JP5907879B2 - プロットを用いて生物学的持続状態の存在を検出するためのシステムおよび方法 - Google Patents

プロットを用いて生物学的持続状態の存在を検出するためのシステムおよび方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／２６１，１０９号（名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｔｕｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｌｏｔ」（代理人事件番号０２１５９４−０１０３００ＵＳ））の本出願であり、かつ上記米国仮特許出願第６１／２６１，１０９号の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。上記出願は、その全容が、全ての目的について、参考として本明細書に援用される。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性菌株（ＭＲＳＡ）は、院内発生を含めた重大な帰結を伴う感染症に関与し、広範にわたる抗生剤に対して耐性を示し、このため、処置の選択肢を制限する。医療に随伴するＭＲＳＡは、すべてのペニシリンおよびセファロスポリンに対して交差耐性であることが予測可能であるだけでなく、一般的に用いられる他の複数の抗生剤に対してもまた耐性であることが典型的である。ＭＲＳＡ感染症の処置は一般に、通常は防御の最後の一線として用いられる、より高価で、多くはより毒性の強い抗生剤を必要とする。したがって、ＭＲＳＡの迅速な検出は、処置の方策および感染制御の方策のいずれに対しても臨床的に極めて重要である。
ＭＲＳＡの検出は、ＭＲＳＡが、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＲ−ＣｏＮＳ）、および／またはメチシリン感受性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＳ−ＣｏＮＳ）を含め、他の複数の類縁細菌と共にしばしば共コロニー形成しうるという事実によりさらに複雑化する。
臨床微生物検査室においてＭＲＳＡを検出するための従来の方法は、ＭＲＳＡをＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳから単離および区別するための最初のステップとして、試料から、その細菌を培養するステップを伴う。この手法は時間がかかり、結果が分かるまでに少なくとも２０〜２４時間を必要とする。
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出し、それをメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）から区別するための、多くの分子ベースの方法が公表されている。このような一方法は、ＭＲＳＡの２つの個別の領域である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓカセット染色体（ＳＣＣｍｅｃ；メチシリン耐性の原因である）のｍｅｃＡ遺伝子と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｓｐａ遺伝子を標的とする（特許文献１；非特許文献１）。この手法を用いるＭＲＳＡの明確な検出は、これもまたｍｅｃＡ遺伝子を保有してメチシリン耐性をもたらす、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＲ−ＣｏＮＳ）など、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ以外の菌株が共存することにより妨げられる（非特許文献２）。
より近年の分子的手法では、ＳＣＣｍｅｃに対するプライマーおよびプローブ、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓゲノムの隣接領域を用いる（特許文献２；非特許文献３）。ＳＣＣｍｅｃは、ｍｅｃＡ遺伝子を保有し、ｏｒｆＸ遺伝子の３’端の特定の部位であるａｔｔＢｓｃｃ部位にこれを挿入する、移動性の遺伝子エレメントである。ＳＣＣｍｅｃの左側末端が、ａｔｔＢｓｃｃの、ｏｒｆＸを含まない側と隣接するのに対し、ＳＣＣｍｅｃの右側末端は、ａｔｔＢｓｃｃのｏｒｆＸ側と隣接する（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。この手法により、ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ接合部の検出から、ｍｅｃＡ遺伝子の存在が推測される。数個の異なる種類のＳＣＣｍｅｃについて記載されている通り、この手法は、複数のプライマーの使用を必要とする。この手法はまた、ｍｅｃＡ遺伝子を含有しないＳＣＣｍｅｃカセットの存在に起因する偽陽性結果（非特許文献７）およびそのアッセイが対象としない新規出現型のＳＣＣｍｅｃに起因する偽陰性結果（非特許文献８）をもたらす。
別の手法は、異なるＳＣＣｍｅｃ型を通じて相同性が高い領域における１つのプライマーと、隣接するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡにおける１つのプライマーを用いている（Ｃｕｎｙら、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ、２００５年、１１巻：８３４〜８３７頁；欧州特許第１５２９８４７Ｂ１号）。この領域を包含するプライマーによりＭＳＳＡもまたプライミングされる可能性も高いので、この手法もまた、偽陽性をもたらす。
最後に、特異的な抗体および磁気ビーズを用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを陽性選択する方法が記載されている（Ｆｒａｎｃｏｉｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年１月、２５４〜２６０頁；欧州特許第１，３７０，６９４Ｂ１号）。この手法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを富化するが、ＭＲＳＡを陽性同定し、ＣｏＮＳを検出する可能性を低減するために、３つのプライマー／プローブセットの使用を必要とする。この方法は、その核酸を回収するのに、遠心分離ステップと分離溶解ステップを必要とする。
市販のＭＲＳＡアッセイは、ＳＣＣｍｅｃの右側末端における接合部およびｏｒｆＸを標的とする。５つの異なるＳＣＣｍｅｃ型および多数のＳＣＣｍｅｃ亜型が同定されており、新たなＳＣＣｍｅｃ亜型が出現する可能性は高い。加えて、ＭＲＳＡに由来するＭＳＳＡは、ｍｅｃＡ遺伝子を伴わずにＳＣＣｍｅｃ配列の一部を保持しうる可能性がある。したがって、ＳＣＣｍｅｃ右側末端のｏｒｆＸとの接合部を標的とするアッセイは、ＭＲＳＡに由来するＭＳＳＡによる偽陽性結果と、新規出現のＳＣＣｍｅｃ型／亜型を保有するＭＲＳＡによる偽陰性結果をもたらす可能性がある。
米国特許第５，７０２，８９５号明細書 米国特許第６，１５６，５０７号明細書
Ｓｉｎｓｉｍｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００５年９月、４５８５〜４５９１頁 Ｂｅｃｋｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年１月、２２９〜２３１頁 Ｈｕｌｅｔｓｋｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００４年５月、１８７５〜１８８４頁 Ｉｔｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００１年、４５巻、１３２３〜１３３６頁 Ｉｔｏら、Ａｎｔｏｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００４年、４８巻、２６３７〜２６５１頁 Ｎｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００８年、１９０巻：１２７６〜１２８３頁 Ｆａｒｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年２月、７４３〜７４６頁 Ｈｅｕｓｓｅｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００７年１月、３９０〜３９３頁
このように、ＭＲＳＡを検出するための現行の方法は、日常的な臨床および監視の目的には、労力を要し、時間がかかり、信頼を置けない。したがって、ＭＲＳＡを検出し、同時に、ＭＳＳＡおよび／またはＭＲ−ＣｏＮＳを含めた他の類縁細菌からこれを識別する、迅速で、容易で、信頼のおけるアッセイを開発する必要がある。
本発明の実施形態は、加えて、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＲ−ＣｏＮＳ）、および／または他の細菌株も含有しうる試料中に、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出するためのシステムおよび方法に関する。本発明の他の実施形態は、より一般的に、プロットおよび境界関数を用いて生物学的実体を解析するためのシステムおよび方法にも関しうる。
本発明の一実施形態は、試料中の生物学的実体の存在を決定する方法を対象とする。その方法は、試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントの量を検出するステップを含む。デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、試料中の該生物学的実体の存在を決定する。判定アルゴリズムは、少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する測定値（例えば、測定量）を入力として用い、その値を組み合わせてベクトルを形成し、ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較する。ベクトルが、境界関数内にある場合は、生物学的実体が存在し、ベクトルが、境界関数内にない場合は、生物学的実体が存在しない。
本発明の別の実施形態は、試料中の生物学的実体の存在を決定するためのシステムを対象とする。該システムは、試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントの値（例えば、量）を検出することが可能な測定モジュールと、該測定モジュールからの検出値（例えば、検出量）を保存するメモリを含む。該システムはまた、判定アルゴリズムを実行するための命令を有する、コンピュータにより読み取り可能なコードを含有する、コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、ここで、該判定アルゴリズムが、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの検出値および測定値（例えば、検出量および測定量）を入力として用い、その値を組み合わせてベクトルを形成する媒体も包含する。ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較する。ベクトルが、境界関数内にある場合は、生物学的実体が存在し、ベクトルが、境界関数内にない場合は、生物学的実体が存在しない。該システムはまた、試料中の生物学的実体の存在を決定するために、コンピュータにより読み取り可能な媒体上で、コンピュータにより読み取り可能なコードを実行するプロセッサも包含する。
本発明の別の実施形態は、判定アルゴリズムのためのコードを含む、コンピュータにより読み取り可能な媒体を対象とする。該判定アルゴリズムは、少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する検出値および測定値（例えば、検出量および測定量）を入力として用い、その値を組み合わせてベクトルを形成する。該ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較する。該ベクトルが、該境界関数内にある場合は、生物学的実体が存在し、該ベクトルが、該境界関数内にない場合は、該生物学的実体が存在しない。
本発明の別の実施形態は、未知試料中の生物学的実体の存在を決定するのに用いることができるモデルを創出するための方法を対象とする。該方法は、既知試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントの存在および値（例えば、量）を検出するステップと、既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムがベクトルを創出し、各ベクトルについての入力として、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの検出値（例えば、検出量）を用いるステップを包含する。一部のベクトルは、生物学的実体と関連し、一部のベクトルは、生物学的実体と関連しない。該方法は、ベクトルを、二次元プロット上にプロットするステップと、生物学的実体と関連するベクトルと、生物学的実体と関連しないベクトルを区分する、境界関数を創出するステップをさらに包含する。
