CN102598006A - 用于使用图表检测生物状态的存在的系统和方法 - Google Patents

Abstract

基于MRSA阳性样品应当大致具有相同复制数的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的事实，使用用于识别样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的系统和方法。这些系统和方法可以进一步在2维图表上同时呈现三个化验，图表的每个轴相隔120度。根据一个实施例，Y图表被用于2维显示。如果给定的样品具有mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的类似读数，那么样品的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的测量复制数可以靠近起点标绘，而不管样品的绝对的化验读数。借助于这个转换，边界函数可以被限定，该边界函数可用于区分MRSA阳性样品与MRSA阴性样品。

Description

用于使用图表检测生物状态的存在的系统和方法

相关申请的交叉引用

这个申请是非临时的，而且要求在2009年11月13日美国临时专利申请第61/261,109号，名称为“用于使用图表检测生物状态的存在的系统和方法”（代理机构标签号021594-010300US），为了所有的目的，通过引用在此被全部结合。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）涉及伴有包含医院暴发的严重后果的感染，而且对各种各样的抗生素显现抵抗力，因此限制了治疗选择。与MRSA关联的保健有特殊的临床重要性，因为它不但对所有的青霉素和头孢菌素有显著的交叉抗性，而且还对多个其它通常使用的抗生素有典型的抗药性。MRSA感染的治疗通常需要更加昂贵的以及常常更加有毒性的抗生素，这通常被用作最后的防线。因此，MRSA的迅速检测对于治疗以及感染控制措施两者来说在临床上是至关紧要的。

由于MRSA可能常常与多个其它相关的细菌相互移植的事实，MRSA的检测进一步是复杂的，多个其它相关的细菌包含甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）、耐甲氧西林血浆凝固酶阴性葡萄球菌（MR-CoNS)和/或甲氧西林敏感血浆凝固酶阴性葡萄球菌（MS-CoNS）。

在临床微生物学实验室中用于MRSA的检测的传统方法涉及将来自样品的细菌进行培养作为第一步骤，用于MRSA与MSSA以及MR-CoNS的隔离和区分。这个方法是消耗时间的，而且需要最少20到24小时，直至知道结果为止。

对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)的检测以及将它与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）区分，许多基于分子的方法已经被出版。一个这样的方法靶向MRSA、葡萄球菌盒(Staphylococcus cassette)染色体的mecA基因（SCCmec，担负甲氧西林耐药性）以及金黄色葡萄球菌的矿泉基因的两个分离区域（美国专利5,702,895，Sinsimer等人，临床微生物学的期刊（Journal of Clinical Microbiology），2005年9月，45854591）。使用这个方法的MRSA的清楚的检测被非金黄色葡萄球菌菌株的相互存在所阻碍，非金黄色葡萄球菌菌株诸如是还持有用于甲氧西林耐药性的mecA基因的耐甲氧西林血浆凝固酶阴性葡萄球菌（MR-CoNS）（Becker等人，临床微生物学的期刊（Journal of ClinicalMicrobiology），2006年1月，p229-231）。

更近来的分子的方法对于SCCmec以及金黄色葡萄球菌基因组的侧翼区域（flankingregion）利用引物以及探针（美国专利6,156,507，Huletsky等人，临床微生物学的期刊（Journal of Clinical Microbiology），2004年5月，p1875-1884）。SCCmec是可动遗传因子，可动遗传因子携带mecA基因，并且在orfX基因的3’端插入在特异性位点attBscc。SCCmec的左末端邻接有attBscc的无orfX侧，同时SCCmec的右末端邻接有attBscc的orfX侧（Ito等人，Antimicrob.Agent Chemother.2001，45，p1323-1336；Ito等人，Antimicrob.Agent Chemother.2004，48，p2637-2651，Noto等人，J.Bacteriol.2008，190:1276-1283）。这个方法从SCCmec/orfX接点的检测来推断mecA基因的存在。当已经有描述的许多不同类型的SCCmec时，这个方法需要多个引物的使用。这个方法还受到由没有包含mecA基因的SCCmec盒的存在所引起的假阳性结果（Farley等人，临床微生物学的期刊（Journal of Clinical Microbiology），2008年2月，p743-746）以及由新出现的SCCmec类型没有被化验覆盖所引起的假阴性结果（Heusser等人，Antimicrob.Agent s Chemother.2007年1月，p390-393）。

另一个方法利用跨越不同的SCCmec类型的高同源性的区域中的一个引物以及侧翼金黄色葡萄球菌DNA中的一个引物（Cuny等人，Clin.Microbiol Infect 2005；11：834-837，欧洲专利1529847B1）。这个方法也经受假阳性，因为随着引物包围这个区域，同样引发MSSA的概率是高的。

最后，已经描述一种方法，使用特异性抗体以及磁性颗粒对于金黄色葡萄球菌进行积极地选择（Francois等人，临床微生物学的期刊（Journal of Clinical Microbiology），2003年1月，p254-260；欧洲专利1,370,694B1）。这个方法使金黄色葡萄球菌富足，但是需要三个引物/探针组的使用以便积极地识别MRSA并且降低检测CoNS的可能性。该方法需要离心步骤以及分离溶菌步骤以便恢复核酸。

市场上可买到的MRSA化验靶向SCCmec右末端接点以及orfX。五个不同类型以及很多亚型的SCCmec已经被识别，并且新的SCCmec亚型的出现的潜力是高的。此外，来源于MRSA的MSSA可能保留一部分SCCmec序列，而没有mecA基因是可能的。因此，靶向具有orfX的SCCmec右末端接点的化验可能给出伴随MRSA衍生出的MSSA的假阳性结果，以及伴随MRSA携带新的紧急的SCCmec型/亚型的假阴性结果。

如此，当前用于MRSA的检测的方法是麻烦的、消耗时间的，而且对于常规的临床和监督目的是不可靠的。因此，存在有开发化验的需要，该化验快速、简单、可靠而且能够从包含MSSA和/或MR-CoNS的其它相关的细菌检测和同时区分MRSA。

发明内容

本发明的实施例涉及用于检测样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的系统和方法，样品可能另外包含甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）、耐甲氧西林血浆凝固酶阴性葡萄球菌（MR-CoNS），和/或细菌的其它菌株。本发明的其它实施例可能更一般地涉及用于使用图表和边界函数来分析生物学实体的系统和方法。

本发明的一个实施例指向用于判定样品中的生物学实体的存在的方法。该方法包括检测样品中的至少三个遗传因子的量。通过在数字计算机上执行调用算法来判定样品中的生物学实体的存在。该调用算法使用与至少三个遗传因子关联的测量值（例如，量）作为输入，并且将它们组合以形成矢量，将该矢量与2维图表上的边界函数相比。如果该矢量在边界函数之内，那么生物学实体存在，而且如果该矢量不在边界函数之内，那么生物学实体不存在。

