JP5911131B2 - 新規ニトロキシルラジカル化合物及びその製造方法 - Google Patents

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Description

本出願は、2009年10月29日付出願の米国仮出願第61/256,184号に対して優先権を主張するものであり、前記仮出願の開示内容はすべて、本願発明に組み込まれるものである。
本発明は、2,6位置換ピペリジン系ニトロキシルラジカル及びその新規合成法に関する。
ニトロキシルラジカルは、比較的安定なラジカルとして知られているが、種々の活性酸素や酸化還元物質に対して鋭敏に反応することから、フリーラジカルが関与する様々な疾患に対するニトロキシルラジカルの効果が期待されている。
フリーラジカルが関与する疾患は、疾患の原因となるフリーラジカル種が異なるため、特定の疾患に特異的に働く有効なラジカル補足種が望まれている。これまでの研究により、ニトロキシルラジカルの基本骨格や側鎖の違いにより、その反応性が異なることが知られている(F.Vianello,et al.,Kinetics of nitroxide spin label removal in biological systems:An in vitro and in vivo ESR study.Magn Reson Imag, 1995.13(2):219−226.;W.R.Couet,et al.,Influence of chemical structure of nitroxyl spin labels on their reduction by ascorbic acid. Tetrahedron, 1985.41(7):1165−1172.;K. Takeshita, et al., Kinetic study on ESR signal decay of nitroxyl radicals,potent redox probes for in vivo ESR spectroscopy,caused by reactive oxygen species.Biochim Biophys Acta,2002.1573(2):156−64.)。例えば、ニトロキシルラジカルは、細胞内で、アスコルビン酸やチオール(金属が触媒する反応)、ミトコンドリア呼吸鎖、NADPH、シトクロムP450などと反応することが報告され、アポトーシスの誘発や、シトクロムP450を介したHの産生などが細胞毒性の原因となっていると報告されている。一方、テトラエチル基を有するニトロキシルラジカルは、アスコルビン酸との反応性が顕著に低下していることが報告されている。
近年、イソインドリン骨格のニトロキシルラジカルのα位の置換基をエチル基にすることによって、TEMPOと比較して、p−フェニレンジアミン(N.Kocherginsky and H.M.Swartz,Chemical reactivity of nitroxides,in Nitroxide Spin Labels:Reactions in Biology and Chemistry,N.Kocherginsky and H.M.Swartz,Editors.1995,CRC Press: Boca Raton.p.27−66.)やアスコルビン酸(L. Marx,et al.,A comparative study of the reduction by ascorbate of 1,1,3,3−tetraethylisoindolin−2−yloxyl and of 1,1,3,3−tetramethylisoindolin−2−yloxyl. J Chem Soc, Perkin Trans 1,2000:1181.)による還元に対して抵抗性が増すことが報告されている。また、イミダゾール骨格のニトロキシルラジカルのα位の炭素をエチル基に置換したものが、アスコルビン酸に対して還元抵抗性を示すことが報告されている(A.A.Bobko,et al.,Reversible reduction of nitroxides to hydroxylamines:roles for ascorbate and glutathione.Free Radic Biol Med,2007.42(3):404−12.)。このように、ニトロキシルラジカルのα位の置換基を変えることによって、様々な物質に対する反応性を制御できると考えられる。
2,6位置換ニトロキシルラジカルの従来の合成法を下記に示す。
Figure 0005911131
図に示すように、従来法は、反応ステップが多く煩雑であり、そのため2,6位置換ニトロキシラジカルの収率が非常に低いという課題が挙げられる。この課題を解決するために、簡便かつ高収率で2,6位に様々な置換基を導入するニトロキシラジカルの合成法の開発が望まれている。
また、当該発明者により開発されたニトロキシラジカルの製造方法が、国際特許公開第WO2008/093881号に開示されており、本特許出願は、この参照により本願明細書に組み込まれるものである。
発明者らは、上記課題を解決するために、様々な検討を重ねた結果、2,6位置換ピペリジン系ニトロキシルラジカルの簡便且つ高収率合成方法を開発した。さらに、当該製造方法により得られたニトロキシルラジカルの有効性を検討したところ、アジュバンド関節炎モデルラットにおける胃粘膜損傷抑制効果、並びに血圧降下作用を有することが明らかとなった。
当該発明方法によると、1,2,2,6,6−ペンタアルキルピペリジン−4−オンを出発原料として、アンモニウム塩の存在下、カルボニル化合物を反応させると、2及び6位が置換されたピペリドンが生成され、更に、この化合物を酸化することにより、2及び6位が置換されたニトロキシラジカルが得られる。
本願発明の特徴としては、窒素原子上にメチル基などのアルキル基を有する、2,6置換ピペリジンを用いることである。窒素上にメチル基を有する1,2,2,6,6−ペンタメチルピペリジン−4−オンを用いた場合、2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−4−オンと比べて、顕著な収率の上昇並びに反応促進効果が見られた。従って、当該反応は、窒素上にメチル基などのアルキル基が置換されているピペリジン化合物を出発物質として用いることが最も重要である。
Figure 0005911131
本願製造方法に使用される前記ケトンとしては、例えば、シクロヘキサノン、ピラン環、チオピラン環、アセトアミノフェンなどの環状・鎖状カルボニル化合物やベンズアルデヒドなどが用いられる。
具体的なカルボニル化合物と対応する生成物(ピペリドン)を表2に示す。
Figure 0005911131
Figure 0005911131
Figure 0005911131
上記表から明らかなように、環状構造を有するカルボニル化合物と、直鎖状カルボニル化合物では、ピロリドン生成物に対して異なる選択性が見られる。つまり、環構造を有するカルボニル化合物を原料として用いた場合、二置換体が主生成物として得られるのに対して、直鎖状のカルボニル化合物を原料として用いた場合には、一置換体が主生成物として得られる。また、フェニル基をもつカルボニル化合物の場合では、一置換体が選択的に得られる。さらに、2−アダマンタノンをカルボニル化合物として用いた場合、一置換体と二置換体の両方が得られる。
