤＮＡ１０μｌに対し、ミリＱ水９０μｌを添加して全量が１００μｌのｃＤＮＡ溶液とし、−２０℃で保存した。
３−２−３．定量的ＲＴ−ＰＣＲ
上記ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
具体的には、上記で得られたｃＤＮＡ溶液を３８４穴プレートの各ウェルに２μｌずつ滴下し、さらにミリＱ水 ６．４μｌ、２×ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（製品名：ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社製） １０μｌ、１０μＭ フォワードプライマー ０．６μｌ、１０μＭ リバースプライマー ０．６μｌ及び５０倍希釈したＲＯＸ（ＴＯＹＯＢＯ社製） ０．４μｌとからなるＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 溶液を１８μｌ添加し、最終液量を２０μｌとした。使用したフォワードプライマー、リバースプライマーの塩基配列はそれぞれ以下のとおりであった。各試料について９５℃で６０秒間の熱変性を行い、その後９５℃で１５秒間のアニーリングと６０℃で６０秒間の伸長を４０サイクル繰り返した。
こうして得られたｃＤＮＡに基づき、耳介における各種サイトカイン及び炎症性メディエーターｍＲＮＡの発現量を測定した。
・使用したプライマーの塩基配列
（ＩＬ−１３）
Ｆ：５´―ＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＡ―３´
Ｒ：５´―ＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧ―３´
（ぺリオスチン）
Ｆ：５´―ＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＧＧＴＣＣ―３´
Ｒ：５´―ＧＧＡＧＡＣＣＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＡ―３´
（ＴＳＬＰ）
Ｆ：５´―ＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧ―３´
Ｒ：５´―ＧＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＣＡＣ―３´
上記ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
具体的には、上記で得られたｃＤＮＡ溶液を３８４穴プレートの各ウェルに２μｌずつ滴下し、さらにミリＱ水 ６．４μｌ、２×ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（製品名：ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社製） １０μｌ、１０μＭ フォワードプライマー ０．６μｌ、１０μＭ リバースプライマー ０．６μｌ及び５０倍希釈したＲＯＸ（ＴＯＹＯＢＯ社製） ０．４μｌとからなるＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 溶液を１８μｌ添加し、最終液量を２０μｌとした。使用したフォワードプライマー、リバースプライマーの塩基配列はそれぞれ以下のとおりであった。各試料について９５℃で６０秒間の熱変性を行い、その後９５℃で１５秒間のアニーリングと６０℃で６０秒間の伸長を４０サイクル繰り返した。
こうして得られたｃＤＮＡに基づき、耳介における各種サイトカイン及び炎症性メディエーターｍＲＮＡの発現量を測定した。
・使用したプライマーの塩基配列
（ＩＬ−１３）
Ｆ：５´―ＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＡ―３´
Ｒ：５´―ＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧ―３´
（ぺリオスチン）
Ｆ：５´―ＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＧＧＴＣＣ―３´
Ｒ：５´―ＧＧＡＧＡＣＣＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＡ―３´
（ＴＳＬＰ）
Ｆ：５´―ＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧ―３´
Ｒ：５´―ＧＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＣＡＣ―３´
３−３．ＩＬ−１３のｍＲＮＡ発現抑制作用
炎症性サイトカインであるＩＬ−１３の耳介におけるｍＲＮＡ発現量を図２に示す。対照群におけるＩＬ−１３ ｍＲＮＡの発現量１に対し治療群３％では０．１６７、治療群５％では０．２５０、予防群３％では０．０７８、予防群５％では０．１０１であった。よって乳酸菌生産物質を摂取しなかった対照群と比較してＩＬ−１３ ｍＲＮＡの発現はいずれも劇的に抑制されたことが分かった。
炎症性サイトカインであるＩＬ−１３の耳介におけるｍＲＮＡ発現量を図２に示す。対照群におけるＩＬ−１３ ｍＲＮＡの発現量１に対し治療群３％では０．１６７、治療群５％では０．２５０、予防群３％では０．０７８、予防群５％では０．１０１であった。よって乳酸菌生産物質を摂取しなかった対照群と比較してＩＬ−１３ ｍＲＮＡの発現はいずれも劇的に抑制されたことが分かった。