本发明的另一个实施例指向用于判定样品中的生物学实体的存在的系统。该系统包括能够检测样品中的至少三个遗传因子的值（例如，量）的测量模块、以及存储来自测量模块的检测值（例如，量）的存储器。该系统还包括计算机可读介质，该计算机可读介质包含具有用于执行调用算法的计算机可读代码，其中，调用算法使用至少三个遗传因子的检测和测量值（例如，量）作为输入，并且将它们组合以形成矢量。将该矢量与2维图表上的边界函数相比。如果该矢量在边界函数之内，那么生物学实体存在，而且如果该矢量不在边界函数之内，那么生物学实体不存在。该系统还包括处理器，该处理器在计算机可读介质上执行计算机可读代码，以便判定样品中的生物学实体的存在。

所述发明的另一个实施例指向包含用于调用算法的代码的计算机可读介质。该调用算法使用与至少三个遗传因子关联的检测和测量值（例如，量）作为输入，并且将它们组合以形成矢量。将该矢量与2维图表上的边界函数相比。如果该矢量在边界函数之内，那么生物学实体存在，而且如果该矢量不在边界函数之内，那么生物学实体不存在。

发明的另一个实施例指向用于产生模型的方法，该模型可用于判定未知样品中的生物学实体的存在。该方法包括检测在已知样品中的至少三个遗传因子的存在和值（例如，量），以及对于已知样品中的每个样品在数字计算机上执行调用算法，其中调用算法产生矢量，而且使用至少三个遗传因子的检测值（例如，量）作为每个矢量的输入。一些矢量与生物学实体关联，以及一些矢量与生物学实体不关联。该方法进一步包括在2维图表上标绘矢量，以及产生将与生物学实体关联的矢量和与生物学实体不关联的矢量分离的边界函数。

根据一个实施例，公开一种对于判定样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的存在的方法。该方法使样品经受将暴露存在于样品中的任何细菌的核酸的条件。接下来，样品可以被扩增，而且可以检测样品中的至少mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌（SA）特异性靶基因序列的存在和量。然后通过在数字计算机上执行调用算法来判定样品中的MRSA的存在。该调用算法可以使用mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测和测量量作为输入，以判定MRSA是否存在于样品中。当样品中的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测量与通过选择的边界函数限定的近似相等时，调用算法可用于判定MRSA存在于样品中。

根据一个实施例，公开一种对于判定样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的存在的系统。该系统可以包含许多部件。比如，该系统可以包含测量模块，在样品已经经受将暴露存在于样品中的任何细菌的核酸的条件之后，该测量模块能够扩增和检测样品中的至少mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的存在和量。该系统可以进一步包含存储器，该存储器可以存储来自测量模块的检测量。该系统还可以包含计算机可读介质，该计算机可读介质包含具有对于执行调用算法的指令的计算机可读代码。该调用算法可以使用mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测和测量量作为输入，以判定MRSA是否存在于样品中。当样品中的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测量与通过选择的边界函数限定的近似相等时，调用算法可用于判定MRSA存在于样品中。该系统还可以包含处理器，该处理器可以在计算机可读介质上执行计算机可读代码，以便判定样品中的MRSA的存在。

根据另一个实施例，公开一种计算机可读介质。计算机可读介质可以包含用于调用算法的代码，该调用算法可以判定样品中的MRSA的存在。该调用算法可以使用mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测和测量量作为输入，以判定MRSA是否存在于样品中。当样品中的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测量与通过选择的边界函数限定的近似相等时，调用算法可用于判定MRSA存在于样品中。通过使样品经受将暴露存在于样品中的任何细菌的核酸的条件、以及扩增和检测样品中的至少mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的存在和量，获得mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测和测量量。

根据又一个实施例，公开一种用于产生模型的方法，该模型可用于判定未知样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的存在。该方法可以包含使一组已知样品经受将暴露存在于已知样品中的任何细菌的核酸的条件。对于该组已知样品中的每个样品，MRSA的存在或不存在是已知的。然后该方法可以扩增和检测所述已知样品中的至少mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌（SA）特异性靶基因序列的存在和量。然后该方法可以在数字计算机上对于已知样品中的每个样品执行调用算法。该调用算法可以使用mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测和测量量作为输入。最后，该方法可以产生模型，该模型可用于判定MRSA是否存在于未知样品中。可以从针对已知样品执行的调用算法的输出产生该模型，而且可以通过选择的边界函数来限定该模型，该选择的边界函数限定MRSA阳性和MRSA阴性样品之间的边界。

在这个公开中，这些实施例以及其它实施例稍后将被更详细地描述。

附图说明

图1显示说明在根据一个实施例的方法中采取的步骤的流程图。

图2显示说明在根据本发明的一个实施例的方法中采取的步骤的流程图。

图3-5显示说明根据本发明的实施例的来自各种阳性和阴性样品的调用算法的输出的图。

图6是可用于执行本发明的各种实施例的系统的方框图。

具体实施方式

各种实施例公开了用于基于MRSA阳性样品可以大致具有相同复制数的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的事实，来识别样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的系统和方法。这些系统和方法可以进一步在2维图表上同时呈现三个化验，图表的每一个轴相隔120°的角度。根据一个实施例，Y图表被用于2维显示。如果给定的样品具有mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的类似值，那么样品的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的测量的复制数可以标绘为非常靠近起点，而不管样品的绝对的化验读数。借助于这个转换，边界函数可以被限定，该边界函数可用于区分MRSA阳性样品与MRSA阴性样品。

在这个公开中使用的所有科学和技术术语具有本领域中通常使用的含义，除非另有说明。如在这个公开中使用的，以下的词或短语具有指定的含义。

如在此使用的，“边界函数”可以是被用于判定数据是与生物学状态关联还是与生物学状态不关联的数学函数。通过使用神经网络、代价函数等等，可以以包含手工的任何适当的方式产生边界函数。边界函数还可以由包含椭圆形、矩形、圆形等等的任何适当的形状或线条来表示。边界函数还可以是在形状上有规律的或无规律的。

如在此使用的，“矢量”可以涉及来源于一个以上的分量的值，每个分量具有至少方向和典型的标量。

如在此使用的术语“遗传因子”可以涉及在本发明的方法中作为标靶是有用的所关心的基因组中的子序列。在一些实施例中，遗传因子是开放解读框或基因，诸如例如葡萄球菌中的orfX、femA或mecA。遗传因子还可以是可能或不可能包含mecA基因的可动遗传因子，诸如葡萄球菌盒染色体、SCCmec。

在此，术语“SCCmec”、“SCCmec序列”和“SCCmec盒”被可替交地使用，以涉及被称为葡萄球菌盒染色体的遗传因子，该遗传因子携带mecA基因并且被插入如Ito等人(2001，Antimicrob.Agents Chemother.，45:1323-1336)中描述的葡萄球菌基因组中。