上述したように、ケトンの立体構造により、ピぺリドン誘導体生成物に対する一置換体及び二置換体の選択性が異なること、並びに、NHClを15NHClに変えてTEMPONEを出発物質に用いて当該発明を行うと、[15N]TEMPONEが得られることなどから、以下のスキームで示される反応機構が推測される。
Figure 0005911131
当該発明の製造方法において、ピぺリドン誘導体の生成工程において用いられる塩基は、塩化アンモニウムが使用されるが、これに限られるものではない。
また、塩化アンモニウムと共に、水酸化セシウム(CsOH)、又はベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド(トリトンB)を用いた場合、収率の向上が見られる。
ピぺリドン誘導体からニトロキシラジカル誘導体への酸化は、一般に、タングステン触媒と過酸化水素が用いられるが、これに限られるものではない。2,6位アダマンタン置換ニトロキシルラジカルへの酸化には、MCPBAが用いられる。
当該発明の製造方法により得られるニトロキシラジカル誘導体を、10mM PB(pH7.4)に溶解し(50μM)、室温下測定することで、ESRパラメーターを算出した。ただし、溶解性の点から、12は0.5%EtOHを含む。結果を下記表に示した。
Figure 0005911131
Figure 0005911131
Figure 0005911131
本発明の一実施形態によると、当該発明は、化学式1で示されるニトロキシラジカル化合物の製造方法であって、
Figure 0005911131
式中、
〜Rは、独立して、C〜C10のアルキルであるか、或いは、R及びR、又はR及びRが共に結合して、(CH、(CHO(CH、(CHSO(CH、(CHNX(CH、(CHCY(CH
Xは、CHCO、CFCO、又はRCOであり、
Yは、酸素(=O)、(OCHであり、
nは2〜4の整数であり、
当該方法は、
化学式2で示される化合物であって、
Figure 0005911131
式中、
〜Rは、独立して、C1〜C20のアルキルである、化学式2で示される化合物と、
化学式3で示される化合物であって、
Figure 0005911131
式中、
〜Rは、独立して、C〜C10のアルキル、R及びR、又はR及びRが共に結合して、(CH、(CHO(CH、(CHS(CH、(CHNX(CH、(CHCY(CH
Xは、CHCO、CFCO、又はRCOであり、
Yは、酸素(=O)、(OCHであり、
nは2〜4の整数である、化学式3で示される化合物と
をアンモニウム塩の存在下にて反応させることにより、2,6置換−4−ピペリドン誘導体を生成させる工程と、
前記2,6置換−4−ピペリドン誘導体を酸化させる工程と、
を有する、前記ニトロキシラジカル化合物の製造方法が提供される。
また、本発明に係る他の一実施形態によれば、上記製造方法によって製造された化合物が提供される。この場合、この化合物は、胃粘膜損傷(胃潰瘍)又は高血圧の治療に使用されることができる。
さらに、本発明に係る別の一実施形態によれば、上記化合物と薬学的に許容可能な担体とを有する医薬組成物が提供される。
また、本発明に係る他の一実施形態によれば、胃粘膜損傷(胃潰瘍)を治療する方法であって、この方法は、上記化合物を対象に投与する工程を含むものである方法、並びに高血圧を治療する方法であって、この方法は、上記化合物を対象に投与する工程を含むものである方法が提供される。この場合、当該2つの方法において、前記化合物は、約0.0001〜4g/日の量で投与されることが好ましい。さらに、胃粘膜損傷(胃潰瘍)を治療する際に、当該化合物が18mMである場合、90μmol/kgの用量で投与されることができる。
図1は、本発明の一実施形態に係るニトロキシルラジカル化合物の細胞毒性の評価を示すグラフである。 図2は、本発明の一実施形態に係るニトロキシルラジカル化合物の胃粘膜に与える影響を示すグラフである。 図3は、本発明の一実施形態に係るニトロキシルラジカル化合物の血圧変動に及ぼす影響を示すグラフである。
以下に、実施例を用いて本発明について説明するが、本発明は、これらに限定されるものではないことが理解される。
試薬はSigma−Aldrich、和光純薬工業株式会社より購入し、精製せず用いた。融点は微量融点測定装置MP−500P(Yanaco)を用いて測定した。質量分析はJMS−600H(JEOL)にて測定し、3−ニトロベンジルアルコールをマトリックスとして用いた。IRスペクトルはFT/IR−4200(JASCO)を用い、溶液法または全反射法にて測定した。H−NMRはUnity INOVA 400(Varian)を用いて測定し、標準物質としてtetramethylsilane(TMS)を用いた。化学シフト(δ)はTMS(0ppm)を基準とし、カップリング定数はHz単位で示した。元素分析は九州大学理学部中央元素分析所に測定を依頼した。
7−Azadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3a)
方法A
2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−4−オン(1)1.55g(10mmol)とシクロヘキサノン(a)2.94g(30mmol)をDMSO 15mlに溶解し、NHCl 3.21g(60mmol)を室温下で加えた。この溶液を60℃で20時間撹拌した。水を40mL加え希釈し、7%塩酸水溶液で酸性にした。これを、エーテルで洗浄し、水層を10%KCO水溶液でアルカリ性にした。さらに、これを酢酸エチルで抽出し、水洗を行い、有機層を硫酸ナトリウム乾燥し、溶媒を完全に留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、再結晶を行い白色結晶376mg(収率:16%)を得た。
方法B
1,2,2,6,6−ペンタメチルピペリジン−4−オン(2)1.69g(10mmol)とシクロヘキサノン(a)2.94g(30mmol)をDMSO15mlに溶解し、NHCl3.21g(60mmol)を室温下で加えた。この溶液を60℃で5時間撹拌した。水を40mL加え希釈し、7%塩酸水溶液で酸性にした。これを、エーテルで洗浄し、水層を10%KCO水溶液でアルカリ性にした。さらに、これを酢酸エチルで抽出し、水洗を行い、有機層を硫酸ナトリウム乾燥し、溶媒を完全に留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、再結晶を行い白色結晶799mg(収率:34%)を得た。
mp:103℃(hexane−EtOAc,lit.mp 101−103℃[19]);
MS(FAB):236.3(M+1);
νmax/cm−1:1689(C=O);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.36−1.46(8H,m),1.47−1.56(8H,m),1.68−1.71(4H,m),2.31(4H,s);
Found:C,76.51;H,10.68;N,5.93%.Calc.forC1525NO:C,76.55;H,10.71;N,5.95%.