一実施形態によれば、試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するための方法が開示される。該方法は、試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置く。次に、試料を増幅し、該試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出することができる。次いで、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、試料中のＭＲＳＡの存在を決定することができる。判定アルゴリズムは、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いて、試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定することができる。該試料中のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量が、選択した境界関数により定義される量とほぼ等しい場合は、判定アルゴリズムを用いて、ＭＲＳＡが該試料中に存在するこを決定することができる。
一実施形態によれば、試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するためのシステムが開示される。該システムは、多くの構成要素を含みうる。例えば、該システムは、試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置いた後で、該試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出することが可能な測定モジュールを含みうる。該システムは、測定モジュールからの検出量を保存することができるメモリをさらに含みうる。該システムはまた、判定アルゴリズムを実行するための命令を有する、コンピュータにより読み取り可能なコードを含有する、コンピュータにより読み取り可能な媒体も含みうる。判定アルゴリズムは、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いて、ＭＲＳＡが該試料中に存在するかどうかを決定することができる。該試料中のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量が、選択した境界関数により定義される量とほぼ等しい場合は、判定アルゴリズムを用いて、ＭＲＳＡが該試料中に存在することを決定することができる。該システムはまた、該試料中のＭＲＳＡの存在を決定するために、該コンピュータにより読み取り可能な媒体上で、該コンピュータにより読み取り可能なコードを実行することができるプロセッサも含みうる。
別の実施形態によれば、コンピュータにより読み取り可能な媒体が開示される。該コンピュータにより読み取り可能な媒体は、試料中のＭＲＳＡの存在を決定することができる判定アルゴリズムについてのコードを含みうる。判定アルゴリズムは、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いて、ＭＲＳＡが該試料中に存在するかどうかを決定することができる。該試料中のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量が、選択した境界関数により定義される量とほぼ等しい場合は、判定アルゴリズムを用いて、ＭＲＳＡが該試料中に存在することを決定することができる。ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量は、試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置き、該試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出することにより得ることができる。
さらに別の実施形態によれば、未知試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するのに用いることができるモデルを創出するための方法が開示される。該方法は、既知試料のセットを、該既知試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップを含みうる。既知試料の該セット中の各試料について、ＭＲＳＡの存在または非存在が既知である。次いで、該方法は、該既知試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出しうる。次いで、該方法は、既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行しうる。判定アルゴリズムは、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いうる。最後に、該方法は、未知試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定するのに用いることができるモデルを創出しうる。該モデルは、既知試料に対して実行される判定アルゴリズムの出力から創出することができ、該モデルは、ＭＲＳＡ陽性試料とＭＲＳＡ陰性試料との間の境界を定義する、選択した境界関数により定義することができる。
これらの実施形態、ならびに他の実施形態については、本開示の後出においてより詳細に説明する。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
試料中の生物学的実体の存在を決定するための方法であって、
該試料において、少なくとも３つの標的の量を検出するステップと、
デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、該試料中の該生物学的実体の存在を決定するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する測定値を入力として用い、該少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する測定値を組み合わせてベクトルを形成し、該ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較し、該ベクトルが該境界関数内にある場合は、該生物学的実体が存在し、該ベクトルが該境界関数内にない場合は、該生物学的実体が存在しない、ステップ
を含む方法。
（項目２）
上記二次元プロットがＹプロットであり、ここで、上記少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含み、ここで、上記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせる、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記少なくとも３つの遺伝子エレメントが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびｆｅｍＡを含む、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
上記生物学的実体が、ＭＲＳＡを含む、項目１から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
上記Ｙプロットをディスプレイ上に表示するステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目７）
上記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数により定義される、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記境界関数が、既知試料のセットから創出され、ＭＲＳＡの存在が、既知試料の該セット中の各試料について既知である、項目１から８のいずれかに記載の方法。
（項目９）
試料中の生物学的実体の存在を決定するためのシステムであって、
該試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する値を検出することが可能な測定モジュールと、
該測定モジュールからの検出値を保存するメモリと、
判定アルゴリズムを実行するための命令を有する、コンピュータにより読み取り可能なコードを含有する、コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、ここで、該判定アルゴリズムが、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの検出値および測定値を入力として用い、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの検出値および測定値を組み合わせてベクトルを形成し、該ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較し、該ベクトルが該境界関数内にある場合は、該生物学的実体が存在し、該ベクトルが該境界関数内にない場合は、該生物学的実体が存在しない、媒体と、
該試料中の該生物学的実体の存在を決定するために、該コンピュータにより読み取り可能な媒体上で、該コンピュータにより読み取り可能なコードを実行するプロセッサ
を含むシステム。
（項目１０）
上記値が、上記少なくとも３つの標的の量である、項目９に記載のシステム。
（項目１１）
上記二次元プロットが二次元Ｙプロットであり、ここで、少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含み、ここで、上記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせる、項目９または１０に記載のシステム。
（項目１２）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目１１に記載のシステム。
（項目１３）
上記測定モジュールがリアルタイムＰＣＲ装置を含む、項目９から１２のいずれかに記載のシステム。
（項目１４）
上記二次元プロットを表示するためのディスプレイをさらに含む、項目１１に記載のシステム。
（項目１５）
上記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数により定義される、項目９から１４のいずれかに記載のシステム。
（項目１６）
コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、判定アルゴリズムのためのコードを含み、ここで、該判定アルゴリズムが少なくとも３つの遺伝子エレメントの検出値および測定値を入力として用い、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの検出値および測定値を組み合わせてベクトルを形成し、該ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較し、該ベクトルが該境界関数内にある場合は、生物学的実体が存在し、該ベクトルが該境界関数内にない場合は、該生物学的実体が存在しない、媒体。
（項目１７）
上記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数により定義される、項目１６または１７に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目１８）
上記二次元プロットが二次元Ｙプロットであり、ここで、少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含み、ここで、上記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせる、項目１６に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目１９）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目１８に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目２０）
上記二次元プロットを表示するためのコードをさらに含む、項目１８に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目２１）
未知試料中の生物学的実体の存在を決定するのに用いることができるモデルを創出する方法であって、
既知試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントの存在および値を検出するステップと、