在这个申请中，SCCmec插入位点被称为“orfX-ISS/attBscc”。插入位点基因的3'端，在此指的是“orfX”。发生SCCmec插入的染色体位点指的是“attBscc”。在插入位点的特异性序列在这里指的是“orfX-插入位点序列（orfX-ISS）”或“attBscc核心区域”。已知这个序列在金黄色葡萄球菌中是高保存的序列（Ito等人，Antomicrob.AgentChemother.，2001，45，p323-1336，Noto等人，J.Bacteriol.，2008，190：1276-1283）。

在插入金黄色葡萄球菌的orfX-ISS/attBscc区域之后，SCCmec左末端接点区域被称为MRSA-LE并且右末端接点区域被称为MRSA-RE。在左末端接点中，SCCmec序列与attBscc的无orfX侧邻接。在右末端接点中，SCCmec序列与attBscc的orfX侧邻接。OrfX-ISS/attBscc区域被详细地描述在Ito等人中（2001，Antimicrob，AgentsChemother.45:1323-1336；Ito等人，Antimicrob，Agent Chemother，2004,48,p2637-2651，Noto等人，J.Bacteriol，2008，190：1276-1283）以及美国专利第6,156,507号中，所有都通过引用被结合在此。如果SCCmec插入不存在，那么orfX-ISS/attBscc区域是不间断的。如果orfX-ISS/attBscc区域被识别作为完整的通过扩增方法论，那么这表示SCCmec盒没有被插入。然而，没有orfX-ISS/attBscc区域的扩增不表示mecA基因存在。已知在SCCmec盒变得被插入之后，可能失去mecA基因。因此即使没有mecA，SCCmec盒仍然可以防止orfX-ISS/attBscs区域的扩增。

“低聚核苷酸”是具有两个以上的核苷酸亚基共价连接在一起的核苷聚合体。低聚核苷酸通常是大约10到大约100核苷酸。核苷酸亚基的糖类基团可以是核糖、脱氧核糖或它们的改性派生物，诸如OMe。核苷酸亚基可以通过诸如磷酸二酯键合、改性键合的键合或通过不防止低聚核苷酸与它的互补标靶核苷酸序列杂交的非核苷酸部分被结合。改性键合包含其中标准磷酸二酯键合被诸如硫代磷酯键合、膦酸甲酯联接或中性的肽键代替的那些键合。含氮碱基类似物还可以是对应于本发明的低聚核苷酸的成分。“标靶核酸”是包含标靶核酸序列的核酸。“标靶核酸序列”、“标靶核苷酸序列”或“标靶序列”是可以被杂交到互补低聚核苷酸的特异性脱氧核糖核苷酸或核苷酸序列。

如在此使用的，术语“探针”指的是能够杂交到所关心的标靶核酸的低聚核苷酸。作为探针通过互补碱基对结合到所关心的标靶核酸的结果，杂交出现。一个本领域的技术人员将理解，依据杂交条件的严格性，探针将典型地基本上使缺乏完全互补的标靶序列与探针序列形成化学键。探针可以与适当的标签或报道基因部分（reporter moiety）关联，以使探针（以及因此它的标靶）可以被检测、目测、测量和/或测定。

如在此使用的，术语“引物”指的是用于引发核酸综合物的低聚核苷酸。引物通过互补碱基对与模板杂交，并且因此用于发起复制。以与以上对于探针的描述的同样方式出现杂交。在PCR中，使用两个引物：典型地与双链核酸分子的有义链杂交的“正向引物”以及典型地与分子的反义链杂交的“反向引物”。

如在此使用的，术语“PCR”指的是用于通过在没有使用活体的情况下的DNA的酶的复制，在较长的双链DNA分子之内的短的DNA序列（通常50到600个碱基）的指数式扩增的技术（Mullis等人，MethodsEnzymol.1987；155：335-50）。其它体外扩增技术可被用于本发明，而且对于那些技术人员是众所周知的。这些方法例如包括连接酶链式反应（LCR）、核酸序列扩增法（NASBA）、链置换扩增法（SDA）、转录介导扩增法（TMA）、分支DNA（bDNA)以及滚环扩增技术（RCAT）。

在此使用的术语“实时PCR”指的是PCR的类型，在每个扩增循环之后，当实时积聚在反应中时，扩增的DNA被量化（Heid等人，Genome Research，19966（10）：986-994）。用于实现实时PCR的许多探针化学处理对于那些技术人员来说是众所周知的。一个通常使用的方法是

化验（参见，例如，美国专利第5,210,015号；第5,487,972号；以及第5,804,375号）。可以使用并且可以被商业上采购的其它实时PCR探针包含FRET引物、Molecular Beacons、Scorpion引物

Amplifluor引物LUX引物

以及Ultimate探针

对于实时PCR技术的综述，参见Bustin等人，J.Mol.Endocrin，34：597-601（2005）。

如在此使用的，术语“多重PCR”指的是PCR的类型，其中，超过一个组的引物被包含在反应中，该反应允许两个以上的不同的标靶在单个反应试管中被扩增。术语“多重PCR”还指的是多个引物以及探针被使用，但只有一个标靶被扩增的PCR。在一个实施例中，本发明的多重PCR是实时PCR。

如在此使用的，“生物学状态”可以涉及来源于病人的样品的特殊的生物学状态。在大多数情况下，生物学状态涉及样品是否包含特殊的生物学实体，例如，标靶疾病生物体或与疾病关联的患者细胞。例如，一个生物学状态可以是包含MRSA细菌的样品，同时另一个生物学状态可以是不包含MRSA细菌的样品。在其它实例中，生物学状态可以涉及样品是否包含癌细胞。

本发明的一个实施例涉及用于检测样品中的MRSA的化验，该样品可以包含MRSA、MSSA、MR-CoNS或其它细菌。本发明的实施例利用用于同时扩增和检测多个遗传因子（例如，标靶）的组合的多重PCR。

根据一个实施例，标靶DNA的初始量通过PCR阈值循环（Ct）被测量。例如，对于要被分析的反应，确定限定的信号阈值。达到这个信号阈值所需的循环数（Ct）被确定，用于标靶核酸以及用于参考或标准核酸。靶分子的绝对的或相对的复制数可以根据对于标靶核酸获得的Ct值与参考核酸相比来确定。因此Ct值与初始标靶DNA的量成反比，参见Heid等人，1996，Genome Research 6（10）：986，用于通过引用在此结合的Ct值的全部讨论。可以采用其它数学方法，其考虑基于在一个识别方法期间扩增的基因的预定设置量或数量的指征的特殊的靶基因的初始量的外推法。

在一个实施例中，本发明指向判定样品中的MRSA的存在的方法，所述方法包括使样品暂时并且在条件下经受实时PCR，以便产生扩增产物的水平，该扩增产物的水平足以通过荧光被检测，而且指示样品中的一个以上的MRSA特异性标靶序列的初始水平。