7−Aza−3,11−dioxadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one (3b)
方法Bに従って、シクロヘキサノン(a)をテトラヒドロ−4H−ピラン−4−オン(b)3.00g(30mmol)に変えて行った。得られた結晶はHexane−EtOAcから再結晶した。
収率:32%;
mp:167℃;
MS(FAB):240.1 (M+1);
νmax/cm−1:1692(C=O);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.64(8H,t,J=5.6Hz),2.40(4H,s),3.54−3.60(4H,m),3.81−3.87(4H,m);
Found:C,65.17;H,8.85;N,5.86%.Calc.for C1321NO:C,65.25;H,8.84;N,5.85%.
7−Aza−3,11−dithiadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3c)
方法Bに従ってシクロヘキサノン(a)をテトラヒドロ−4H−チオピラン−4−オン(c) 3.49g(30mmol)に変えて行った。
収率:30%;
mp:155−157℃(EtOAc);
MS(FAB):272.2(M+1);
νmax/cm−1:1697(C=O);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):0.8(1s,br s),1.75−1.90(8H,m),2.27(4H,s),2.43−2.50(4H,m),2.88−2.95(4H,m);
Found:C,57.54;H,7.78;N,5.11%.Calc.for C1321NOS:C,57.52;H,7.80;N,5.16%.
3,11−Diacetyl−3,7,11−trithiadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one (3d)
9−Acetyl−2,2−dimethyl−1,9−diazaspiro[5.5]undecan−4−one(3d’)
方法Bと同様に1,2,2,6,6−ペンタメチルピペリジン−4−オン(2)0.845 g (5mmol)、1−アセチル−4−ピペリドン(d)2.12g(15mmol)、NHCl 1.61g(30mmol)、DMSO 12mlの混合物を58〜62℃で8時間加熱撹拌する。水40mLで希釈し、7%塩酸水溶液で酸性にした後、エーテルで中性部分を抽出除去した。水層を10%KCO水溶液でpH 9〜10に調整し、クロロホルムで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下、留去して得られた油状物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(1〜5%MeOH/CHCl)で精製し、hexane−EtOAcから再結晶を行い、3d 328mg、3d’556mgを得た。
3d;
収率:21%;
mp:164.2℃;
MS(FAB):322.3(M+1);
νmax/cm−1:1687(C=O),1634(N−Ac);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.58−1.66(8H,m),2.08(6H,s),2.38(4H,s),3.37−3.71(8H,m);
Found:C,62.92;H,8.62;N,12.12%.Calc.for C1727:C,63.53;H,8.47;N,13.07%.
3d’;
収率:47%;
mp:80.4℃(hexane−EtOAc);
MS(FAB):239.2(M+1);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.21(6H,d,J=13.6Hz),1.50−1.69(4H,m),2.05(3H,s),2.28(4H,d,J=9.2Hz),3.34−3.78(4H,m);
Found:C,64.86;H,9.28;N,11.67%.Calc.for C1322:C,65.51;H,9.30;N,11.75%.
1,4,14,17−Tetraoxa−9−azatetraspiro[4.2.1.2.4.2.3.2]tetracosan−21−one(3e)
方法Bに従ってシクロヘキサノン(a)を1,4−シクロヘキサンジオンモノエチレンアセタール(e)4.69g(30mmol)に変えて行い、Hexane−EtOAcから再結晶を行い3e 1.12gを得た。
収率:32%;
mp:190.6℃;
MS(FAB):352.4(M+1).
νmax/cm−1:1699(C=O),1083(−O−CH−CH−O−);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.56−1.74(12H,m),1.85−1.92(4H,m),2.32(4H,s),3.93(8H,t,J=2.8Hz);
Found:C,64.95;H,8.30;N,4.05%.Calc.for C1929NO:C,64.93;H,8.32;N,3.99%.
2,2,6−Trimethyl−6−phenylpiperidin−4−one (3f)
方法Bに従ってシクロヘキサノン(a)をアセトフェノン(f) 3.60 g (30 mmol)に変えて行った。
収率:16%;
mp:109.5℃(EtOAc);
MS(FAB):218.2(M+1).
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.20(3H,s),1.31(3H,s),2.23−2.50(4H,m),2.34(3H,s),4.17−4.20(1H,m),7.11−7.33(4H,m);
Found:C,77.92;H,8.78;N,6.44%.Calc.for C1929NO:C,77.38;H,8.81;N,6.45%.