３−３−１．ペリオスチン及びＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現抑制作用
各群のアレルギー性皮膚炎（耳介）におけるペリオスチンｍＲＮＡの発現量を図３に、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの発現量を図４に示す。対照群におけるペリオスチンｍＲＮＡの発現量を１とすると、治療群３％では０．９０１、治療群５％では０．１２０、予防群３％では０．４７２、予防群５％では０．３５５であった。また、ＴＳＬＰｍＲＮＡ発現量については、対照群１に対して、治療群３％では０．９４１、治療群５％では０．６１４、予防群３％では０．５０６、予防群５％では０．４５７であった。
したがって、本発明の乳酸菌生産物質を摂取しなかった対照群と比較してペリオスチン、ＴＳＬＰのいずれにおいてもｍＲＮＡの発現が抑制されることが分かった。
各群のアレルギー性皮膚炎（耳介）におけるペリオスチンｍＲＮＡの発現量を図３に、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの発現量を図４に示す。対照群におけるペリオスチンｍＲＮＡの発現量を１とすると、治療群３％では０．９０１、治療群５％では０．１２０、予防群３％では０．４７２、予防群５％では０．３５５であった。また、ＴＳＬＰｍＲＮＡ発現量については、対照群１に対して、治療群３％では０．９４１、治療群５％では０．６１４、予防群３％では０．５０６、予防群５％では０．４５７であった。
したがって、本発明の乳酸菌生産物質を摂取しなかった対照群と比較してペリオスチン、ＴＳＬＰのいずれにおいてもｍＲＮＡの発現が抑制されることが分かった。
上記で得られた結果より、本発明に係る乳酸菌生産物質はアレルギー性皮膚炎部位におけるＩＬ−１３、ペリオスチン及びＴＳＬＰなどのサイトカイン及び炎症性メディエーターの産生を抑制する、アレルギー性炎症の抑制効果を有することが示唆された。
４．全身性アレルギー反応抑制効果の検証
上記の結果により、本発明に係る乳酸菌生産物質はアレルギー性皮膚炎部位における炎症抑制効果を有することが見出された。これに対し、乳酸菌生産物質の全身性アレルギー反応に対する効果を測定するために、炎症性サイトカインであるＩＬ−４、血中ＩｇＥ及び血中ＩｇＡの発現量の測定を行った。
上記の結果により、本発明に係る乳酸菌生産物質はアレルギー性皮膚炎部位における炎症抑制効果を有することが見出された。これに対し、乳酸菌生産物質の全身性アレルギー反応に対する効果を測定するために、炎症性サイトカインであるＩＬ−４、血中ＩｇＥ及び血中ＩｇＡの発現量の測定を行った。
４−１．脾臓ＩＬ−４ ｍＲＮＡ発現量
脾臓はマウスから採取後、破砕してからＴＲＩＺＯＬに保存した。また、前述の方法でｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの調製及びＲＴ−ＰＣＲを行った。また、ＲＴ−ＰＣＲで使用したフォワードプライマー、リバースプライマーの塩基配列はそれぞれ以下のとおりであった。
（ＩＬ−４）
Ｆ：５´―ＴＣＴＣＧＡＡＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣ―３´
Ｒ：５´―ＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＡ―３´
脾臓はマウスから採取後、破砕してからＴＲＩＺＯＬに保存した。また、前述の方法でｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの調製及びＲＴ−ＰＣＲを行った。また、ＲＴ−ＰＣＲで使用したフォワードプライマー、リバースプライマーの塩基配列はそれぞれ以下のとおりであった。
（ＩＬ−４）
Ｆ：５´―ＴＣＴＣＧＡＡＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣ―３´
Ｒ：５´―ＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＡ―３´
ＤＮＦＢ（−）群における脾臓ＩＬ−４ ｍＲＮＡ発現量を１とし、これに対する他の群でのｍＲＮＡ発現量の相対値を図５で示す。ＤＮＦＢ（−）群で１であったのに対し対照群が５．７５７であり、ＤＮＦＢ感作によるアレルギー性皮膚炎の炎症部位以外においてもＩＬ−４の産生が促進されていることが分かった。また、これに対し、治療群３％では２．４３８、治療群５％では２．３１０、予防群３％では３．１１０、予防群５％では２．１６４であり、いずれの群においてもｍＲＮＡ発現の劇的な低下が見られた。
４−２．ＥＬＩＳＡ法による血中ＩｇＥ及び血中ＩｇＡの定量
ＥＬＩＳＡ法により血中ＩｇＥ及び血中ＩｇＡの定量を行った。
ＥＬＩＳＡキットとしては、血中ＩｇＥの定量にはレビス ＩｇＥ−ＥＬＩＳＡ キット（マウス） ＡＫＲＩＥ−１０（株式会社シバヤギ）を用い、血中ＩｇＡの定量にはＭｏｕｓｅ ＩｇＡ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！ ＥＬＩＳＡ ８８−５０４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、それぞれのキットに付属のプロトコールに従って測定を行った。