在另一个实施例中，利用一组引物（正向和反向）以及探针进行扩增。可以利用在它的5'端的荧光报道基因分子以及在它的3'端的猝灭分子标明该探针。该猝灭分子防止信号从荧光报道基因分子的发射。探针杂交到正向和反向引物杂交的区域之间的标靶序列的区域。随着聚合酶沿着探针已经杂交的链移动，探针的5'端通过聚合酶的外切核酸酶活度被劈开，因此允许由于猝灭部分的分离引起的荧光信号的发射。

在具体的实施例中，本发明的探针可以包含双标签的荧光探针，双标签的荧光探针包括荧光的报道基因（荧光基团）和荧光的或非荧光的猝灭剂分子。本发明的实施例的荧光团可以在任何位置被附接到探针，包含在5'末端、3'末端或任何末端的内部。在本发明的实施例中，荧光团和猝灭剂分别被附接到探针的5'和3'末端。荧光团的实例包括但不局限于FAM、ROX、HEX、NED、Cy5、Texas Red、Calfluor Red、CalFluor Orange、Quasar 670、Quasar 705。猝灭剂的实例包括但不局限于TAMARA、Blackhole猝灭剂BHQ-1,BHQ-2。

在另一个实施例中，本发明提供一种利用三个标靶化验来检测和区分MRSA与MSSA、MR-CoNS或其它细菌的方法，其中，化验中使用的标靶包含mecA基因序列、金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列和SCCmec基因序列。在具体的实施例中，金黄色葡萄球菌特异性靶基因是femA。在以下的描述中，femA常常被明确地提及作为金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列；然而，根据各种实施例，其它金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列同样可以被使用。然而，可用于判定MRSA的存在的其它标靶可以包含orfX。

各种实施例无须使用传统的阳性-阴性或德耳塔方法，以便判定MRSA的存在。代替地，基于MRSA阳性样品大致具有相同的mecA、femA和SCCmec的复制数的事实，使用一个方法。当mecA、femA和SCCmec的复制数以大致等份存在时，可以表现出样品中的MRSA的存在。在本发明的实施例中，可以使用化验调用算法来分析mecA、SCCmec和femA的Ct值。这个调用算法可以进一步在2维图表上同时呈现三个化验，2维图表中的线相隔120度。这个图表可以指的是Y图表，因为表示mecA、SCCmec和femA的测量量的图表的三个轴中的每个轴看起来像2维图表上的“Y”。如果样品具有类似的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的读数，那么样品的mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的测量复制数将靠近图表的起点标绘，而不管样品的绝对的化验读数。借助于这个转换，矩形门方法可以足以区分MRSA阳性和阴性样品。其它适当的方法可以使用圆形门函数、神经网络或高斯分布函数。以下提供其他的细节。

图1图解根据一个实施例的可用于构造模型的步骤，该模型可用于判定MRSA是否存在于样品中。该模型中的边界函数可以基于mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的测量量，使MRSA阳性样品与MRSA阴性样品分离。

在更多的通称中，本发明的一个实施例指向用于产生模型的方法，该模型可用于判定未知样品中的生物学实体的存在。该方法包括检测在已知样品中的至少三个标靶的存在和量以及对于已知样品中的每个样品在数字计算机上执行调用算法，其中调用算法产生矢量，以及将至少三个标靶的检测量使用作为每个矢量的输入。一些矢量与生物学实体关联，以及一些矢量不与生物学实体关联。该方法进一步包括在2维图表上标绘矢量，以及产生使与生物学实体关联的矢量和与生物学实体不关联的矢量分离的边界函数。

在步骤1000，选择数量的已知样品经受暴露样品中的细菌的核酸的条件。关于这点，已知样品是其中已经知道样品是否应当对于MRSA测试阳性或阴性的样品。如此，已知样品可以被用于构造可以判定以后的未知样品是否也包含MRSA的模型。虽然详细地描述MRSA，但是当然，其它适当的生物学实体的存在可以在本发明的其它实施例中被检测。

对于使样品经受暴露样品中的核酸的条件，有许多不同的方式。例如，如本领域中众所周知的，样品可以使它的温度上升，从而使DNA的链分离。同样可以使用用于暴露样品中的核酸的其它众所周知的手段。

在步骤1010，对于每个已知样品，检测诸如mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的至少三个标靶的存在和量。在一些实施例中，可以为每个所关心的标靶测量Ct值。根据一个实施例，金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列是femA。有许多不同的方式来从样品测量基因。例如，多重PCR可用于为每个测量标靶测量PCR阈值循环（Ct）。其它测量技术同样可以被使用。

确定的Ct值可用于产生Y图表。然而，在Y图表的产生之前，可以进行预筛选处理。在预筛选处理中，如果系统没有检测到三个标靶基因序列中的任何一个，那么该样品被认为是MRSA阴性的，而且将不被显示在Y图表中。在一个实施例中，如果mecA>35、femA>32、或SCCmec>32，那么样品被认为是阴性的。在另一个实施例中，如果mecA>30、femA>30或SCCmec>30，那么样品被认为是阴性的。在一些实施例中，在样品经受得住这个预筛选处理之后，该样品将被标绘在Y图表上，并且利用该Y图表被分析。预筛选处理中使用的阈值可以取决于仪器和样品制备。

在步骤1020，调用算法可以被应用于来自每个已知样品的每个测量标靶。根据一个实施例，调用算法可以使用Y图表。

根据一个实施例，对于每个已知样品，该调用算法产生中间矢量，该中间矢量可以被投射在2维图表上，该2维图表可以是Y图表。该中间矢量可以是三个单位矢量的总和，该三个单位矢量彼此相隔120度，而且通过从步骤1020获得的mecA、femA和SCCmec被加权。根据一个实施例，矢量的总和可以由公式表示：

其中是中间矢量。femA可以由通用变量“SA”（表示与金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列关联的值）代替。根据其它实施例，同样可以使用用于表示测量标靶的多少相对量的其它类似的手段。

在步骤1030，在步骤1020期间对于每个已知样品产生的中间矢量可以被分析，以便产生可用于判定未知样品是否包含MRSA的模型。根据一个实施例，使用已知样品的中间矢量，选择边界函数，而且限定该边界函数的参数。该边界函数可用于判定MRSA是在未知样品中还是不在未知样品中。

根据一个实施例，可以在所有测量的已知样品的Y图表上施行聚类分析，从而将MRSA阳性和阴性样品分离。聚类分析可以将阳性样品聚合在一起，因为femA、mecA和SCCmec是单个复制标靶，而且在MRSA阳性样品中这些标靶应当是相等的份数。数学上，这意指如果样品是MRSA阳性，那么它在Y图表上的中间矢量应当靠近起点。如此，诸如包围阳性样品的矩形区域的简单的边界函数可用于聚集位于Y图表的起点周围的阳性样品。阴性样品可能被分散在这个边界之外。根据一个实施例，简单的矩形方框可用于分离Y图表上的阳性和阴性样品。可以使用来自已知样品的测量来调节该矩形方框的边界。例如，神经网络算法可以被使用以帮助限定该方框的边界。其它实施例可以选择更复杂的边界函数或使用其它手段来调节选择的边界函数的系数。如上所述，可以使用其它方法（例如，圆形门处理、神经网络或高斯分布函数）来产生边界函数。