Methyl 3−(2,6,6−trimethyl−4−oxopiperidin−2−yl)propanoate(3g)
方法Bに従ってシクロヘキサノンをレブリン酸メチル(g)に変えて行った。この化合物は、二置換体との混合物が得られており、単離には至っていない。構造の同定は、3gを酸化して得られるMethyl 3−(2,6,6−trimethyl−4−oxopiperidin−1−oxyl−2−yl)propanoate(4g)で行った。
2,2−Dimethyl−6−p−tolylpiperidin−4−one(3h)
方法Bに従ってシクロヘキサノン(a)をp−トルアルデヒド(h)3.60g(30mmol)に変えて行った。
収率:10%;
mp:109.5℃(hexane);
MS(FAB):218.2(M+1);
νmax/cm−1:1693(C=O);
H−NMR(500MHz;CDCl)δ(ppm):1.20(3H,s),1.31(3H,s),1.53(1H,brs),2.25−2.50(4H,m),2.34(3H,s),4.18(1H,dd,J=11.5Hz,J=3.5Hz),7.16(2H,d,J=8.0Hz),7.29(2H,d,J=8.0Hz);
Found:C,77.55;H,8.82;N,6.53%.Calc.for C1419NO:C,77.38;H,8.81;N,6.45%.
3,11−Trifluoroacetyl−3,7,11−trithiadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3i)
9−Trifluoroacetyl−2,2−dimethyl−1,9−diazaspiro[5.5]undecan−4−one(3i’)
方法Bに従ってシクロヘキサノン(a)を1−トリフルオロアセチル−4−ピペリドン(i)5.85g(30mmol)に変えて行った。EtOAcで中性部分を抽出除去し、pH9〜10に調整後、CHClで抽出した。Hexane−EtOAcから再結晶し、3i 192mg、3i’126mgを得た。
3i;
収率:4%;
mp:172.6−173.2℃;
MS(FAB):430.2(M+1);
νmax/cm−1:1688(−N−CO−CF);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.64−1.77(8H,m),2.42(4H,s),3.57−3.82(8H,m);
Found:C,47.62;H,5.01;N,9.79%.Calc.for C1721:C,47.56;H,4.93;N,9.79%.
3i’;
収率:4%;
mp:85.8−86.4℃(hexane−EtOAc);
MS(FAB):293.1(M+1);
νmax/cm−1:1692(−N−CO−CF);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.23(3H,s),1.25(3H,s),1.62−1.80(4H,m),2.30(2H,s),2.33(2H,s),3.54−3.96(4H,m),;
Found:C,53.30;H,6.44;N,9.58%.Calc.for C1319:C,53.42;H,6.55;N,9.58%.
方法C
7−Aza−15−oxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4a)
7−Azadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3a)235mg(0.99mmol)をエタノール10mLに溶解し、NaWO・2HO 50mg(0.15mmol)を加え、この溶液にH(30%)2mLを徐々に加えた。これを室温下、24時間撹拌した。その後、KCOを加えクエンチし、クロロホルムで抽出した。続いて、溶媒を完全に留去し、再結晶(ヘキサン)により精製し、微黄色鱗片状結晶208mg(収率:83%)を得た。
mp:114.2°C(lit.mp 114−116°C);
MS (FAB):250.3(M);
νmax/cm−1:1717(C=O);
Found:C,71.86;H,9.62;N,5.57%.Calc.for C1524NO:C,71.96;H,9.66;N,5.59%.
7−Aza−3,11−dioxa−15−oxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4b)
方法Cに従って7−Aza−3,11−dioxadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3b)130mg(0.54mmol)を原料として行った。EtOAcから再結晶し、4b 110mg(0.43mmol)を得た。
収率:80%;
mp:149.5°C;
MS(FAB):255.2(M+2);
νmax/cm−1:1717(C=O);
Found:C,61.23;H,7.97;N,5.40%.Calc.for C1320NO:C,61.40;H,7.93;N,5.51%.
7−Aza−3,11−dithia−3,3,11,11,15−pentaoxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4c)
7−Aza−3,11−dithiadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3c)210mg(0.78mmol)、NaWO・2HO 118mg(0.36mmol)、MeOH 3ml、及び、H(30%)1mLを混合し、室温で48時間撹拌した。KCOを加え、CHCl:MeOH=3:1の混合溶媒で抽出し、溶媒を留去した。これを、水から再結晶し4c 80mg(0.23mmol)を得た。
収率:29%;
mp:212.5−214.2°C;
MS(FAB):351.0(M+1);
νmax/cm−1:1712(C=O),1287(SO),1122(SO);
Found:C,44.38;H,5.79;N,3.93%.Calc.for C1321NO:C,44.56;H,5.75;N,4.00%.
3,11−Diacetyl−15−oxo−3,7,11−trithiadispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4d)
方法Cに従って3,11−Diacetyl−3,7,11−trithiadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3d)を原料として行った。
mp:162−163°C;
MS(FAB):337.3(M+1);
νmax/cm−1:1720(C=O),1637(−N−CO−CH);
1,4,14,17−Tetraoxa−9−aza−21−oxotetraspiro[4.2.1.2.4.2.3.2]tetracos−9−yl−9−oxyl(4e)
方法Cに従って1,4,14,17−Tetraoxa−9−azatetraspiro[4.2.1.2.4.2.3.2]tetracosan−21−one(3e)を原料として行った。
mp:183.2−184.2°C;
MS(FAB):367.3(M+1);
νmax/cm−1:1713(C=O);
Found:C,62.18;H,7.38;N,3.88%.Calc.for C1928NO:C,62.28;H,7.70;N,3.82%.
7−Aza−3,11,15−trioxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4e’)
1,4,14,17−Tetraoxa−9−azatetraspiro[4.2.1.2.4.2.3.2]tetracosan−21−one(3e)536mg(1.53mmol)を水2mLと酢酸5mLに溶解し、10%HClを滴下し、70℃で撹拌した。この溶液を水で希釈し、pHを7に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を完全に留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーhexane/EtOAc,1:4)で分離精製し、再結晶(ヘキサン、酢酸エチル)により7−Aza−3,11,15−trioxodispiro[5.1.5.3]hexadecaneの白色個体330mg(1.25mmol)を得た。
収率:82%
mp:99.7℃;
MS(FAB):264.2(M+1);
νmax/cm−1:1705(C=O);
H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.24(1H,brs),1.87−2.05(8H,m),2.29−2.67(8H,m),2.49(4H,s);
Found:C,76.51;H,10.68;N,5.93%.Calc.for C1525NO:C,76.55;H,10.71;N,5.95%.