該既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムがベクトルを創出し、各ベクトルについての入力として、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの該検出値を用い、ここで、一部のベクトルが該生物学的実体と関連し、一部のベクトルが該生物学的実体と関連しないステップと、
該ベクトルを、二次元プロット上にプロットするステップと、
該生物学的実体と関連するベクトルと、該生物学的実体と関連しないベクトルを区分する、境界関数を創出するステップ
を含む方法。
（項目２２）
上記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数を用いて定義される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記二次元プロットを表示するステップをさらに含む、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
上記二次元プロットがＹプロットであり、上記少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含み、ここで、上記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせる、項目２１から２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するための方法であって、
該試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
該試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出するステップと、
デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、該試料中のＭＲＳＡの存在を決定するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用い、ここで、該試料中のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量が、選択した境界関数により定義される量とほぼ等しい場合は、該判定アルゴリズムを用いて、ＭＲＳＡが、該試料中に存在することを決定することができるステップ
を含む方法。
（項目２７）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記検出量を、二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせ、ここで、該ベクトル
Figure 0005907879
 を用いて、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量が、上記選択した境界関数により定義される量とほぼ等しいかどうかを決定することができる、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記二次元Ｙプロットがディスプレイ上に表示される、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
上記選択した境界関数が、矩形ゲーティング法、円形ゲーティングプロセス、またはガウス分布関数を用いて定義される、項目２６から３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
上記選択した境界関数が、ニューラルネットワークを用いて計算される、項目２６から３１のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
上記選択した境界関数が既知試料のセットから創出され、ここで、ＭＲＳＡの存在が既知試料の該セット中の各試料について既知である、項目２６から３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
上記試料中の、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を、リアルタイムＰＣＲにより検出する、項目２６から３３のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の量を、サイクル数で測定する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するシステムであって、
該試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出することが可能な測定モジュールであって、ここで、該試料が、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置かれる、測定モジュールと、
該測定モジュールからの検出量を保存するメモリと、
判定アルゴリズムを実行するための命令を有する、コンピュータにより読み取り可能なコードを含有する、コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、ここで、該判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いる媒体と、
該試料中のＭＲＳＡの存在を決定するために、該コンピュータにより読み取り可能な媒体上で、該コンピュータにより読み取り可能なコードを実行するプロセッサ
を含み、ここで、
該試料中のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量が、選択した境界関数により定義される量とほぼ等しい場合は、ＭＲＳＡが該試料中に存在することを、該判定アルゴリズムが決定するシステム。
（項目３７）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目３６に記載のシステム。
（項目３８）
上記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記検出量を、二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせ、ここで、該ベクトル
Figure 0005907879
 を用いて、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量が、上記選択した境界関数により定義される量とほぼ等しいかどうかを決定することができる、項目３６または３７に記載のシステム。
（項目３９）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目３８に記載のシステム。
（項目４０）
使用者に情報を表示することが可能であるディスプレイをさらに含み、ここで、上記二次元Ｙプロットが該ディスプレイ上に示される、項目３８または３９に記載のシステム。
（項目４１）
上記選択した境界関数が、矩形ゲーティング法を用いて定義される、項目３６から４０のいずれかに記載のシステム。
（項目４２）
上記選択した境界関数が、ニューラルネットワークを用いて計算される、項目３６から４１のいずれかに記載のシステム。
（項目４３）
上記選択した境界関数が、既知試料のセットから創出され、ここで、ＭＲＳＡの存在が、既知試料の該セット中の各試料について既知である、項目３６から４２のいずれかに記載のシステム。
（項目４４）
上記測定モジュールが、リアルタイムＰＣＲを用いて、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出する、項目３９から４３のいずれかに記載のシステム。
（項目４５）
少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記量を、サイクル数で測定する、項目４４に記載のシステム。
（項目４６）
コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、試料中のＭＲＳＡの存在を決定することができる判定アルゴリズムのためのコードを含み、ここで、該判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用い、ここで、該判定アルゴリズムが、該試料中のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量が、選択した境界関数により定義される量とほぼ等しい場合は、ＭＲＳＡが該試料中に存在することを決定し、ここで、
該試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置き、該試料中において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出することにより、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量および測定量を得る、媒体。
（項目４７）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目４６に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目４８）
ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記検出量が、上記選択した境界関数により定義される量とほぼ等しいかどうかを決定するために、上記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量を、二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせる、項目４６または４７に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目４９）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目４８に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目５０）
未知試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するのに用いることができるモデルを創出するための方法であって、
既知試料のセットを、該既知試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップであって、ここで、ＭＲＳＡの存在が、既知試料の該セット中の各試料について既知であるステップと、
該既知試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出するステップと、
該既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いるステップと、
該未知試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定するのに用いることができるモデルを創出するステップであって、ここで、該モデルを、該既知試料に対して実行される該判定アルゴリズムの出力から創出し、ここで、該モデルが、ＭＲＳＡ陽性試料とＭＲＳＡ陰性試料との間の境界を定義する、選択した境界関数により定義されるステップ
を含む方法。
（項目５１）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
上記選択した境界関数を較正するために、上記判定アルゴリズムが、上記既知試料中の各試料について、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記検出量を、二次元Ｙプロット上のベクトル
Figure 0005907879
 として組み合わせる、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
上記ベクトル
Figure 0005907879
 が、式：
Figure 0005907879
 により定義される、項目５２に記載の方法。
図１は、一実施形態による方法において実行されるステップを例示するフローチャートを示す。 図２は、本発明の一実施形態による方法において実行されるステップを例示するフローチャートを示す。 図３〜５は、本発明の実施形態による、各種の陽性試料および陰性試料からの判定アルゴリズムの出力を例示する図を示す。 図３〜５は、本発明の実施形態による、各種の陽性試料および陰性試料からの判定アルゴリズムの出力を例示する図を示す。 図３〜５は、本発明の実施形態による、各種の陽性試料および陰性試料からの判定アルゴリズムの出力を例示する図を示す。 図６は、本発明の各種の実施形態を実行するのに用いることができるシステムについてのブロック図である。