图2图解根据一个实施例的可用于判定MRSA是否存在于样品中的步骤。如在此使用的，未知样品指的是不知道MRSA是否存在于其中的样品。图2中的步骤可以使用模型，诸如使用来自图1的步骤产生的模型，来判定未知样品是否包含MRSA。未知样品可以具有各种测量的标靶，而且通过分析从未知样品的测量标靶产生的中间矢量相对于模型的边界函数存在于哪里，这些测量可用于检测MRSA的存在。

在更多的通称中，本发明的实施例指向用于判定样品中的生物学实体的存在的方法。该方法包括检测样品中的至少三个标靶的值（例如，量）。通过在数字计算机上执行调用算法来判定样品中的生物学实体的存在。该调用算法使用至少三个标靶的测量值（例如，量）作为输入，并且将它们组合以形成矢量，该矢量与2维图表上的边界函数相比较。如果该矢量在边界函数之内，那么生物学实体存在，以及如果该矢量不在边界函数之内，那么生物学实体不存在。

在步骤1100，未知样品经受暴露样品中的细菌的核酸的条件。同样可以在步骤1100使用在构造模型的同时在步骤1000期间使用的相同的技术。

在步骤1110，从未知样品测量至少三个标靶，mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的Ct值。在步骤1010期间使用的相同的技术可用于实现步骤1110。

此时，如上所述的类似的预筛选处理可用于去除很可能不与MRSA关联的样品。

在步骤1120，用于构造模型的调用算法可以被应用于来自未知样品的测量标靶。例如，可以使用在步骤1020使用的相同的函数来从未知样品产生中间矢量。

在步骤1130，判定MRSA是否存在于未知样品中。根据一个实施例，这可以通过将对于未知样品产生的中间矢量与从已知样品产生的边界函数进行比较来被实现。如果对于未知样品的中间矢量落在标明阳性MRSA样品的边界之内，那么可以判定MRSA存在于未知样品中。如果对于未知样品的中间矢量落在标明阳性MRSA样品的边界之外，那么可以判定MRSA不存在于未知样品中。

本发明的实施例是特别有利的。以下注意，本发明的实施例在识别样品中的MRSA上是特别有用的，不管MRSA常常可能与多个其它相关的细菌相互移植的事实。

通过以下说明的例子进一步论证本发明的各种实施例。实例经由说明被提供，并且不意欲以任何方式限制所述发明。

说明性的实例1

样品制备

659个样品被收集和分析，以形成根据一个实施例的可以使用的模型。样品是已知样品，即，已知MRSA是否存在于每个样品中。对于每个样品收集两个药签。然后这两个药签对于MRSA被单独培养。如果来自两个药签的培养结果一致，那么这个样品被认为是有效的。

然后每个有效的已知样品被放置在样品缓冲剂试管中，样品缓冲剂试管具有1ml的Tris、pH8.0，以及1mM EDTA、pH8.0。该样品缓冲管以3000rpm被涡旋40秒，以从药签头逐出细菌。然后500μL的细菌悬浮液（即，包含细菌悬浮液的样品缓冲剂）被转移到新的试管中。

然后，10μL的处理控制日常存储液（Process Control Working Stock）被添加到新的试管中。10μL的细胞壁消化酶同样被添加到新的试管中。在简短的涡旋之后，试管在70°C被培育5分钟。然后使用Agencourt VirNA提取试剂盒（Extraction Kit）提取细菌性的DNA。

然后，通过将188μL的溶菌缓冲剂、1.0μL的polyA RNA（10μg/μl）以及100μl的蛋白酶K（20mg/ml）混合在一起来制备预混合物（在10mM Tris pH8.0、50%甘油、5mM氯化钙中）。

该预混合物然后被添加到试管，以1700RPM涡旋10秒，然后在70°C的水浴槽中培育5分钟。

在试管被冷却到室温之后，575μL的100%异丙醇以及10μL的凝固缓冲剂（涂有羧基的顺磁性的颗粒）被添加到该试管，并且该试管以1700RPM被涡旋10秒。

然后该试管在室温下被培育2分钟，然后被放置在微量离心管磁体上6分钟，以捕获磁性颗粒。上清液被吸出，而没有妨碍磁性颗粒。然后试管被去掉磁体，并且500μL的冲洗缓冲剂（3.3M硫氰酸胍，1.7%v/v TritonX-100，167.5mM柠檬酸钠)被添加。

该试管以1700RPM被涡旋10秒，然后被放回在磁体上4分钟。上清液被吸出并且丢弃。试管被去掉磁体并且900μL的75%的乙醇被添加。该试管然后以1700RPM被涡旋10秒，放回在磁体上6分钟并且上清液被吸出。75%乙醇冲洗重复总共两次冲洗。允许磁性颗粒在室温下在磁体上干燥15分钟。

为了洗提DNA，25μL的核酸酶自由水被添加到干燥的颗粒。该试管被短暂地涡旋，然后在70°C被培育5分钟。然后试管被放回在磁体上1分钟。洗提的核酸被用于PCR分析。

PCR反应混合物设置

PCR试剂首先被解冻然后在以下步骤期间被保持为准备就绪。在96孔板（行A和H，列1和12）上不使用边缘孔。每个PCR板使用一个阳性和1阴性控制。

然后，为了所需量的样品和控制，制备反应混合物。基于12个反应的增量，制备反应混合物。

以下容量被添加到2.0ml的聚丙烯试管：300μL的5xPCR反应缓冲剂（每个反应所需的容量×13），108.33μL的6x低聚混合物（每个反应所需的容量×13），2.6μL的1M MgC12（每个反应所需的容量×13），31.2μL的1单位/μl UDG（每个反应所需的容量×13），20.8μl的12.5mM dNTP（每个反应所需的容量×13），1.82μL的40单位/μlDNA聚合酶（每个反应所需的容量×13），以及95.25μL H20（每个反应所需的容量×13）。

反应混合物以每个孔30μL容量被等分到Stratagene的96孔PCR板中。20μL的SPRI-TE提取的DNA样品被添加到单个孔中。20μL的阴性控制液被添加到具有核酸酶自由水的单个孔中。20μL的阳性控制液被添加到单个孔中。然后，通过使用设置为45μL的吸管将混合物向上和向下吸10次，产生样品和反应混合物。然后，制备的PCR板利用光学粘合盖（Optical Adhesive Cover）被密封，然后以3000rpm被离心3分钟。