続いて、得られた7−Aza−3,11,15−trioxodispiro[5.1.5.3]hexadecane 215mg(0.82mmol)を方法Cに従って酸化し、4e’170mg(0.61mmol)を得た。
収率:75%
mp:161.5℃;
MS(FAB):279.3(M+1);
νmax/cm−1:1708(C=O);
Found:C,64.71;H,7.25;N,5.06%.Calc.for C1520NO:C,64.73;H,7.24;N,5.03%.
Methyl 3−(2,6,6−trimethyl−4−oxopiperidin−1−oxyl−2−yl)propanoate(4g)
方法Cに従ってMethyl 3−(2,6,6−trimethyl−4−oxopiperidin−2−yl)propanoate(3g)と二置換体の混合物147mgを原料として用い、赤色油状物質を得た37mg(0.15mmol)。
MS(FAB):242.2(M);
νmax/cm−1:1720(C=O);
Found:C,58.93;H,8.27;N,5.65%.Calc.for C1220NO:C,59.49;H,8.32;N,5.78%.
3,11−Trifluoroacetyl−3,7,11−trithia−15−oxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4i)
方法Cに従って3,11−Trifluoroacetyl−3,7,11−trithiadispiro[5.1.5.3]hexadecan−15−one(3i)130mg(0.30mmol)を原料として行い、4i 57mg(0.13mmol)を得た。
収率:42%
MS(FAB):445.1(M+1);
Found:C,44.90;H,4.46;N,9.25%.Calc.for C1720:C,45.95;H,4.54;N,9.46%.
7−[ 15 N]−Aza−15−oxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(5a)
NHClを15NHClに変えて、7−Aza−15−oxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4a)と同様に行った。
mp:115.4−117.4℃(hexane);
MS(FAB):251.3(M+1);
νmax/cm−1:1717(C=O);
Found:C,71.67;H,9.79;N,5.67%.Calc.for C1524 15NO:C,71.68;H,9.62;N,5.57%.
7−[ 15 N]−Aza−3,11−Dioxa−15−oxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(5b)
NHClを15NHClに変えて、7−Aza−3,11−Dioxa−15−oxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4b)と同様に行った。
mp:171.7−172.0℃(EtOAc);
MS(FAB):256.23(M+1);
νmax/cm−1:1719(C=O);
Found:C,61.18;H,7.90;N,5.52%.Calc.for C1320 15NO:C,61.16;H,7.90;N,5.48%.
7−[ 15 N]−Aza−3,11,15−trioxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(5c)
NHClを15NHClに変えて、7−Aza−3,11,15−trioxodispiro[5.1.5.3]hexadec−7−yl−7−oxyl(4e’)と同様に行った。
mp:165.8℃(Hexane−EtOAc);
MS(FAB):280.22(M+1);
νmax/cm−1:1707(C=O);
Found:C,64.47;H,7.22;N,5.01%.Calc.for C1520 15NO:C,64.50;H,7.22;N,5.01%.
2,2−diethyl−6,6−dimethylpiperidin−4−one (1)
1,2,2,6,6−ペンタメチルピペリジン−4−オン1.69g(10mmol)と3−ペンタノン5.16g(60mmol)をDMSO 28mlに溶解し、CsOH 1.50g(10mmol)、NHCl 3.22g(60mmol)を室温下で加えた。この溶液を80℃で4時間攪拌した。水を適量加えて希釈し、7〜8%塩酸水溶液で酸性にした。これを、エーテルで洗浄し、水層をKCO水溶液でアルカリ性にした。さらに、これを酢酸エチルで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を完全に留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、淡黄色油状物質25mg(収率:1%)を得た。
方法B
2,2−dimethyl−6,6−dipropylpiperidin−4−one (3)
1,2,2,6,6−ペンタメチルピペリジン−4−オン1.69g(10mmol)と4−ヘプタノン3.43g(30mmol)をDMSO 16mlに溶解し、TritonB 2ml(4.40mmol)、NHCl 2.68g(50mmol)を室温下で加えた。この溶液を50℃で4.5時間攪拌した。水を適量加えて希釈し、7〜8%塩酸水溶液で酸性にした。これを、エーテルで洗浄し、水層をKCO水溶液でアルカリ性にした。さらに、これを酢酸エチルで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を完全に留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、得られた結晶をヘキサンから再結晶し、淡黄色針状結晶368mg(収率:17%)を得た。mp:53.4−55.0℃;MS(FAB):212.2(M+1);vmax/cm−1:1690(C=O);H−NMR(300MHz;CDCl)δ(ppm):0.88(6H,t,J=7.05Hz),1.21(6H,s),1.26−1.45(8H,m),2.23(2H,s),2.26(2H,s);Found:C,73.74;H,11.88;N,6.67%.Calc.for C1325NO:C,73.88;H,11.92;N,6.63%.
2,2−dimethyl−6,6−dipropyl−4−oxo−piperidin−1−yl 1−oxyl(4)
方法Aに従って、2,2−dimethyl−6,6−dipropylpiperidin−4−one(3)59mg(0.28mmol)を原料として行った。反応溶液は、室温で一晩攪拌した。また、反応の進行をTLCで確認し、HとNaWO・2HOを適宜追加した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、橙色油状物質38mg(収率:60%)を得た。MS(FAB):226.3(M);vmax/cm−1:1720(C=O);Found:C,68.95;H,10.76;N,6.28%.Calc.for C1324NO:C,68.99;H,10.69;N,6.19%.