各種の実施形態は、試料中のＭＲＳＡを同定するためのシステムおよび方法を開示し、それは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性菌株（ＭＲＳＡ）陽性試料は、ｍｅｃＡのコピー数と、ＳＣＣｍｅｃのコピー数と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列のコピー数とがほぼ同じであるという事実に基づいている。これらのシステムおよび方法はさらに、そのプロットの各軸が１２０°ずつ離れている２Ｄプロット上に、３つのアッセイを同時に示しうる。一実施形態によれば、その２Ｄ表示にＹプロットを用いる。所与の試料のｍｅｃＡについての値と、ＳＣＣｍｅｃについての値と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列についての値とが同様である場合は、該試料の絶対アッセイの読み取り値（ａｂｓｏｌｕｔｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｄｉｎｇ）に関わらず、該試料のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定コピー数が、原点に極めて近接してプロットされうる。この変換を一助として、ＭＲＳＡ陽性試料を、ＭＲＳＡ陰性試料から識別するのに用いることができる境界関数を定義することができる。
本開示で用いられるすべての科学用語および技術用語は、別段に指定しない限り、当技術分野において一般的に用いられる意味を有する。本開示で用いられる以下の語または語句は、意味が指定されている。
本明細書で用いられる「境界関数」とは、データが、ある生物学的持続状態と関連するか、またはある生物学的持続状態と関連しないかを決定するのに用いられる数学関数でありうる。境界関数は、手作業を介すること、ニューラルネットワーク、費用関数などの使用を介することを含め、任意の適切な様式で創出することができる。境界関数はまた、楕円、四角形、円などを含めた、任意の適切な形態または線により表わすこともできる。境界関数は、形態が規則的な場合もあり、不規則的な場合もある。
本明細書で用いられる「ベクトル」とは、各々が少なくとも１つの方向、および典型的には１つのスカラーを有する、１つ以上の成分に由来する値に関しうる。
本明細書で用いられる「遺伝子エレメント」という用語は、本発明の方法における標的として有用な、対象のゲノムにおける配列を指す場合がある。一部の実施形態では、遺伝子エレメントが、例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓにおけるｏｒｆＸ、ｆｅｍＡ、またはｍｅｃＡなどのオープンリーディングフレームまたは遺伝子である。遺伝子エレメントはまた、ｍｅｃＡ遺伝子を含む場合もあり、含まない場合もある、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓカセット染色体であるＳＣＣｍｅｃなど、移動性の遺伝子エレメントでもありうる。
本明細書で用いられる「ＳＣＣｍｅｃ」、「ＳＣＣｍｅｃ配列」、および「ＳＣＣｍｅｃカセット」という用語は、互換的に用いられ、Ｉｔｏら（２００１年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５巻：１３２３〜１３３６頁）において記載されている通り、ｍｅｃＡ遺伝子を保有し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの種のゲノムへと挿入される、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓカセット染色体として公知の遺伝子エレメントを指す。
本出願では、ＳＣＣｍｅｃ挿入部位を、「ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ」と称する。この挿入部位は、本明細書で「ｏｒｆＸ」と称する、遺伝子の３’端に位置する。ＳＣＣｍｅｃの挿入がなされる染色体の遺伝子座を、「ａｔｔＢｓｃｃ」と称する。本明細書では、該挿入部位における特異的な配列を、「ｏｒｆＸ挿入部位配列（ｏｒｆＸ−ＩＳＳ）」または「ａｔｔＢｓｃｃコア領域」と称する。この配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓにおいて高度に保存的な配列であることが公知である（Ｉｔｏら、Ａｎｔｏｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００１年、４５巻、３２３〜１３３６頁；Ｎｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００８年、１９０巻：１２７６〜１２８３頁）。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域へと挿入した後では、ＳＣＣｍｅｃ左側末端の接合領域をＭＲＳＡ−ＬＥと称し、ＳＣＣｍｅｃ右側末端の接合領域をＭＲＳＡ−ＲＥと称する。左側末端の接合部では、ＳＣＣｍｅｃ配列が、ａｔｔＢｓｃｃのｏｒｆＸを含まない側と隣接する。右側末端の接合部では、ＳＣＣｍｅｃ配列が、ａｔｔＢｓｃｃのｏｒｆＸ側と隣接する。ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域は、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｔｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００１年、４５巻、１３２３〜１３３６頁；Ｉｔｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００４年、４８巻、２６３７〜２６５１頁；Ｎｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００８年、１９０巻：１２７６〜１２８３頁；および米国特許第６，１５６，５０７号において詳細に記載されている。ＳＣＣｍｅｃの挿入が存在しない場合は、このｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域に切れ目がなくなる。増幅法により、ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域が完全であると同定される場合は、これにより、ＳＣＣｍｅｃカセットが挿入されていないことが示される。しかし、ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域が増幅されないからといって、ｍｅｃＡ遺伝子の存在が示されるわけではない。ＳＣＣｍｅｃカセットが挿入された後で、ｍｅｃＡ遺伝子が失われる可能性があることも公知である。したがって、ｍｅｃＡが存在しない場合でもなお、ＳＣＣｍｅｃカセットにより、ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｓ領域の増幅が阻止される可能性がある。
「オリゴヌクレオチド」とは、併せて共有結合している２つ以上のヌクレオチドサブユニットを有する、ヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは一般に、約１０〜約１００ヌクレオチドである。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボースの場合もあり、デオキシリボースの場合もあり、ＯＭｅなど、これらの修飾誘導体の場合もある。該ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾結合（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）などの結合により接合される場合もあり、オリゴヌクレオチドの、その相補的標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを阻止しない、非ヌクレオチド部分により接合される場合もある。修飾結合には、標準的なホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、または中性ペプチド結合など、異なる結合で置換する修飾結合が含まれる。また、窒素塩基類似体も、本発明によるオリゴヌクレオチドの構成要素でありうる。「標的核酸」とは、標的核酸配列を含む核酸である。「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、または「標的配列」とは、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうる、特異的なデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列である。
本明細書で用いられる「プローブ」という用語は、対象の標的核酸とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを指す。ハイブリダイゼーションは、対象の標的核酸との相補的な塩基対合を介してプローブが結合する結果として生じる。当業者は、ハイブリダイゼーション条件の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に応じて、プローブが、該プローブ配列と完全に相補的であるわけではない標的配列と実質的に結合することが典型的であることを理解するはずである。プローブ（および、したがって、その標的）を検出、視覚化、測定、および／または定量しうるように、該プローブを適切な標識またはレポーター部分と会合させることができる。
本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、核酸合成をプライミングするのに用いられるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、相補的塩基対合によりその鋳型とハイブリダイズし、したがって、複製を開始するのに用いられる。ハイブリダイゼーションは、上記でプローブについて記載したのと同じ様式で生じる。ＰＣＲでは、２つのプライマー：二本鎖核酸分子のセンス鎖にハイブリダイズすることが典型的である「フォワードプライマー」と、その分子のアンチセンス鎖にハイブリダイズすることが典型的である「リバースプライマー」を用いる。
本明細書で用いられる「ＰＣＲ」という用語は、生物（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）を用いることなく、ＤＮＡを酵素的に複製することにより、長い二本鎖ＤＮＡ分子内で短いＤＮＡ配列（通常、５０〜６００塩基）を指数関数的に増幅するための技法を指す（Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８７年、１５５巻：３３５〜５０頁）。本発明では、他のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増幅技法も用いることができ、これらは、当業者に周知である。これらの方法には、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写を介する増幅（ＴＭＡ）、分枝ＤＮＡ法（ｂＤＮＡ）、およびローリングサークル増幅技法（ＲＣＡＴ）が含まれる。
本明細書で用いられる「リアルタイムＰＣＲ」という用語は、各増幅サイクル後に、増幅されたＤＮＡを、その反応においてそれが蓄積するにつれてリアルタイムで定量化する種類のＰＣＲを指す（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、６巻（１０号）：９８６〜９９４頁）。当業者には、リアルタイムＰＣＲを実施するための多数のプローブ化学（ｐｒｏｂｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が周知である。一般的に用いられる一方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号；同第５，４８７，９７２号；および同第５，８０４，３７５号を参照されたい）である。用いることが可能であり、市販品の購入が可能である、他のリアルタイムＰＣＲプローブ化学には、ＦＲＥＴプライマー、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（登録商標）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー（登録商標）、ＬＵＸプライマー（登録商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）、およびＵｌｔｉｍａｔｅ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）が含まれる。リアルタイムＰＣＲ技法の総説については、Ｂｕｓｔｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、３４巻：５９７〜６０１頁（２００５年）を参照されたい。