模型产生和分析

该板然后被装载到Stratagene Mx3005P qPCR仪器上。板中使用的孔被选择，并且为了荧光数据收集而选择以下染料：CY5、HEX、ROX、FAM。最后，以下循环条件被指定：4'37°C（lx）；1'95°C（lx）；5”91°C-->10”62°C-->25”58°C（50x）。一些监视的标靶被表示在以下的表1中。

在以上的表中，用于SCCmec的探针具有与SCCmec的右末端互补的序列。

在其它实施例中，序列和/或长度基本上相同的其它引物和探针可被用于本发明的实施例中。

首先，所有的样品孔和阳性控制孔连同阈值一起被选择。然后进行数据分析。PCR阈值然后以FAM、HEX、ROX和CY5的顺序被记录和放置在化验调用算法文件中。收集的用于样品的阈值对应于每个样品中的mecA、femA和SCCmec的量。

如同图1中图解的实施例，对于每个样品产生中间矢量。每个中间矢量是三个单位矢量的总和，该三个单位矢量彼此相隔120度，而且分别通过mecA、femA和SCCmec值被加权。使用的公式是：

其中

是中间矢量。在图3中显示当标绘在2维Y图表上时有多少这些样品出现的图例。

如可以在图3中看出的，从MRSA阳性样品产生的中间矢量通常具有它们的端点聚集在图表的起点周围。与此相反，MRSA阴性样品通常具有它们的中间矢量的端点存在于更加远离起点的位置。

图4显示简单的矩形方框4000如何可以被用作边界函数以分离阳性和阴性样品。使用659个样品作为用于模型的基础，矩形方框的左、右、顶部和底部边缘是在-3、2.5、2和-1.3。不使用简单的矩形来聚集样品，更复杂的方法可以被应用于其它模型。例如，可以通过函数来限定边界，然后使用神经网络来调整该函数。同样，边界并非必需是矩形；更复杂的几何结构可以更好地适合其它模型中的已知样品。

然后使用新产生的模型分析已知样品，以测试模型如何准确地分类已知样品。如上所述，对于每个已知样品计算中间矢量并且将该矢量与边界函数进行比较的基于Y图表的调用算法对于659个样品引起5个假阴性（FN）和0个假阳性（FP）。更靠近地查看5个FN，该5个FN揭示5个样品中的3个样品具有没有Ct值的至少一个化验（Ct=40）。这不应当伴随阳性样品发生。因此，这3个样品没有被认为是可靠的测试点。如此，在去除这3个FN之后，剩下2个FN和0个FP。这些假阴性中的一个在图4中在4010处被突出。

与此相反，应用于已知样品的参考方法（BD Geneohm^TM MRSA化验）产生3个FN和9个FP。如此，与参考方法相比，新的MRSA调用算法显示FP中的明显减少，而没有增加FN。

说明性的实例2

样品制备

199个Nasal药签被收集并且存储在Stuart传送介质中。药签头被去除，而且每个药签头被转移到2ml的样品悬浮液试管中，该样品悬浮液试管具有基于样品缓冲剂的1200μL的Tris，该样品缓冲剂具有10mM Tris pH8.0以及1mM EDTA，pH8.0～lOOmg的1mm氧化锆/硅质颗粒。通过以3000rpm的速度涡旋样品试管至少15秒，药签头上的细菌被逐出。

然后药签头从样品试管被无菌地去除，并且被传送到具有1ml的Trypic Soy broth（TSB）以及6.5%NaCl的15ml细菌培养试管中。接种过的细菌试管被传送到37°C的孵育箱中，并且以200rpm的速度摇动，被整夜培育。

然后确定金黄色葡萄球菌和/或MRSA的存在或不存在。10μL的每一个整夜培养液在BBL^TM CHROMagar MRSA以及BBL^TM CHROMagar金黄色葡萄球菌板上被划线。来自每个试管的1200μL样品溶液中的500μL然后经受如Agencourt VirNA试剂盒方案描述的DNA分离过程。简单地说，这个过程开始于大量CFU S.猫属（felis）细菌（或大量没有CFU的S.猫属）作为处理控制。10单位的消色肽酶（Achrompeptidase）被添加到每个试管，很好地混合，并且在70°C的水浴槽中培育4分钟。然后包含188μL的溶菌缓冲剂的289μL的新鲜制备的溶菌溶液、1.0μL的多聚腺甘酸（PolyA）（600ug/ml）、以及100μL的蛋白酶K（6.4mg/ml)被添加到每个样品中并且被很好地混合。然后每个样品被培育，其次被允许冷却2分钟。然后，10μL的磁性颗粒和575μL的100%异丙醇被添加，并且通过涡旋被很好地混合。反应含量被允许在室温下培育5分钟，然后，通过将样品试管放置在磁体架子上6分钟来收集磁性颗粒，从而将磁性颗粒与样品溶液分离，直到溶液变得清澈。

接下来，上清液被吸出样品，同时注意在吸出期间不去除任何颗粒。500μL的清洗缓冲剂被添加到样品中并且为了混合而涡旋10秒。然后试管在磁体上被培育4分钟（或直到清澈）。然后上清液被再次吸出样品。然后，900μL的新鲜制备的75%乙醇被添加并且试管被涡旋10秒。然后试管在磁体上被培育，直到清澈。然后上清液再次被吸出样品，并且再一次重复乙醇清洗。然后颗粒在磁体上被干燥15-25分钟。当颗粒的环开始破裂时，样品被洗提。试管被去掉磁体，并且25μL的核酸酶自由水被添加以便洗提DNA。然后样品被涡旋以便混合。然后试管在70°C被培育5分钟。试管被放回到磁体上并且被培育1分钟。然后洗提液被传送到干净的试管用于PCR扩增。

PCR引物和探针，PCR循环条件

列举在主要混合物（Master mix）表中的试剂被制备就绪。根据总的反应数，可以通过简单地将标明容量的试剂在DNA/RNase-自由试管中添加在一起，制备充足的Master混合物。试管可以被涡旋以便混合，然后保持就绪用于以后的使用。20μL的每个洗提液被添加到Mx3000P 96-孔PCR板（非边缘的）（Stratagene，Cat#401333)（一个洗提液，一个孔）。30μL主要混合物被添加到填充有洗提液的每个孔中，然后通过轻轻地上上下下吸8次以上（多通道可能是有用的）而被混合。该板利用MicroAmp^TM光学粘合剂膜（采用的生物学系统）被紧密地覆盖，然后在进入PCR机器之前，以1100xg被离心3分钟。

Stratagene MX3005P仪器上的PCR循环条件设置如下：4'37°C（lx）；1分钟95°C（lx）；15秒95°C→10秒62°C→30秒58°C（40x）。一些被监视的标靶是如上所述的。