2,2−dibutyl−6,6−dimethylpiperidin−4−one (5)
方法Bに従って、4−ヘプタノンを5−デカノン4.27g(30mmol)に変えて行った。反応溶液は、60℃の水浴中で4時間攪拌した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル,85:15)で精製し、淡黄色油状物質106mg(収率:4%)を得た。MS(FAB):240.3(M+1);vmax/cm−1:1705(C=O);H−NMR(300MHz;CDCl)δ(ppm):0.89(6H,t,J=6.7Hz),1.25(6H,s),1.24−1.56(12H,m),2.23(2H,s),2.26(2H,s);Found:C,74.83;H,11.96;N,5.97%.Calc.for C1529NO:C,75.26;H,12.21;N,5.85%.
2,2−dibutyl−6,6−dimethyl−4−oxo−piperidin−1−yl 1−oxyl(6)
方法Aに従って、2,2−dibutyl−6,6−dimethylpiperidin−4−one(5)100mg(0.42mmol)を原料として行った。反応溶液は、室温で一晩攪拌した。また、反応の進行をTLCで確認し、HとNaWO・2HOを適宜追加した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、橙色油状物質53mg(収率:50%)を得た。MS(FAB):254.3(M);vmax/cm−1:1720(C=O);Found:C,70.55;H,11.05;N,5.24%.Calc.for C1528NO:C,70.82;H,11.09;N,5.51%.
2−butyl−2,6,6−trimethylpiperidin−4−one (7)
2,6−dibutyl−2,6−dimethylpiperidin−4−one (9)
方法Bに従って、4−ヘプタノンを2−ヘキサノン3.00g(30mmol)に変えて行った。反応溶液は、50℃の水浴中で2.5時間攪拌した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル,9:1)で精製し、淡黄色油状物質(7)239mg(収率:12%)と淡黄色油状物質(9)98mg(収率:4%)を得た。(7):MS(FAB):198.3(M+1);vmax/cm−1:1703(C=O);H−NMR(300MHz;CDCl)δ(ppm):0.90(3H,t,J=7.1Hz),1.16(3H,s),1.23(6H,s),1.29−1.33(6H,m),2.22−2.26(4H,m);Found:C,72.83;H,11.63;N,7.02%.Calc.for C1223NO:C,73.04;H,11.75;N,7.10%.(9):MS(FAB):240.4(M+1);vmax/cm−1:1706(C=O);H−NMR(300MHz;CDCl)δ(ppm):0.91(6H,t,J=3.3Hz),1.14(6H,s),1.28−1.46(12H,m),2.18−2.31(4H,m);Found:C,75.15;H,12.11;N,5.75%.Calc.for C1529NO:C,75.26;H,12.21;N,5.85%.
2−butyl−2,6,6−trimethyl−4−oxo−piperidin−1−yl 1−oxyl(8)
方法Aに従って、2−butyl−2,6,6−trimethylpiperidin−4−one(7)199mg(1.01mmol)を原料として行った。反応溶液は、室温で一晩攪拌した。また、反応の進行をTLCで確認し、HとNaWO・2HOを適宜追加した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル,95:5)で精製し、橙色油状物質68mg(収率:32%)を得た。MS(FAB):212.3(M);vmax/cm−1:1720(C=O);Found:C,68.01;H,10.44;N,6.53%.Calc.for C1222NO:C,67.89;H,10.44;N,6.60%.
2,6−dibutyl−2,6−dimethyl−4−oxo−piperidin−1−yl−oxyl(10)
方法Aに従って、2,6−dibutyl−2,6−dimethylpiperidin−4−one(9)77mg(0.32mmol)を原料として行った。反応溶液は、室温で一晩攪拌した。また、反応の進行をTLCで確認し、HとNaWO・2HOを適宜追加した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、橙色油状物質25mg(収率:31%)を得た。MS(FAB):254.3(M);vmax/cm−1:1720(C=O);Found:C,70.94;H,10.98;N,5.18%.Calc.for C1528NO:C,70.82;H,11.09;N,5.51%.
2,2,6−trimethyl−6−octylpiperidin−4−one (11)
方法Bに従って、4−ヘプタノンを2−デカノン4.69g(30mmol)に変えて行った。反応溶液は、50℃の水浴中で4時間攪拌した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、淡黄色油状物質137mg(収率:5%)を得た。MS(FAB):254.3(M+1);vmax/cm−1:1708(C=O);H−NMR(300MHz;CDCl)δ(ppm):0.87(3H,t,J=5.7Hz),1.16(3H,s),1.22(6H,s),2.16−2.29(4H,m);Found:C,75.57;H,12.15;N,5.09%.Calc.for C1631NO:C,75.83;H,12.33;N,5.53%.
2,2,6−trimethyl−6−octyl−4−oxo−piperidin−1−yl 1−oxyl(12)
方法Aに従って、2,2,6−trimethyl−6−octylpiperidin−4−one(11)100mg(0.39mmol)を原料として行った。反応溶液は、室温で一晩攪拌した。また、反応の進行をTLCで確認し、HとNaWO・2HOを適宜追加した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、橙色油状物質78mg(収率:74%)を得た。MS(FAB):268.3(M);vmax/cm−1:1721(C=O);Found:C,71.45;H,11.13;N,5.10%.Calc.for C1630NO:C,71.59;H,11.27;N,5.22%.
