JP5867797B2 - ドーパミン産生神経の分化誘導用の細胞培養基材 - Google Patents
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Landscapes
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
以下の実施例では、キメラタンパク質を固定した培養基材として、ガラス基板をベースとした材料を用いた(参考文献:Nakaji-Hirabayashi T, Kato K, Arima Y, Iwata H. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials 2007:28;3517-29)。まず、22 mm × 26 mm × 0.5 mmのガラス基板上に金を蒸着(厚さ:19 nm)することにより金薄膜ガラス基板を作製した。次にこの金薄膜ガラス基板を、カルボキシル基末端を有するアルカンチオール(11-メルカプト-1-ウンデカン酸)の1 mM エタノール溶液中に室温下で浸漬し、表面に自己組織化単分子膜を形成させた。次に、この基板を50 mM 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩および50 mM N-ヒドロキシスクシンイミドを含む水溶液に室温下で30分間浸漬して、自己組織化単分子膜表面のカルボキシル基を活性エステルに変換した。次いで、その基板を10 mM N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸溶液に浸漬し、室温下で1時間反応させた。さらにその表面を40 mM 硫酸ニッケル水溶液に室温下で1時間曝露することによって、ニッケルイオンを有する表面を得た。この表面を下記で調製したオリゴヒスチジンを有するキメラタンパク質溶液に室温下で2時間曝露することで、タンパク質を安定に固定した培養基材を作製した(図1)。GH、BH、およびLGキメラタンパク質を共固定する場合は、それらを1:1:2のモル比で混合した(総タンパク濃度を3 μMとした)。
大腸菌発現系を利用して、BH(配列番号2)およびGH(配列番号4)を合成した(図2)。まず、BDNFおよびGDNFをコードするDNA配列をヒト脳由来cDNAライブラリーよりPCR法により増幅した。BDNF cDNAの増幅には配列番号9、10に示す塩基配列から成るプライマーを、GDNF cDNAの増幅には配列番号11、12に示す塩基配列から成るプライマーを用いた。得られた各DNA断片をタンパク質発現用のプラスミドベクターに導入した。Hisをコードする配列は、BDNFおよびGDNFのDNA配列の下流に配置し、それぞれ当該タンパク質のアミノ酸配列のC末端にオリゴヒスチジンが融合するように設計した。作製したプラスミドベクターは、大腸菌宿主に導入し、IPTG法により当該融合タンパク質を発現誘導させた。Novagen社のOvernight Autoinduction systemを用いても同様に発現させることが可能であった。
大腸菌発現系を利用して、LGを合成した(図2)。このキメラタンパク質は、ラミニンα1鎖のインテグリン結合ドメインとして知られる、グロビュラードメインの3番目[G3ドメイン(LG3)]と、γ1鎖C末端のペプチド(LγP)を主要構成要素として含んでいる。LG3・αヘリックスペプチド・オリゴヒスチジンを融合したキメラタンパク質とLγP・αヘリックスペプチド・オリゴヒスチジンを融合したキメラタンパク質を別々に合成し、αヘリックスペプチドのコイルドコイル形成によるヘテロ二量化を利用して複合体としたものがLGである。
ガラス基材へのタンパク質固定の最適条件を調査するために、様々な条件の下、GH、LGの基材表面への固定化を行った。各種の比率でそれらを固定した場合、GH:LG=5:5の場合に神経細胞の出現率がもっとも高く、細胞の接着も良好であった(図3)。これらの結果から、神経栄養因子キメラタンパク質(BH及びGH)と細胞接着性キメラタンパク質(LG)は、等モル量で固定するのが最適であることが明らかとなった。また、LGの比率を5に固定し、BHおよびGHの比率を1:4、2.5:2.5、4:1とした場合の神経分化の評価を行ったところ、2.5:2.5で最もよい結果が得られた。これらの結果を踏まえ、以下の実験では、BH:GH:LG=2.5:2.5:5の比率でガラス基材上に固定化させたBH/GH/LG共固定基材を用いることとした。
BH、GHおよびLGを共固定した基材上でのドーパミン産生神経への分化誘導を行った。対照実験として、従来から行われている方法、すなわち、ラミニン吸着基材上に細胞を播種し、液性因子としてリコンビナントBDNF(50 ng/mL)およびリコンビナントGDNF(10 ng/mL)を添加した培地中で分化誘導した。
BHおよびGHを固定する必要性について、また、BHとGHを共固定する必要性について調査するため、LG固定基材上でBDNFおよびGDNFを液性で添加する培養系、BH/LG共固定基材上での培養系(固定化比率はBH:LG=1:1)、およびGH/LG共固定基材上での培養系(固定化比率はGH:LG=1:1)について検討した。上記と同様にして神経幹細胞を各基材上に播種し培養した。
BH、GHおよびLGを共固定した基材上で分化誘導した細胞のドーパミン産生量を定量し、従来の分化誘導法と比較した。2週間分化誘導を行った細胞をPBSにて洗浄した後、56 mM 塩化カリウム/HBSS溶液(カルシウムおよびマグネシウム含有)に15分間曝露した。上澄み液をシリンジフィルターで処理し、高速液体クロマトグラフィ−電気化学検出法(HPLC-ECD)により分泌ドーパミン量を定量した。その結果、BH/GH/LG共固定基材上で誘導した細胞では、106 細胞あたり23 pmolのドーパミンが検出された。従来法で分化誘導した細胞に比べ、ドーパミン産生量は約8倍高かった(図5)。