本明細書で用いられる「多重ＰＣＲ」という用語は、単一の反応試験管内で、２つ以上の異なる標的の増幅を可能とする反応物中に、１つより多いセットのプライマーが包含される種類のＰＣＲを指す。「多重ＰＣＲ」という用語はまた、複数のプライマーおよびプローブを用いるが、１つの標的だけを増幅するＰＣＲも指す。一実施形態では、本発明の多重ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲである。
本明細書で用いられるある「生物学的持続状態」とは、患者に由来する試料の特定の生物学的状態（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｅ）に関しうる。大半の場合において、該生物学的持続状態は、試料が、特定の生物学的実体、例えば、標的の疾患生物または疾患と関連する患者細胞を含むかどうかに関する。例えば、１つの生物学的持続状態は、試料がＭＲＳＡ細菌を含むことでありうるのに対し、別の生物学的持続状態は、試料がＭＲＳＡ細菌を含まないことでありうる。他の例において、該生物学的持続状態は、試料が癌細胞を含むかどうかに関しうる。
本発明の一実施形態は、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、または他の細菌を含有しうる試料においてＭＲＳＡを検出するためのアッセイに関する。本発明の実施形態は、多重遺伝子エレメント（例えば標的）の組合せを同時に増幅および検出するのに多重ＰＣＲを用いる。
一実施形態によれば、標的ＤＮＡの初期量を、ＰＣＲ閾値サイクル数（Ｃｔ）で測定する。例えば、解析される反応について、規定のシグナル閾値を決定する。標的核酸のほか、基準核酸または標準核酸について、このシグナル閾値に達するのに必要とされるサイクル数（Ｃｔ）を決定する。標的分子の絶対コピー数または相対コピー数は、基準核酸と比較した標的核酸について得られるＣｔ値に基づき決定することができる。したがって、Ｃｔ値は、標的ＤＮＡの初期量に反比例する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｔ値の完全な議論については、Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、６巻（１０号）：９８６頁を参照されたい）。同定した方法のうちの１つにおいて増幅された遺伝子セットの所定量または所定数の表示に基づいて、特定の標的遺伝子の初期量を外挿することを可能とする、他の数学的手法を用いることができる。
一実施形態では、本発明が、試料中のＭＲＳＡの存在を決定する方法であって、蛍光による検出に十分であり、該試料中の１つ以上のＭＲＳＡ特異的な標的配列の初期レベルを示すレベルの増幅産物を生成させるように、該試料をある時間にわたり、ある条件下でリアルタイムＰＣＲにかけるステップを含む方法を対象とする。
別の実施形態では、増幅を、プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）のセットおよびプローブにより実施する。プローブは、その５’端において蛍光原レポーター分子で標識することができ、その３’端において消光分子で標識することができる。消光分子は、蛍光原レポーター分子からのシグナルの発光を阻止する。プローブは、フォワードプライマーがハイブリダイズする領域と、リバースプライマーがハイブリダイズする領域との間の標的配列領域にハイブリダイズする。プローブがハイブリダイズする鎖に沿ってポリメラーゼが移動すると、このポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性によりプローブの５’端が切断され、このため、消光部分の分離により、蛍光原シグナルの発光が可能となる。
具体的な実施形態では、本発明のプローブが、蛍光レポーター（フルオロフォア）および蛍光性または非蛍光性の消光分子を含む、二重標識した蛍光原プローブを含みうる。本発明の実施形態のフルオロフォアは、５’端、３’端、またはいずれかの端の内部を含めた任意の位置においてプローブに結合させることができる。本発明のある実施形態では、フルオロフォアおよび消光剤を、それぞれ、プローブの５’端および３’端に結合させる。フルオロフォアの例には、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃａｌｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ、ＣａｌＦｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ、Ｑｕａｓａｒ ６７０、Ｑｕａｓａｒ ７０５が含まれるがこれらに限定されない。消光剤の例には、ＴＡＭＡＲＡ、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅ消光剤であるＢＨＱ−１およびＢＨＱ−２が含まれるがこれらに限定されない。
別の実施形態では、本発明は、３標的アッセイ（ｔｈｒｅｅ ｔａｒｇｅｔ ａｓｓａｙ）を用いて、ＭＲＳＡを検出し、これをＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、または他の細菌から識別する方法であって、ここで、そのアッセイに用いられる標的にｍｅｃＡ遺伝子配列、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列、およびＳＣＣｍｅｃ遺伝子配列が含まれる方法を提供する。具体的な実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子が、ｆｅｍＡである。以下の記載では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列として、ｆｅｍＡに明示的に言及することが多いが、各種の実施形態ではまた、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列も用いることができる。ＭＲＳＡの存在を決定するのに用いることができるさらに他の標的には、ｏｒｆＸが含まれうる。
各種の実施形態では、ＭＲＳＡの存在を決定するために、従来の陽性−陰性法またはデルタ法を用いる必要がない。代わりに、ＭＲＳＡ陽性試料では、ｍｅｃＡのコピー数と、ｆｅｍＡのコピー数と、ＳＣＣｍｅｃのコピー数とがほぼ同じであるという事実に基づく手法を用いる。ｍｅｃＡのコピー数と、ｆｅｍＡのコピー数と、ＳＣＣｍｅｃのコピー数とがほぼ等量で存在する場合は、試料中におけるＭＲＳＡの存在が示されうる。本発明の実施形態では、アッセイ判定アルゴリズムを用いて、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびｆｅｍＡのＣｔ値を解析することができる。この判定アルゴリズムはさらに、１２０度ずつ開いた線を有する２Ｄプロットに、３つのアッセイを同時に示しうる。ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびｆｅｍＡの測定量を表わす、そのプロットの３つの軸の各々が、２Ｄプロット上で「Ｙ」として表わされるので、このプロットをＹプロットと称することができる。試料のｍｅｃＡについての読み取り値と、ｆｅｍＡについての読み取り値と、ＳＣＣｍｅｃについての読み取り値とが同様である場合は、該試料の絶対アッセイの読み取り値に関わらず、該試料のｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、およびＳＣＣｍｅｃの測定コピー数が、プロットの原点に近接してプロットされる。この変換を一助とすれば、矩形ゲーティング法（ｒｅｃｔａｎｇｌｅ ｇａｔｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）で、ＭＲＳＡ陽性試料と、ＭＲＳＡ陰性試料を識別するのに十分でありうる。他の適切な手法は、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数を用いうる。さらなる詳細を以下に示す。
図１は、一実施形態により、試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定するのに用いることができる、モデルを構築するのに用いることができるステップを例示する。該モデル内の境界関数は、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定量に基づき、ＭＲＳＡ陽性試料を、ＭＲＳＡ陰性試料から区分することができる。
より一般的に述べると、本発明の一実施形態は、未知試料中の生物学的実体の存在を決定するのに用いることができるモデルを創出するための方法を対象とする。該方法は、既知試料において、少なくとも３つの標的の存在および量を検出するステップと、既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行するステップであって、該判定アルゴリズムがベクトルを創出し、各ベクトルについての入力として、該少なくとも３つの標的の検出量を用いるステップを包含する。一部のベクトルは、生物学的実体と関連し、一部のベクトルは、生物学的実体と関連しない。該方法は、ベクトルを、二次元プロット上にプロットするステップと、生物学的実体と関連するベクトルと、生物学的実体と関連しないベクトルを区分する、境界関数を創出するステップをさらに包含する。
ステップ１０００では、選択した数の既知試料を、該試料中の細菌の核酸を露出させる条件下に置く。この文脈では、既知試料が、それがＭＲＳＡについて陽性であると検定されるべきか陰性であると検定されるべきかが既に知られている試料である。したがって、該既知試料を用いて、後の未知試料もまたＭＲＳＡを含有するかどうかを決定することができるモデルを構築することができる。詳細に記載するのはＭＲＳＡについてであるが、本発明の他の実施形態では、他の適切な生物学的実体の存在も検出しうることが理解される。
試料を、該試料中の核酸を露出させる条件下に置くための、多くの異なる方法が存在する。例えば、当技術分野で周知である通り、試料の温度を上昇させて、ＤＮＡ鎖を分離することができる。また、試料中の核酸を露出させるための他の周知の手段も用いることができる。
ステップ１０１０では、既知試料の各々について、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列など、少なくとも３つの標的の存在および量を検出する。一部の実施形態では、対象の標的の各々について、Ｃｔ値を測定することができる。一実施形態によれば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである。試料に由来する遺伝子を測定するには、多くの異なる方法が存在する。例えば、多重ＰＣＲを用いて、測定の各標的のＰＣＲ閾値サイクル数（Ｃｔ）を測定することができる。
決定されたＣｔ値を用いて、Ｙプロットを創出することができる。しかし、Ｙプロットを創出する前に、プレスクリーニングプロセスを実施することができる。プレスクリーニングプロセスでは、システムが３つの標的遺伝子配列のうちのいずれも検出しない場合、試料をＭＲＳＡ陰性とみなし、Ｙプロットには示さない。一実施形態では、ｍｅｃＡ＞３５、ｆｅｍＡ＞３２、またはＳＣＣｍｅｃ＞３２であれば、試料を陰性とみなす。別の実施形態では、ｍｅｃＡ＞３０、ｆｅｍＡ＞３０、またはＳＣＣｍｅｃ＞３０であれば、試料を陰性とみなす。一部の実施形態では、試料がこのプレスクリーニングプロセスを通過した後に、試料をＹプロット上にプロットし、これにより解析する。プレスクリーニングプロセスで用いられる閾値は、機器および試料の調製に依存しうる。
ステップ１０２０では、判定アルゴリズムを、既知試料の各々からの、測定された標的の各々に適用することができる。一実施形態によれば、判定アルゴリズムが、Ｙプロットを用いうる。
一実施形態によれば、各既知試料について、判定アルゴリズムが、Ｙプロットでありうる２Ｄプロット上へと投影されうる、中間ベクトルを創出する。中間ベクトルは、互いに１２０度ずつ離れた３つの単位ベクトルの和であることが可能であり、ステップ１０２０から得られるｍｅｃＡ値、ｆｅｍＡ値、およびＳＣＣｍｅｃ値によりこれを重み付けすることができる。一実施形態によれば、式：
Figure 0005907879
 は、中間ベクトルである］により、ベクトルの和を表わすことができる。ｆｅｍＡは、総称変数（ｇｅｎｅｒｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅ）「ＳＡ」（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列と関連する値を表わす）で置き換えることができる。他の実施形態によればまた、測定された標的の相対量をどのように用いうるかを表わすための他の類似の手段も用いることができる。
ステップ１０３０では、未知試料がＭＲＳＡを含有するかどうかを決定するのに用いることができるモデルを創出するために、ステップ１０２０において創出した、各既知試料についての中間ベクトルを解析することができる。一実施形態によれば、既知試料の中間ベクトルを用いて、境界関数を選択し、境界関数のパラメータを定義する。境界関数を用いて、未知試料中にＭＲＳＡが存在するか、または未知試料中にＭＲＳＡが存在しないかを決定することができる。