2,2−dimethyl−6−spiro−2’−tricyclo[3.3.1.1 3’,7’ ]decanepiperidine−4−one(13)
2,6−dispiro−2’,2’−ditricyclo[3.3.1.1 3’,7’ ]decanepiperidine−4−one(16)
方法Bに従って、4−ヘプタノンを2−アダマンタノン4.51g(30mmol)に変えて行った。反応条件はTableに示した。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、得られた結晶をヘキサンからそれぞれ再結晶し、白色針状結晶(13)と淡黄色鱗片状結晶(16)を得た。(13):収率:(粗結晶);mp:92.5−92.6℃;MS(FAB):248.3(M+1);vmax/cm−1:1699(C=O);H−NMR(300MHz;CDCl)δ(ppm):1.23(6H,s),1.50−1.95(14H,m),2.27(2H,s),2.53(2H,s);Found:C,77.65;H,10.12;N,5.60%.Calc.for C1625NO:C,77.68;H,10.19;N,5.66%.(16):収率:0.62%(2.5時間50℃)(粗結晶);mp:131.2−131.5℃;MS(FAB):340.4(M+1);vmax/cm−1:1709(C=O);H−NMR(400MHz;CDCl)δ(ppm):1.25(brs),1.56−1.69(m),1.79−1.92(m),2.33(brs),2.36(brs),2.61(4H,s);Found:C,81.30;H,9.77;N,4.07%.Calc.for C2333NO:C,81.37;H,9.80;N,4.13%.
方法C
2,2−dimethyl−6−spiro−2’−tricyclo[3.3.1.1 3’,7’ ]decane−4−oxo−piperidin−1−yl 1oxyl (14)
2,2−dimethyl−6−spiro−2’−tricyclo[3.3.1.13’,7’]decanepiperidine−4−one(13)410mg(1.66mmol)をクロロホルム30mlに溶解し、氷浴中で攪拌した。MCPBA371mg(1.66mmol)を加え、15分後に室温に戻し、さらに2時間攪拌を続けた。クロロホルムで抽出を行い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を完全に留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、得られた結晶をジイソプロピルエーテルから再結晶し、橙色鱗片状結晶172mg(収率:40%)を得た。mp:134.7−135.3℃;MS(FAB):262.3(M);vmax/cm−1:1709(C=O);Found:C,73.13;H,9.14;N,5.29%.Calc.for C1624NO:C,73.25;H,9.22;N,5.34%.
2,2−dimethyl−6−spiro−2’−tricyclo[3.3.1.1 3’,7’ ]decane −4−hydroxy−piperidin−1−yl 1oxyl (15)
2,2−dimethyl−6−spiro−2’−tricyclo[3.3.1.13’,7’]decane−4−oxo−piperidin−1−yl 1oxyl(14)180mg(0.73mmol)をエタノール5mlに溶解し、水浴中で攪拌した。NaBH34mg(0.91mmol)を加え、室温に戻し、一晩攪拌を続けた。また、反応の進行をTLCで確認し、NaBHを適宜追加した。これをクロロホルムで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を完全に留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール,99:1)で精製し、得られた結晶を酢酸エチルから再結晶し、赤紫色鱗片状結晶89mg(収率:46%)を得た。mp:132.0−133.6℃;MS(FAB):264.3(M);vmax/cm−1:3407(br,OH);Found:C,72.55;H,9.89;N,5.36%.Calc.for C1624NO:C,72.69;H,9.91;N,5.30%.
2,6−dispiro−2’,2’−ditricyclo[3.3.1.1 3’,7’ ]decanepiperidine−4−oxo−piperidin−1−yl 1−oxyl(17)
方法Cに従って、2,6−dispiro−2’,2’−ditricyclo[3.3.1.13’,7’]decanepiperidine−4−one(16)149mg(0.439mmol)を原料として行った。抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル)で精製し、得られた結晶をヘキサンから再結晶し、紫色球状結晶18mg(収率:12%)を得た。mp:154.6−160.9℃;MS(FAB):354.3(M);vmax/cm−1:1705(C=O);Found:C,77.67;H,9.03;N,3.76%.Calc.for C2332NO:C,77.92;H,9.10;N,3.95%.
細胞毒性
ニトロキシルラジカルは、細胞内で、アスコルビン酸やチオール(金属が触媒する反応)、ミトコンドリア呼吸鎖、NADPH、シトクロムP450などと反応することが報告され、アポトーシスの誘発や、シトクロムP450を介したHの産生などが細胞毒性の原因となっていると報告されている。一方、テトラエチル基を有するニトロキシルラジカルは、アスコルビン酸との反応性が顕著に低下していることを、本発明者らは報告している。そこで、合成したニトロキシルラジカル化合物の細胞毒性を評価した。
方法
HUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)はブレットキットEGMを培地として用いて、37℃、5%CO下、COインキュベーターで培養した。また、HUVECは対数増殖期を維持するために、一定の間隔で継代を行い、2〜5代培養の間を実験に用いた。HUVEC(5000cells/well)は、コラーゲンIコートした透明平底プレートを用いて、各濃度のニトロキシルラジカルを添加後、24時間インキュベートし、細胞生存率をWST−1法により解析した。24時間インキュベート後、WST−1試薬を各ウェル10μlずつ添加し、3時間インキュベート後、450nmの吸光度をプレートリーダーにて測定した。ポジティブコントロールに2%Tween20、ネガティブコントロールにPBSを用い、データはコントロールに対する相対値(%)で表した。
結果
HUVEC細胞にニトロキシルラジカル化合物を添加し、24時間後の細胞増殖能を測定した。その結果、Oxo−TEMPO、Tempolは、濃度依存的な細胞増殖能抑制効果を示した。一方、テトラエチル基を導入した化合物では、1mMの濃度まで細胞増殖能抑制効果は認められず、脂溶性が高いにも関わらず低毒性であることが示された(図1を参照)。