模型产生和分析

如先前以第一说明性的实例所描述的，每个标靶的阈值被输出和输入到调用算法中。

因为在这个实例中的已知样品没有以与第一实例严格相同的方法被收集，所以对于第二实例，在Y图表算法中的矩形方框的左、右、顶部和底部边缘被发现是-4、5.5、3和4。这个在图5中被图解。当使用该模型重新处理该已知样品时，发现3个假阳性和4个假阴性。这表示超过得到11个假阳性和2个假阴性的Cephied

MRSA参考方法的改进。

图6是可用于执行本发明的一个实施例的计算机系统300的方框图。计算机系统300具有多个输入模块。测量模块301用于测量样品中的选择标靶。根据被选择为测量标靶响应的测量方法，这个测量模块可以在本发明的不同的实施例之间变化。例如，根据一个实施例，测量模块可以实施关于样品的PCR分析。测量模块可以通过至少一部分典型的实时PCR设备的工作部件被具体化。同样显示的是标准键盘302和鼠标303。计算机系统300还包含计算机内的各种典型的计算机部件。这些部件包含系统总线304，一个以上的磁盘驱动器305，RAM306以及处理器307。根据本实施例的准确的特性，还可以存在其它部件。图5还显示监视器308，监视器308允许信息被显示给系统的用户。

在本发明的一个实施例中，样品被放置在测量模块301中，在测量模块301中，样品被处理，而且来自样品的选择标靶的量被测量。然后这个信息沿着系统总线304被传送到计算机系统中，而且使用处理器307，适当的调用算法可以被应用于反应数据。处理器307执行以实现调用算法的指令被存储在诸如RAM306或磁盘驱动器305的计算机可读介质上。调用算法还可以被存储在前述的介质上。然后调用算法的输出可以被显示在监视器308上。例如，如果调用算法使用2维Y图表经由中间矢量来图示三个标靶的测量的量，那么中间矢量的终点可以被显示在监视器308上。本发明的替换的实施例可以经由其它通信手段信息输出。例如，计算机系统可以使用打印机来打印Y图表，或在网络上将Y图表发送给另一个计算机。然后来自测量的样品的信息被用于帮助构造模型或判定样品是否包含MRSA。

本发明涉及的，对于本领域的技术人员将明显的是，在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以除了以上具体公开的那些形式之外的形式被具体化。因此，如上所述本发明的特殊的实施例被认为是说明性的，而不是限制性的。本发明的范围如附加的权利要求书所阐明，而不是被局限于包含在上文描述中的实例。

在这个申请中描述的软件成分、步骤或函数可以被实现作为软件代码，通过一个以上的处理器使用任何适当的计算机语言，诸如，例如Java，C++或使用例如传统的或目标定向技术的Perl，来执行软件代码。软件代码可以被存储作为计算机可读介质（例如，非暂时的计算机可读介质）上的一系列的指令或命令，计算机可读介质诸如是随机存取存储器（RAM），只读存储器（ROM），诸如硬盘驱动器或软磁盘的磁性介质，或诸如CD-ROM的光学介质。任何这样的计算机可读介质还可以存在于单个计算的设备上或之内而且可以存在于系统或网络之内的不同的计算的设备上或之内。

本发明的一些实施例可以作为软件或硬件或两者相结合的控制逻辑被实现。控制逻辑可以被存储在信息存储介质中，作为多个指令，多个指令适于引导信息处理装置以施行本发明的实施例中公开的一组步骤。基于在此提供的公开和教导，普通的本领域的技术人员的个人将领会其它途径和/或方法来实现本发明。

任何“一”、“一个”、“该”的叙述打算意指“一个以上”，除非具体地有相反的标明。

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整个这个申请各种公报被参考。为了所有的目的，这些公报的公开通过引用，以它们的全部在此被结合到这个申请中。均没有被承认是现有技术。

Claims (53)

1.一种用于判定样品中的生物学实体的存在的方法，其特征在于，所述方法包括：

检测所述样品中的至少三个标靶的量；以及

通过在数字计算机上执行调用算法来判定所述样品中的所述生物学实体的所述存在，其中，所述调用算法使用与至少三个遗传因子关联的测量值作为输入，并且将它们组合以形成矢量，将所述矢量与2维图表上的边界函数相比，并且如果所述矢量在所述边界函数之内，那么所述生物学实体存在，如果所述矢量不在所述边界函数之内，那么所述生物学实体不存在。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2维图表是Y图表，而且其中所述至少三个遗传因子包含mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列，而且其中所述调用算法在所述2维Y图表上，将mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测量组合作为矢量

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少三个遗传因子包含mecA、SCCmec和femA。

5.如权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物学实体包括MRSA。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包含在显示器上显示所述Y图表。

7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于，通过矩形门函数、圆形门处理、神经网络或高斯分布函数来限定所述边界函数。

8.如权利要求1到8中任一项所述的方法，其特征在于，从一组已知样品产生所述边界函数，其中对于所述一组已知样品中的每个样品，MRSA的存在是已知的。

9.一种用于判定样品中的生物学实体的存在的系统，其特征在于，所述系统包括：

测量模块，能够检测与所述样品中的至少三个遗传因子关联的值；

存储器，存储来自所述测量模块的检测值；

计算机可读介质，包含具有用于执行调用算法的指令的计算机可读代码，其中所述调用算法使用所述至少三个遗传因子的所述检测和测量值作为输入，并且将它们组合以形成矢量，将所述矢量与2维图表上的边界函数相比，并且如果所述矢量在所述边界函数之内，那么所述生物学实体存在，如果所述矢量不在所述边界函数之内，那么所述生物学实体不存在；和

处理器，在所述计算机可读介质上执行所述计算机可读代码，以便判定所述样品中的所述生物学实体的所述存在。

10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述值是所述至少三个标靶的量。

11.如权利要求9或10所述的系统，其特征在于，所述2维图表是2维Y图表，而且其中所述至少三个遗传因子包含mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列，而且其中所述调用算法在所述2维Y图表上，将mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量组合作为矢量

12.如权利要求11所述的系统，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

13.如权利要求9到12中任一项所述的系统，其特征在于，所述测量模块包括实时PCR设备。

14.如权利要求11所述的系统，其特征在于，进一步包含用于显示所述2维图表的显示器。

15.如权利要求9到14中任一项所述的系统，其特征在于，通过矩形门函数、圆形门处理、神经网络或高斯分布函数来限定所述边界函数。

16.一种计算机可读介质，其特征在于，包括：

用于调用算法的代码，其中所述调用算法使用所述至少三个遗传因子的检测和测量值作为输入，并且将它们组合以形成矢量，将所述矢量与2维图表上的边界函数相比，而且如果所述矢量在所述边界函数之内，那么生物学实体存在，并且如果所述矢量不在所述边界函数之内，那么所述生物学实体不存在。

17.如权利要求16或17所述的计算机可读介质，其特征在于，通过矩形门函数、圆形门处理、神经网络或高斯分布函数来限定所述边界函数。

18.如权利要求16所述的计算机可读介质，其特征在于，所述2维图表是2维Y图表，而且其中至少三个遗传因子包含mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列，而且其中所述调用算法在所述2维Y图表上，将mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量组合作为矢量