一実施形態によれば、測定された既知試料のすべてについてのＹプロットに対してクラスタリング解析を実施して、ＭＲＳＡ陽性試料と、ＭＲＳＡ陰性試料を区分することができる。ｆｅｍＡ、ｍｅｃＡ、およびＳＣＣｍｅｃは、単一コピーの標的であり、ＭＲＳＡ陽性試料には、これらの標的のコピーが等量で存在するはずなので、クラスタリング解析により、陽性試料を併せてまとめることができる。数学的に述べると、これは、試料がＭＲＳＡ陽性であれば、その中間ベクトルが、Ｙプロット上で原点近くに存在するはずであることを意味する。したがって、陽性試料を包含する矩形面積など、単純な境界関数を用いて、Ｙプロットの原点周囲に位置する陽性試料をクラスタリングすることができる。陰性試料は、この境界の外部に分散しうる。一実施形態によれば、単純な矩形ボックスを用いて、Ｙプロット上の陽性試料と陰性試料を区分することができる。既知試料からの測定値を用いて、矩形ボックスによる境界を調整することができる。例えば、ニューラルネットワークアルゴリズムを用いれば、該ボックスによる境界を定義する一助とすることができる。他の実施形態では、より複雑な境界関数を選択することもでき、他の手段を用いて、選択した境界関数の係数を調整することもできる。上記で言及した通り、他の手法（例えば、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数）を用いて境界関数を創出することもできる。
図２は、一実施形態により、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうかを決定するのに用いうるステップを例示する。本明細書で用いられる未知試料とは、試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかが知られていない試料を指す。図２のステップは、図１によるステップを用いて創出されるモデルなどのモデルを用いて、未知試料がＭＲＳＡを含有するかどうかを決定しうる。未知試料は、様々な測定標的を有しうる。これらの測定値は、未知試料の測定標的から創出される中間ベクトルがモデルの境界関数に相対して存在するかどうかの分析によってＭＲＳＡの存在を検出するのに用いることができる。
より一般的に述べると、本発明の実施形態は、試料中の生物学的実体の存在を決定するための方法を対象とする。該方法は、試料において、少なくとも３つの標的の値（例えば、量）を検出するステップを含む。デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、試料中の生物学的実体の存在を決定する。判定アルゴリズムは、少なくとも３つの標的の測定値（例えば、測定量）を入力として用い、その値を組み合わせてベクトルを形成し、これを、二次元プロット上の境界関数と比較する。ベクトルが、境界関数内にある場合は、生物学的実体が存在し、ベクトルが、境界関数内にない場合は、生物学的実体が存在しない。
ステップ１１００では、未知試料を、試料中の細菌の核酸を露出させる条件下に置く。モデルを構築しながらステップ１０００において用いた同じ技法を、ステップ１１００でもまた用いることができる。
ステップ１１１０では、未知試料から、少なくとも３つの標的であるｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列のＣｔ値を測定する。ステップ１０１０において用いた同じ技法を用いて、ステップ１１１０を達成することができる。
この時点で、上に記載したのと同様のプレスクリーニングプロセスを用いて、ＭＲＳＡと関連しない可能性が極めて高い試料を除去することができる。
ステップ１１２０では、モデルを構築するのに用いた判定アルゴリズムを、未知試料に由来する、測定された標的に適用することができる。例えば、ステップ１０２０で用いた同じ関数を用いて、未知試料から中間ベクトルを創出することができる。
ステップ１１３０では、ＭＲＳＡが未知試料に存在するかどうかを決定する。一実施形態によれば、未知試料について創出された中間ベクトルを、既知試料から創出された境界関数に対して比較することにより、これを達成することができる。未知試料の中間ベクトルが、ＭＲＳＡ陽性試料を示す境界内部に収まる場合は、該未知試料中のＭＲＳＡの存在を決定することができる。未知試料の中間ベクトルが、ＭＲＳＡ陽性の境界外部に外れる場合は、該未知試料中のＭＲＳＡの非存在を決定することができる。
本発明の実施形態は、特に有利である。以下で言及する通り、ＭＲＳＡが、他の複数の類縁細菌と共コロニー形成しうることが多いという事実にもかかわらず、本発明の実施形態は、試料中のＭＲＳＡを同定するのに特に有用である。
以下の例示的な実施例により、本発明の各種の実施形態がさらに実証される。該実施例は、例示を目的として示されるものであり、いかなる形であれ、本発明を限定することを意図するものではない。
（実施例１）
試料の調製
６５９例の試料を収集し、一実施形態により用いることができるモデルを形成する目的でこれらを解析した。試料は既知試料であった、すなわち、試料の各々においてＭＲＳＡが存在するかどうかが既知であった。各試料について、２つずつのスワブを回収した。次いで、これらの２つのスワブを、個別に、ＭＲＳＡについて培養した。２つのスワブからの培養結果が一致する場合は、この試料を有効（ｖａｌｉｄ）であるとみなした。
次いで、有効な各既知試料を、ｐＨ８．０のトリス１ｍｌ、およびｐＨ８．０の１ｍＭ ＥＤＴＡを伴う試料緩衝液用試験管内に入れた。３０００ｒｐｍで４０秒間にわたり、試料緩衝液用試験管をボルテックスすることにより、そのスワブヘッドから細菌をふるい落とした。次いで、５００μＬの細菌懸濁物（すなわち、細菌懸濁物を含有する試料緩衝液）を、未使用の試験管へと移した。
次いで、１０μＬのプロセスコントロール用作業原液を、該未使用の試験管に添加した。また、１０μＬの細胞壁消化酵素も、該未使用の試験管に添加した。短時間にわたりボルテックスした後、７０℃で５分間にわたり、該試験管をインキュベートした。次いで、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＶｉｒＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、細菌ＤＮＡを抽出した。
次いで、１８８μＬの溶解用緩衝液、１．０μｌのポリＡ ＲＮＡ（１０μｇ／μｌ）、および１００μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）を一緒に混合する（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス、５０％のグリセロール、５ｍＭの塩化カルシウム中で）ことにより、プレミックス（ｐｒｅ−ｍｉｘ）を調製した。
次いで、該プレミックスを、該試験管に添加し、１７００ＲＰＭで１０秒間にわたりボルテックスし、次いで、７０℃の水浴中で５分間にわたりインキュベートした。
該試験管を室温まで冷却した後に、１００％のイソプロパノール５７５μＬ、および１０μＬの結合緩衝液（カルボキシル基でコーティングした常磁性ビーズ）を該試験管に添加し、該試験管を、１７００ＲＰＭで１０秒間にわたりボルテックスした。
次いで、該試験管を室温で２分間にわたりインキュベートし、次いで、マイクロ遠心分離試験管用の磁石上で６分間にわたり静置し、磁性ビーズを捕捉した。その磁性ビーズを乱すことなく上清を吸引除去した。次いで、磁石から該試験管を取り去り、５００μＬの洗浄用緩衝液（３．３Ｍのチオシアン酸グアニジン、１．７％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１６７．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を添加した。
該試験管を、１７００ＲＰＭで１０秒間にわたりボルテックスし、次いで、磁石上に戻し、４分間にわたり静置した。次いで、上清を吸引除去し、廃棄した。磁石から該試験管を取り去り、７５％のエタノール９００μＬを添加した。次いで、該試験管を、１７００ＲＰＭで１０秒間にわたりボルテックスし、磁石上に戻し、６分間にわたり静置し、上清を吸引除去した。７５％エタノールによる洗浄を合計２回にわたり繰り返した。磁性ビーズを、磁石上、室温で１５分間にわたり乾燥させた。
ＤＮＡを溶出させるために、２５μＬのヌクレアーゼ非含有水を、該乾燥させたビーズに添加した。短時間にわたり該試験管をボルテックスし、次いで、７０℃で５分間にわたりインキュベートした。次いで、該試験管を磁石上に戻し、１分間にわたり静置した。溶出した核酸を、ＰＣＲ解析に用いた。
ＰＣＲ反応混合物の準備
まず、ＰＣＲ試薬を融解させ、次いで、以下のステップの間、氷上で維持した。９６ウェルプレート上の縁辺部のウェル（行ＡおよびＨのウェル、列１および１２のウェル）は用いなかった。ＰＣＲプレート１枚につき、１つの陽性対照および１つの陰性対照を用いた。
次いで、試料および対照に必要とされる量の反応混合物を調製した。反応１２回分の増量に基づき、該反応混合物を調製した。
２．０ｍｌのポリプロピレン製試験管に、以下の容量：５倍濃度のＰＣＲ反応用緩衝液３００μＬ（反応１回当たりに必要とされる容量×１３）、６倍濃度のＯｌｉｇｏ Ｍｉｘ １０８．３３μＬ（反応１回当たりに必要とされる容量×１３）、１ＭのＭｇＣｌ２ ２．６μＬ（反応１回当たりに必要とされる容量×１３）、１単位／μＬのＵＤＧ ３１．２μＬ（反応１回当たりに必要とされる容量×１３）、１２．５ｍＭのｄＮＴＰ ２０．８μＬ（反応１回当たりに必要とされる容量×１３）、４０単位／μＬのＤＮＡポリメラーゼ １．８２μＬ（反応１回当たりに必要とされる容量×１３）、およびＨ２Ｏ ９５．２５μＬ（反応１回当たりに必要とされる容量×１３）を添加した。
ウェル１個当たり３０μＬの容量で、該反応混合物を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの９６ウェルＰＣＲプレートへとアリコート分割した。２０μＬのＳＰＲＩ−ＴＥにより抽出したＤＮＡ試料を、単一のウェルに添加した。２０μＬの陰性対照を、ヌクレアーゼ非含有水を伴う単一のウェルに添加した。２０μＬの陽性対照を、単一のウェルに添加した。４５μＬのピペットセットを用いて、その混合物を上下に１０回にわたりピペッティングすることにより、該試料および該反応混合物を作製した。次いで、その調製したＰＣＲプレートを、Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒで密封し、次いで、３０００ｒｐｍで３分間にわたり遠心分離した。
モデルの創出および解析
次いで、そのプレートを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５Ｐ ｑＰＣＲ測定器へとロードした。該プレート内で使用するウェルを選択し、蛍光データを収集するために、以下の色素：ＣＹ５、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＦＡＭを選択した。最後に、以下のサイクリング条件：３７℃で４分間（１回）；９５℃で１分間（１回）；９１℃で５秒間→６２℃で１０秒間→５８℃で２５秒間（５０回）を指定した。モニタリング標的の一部を、以下の表１に表示する。
Figure 0005907879
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他の実施形態では、配列および／または長さが実質的に同一である他のプライマーおよびプローブを本発明の実施形態に用いることができる。
まず、閾値と共に、すべての試料ウェルおよび陽性対照ウェルを選択した。次いで、データ解析を実施した。次いで、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、およびＣＹ５の順序で、ＰＣＲ閾値を記録し、アッセイ判定アルゴリズムファイルへと記入した。試料について収集された閾値は、該試料の各々におけるｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、およびＳＣＣｍｅｃの量に対応する。
図１で例示する実施形態についてと同様に、各試料について、中間ベクトルを創出した。各中間ベクトルは、互いに１２０度ずつ離れた３つの単位ベクトルの和であり、それぞれ、ｍｅｃＡ値、ｆｅｍＡ値、およびＳＣＣｍｅｃ値により重み付けした。用いた式は：
Figure 0005907879
 は、中間ベクトルである］であった。２Ｄ Ｙプロット上にプロットしたときに、これらの試料のうちの一部がどのようにあらわれるかの例示を、図３に示す。
図３で見ることができる通り、ＭＲＳＡ陽性試料から創出される中間ベクトルは一般に、それらの終点が、プロットの原点周囲にクラスタリングされている。これに対し、ＭＲＳＡ陰性試料は一般に、それらの中間ベクトルの終点が、原点からより離れた位置に存在している。