ＥＬＩＳＡ法により血中ＩｇＥ及び血中ＩｇＡの定量を行った。
ＥＬＩＳＡキットとしては、血中ＩｇＥの定量にはレビス ＩｇＥ−ＥＬＩＳＡ キット（マウス） ＡＫＲＩＥ−１０（株式会社シバヤギ）を用い、血中ＩｇＡの定量にはＭｏｕｓｅ ＩｇＡ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！ ＥＬＩＳＡ ８８−５０４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、それぞれのキットに付属のプロトコールに従って測定を行った。
４−２−１．血中ＩｇＥ濃度の定量結果
ＥＬＩＳＡ法による血中ＩｇＥ量の測定結果を図６で示す。血中ＩｇＥ濃度はＤＮＦＢ（−）群が１．１８（μｇ／ｍｌ）であったのに対し、対照群が１２．２３（μｇ／ｍｌ）であり、ＤＮＦＢ感作によって血中ＩｇＥ濃度が有意に上昇することが確認された。その一方で、治療群３％では１０．８２（μｇ／ｍｌ）、治療群５％では８．６０（μｇ／ｍｌ）、予防群３％では８．８１（μｇ／ｍｌ）、予防群５％では１０．００（μｇ／ｍｌ）であり、対照群に対していずれにおいても低下していた。
ＥＬＩＳＡ法による血中ＩｇＥ量の測定結果を図６で示す。血中ＩｇＥ濃度はＤＮＦＢ（−）群が１．１８（μｇ／ｍｌ）であったのに対し、対照群が１２．２３（μｇ／ｍｌ）であり、ＤＮＦＢ感作によって血中ＩｇＥ濃度が有意に上昇することが確認された。その一方で、治療群３％では１０．８２（μｇ／ｍｌ）、治療群５％では８．６０（μｇ／ｍｌ）、予防群３％では８．８１（μｇ／ｍｌ）、予防群５％では１０．００（μｇ／ｍｌ）であり、対照群に対していずれにおいても低下していた。
４−２−２．血中ＩｇＡ濃度の定量結果
ＥＬＩＳＡ法による血中ＩｇＡ濃度の測定結果を図７に示す。血中ＩｇＡ濃度はＤＮＦＢ（−）群が５０．１３（μｇ／ｍｌ）であったのに対し、対照群が２９．６９（μｇ／ｍｌ）であり、血中ＩｇＥとは反対にＤＮＦＢ感作によって血中ＩｇＡ濃度が有意に低下することが確認された。その一方で、治療群３％では３６．８０（μｇ／ｍｌ）、治療群５％では４３．０１（μｇ／ｍｌ）、予防群３％では４８．０３（μｇ／ｍｌ）、予防群５％では４９．６３（μｇ／ｍｌ）であり、いずれにおいても有意に増加した。
ＥＬＩＳＡ法による血中ＩｇＡ濃度の測定結果を図７に示す。血中ＩｇＡ濃度はＤＮＦＢ（−）群が５０．１３（μｇ／ｍｌ）であったのに対し、対照群が２９．６９（μｇ／ｍｌ）であり、血中ＩｇＥとは反対にＤＮＦＢ感作によって血中ＩｇＡ濃度が有意に低下することが確認された。その一方で、治療群３％では３６．８０（μｇ／ｍｌ）、治療群５％では４３．０１（μｇ／ｍｌ）、予防群３％では４８．０３（μｇ／ｍｌ）、予防群５％では４９．６３（μｇ／ｍｌ）であり、いずれにおいても有意に増加した。
４−３．全身性アレルギー反応抑制効果の検証結果
以上の結果より、脾臓におけるＩＬ−４の発現が抑制されたことでＩｇＭからＩｇＥへのクラススイッチが抑制され、反対にＩｇＡへのクラススイッチが促進されたことにより、血中ＩｇＥ濃度が低下したことが示唆された。
通常、過剰なＩｇＥ産生に伴いアレルギー症状が生じるものであるが、乳酸菌生産物質を摂取することで、全身レベルにおいてもアレルギー症状抑制効果を発揮することが示された。
以上の結果より、脾臓におけるＩＬ−４の発現が抑制されたことでＩｇＭからＩｇＥへのクラススイッチが抑制され、反対にＩｇＡへのクラススイッチが促進されたことにより、血中ＩｇＥ濃度が低下したことが示唆された。
通常、過剰なＩｇＥ産生に伴いアレルギー症状が生じるものであるが、乳酸菌生産物質を摂取することで、全身レベルにおいてもアレルギー症状抑制効果を発揮することが示された。
５．統計学的処理及び検定法
図１〜図７で示す各グラフにおいて、測定値は全て平均値±標準偏差で示している。統計学的検定法としてｔ検定を用い、対照群との間で両側検定を行った。各グラフにおいて、ｐ＜０．０５の場合を有意差ありと判定し、ｐ＜０．０５を＊で示し、ｐ＜０．０１を＊＊で示した。
図１〜図７で示す各グラフにおいて、測定値は全て平均値±標準偏差で示している。統計学的検定法としてｔ検定を用い、対照群との間で両側検定を行った。各グラフにおいて、ｐ＜０．０５の場合を有意差ありと判定し、ｐ＜０．０５を＊で示し、ｐ＜０．０１を＊＊で示した。
Claims (18)
- ラクトバシラス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌と、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌と、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌から選択した２、３または４種以上の乳酸菌を組み合わせて、その組み合わせに含まれる乳酸菌が異なる複数のグループを作り、そのグループごとに共棲培養する予備培養工程を含む乳酸菌生産物質の製造方法であって、