19.如权利要求18所述的计算机可读介质，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

20.如权利要求18所述的计算机可读介质，其特征在于，进一步包含用于显示所述2维图表的代码。

21.一种用于产生模型的方法，所述模型能够用于判定未知样品中的生物学实体的存在，其特征在于，所述方法包括：

检测已知样品中的至少三个遗传因子的所述存在和值；

在数字计算机上对所述已知样品中的每个样品执行调用算法，其中，所述调用算法产生矢量，而且对于每个矢量，使用所述至少三个遗传因子的所述检测值作为输入，其中一些矢量与所述生物学实体关联，并且一些矢量不与所述生物学实体关联；

在2维图表上标绘所述矢量；以及

产生边界函数，所述边界函数将与所述生物学实体关联的所述矢量和与所述生物学实体不关联的所述矢量分离。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，通过使用矩形门函数、圆形门处理、神经网络或高斯分布函数来限定所述边界函数。

23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，进一步包含显示所述2维图表。

24.如权利要求21到23中任一项所述的方法，其特征在于，所述2维图表是Y图表，而且其中所述至少三个遗传因子包含mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列，而且其中所述调用算法在所述2维Y图表上，将mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的检测量组合作为矢量

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

26.一种用于判定样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的存在的方法，其特征在于，所述方法包括：

使所述样品经受将暴露存在于所述样品中的任何细菌的核酸的条件；

扩增和检测所述样品中的至少mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌（SA）特异性靶基因序列的存在和量；和

通过在数字计算机上执行调用算法来判定所述样品中的MRSA的所述存在，其中所述调用算法使用mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测和测量量作为输入，其中，当所述样品中的mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量与通过选择的边界函数限定的近似相等时，所述调用算法能够用于判定MRSA存在于所述样品中。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列是femA。

28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述调用算法在2维Y图表上将mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量组合作为矢量其中所述矢量

能够用于判定mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量是否与通过所述选择的边界函数限定的近似相等。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

30.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述2维Y图表被显示在显示器上。

31.如权利要求26到30中任一项所述的方法，其特征在于，通过使用矩形门方法、圆形门处理、或高斯分布函数来限定所述选择的边界函数。

32.如权利要求26到31中任一项所述的方法，其特征在于，使用神经网络来计算所述选择的边界函数。

33.如权利要求26到32中任一项所述的方法，其特征在于，从一组已知样品中产生所述选择的边界函数，其中对于所述一组已知样品中的每个样品，MRSA的存在是已知的。

34.如权利要求26到33中任一项所述的方法，其特征在于，通过实时PCR来检测所述样品中的至少mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述存在和量。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，至少mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述量被循环测量。

36.一种用于判定样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的存在的系统，其特征在于，所述系统包括：

测量模块，能够扩增和检测所述样品中的至少mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌（SA）特异性靶基因序列的所述存在和量，其中所述样品已经经受将暴露存在于所述样品中的任何细菌的核酸的条件；

存储器，存储来自所述测量模块的检测量；

计算机可读介质，包含具有用于执行调用算法的指令的计算机可读代码，其中所述调用算法使用mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测和测量量作为输入；和

处理器，在所述计算机可读介质上执行所述计算机可读代码，以便判定所述样品中的MRSA的所述存在；

其中，当所述样品中的mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量与通过选择的边界函数限定的近似相等时，所述调用算法判定MRSA存在于所述样品中。

37.如权利要求36所述的系统，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列是femA。

38.如权利要求36或37所述的系统，其特征在于，所述调用算法在2维Y图表上将mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量组合作为矢量

其中所述矢量

能够用于判定mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测是否与通过所述选择的边界函数限定的近似相等。

39.如权利要求38所述的系统，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

40.如权利要求38或39所述的系统，其特征在于，进一步包括：

能够将信息显示给用户的显示器，其中所述2维Y图表被显示在所述显示器上。

41.如权利要求36到40中任一项所述的系统，其特征在于，使用矩形门方法来限定所述选择的边界函数。

42.如权利要求36到41中任一项所述的系统，其特征在于，使用神经网络来计算所述选择的边界函数。

43.如权利要求36到42中任一项所述的系统，其特征在于，从一组已知样品中产生所述选择的边界函数，其中对于所述一组已知样品中的每个样品，MRSA的存在是已知的。

44.如权利要求39到43中任一项所述的系统，其特征在于，所述测量模块使用实时PCR来检测至少mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述存在和量。

45.如权利要求44所述的系统，其特征在于，至少mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述量被循环测量。

46.一种计算机可读介质，其特征在于，包括：

用于能够判定样品中的MRSA的存在的调用算法的代码，其中，所述调用算法使用mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌（SA）特异性靶基因序列的检测和测量量作为输入，其中，当所述样品中的mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量与通过选择的边界函数限定的近似相等时，所述调用算法判定MRSA存在于所述样品中；

其中，通过使所述样品经受将暴露存在于所述样品中的任何细菌的核酸的条件，以及扩增和检测所述样品中的至少mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述存在和量，获得mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测和测量量。

47.如权利要求46所述的计算机可读介质，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列是femA。

48.如权利要求46或47所述的计算机可读介质，其特征在于，所述调用算法在2维Y图表上将mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量组合作为矢量以便判定mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测是否与通过所述选择的边界函数限定的近似相等。

49.如权利要求48所述的计算机可读介质，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

50.一种用于产生模型的方法，所述模型能够用于判定未知样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的存在，其特征在于，所述方法包括：

使一组已知样品经受将暴露存在于所述已知样品中的任何细菌的核酸的条件，其中，对于所述一组已知样品中的每个样品，MRSA的所述存在是已知的；

扩增和检测所述已知样品中的至少mecA、SCCmec和金黄色葡萄球菌（SA）特异性靶基因序列的所述存在和量；和

在数字计算机上对所述已知样品中的每个样品执行调用算法，其中，所述调用算法使用mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测和测量量作为输入；和

产生能够被用于判定MRSA是否存在于所述未知样品中的模型，其中，从相对所述已知样品执行的所述调用算法的所述输出产生所述模型，其中，通过选择的边界函数来限定所述模型，所述选择的边界函数限定MRSA阳性和MRSA阴性样品之间的边界。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列是femA。

52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述调用算法在2维Y图表上将对于所述已知样品中的每个样品的mecA、SCCmec和所述金黄色葡萄球菌特异性靶基因序列的所述检测量组合作为矢量

以便校准所述选择的边界函数。

53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，通过公式限定所述矢量

$\stackrel{\→}{p}=\mathrm{mecA}*e^{0i}+\mathrm{SA}*e^{\frac{2}{3}\mathrm{\πi}}+\mathrm{SCCmec}*e^{\frac{4}{3}\mathrm{\πi}}.$

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