図４は、単純な矩形ボックス４０００を、境界関数としてどのように用いて、陽性試料と陰性試料を区分することができるかを示す。６５９例の試料を、モデルの基礎として用いると、矩形ボックスの左縁、右縁、上縁、および下縁は、−３、２．５、２、および−１．３である。試料をクラスタリングするのに、単純な矩形を用いずに、より洗練された方法を他のモデルに適用することもできる。例えば、その場合はニューラルネットワークを用いて調整される関数により、境界を定義することができる。また、境界が矩形である必要はなく、他のモデルでは、より複雑な形状により、既知試料に対するより良好な適合（ｆｉｔ）をもたらすことができる。
次いで、新たに創出されたモデルを用いて既知試料を解析し、該モデルが該既知試料をどの程度正確に類別するかを調べることができる。上に記載した通りに、各既知試料について中間ベクトルを計算し、該ベクトルを、境界関数と比較する、Ｙプロットベースの判定アルゴリズムは、６５９例の試料について、５例の偽陰性（ＦＮ）および０例の偽陽性（ＦＰ）を結果としてもたらした。５例のＦＮをより詳しく検討したところ、５例中３例の試料が、少なくとも１つのアッセイで、Ｃｔ値（Ｃｔ＝４０）を伴わなかった。これは、陽性試料では生じないはずである。この理由で、これら３例の試料は、信頼できる検査点ではないと考える。こうして、これら３例のＦＮを除いた後で、２例のＦＮと０例のＦＰが残る。これらの偽陰性のうちの１例を、図４の４０１０で強調する。
これに対し、基準方法（ＢＤ Ｇｅｎｅｏｈｍ（商標）ＭＲＳＡアッセイ）を既知試料に適用したところ、３例のＦＮおよび９例のＦＰが結果として得られた。したがって、新規のＭＲＳＡ判定アルゴリズムは、基準方法と比較して、ＦＮを増大させずに、ＦＰの著明な低減を示す。
（実施例２）
試料の調製
１９９例の鼻腔内スワブを回収し、スチュアート輸送培地内で保存する。スワブヘッドを取り外し、各スワブヘッドを、ｐＨ８．０の１０ｍＭトリスおよびｐＨ８．０の１ｍＭ ＥＤＴＡを伴う、トリスベースの試料緩衝液１２００μＬ、１ｍｍのジルコニア／シリカビーズ約１００ｍｇを伴う、２ｍｌの試料懸濁液用試験管へと移した。３０００ｒｐｍの速度で少なくとも１５秒間にわたり、該試料用試験管をボルテックスすることにより、該スワブヘッド上の細菌をふるい落とした。
次いで、該スワブヘッドを該試料用試験管から無菌的に取り出し、１ｍｌのＴｒｙｐｉｃ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）および６．５％のＮａＣｌを伴う１５ｍｌの細菌培養用試験管へと移した。該接種された細菌用試験管を、３７℃のインキュベータへと移し、２００ｒｐｍの速度で振とうしながら一晩にわたりインキュベートした。
次いで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよび／またはＭＲＳＡの存在または非存在を確認した。一晩にわたる培養ブロスを各々１０μＬずつ、ＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ ＭＲＳＡプレートおよびＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプレートへと画線した。次いで、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＶｉｒＮＡキットのプロトコールに記載される通り、各試験管からの、１２００μＬの試料溶液のうちの５００μＬずつを、ＤＮＡ単離手順にかけた。略述すると、プロセスコントロールとしての一定量のＣＦＵのＳ． ｆｅｌｉｓ細菌（またはＣＦＵなしの一定量のＳ． ｆｅｌｉｓ）でこの手順を開始した。各試験管に１０単位ずつのアクロモペプチダーゼ（Ａｃｈｒｏｍｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を添加し、十分に混合し、７０℃の水浴中で４分間にわたりインキュベートした。次いで、各試料に、１８８μＬの溶解用緩衝液、１．０μＬのＰｏｌｙＡ（６００μｇ／ｍｌ）、および１００μＬのプロテアーゼＫ（６．４ｍｇ／ｍｌ）を含有する、調製したての２８９μＬの溶解用溶液を添加し、十分に混合した。次いで、各試料をインキュベートし、次いで、２分間にわたり冷却した。次いで、１０μＬの磁気ビーズ、および５７５μＬの１００％イソプロパノールを添加し、ボルテックスすることにより十分に混合した。その反応内容物を、室温で５分間にわたりインキュベートし、次いで、該試料用試験管を磁気スタンド上に６分間にわたり静置することにより、磁気ビーズを回収して、該試料溶液が澄明となるまで、該溶液から磁気ビーズを分離した。
次に、吸引の間にビーズを除去しないように注意しながら、該試料から上清を吸引除去した。５００μＬの洗浄用緩衝液を該試料に添加し、１０秒間にわたりボルテックスし、混合した。次いで、その試験管を、磁石上で４分間にわたり（または澄明になるまで）インキュベートした。次いで、再度、該試料から上清を吸引除去した。次いで、調製したての７５％エタノール９００μＬを添加し、該試験管を１０秒間にわたりボルテックスした。次いで、その試験管を、磁石上で、澄明になるまで４分間にわたりインキュベートした。次いで、再度、該試料から上清を吸引除去し、今一度、エタノールによる洗浄を繰り返した。次いで、該ビーズを、磁石上で、１５〜２５分間にわたり乾燥させた。該ビーズのリングが開裂し始めた場合に、該試料が溶出した。磁石からその試験管を取り去り、ヌクレアーゼ非含有水２５μＬを添加し、ＤＮＡを溶出させた。次いで、該試料をボルテックスして混合した。次いで、その試験管を、７０℃で５分間にわたりインキュベートした。その試験管を磁石上に戻し、１分間にわたりインキュベートした。次いで、溶出液を清潔な試験管へと移し、ＰＣＲによる増幅にかけた。
ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブ、ＰＣＲサイクリング条件
Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘの表で列挙される試薬は、氷上で調製した。総反応回数に応じて、ＤＮＡ／ＲＮアーゼ非含有試験管に表示容量の試薬を一緒にして単純に添加することにより、十分なＭａｓｔｅｒ ｍｉｘを調製できた。その試験管をボルテックスして混合し、次いで、後の使用のために氷上に放置した。各溶出液２０μＬずつを、Ｍｘ３０００Ｐ ９６ウェルＰＣＲプレート（スカートなし）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、型番４０１３３３）（１つのウェルに１つの溶出液）へと添加した。３０μＬのＭａｓｔｅｒ ｍｉｘを、溶出液で満たされた各ウェルに添加し、次いで、８回以上にわたり上下に静かにピペッティングする（マルチチャネル型が有用であろう）ことにより、混合した。そのプレートを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）光学接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により密閉し、次いで、１１００×ｇで３分間にわたり遠心分離してから、ＰＣＲ装置に入れた。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ３００５Ｐ装置上でのＰＣＲサイクリング条件は、以下：３７℃で４分間（１回）；９５℃で１分間（１回）；９５℃で１５秒間→６２℃で１０秒間→５８℃で３０秒間（４０回）の通りに設定した。モニタリングした一部の標的については、上に記載している。
モデルの創出および解析
第１の例示的実施例で既に説明した通り、各標的の閾値をエクスポートし、判定アルゴリズムへと入力する。
本実施例における既知試料は、該第１の実施例とまったく同じ方法で収集したわけではないので、第２の実施例についてのＹプロットアルゴリズムにおける矩形ボックスの左縁、右縁、上縁、および下縁は、−４、５．５、３、および−４であることが判明した。これを図５で例示する。上記モデルを用いて該既知試料を処理し直したところ、３例の偽陽性および４例の偽陰性が見つかった。これは、１１例の偽陽性および２例の偽陰性をもたらす、Ｃｅｐｈｉｅｄ Ｘｐｅｒｔ（登録商標）によるＭＲＳＡについての基準方法に対する改良を表わした。
図６は、本発明の一実施形態を実行するのに用いることができるコンピュータシステム３００のブロック図である。コンピュータシステム３００は、一群の入力モジュールを有する。測定モジュール３０１を用いて、試料中の選択した標的を測定する。この測定モジュールは、標的の反応を測定するのに選択した測定方法に応じて、本発明の異なる実施形態間で異なりうる。例えば、一実施形態によれば、測定モジュールが、試料に対してＰＣＲ解析を実施しうる。測定モジュールは、典型的なリアルタイムＰＣＲ装置の作業コンポーネントの少なくとも一部により実施することができる。また、標準的なキーボード３０２およびマウス３０３も示す。コンピュータシステム３００はまた、該コンピュータ内に各種の典型的なコンピュータの構成要素も含有する。これらの構成要素は、システムバス３０４、１つ以上のディスクドライブ３０５、ＲＡＭ ３０６、およびプロセッサ３０７を包含する。実施形態の正確な性質に応じてまた、他の構成要素も存在しうる。図５はまた、システムの使用者への情報の表示を可能とするモニター３０８も示す。
本発明の一実施形態では、試料を処理し、試料から選択した標的の量を測定する測定モジュール３０１に試料を入れる。次いで、この情報を、システムバス３０４を通ってコンピュータシステムへと移し、プロセッサ３０７を用いて、適切な判定アルゴリズムを反応データに適用することができる。判定アルゴリズムを実装する（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ）目的でプロセッサ３０７が実行する命令は、ＲＡＭ３０６またはディスクドライブ３０５など、コンピュータにより読み取り可能な媒体に保存される。判定アルゴリズムもまた、この同じ媒体に保存することができる。次いで、判定アルゴリズムの出力を、モニター３０８に表示することができる。例えば、判定アルゴリズムが、中間ベクトルを介して３つの標的の測定量をグラフ表示するのに２Ｄ Ｙプロットを用いる場合は、該中間ベクトルの終点を、モニター３０８に表示することができる。本発明の代替的な実施形態は、他の通信手段を介して情報の出力をもたらすことができる。例えば、コンピュータシステムは、プリンターを用いてＹプロットを印刷することもできるし、ネットワークを介してＹプロットを別のコンピュータへと送信することもできる。次いで、測定された試料からの情報を用いて、モデルを構築する一助とすることもでき、該試料がＭＲＳＡを含有するかどうかを決定する一助とすることもできる。
本発明が関連する技術分野における当業者には明らかである通り、本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱しない限りにおいて、上記で具体的に開示した形態以外の形態においても実施することができる。したがって、上に記載した本発明の特定の実施形態は、例示的なものであると考えるものとし、制限的なものとしては考えないものとする。本発明の範囲は、前出の記載に含有される例に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に示される通りである。
本出願に記載されるソフトウェアコンポーネント、ステップ、または関数は、例えば、従来の技法またはオブジェクト指向の技法を用いる、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、またはＰｅｒｌなど、任意の適切なコンピュータ言語を用いる、１つ以上のプロセッサにより実行されるソフトウェアコードとして実装することができる。ソフトウェアコードは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）などのコンピュータにより読み取り可能な媒体（例えば一時的でない、コンピュータにより読み取り可能な媒体）、ハードドライブもしくはフロッピー（登録商標）ディスクなどの磁気媒体、またはＣＤ−ＲＯＭなどの光学媒体に、一連の命令またはコマンドとして保存することができる。任意のこのようなコンピュータにより読み取り可能な媒体はまた、単一のコンピュータ装置上または単一のコンピュータ装置内に常駐させることができるが、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ装置上または異なるコンピュータ装置内に存在させることもできる。
本発明の一部の実施形態は、ソフトウェアもしくはハードウェアまたはこれら両方の組合せにおける制御論理の形態で実装することができる。この制御論理は、本発明の実施形態で開示される一連のステップを実施するように情報処理デバイスを方向づけるのに適合させた複数の命令として、情報保存媒体内に保存することができる。本明細書で示される開示および教示に基づき、当業者は、本発明を実装する他の方途および／または方法を理解する。
特にそれに反することを意図しない限りにおいて、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、または「その、該（ｔｈｅ）」は、「１つ以上の」を意味することを意図する。