前記ラクトバシラス属に属する乳酸菌として、Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii）、Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、Ｌ．ガセリ（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、Ｌ．プランタラム（Lactobacillus plantarum）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．サリバリウス（Lactobacillus salivarius）の何れかを用い、前記ラクトコッカス属に属する乳酸菌として、Ｌ．ガルビアエ（Lactococcus garvieae）、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の何れかを用い、前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌として、Ｅ．デュランス（Enterococcus durans）、Ｅ．フェカリス（Enterococcus faecalis）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）の何れかを用い、
前記Ｌ．アシドフィラスを単独でＡグループとし、前記Ｌ．カゼイと前記Ｌ．ラクティス亜種ラクティスの２種をＢグループとし、前記Ｌ．デルブリッキィ亜種ブルガリクスと前記Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイの２種をＣグループとし、前記Ｅ．デュランスと前記Ｅ．フェシウムの２種をＤグループとし、前記Ｌ．ブレビスと前記Ｌ．プランタラムと前記Ｅ．フェシウムの３種をＥグループとし、前記Ｌ．デルブリッキィと前記Ｌ．ヘルベティカスと前記Ｅ．フェカリスの３種をＦグループとし、前記Ｌ．ガセリと前記Ｌ．ラモナウサスと前記Ｅ．フェシウムの３種をＧグループとし、前記Ｌ．ガセリと前記Ｌ．サリバリウスと前記Ｅ．デュランスの３種をＨグループとし、前記Ｌ．ガルビアエと前記Ｅ．デュランスと前記Ｅ．フェシウムの３種をＩグループとして、そのグループごとに共棲培養する予備培養工程と、
前記予備培養工程後に、用いる乳酸菌を全て含めた共棲培養工程と、を行う乳酸菌生産物質の製造方法。 - 前記Ｅ．デュランスと前記Ｅ．フェシウムとを含むＤグループを作り、これに前記Ｌ．ガルビアエを加えてＩグループを作る請求項１記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記予備培養工程が、上記ＡグループからＩグループまでの全てのグループを同一の培地を用いて培養する請求項１または請求項２記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記予備培養工程が、上記ＡグループからＩグループまでの全てのグループを３２℃〜３６℃で１２時間〜４８時間培養する請求項１〜請求項３何れか１項記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記用いる乳酸菌を全て含めた共棲培養工程として、３０℃〜３６℃で１２時間〜７２時間培養する３次培養工程を含む請求項１〜請求項４何れか１項記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記用いる乳酸菌を全て含めた共棲培養工程として、３８℃〜４３℃で４６時間〜５１時間培養する４次培養工程を含む請求項１〜請求項５何れか１項記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記グループごとに共棲培養する予備培養工程における培地に豆乳培地を用いる請求項１〜請求項６何れか１項記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 氷温保存した大豆を前記豆乳培地の原料として用いる請求項７記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記大豆は、氷温庫から出した後、氷温より高いが常温より低い５℃〜１５℃で６時間〜２４時間静置したものである請求項８記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記用いる乳酸菌を全て含めた共棲培養工程で得られた培養液を粉砕処理する粉砕処理工程を含む請求項１〜請求項９何れか１項記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 前記培養工程で得られた培養液をろ過するろ過工程を含む請求項１〜請求項１０何れか１項記載の乳酸菌生産物質の製造方法。
- 請求項１１記載のろ過工程によって得られるろ過液を有効成分として含有する乳酸菌生産物質。
- 前記ろ過液が、前記大豆成分と、前記乳酸菌の菌体成分とを含有する請求項１２記載の乳酸菌生産物質。
- 前記ろ過液が、前記乳酸菌の死菌に由来する菌体成分を含む請求項１２または請求項１３記載の乳酸菌生産物質。
- 前記ろ過液が、前記乳酸菌の生菌を含まない請求項１２〜請求項１４何れか１項記載の乳酸菌生産物質。
- 請求項１１記載のろ過工程によって得られる発酵残渣を有効成分として含有する乳酸菌生産物質。
- 請求項１２〜請求項１６何れか１項記載の乳酸菌生産物質を主成分とするアレルギー性皮膚炎抑制剤。
- 請求項１２〜請求項１６何れか１項記載の乳酸菌生産物質を主成分とする全身性アレルギー反応抑制剤。
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