胃潰瘍モデル動物を用いた薬効評価
アジュバント関節炎ラットの作成
ニトロキシルラジカルが、アジュバント関節炎ラット(AAラット)におけるインドメタシン惹起胃潰瘍を抑制するか否か検討した。
方法
結核死菌Mycobacterium tuberculosis H37 RAを瑪瑙乳鉢中で磨砕し、この中にheavy mineral oilを滴下しつつ加え、さらに磨砕し10mg/mlとした。この結核死菌−oil懸濁液を3分間超音波処理後1ml容量のシリンジにとり、イソフルラン麻酔下、5週齢のDAラットの左足蹠皮内に100μL投与し、アジュバント関節炎を惹起した。陰性対照群は、heavy mineral oilのみを左足蹠皮内に投与した。
DAラットは、アジュバント投与後13日目に飼育ケージ内にて絶食させた。ただし、飲料水は自由飲水とした。絶食開始から24時間後にインドメタシン(20mg/kg)をラットに経口投与して胃潰瘍を作成した。コントロールでは、vehicleとして5%NaHCOを同量経口投与した。ニトロキシルラジカル化合物は、インドメタシン投与5分前に経口投与した。
胃粘膜損傷面積計測
インドメタシンによる胃潰瘍惹起4時間後、ラットを過麻酔下頚椎脱臼により処理し、直ちに胃を食道、小腸側をそれぞれ約1cmずつ残して切断し摘出した。幽門部側を鉗子で固定し、1%ホルマリン溶液を10ml注入後、噴門部側を鉗子で固定した。これを10−20分間浸し続けることにより胃壁を両側面から固定した。固定後、大湾部に沿って胃を切開し、胃腔内膜をデジタルカメラで撮影した。画像処理ソフトImage Jを用いて胃底部粘膜に発生した損傷面積を計測した。
結果
インドメタシンによる胃潰瘍惹起の程度を、インドメタシンを経口投与したAAラットの胃底部粘膜損傷面積で評価した結果、ニトロキシルラジカル化合物を投与していないAAラットでは、損傷面積が高い値を示し、胃潰瘍を惹起していること、つまり胃底部粘膜に炎症が起きていることが確認された。一方、ニトロキシルラジカル化合物を投与したAAラットでは、ニトロキシルラジカル化合物を投与していないAAラットと比較して損傷面積が有為に減少していることが示され、ニトロキシルラジカル化合物が、胃潰瘍における粘膜損傷を有為に抑制していることを示した。
既知のニトロキシルラジカル化合物であるTempol(図2を参照)は、900μmol/kgの濃度で抑制作用を示しているが、本発明に基づき合成されたニトロキシルラジカル化合物(図2における化合物A及びB)は、Tempolと比較して最大1/10の濃度で有為な胃粘膜損傷の抑制作用を有していることも示され、既知化合物より低濃度で抑制効果を示すことが明らかとなった。
ニトロキシルラジカルの血圧降下作用
TempolなどTEMPO系ニトロキシルラジカル化合物は、血圧降下作用を有し、高血圧研究に広く用いられている。血圧降下作用の原因は未だ明らかにはなっていないが、SOD様作用と相関があることから、活性酸素消去能によるものではないかと考察されている。そこで、今回新たに合成したニトロキシルラジカル化合物の血圧降下作用を明らかにする。
方法
日周リズムへの影響を避けるために、実験は全て9:00から16:00の間に行った。自然発症高血圧モデルラット(SHR;♂、208−330g)は、イソフルランを用いて麻酔を施した。平均血圧(MAP)は、大腿部の動脈にポリエチレンチューブ(PE−50)をカニュレーション後、transducer(MLT0670 BP Transducer,ADinstruments,Sydney,Australia)とamplifier(ML117 BP Amp,ADinstruments,Sydney,Australia)にて計測した。ニトロキシルラジカル溶液(60μmol/kg)を1ml/minの速度で大腿静脈より投与し、投与後20分間血圧と心拍数を測定した。
結果
ニトロキシルラジカル化合物を投与後の経時的な血圧変化を図3に示す。今回新たに開発したニトロキシルラジカル化合物(化合物C)が示す血圧降下作用は、既知のニトロキシルラジカル化合物であるTempolと比較して有為に高い作用を示した。また、血圧降下作用の持続時間は、新規ニトロキシル化合物(化合物C)は、Tempolと比較し長時間にわたって持続することも示された。
尚、上述の実施例は本発明の好適な実施の一例ではあるが、その範囲を限定するものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
下記に本願発明に係る参照文献を記載するが、これらは、この参照により本願明細書に完全に組み込まれるものである。
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Claims (3)

  1. 化学式1で示されるニトロキシラジカル化合物の製造方法であって、
    Figure 0005911131
    式中、
    〜Rは、独立して、C〜C10のアルキルであるか、或いは、R及びR、又はR及びRが共に結合して、(CH、(CHO(CH、(CHSO(CH、(CHNX(CH、(CHCY(CHであり、
    Xは、CHCO、CFCO、又はRCOであり、
    Yは、酸素(=O)であり、
    nは2〜4の整数であり、
    当該方法は、
    化学式2で示される化合物であって、
    Figure 0005911131
    式中、
    〜Rは、独立して、C〜C20のアルキルである、化学式2で示される化合物と、
    化学式3で示される化合物であって、
    Figure 0005911131
    式中、
    〜Rは、独立して、C〜C10のアルキルであり、またはR及びR、又はR及びRが共に結合して、(CH、(CHO(CH、(CHS(CH、(CHNX(CH、(CHCY(CHであり、
    Xは、CHCO、CFCO、又はRCOであり、
    Yは、酸素(=O)であり、
    nは2〜4の整数である、化学式3で示される化合物と
    をアンモニウム塩の存在下にて反応させることにより、2,6置換−4−ピペリドン誘導体を生成させる工程と、
    前記2,6置換−4−ピペリドン誘導体を酸化させる工程と、
    を有し、前記2,6置換−4−ピペリドン誘導体を生成させる工程は、水酸化セシウム又はベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド(トリトンB)を含むものである、前記ニトロキシラジカル化合物の製造方法。
  2. 請求項1記載の方法において、前記アンモニウム塩は、塩化アンモニウムである、方法。
  3. 以下の化学式、
    Figure 0005911131
    で示されるニトロキシラジカル化合物。
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