Figure 0005907879
Figure 0005907879
Figure 0005907879
 本出願の全体では、各種の刊行物を参照する。これらの刊行物のそれらの全体における開示は、すべての目的で、本出願における参照により本出願に組み込まれる。いずれも先行技術であるとは容認されない。

Claims (34)

  1. 試料中の生物学的実体の存在を決定するための方法であって、
    該試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントの量を検出するステップと、
    デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、該試料中の該生物学的実体の存在を決定するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する測定値を入力として用い、該少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する測定値を組み合わせてベクトルを形成し、該ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較し、該ベクトルが該境界関数内にある場合は、該生物学的実体が存在し、該ベクトルが該境界関数内にない場合は、該生物学的実体が存在しない、ステップ
    を含み、
    ここで、該生物学的実体が、ＭＲＳＡを含み、ここで、該少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含む、方法。
  2. 前記二次元プロットがＹプロットであり、ここで、前記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定値を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
    Figure 0005907879
    として組み合わせる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ベクトル
    Figure 0005907879
     が、式：
    Figure 0005907879
    により定義される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記少なくとも３つの遺伝子エレメントが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびｆｅｍＡを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記Ｙプロットをディスプレイ上に表示するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数により定義される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記境界関数が、既知試料のセットから創出され、ＭＲＳＡの存在が、既知試料の該セット中の各試料について既知である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. ＰＣＲ閾値サイクル（Ｃｔ）値が、前記遺伝子エレメントの各々に対して測定され、該Ｃｔ値は、前記Ｙプロットを作成するために用いられる、請求項２に記載の方法。
  9. 試料中の生物学的実体の存在を決定するためのシステムであって、
    該試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントと関連する値を検出することが可能な測定モジュールと、
    該測定モジュールからの測定値を保存するメモリと、
    判定アルゴリズムを実行するための命令を有する、コンピュータにより読み取り可能なコードを含有する、コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、ここで、該判定アルゴリズムが、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの測定値を入力として用い、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの測定値を組み合わせてベクトルを形成し、該ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較し、該ベクトルが該境界関数内にある場合は、該生物学的実体が存在し、該ベクトルが該境界関数内にない場合は、該生物学的実体が存在しない、媒体と、
    該試料中の該生物学的実体の存在を決定するために、該コンピュータにより読み取り可能な媒体上で、該コンピュータにより読み取り可能なコードを実行するプロセッサ
    を含み、
    ここで、該生物学的実体が、ＭＲＳＡを含み、ここで、該少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含む、システム。
  10. 前記値が、前記少なくとも３つの遺伝子エレメントの量である、請求項９に記載のシステム。
  11. 前記二次元プロットが二次元Ｙプロットであり、ここで、前記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定値を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
    Figure 0005907879
    として組み合わせる、請求項９または１０に記載のシステム。
  12. 前記ベクトル
    Figure 0005907879
    が、式：
    Figure 0005907879
    により定義される、請求項１１に記載のシステム。
  13. 前記測定モジュールがリアルタイムＰＣＲ装置を含む、請求項９から１２のいずれかに記載のシステム。
  14. 前記二次元プロットを表示するためのディスプレイをさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
  15. 前記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数により定義される、請求項９から１４のいずれかに記載のシステム。
  16. ＰＣＲ閾値サイクル（Ｃｔ）値が、前記遺伝子エレメントの各々に対して測定され、該Ｃｔ値は、前記Ｙプロットを作成するために用いられる、請求項１１に記載のシステム。
  17. コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、判定アルゴリズムのためのコードを含み、ここで、該判定アルゴリズムが少なくとも３つの遺伝子エレメントの測定値を入力として用い、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの測定値を組み合わせてベクトルを形成し、該ベクトルを、二次元プロット上の境界関数と比較し、該ベクトルが該境界関数内にある場合は、生物学的実体が存在し、該ベクトルが該境界関数内にない場合は、該生物学的実体が存在せず、
    ここで、該生物学的実体が、ＭＲＳＡを含み、ここで、該少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含む、媒体。
  18. 前記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数により定義される、請求項１７に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
  19. 前記二次元プロットが二次元Ｙプロットであり、ここで、前記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定値を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
    Figure 0005907879
    として組み合わせる、請求項１７に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
  20. 前記ベクトル
    Figure 0005907879
    が、式：
    Figure 0005907879
     により定義される、請求項１９に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
  21. 前記二次元プロットを表示するためのコードをさらに含む、請求項１９に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
  22. ＰＣＲ閾値サイクル（Ｃｔ）値が、前記遺伝子エレメントの各々に対して測定され、該Ｃｔ値は、前記Ｙプロットを作成するために用いられる、請求項１９に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
  23. 未知試料中の生物学的実体の存在を決定するのに用いることができるモデルを創出する方法であって、
    既知試料において、少なくとも３つの遺伝子エレメントの存在および値を検出するステップと、
    該既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムがベクトルを創出し、各ベクトルについての入力として、該少なくとも３つの遺伝子エレメントの該検出された値を用い、ここで、一部のベクトルが該生物学的実体と関連し、一部のベクトルが該生物学的実体と関連しないステップと、
    該ベクトルを、二次元プロット上にプロットするステップと、
    該生物学的実体と関連するベクトルと、該生物学的実体と関連しないベクトルを区分する、境界関数を創出するステップ
    を含み、
    ここで、該生物学的実体が、ＭＲＳＡを含み、ここで、該少なくとも３つの遺伝子エレメントがｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含む、方法。
  24. 前記境界関数が、矩形ゲーティング関数、円形ゲーティングプロセス、ニューラルネットワーク、またはガウス分布関数を用いて定義される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記二次元プロットを表示するステップをさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記二次元プロットがＹプロットであり、ここで、前記判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定値を、該二次元Ｙプロット上のベクトル
    Figure 0005907879
    として組み合わせる、請求項２３から２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記ベクトル
    Figure 0005907879
    が、式：
    Figure 0005907879
    により定義される、請求項２６に記載の方法。
  28. ＰＣＲ閾値サイクル（Ｃｔ）値が、前記遺伝子エレメントの各々に対して測定され、該Ｃｔ値は、前記Ｙプロットを作成するために用いられる、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記ＳＣＣｍｅｃは、ｏｒｆＸ接合部にある、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  30. 前記ＳＣＣｍｅｃは、ｏｒｆＸ接合部にある、請求項９から１６のいずれかに記載のシステム。
  31. 前記ＳＣＣｍｅｃは、ｏｒｆＸ接合部にある、請求項１７から２２のいずれかに記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
  32. ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ接合部の検出は、前記ＳＣＣｍｅｃの存在を示す、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  33. ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ接合部の検出は、前記ＳＣＣｍｅｃの存在を示す、請求項９から１６のいずれかに記載のシステム。
  34. ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ接合部の検出は、前記ＳＣＣｍｅｃの存在を示す、請求項１７から２２のいずれかに記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
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