BH/GH/LG共固定基材上で分化誘導した細胞が、ドーパミン産生細胞の機能を有することを調査するために、ドーパミンの合成酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)および芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)、ドーパミンの代謝に関連する酵素であるカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ(COMT)およびモノアミン酸化酵素(MAOaおよびMAOb)、ドーパミンのリサイクリングに寄与するドーパミン輸送体(DAT)、ドーパミンのシグナル伝達を担うドーパミンレセプター1〜5(DRD1〜5)の遺伝子発現をRT-PCRにより調べた。培養した細胞を回収・溶解し、RNAを抽出した。そのRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを調製し、PCR法によって上記の各種タンパク質をコードするRNAの存在について調べた。その結果、いずれの場合にもmRNAの存在が認められた。つまり、本発明基材上で誘導した細胞は、ドーパミン産生細胞特有の遺伝子を発現していると考えられ、ドーパミン産生神経の機能を有しているものと推測された(図6)。
上記の「5.BH/GH/LG共固定基材上でのドーパミン産生神経の分化誘導」にて示したように、BH/GH/LG共固定基材上で分化誘導を行うと、アストロサイトへの分化がほとんど見られなかった。この機序について詳細に調べるため、LG基材上に播種した神経幹細胞をアストロサイト分化条件下にて培養し、基材上の細胞の変化を調べた(図7)。神経幹細胞を無血清培地(A)、毛様体由来神経栄養因子(CNTF)を添加した無血清培地(B)、および、2%FBSを添加した培地(C)に懸濁し、LG基材上に播種した。培養初期には、いずれの培養系においても細胞の接着が認められたが、培養4日目ごろから、BおよびCの培養系において細胞の剥離が観察され、培養7日目にはほとんどの細胞が剥離した。ここで、Aの培養系では接着細胞を、BおよびC培養系では浮遊する細胞をそれぞれ回収し、逆転写酵素PCR法により、アストロサイトマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、細胞接着因子であるインテグリンα6(Itgα6)、および、インテグリンβ1(Itgβ1)のmRNAの発現を調べた。その結果、培養条件BおよびCで得られた細胞は、GFAPのmRNA量が高いのに対し、Itgα6のmRNA量が、培養条件Aの細胞に比べ、大きく減少することがわかった。GFAPのmRNA量の増加は、アストロサイトへの分化を意味する。すなわち、この結果は、アストロサイトへの分化に伴いItgα6の発現量が減少することによって、アストロサイトが基板から剥離することを示唆する。このことが、BH/GH/LG共固定基材上での培養によって、神経前駆細胞およびドーパミン神経が選択的に得られる一因であると考えられる。
BH/GH/LG共固定基材上で分化誘導した細胞ではBDNFおよびGDNFのシグナル伝達が継続的に行われていることを調査するために、BDNFの受容体であるTrkB、および、GDNFのシグナル伝達を担うRet(Retは、GDNF−GFRα1複合体が形成された際、その複合体に結合する膜タンパク質であり、リン酸化されることでGDNFのシグナル伝達を行う)のリン酸化をウエスタンブロッティングにより調べた。BH/GH/LG共固定基材上で7日間または14日間培養した細胞からライセート(図8、サンプル(a))を調製し、SDS-PAGEを行った後、ニトロセルロース膜に転写した。次に、転写されたタンパク質を、抗リン酸化TrkB抗体、抗リン酸化Ret抗体、抗TrKB抗体、抗Ret抗体でそれぞれ染色し、ペルオキシダーゼ化学発光法によりバンドを検出した。対照群には、ラミニンコート基板を用いてBDNF(50 ng/mL)およびGDNF(10 ng/mL)を液性で作用させて、7日間および14日間分化誘導を行った細胞を用いた(図8、サンプル(b)および(c))。サンプル(b)は、その培養後、さらに、過剰量のBDNF(500 ng/mL)およびGDNF(100 ng/mL)を30分間作用させた後に回収した細胞のライセートであり、リン酸化検出のポジティブコントロールとした。一方、サンプル(c)は、所定期間の分化培養後、すぐにライセートにしたものである。これら3種類の試料のリン酸化状態を調べることにより、基材上で培養した細胞への継続的なシグナル伝達の有無に加え、液性でBDNFおよびGDNFを作用させた場合のシグナル伝達が一過性であるのか否かについて議論することが可能であると考えた。
市販のラミニンコート基材、LGキメラタンパク質固定基材、LG3のみを固定化した基材、およびアルブミンを固定化した基材上で神経幹細胞を培養し、培養開始から1日後に各基材表面に接着した細胞数をカウントした。神経幹細胞は、LGキメラタンパク質、又はβ1インテグリン若しくはα6インテグリンに対する抗体を含有する培養液中に分散させて播種した。
Claims (4)
- 神経幹細胞、神経前駆細胞及び神経細胞を接着する細胞接着性ポリペプチドと、分化誘導因子であるBDNF及びGDNFとが表面に固定化された支持体を含む、ドーパミン産生神経の分化誘導用の細胞培養基材であって、細胞接着性ポリペプチドは、第1のαへリックス領域を含む配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるLG3ポリペプチド鎖と、第2のαへリックス領域を含む配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるLγPポリペプチド鎖とが、αへリックス領域間の相互作用により結合した複合体の形態にあるポリペプチドである、細胞培養基材。
- 分化誘導因子と細胞接着性ポリペプチドの固定化分子数の比率が0.5:1〜1.5:1である請求項1記載の細胞培養基材。
- 請求項1又は2記載の細胞培養基材上で神経幹細胞を培養することを含む、ドーパミン産生神経の前駆細胞の製造方法。
- 請求項1又は2記載の細胞培養基材上で神経幹細胞を培養することを含む、ドーパミン産生神経細胞の製造方法。
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