JP5858418B2 - 花粉症ワクチンの治療効果を予測するバイオマーカー - Google Patents
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Description
精製アレルゲンによる免疫治療はアレルギー疾患の根治が期待できる治療法であり、世界保険機構(WHO)のポジションペーパーにも記載されている。従来の皮下注射法での施行は患者に少なからず痛みを伴い、通院期間が2年間、注射回数が計50回、あるいはそれ以上に及ぶ場合があるため、日本では施行数そのものが減ってきている。千葉大学ではこの弱点を改良すべく投与経路を舌下法に改めた舌下免疫療法について、2005年より臨床試験を開始し、舌下免疫療法でも皮下注射と同様に良好な花粉症症状緩和効果を奏することを報告している(非特許文献1〜3)。
[1]花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための方法であって、
(1)対象者への花粉アレルゲンによるワクチン療法の適用による、当該対象者から単離された単核球における、CCL2、IGHA1及びNCF1からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現の変化を測定すること;及び
(2)(1)において測定した発現の変化と、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性とを相関付けること
を含む、方法。
[2]花粉がスギ花粉である、[1]記載の方法。
[3]花粉アレルゲンがCryj1又はCryj2を含む、[2]記載の方法。
[4]ワクチン療法が、花粉アレルゲンを口腔粘膜投与することにより行われる、[1]記載の方法。
[5]花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための診断薬であって、
(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、からなる群から選択される少なくとも1つを含む、診断薬。
[6]花粉がスギ花粉である、[5]記載の診断薬。
[7]以下の(A)及び(B)を含むキット:
(A)花粉アレルゲンを含む、花粉症に対するワクチン、及び
(B)(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、
からなる群から選択される少なくとも1つ。
[8]花粉がスギ花粉である、[7]記載のキット。
[9]花粉アレルゲンがCryj1又はCryj2を含む、[8]記載のキット。
[10]ワクチンが、口腔粘膜投与用製剤である、[7]記載のキット。
[11]構成要素(B)がアレイとして提供される、[7]記載のキット。
本発明は、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための方法であって、
(1)対象者への花粉アレルゲンによるワクチン療法の適用による、当該対象者から単離された単核球における、CCL2、IGHA1及びNCF1からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現の変化を測定すること;及び
(2)(1)において測定した発現の変化と、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性とを相関付けること
を含む、方法を提供するものである。
例えば、スギ花粉症の予防又は治療のために、Cryj1を含むスギ花粉アレルゲンを含むワクチンを注射投与する場合、1回あたりの投与量は、ヒト1人あたり通常0.005〜5000JAU、好ましくは0.02〜1000JAUである。好適な実施態様として、例えば投与開始時期(投与用量の増量期)には、1回あたりの投与量を、ヒト1人あたり0.02〜1000JAUとし、投与量維持期には、40〜1000JAUとする。
また、スギ花粉症の予防又は治療のために、Cryj1を含むスギ花粉アレルゲンを含むワクチンを口腔粘膜投与(好ましくは舌下投与)する場合、1回あたりの投与量は、ヒト1人あたり通常0.1〜10000JAU、好ましくは1〜2000JAUである。好適な実施態様として、例えば投与開始時期(投与用量の増量期)には、1回あたりの投与量を、ヒト1人あたり1〜2000JAUとし、投与量維持期には、1000〜2000JAUとする。
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後述の実施例に示すように、花粉アレルゲンによる、花粉症のワクチン療法に対する応答が低く、良好な治療効果が確認されなかった患者においては、末梢血単核球におけるCCL2の発現が治療後において顕著に亢進していた。一方、該ワクチン療法に対する応答が良好であり、良好な治療効果が確認された患者においては、末梢血単核球におけるCCL2の発現は抑制傾向にあり、ほとんど亢進は認められなかった。即ち、花粉アレルゲンによるワクチン療法の適用による、単核球(好ましくは、末梢血単核球)におけるCCL2発現の亢進と、当該ワクチン療法の有効性との間の負の相関に基づき、花粉アレルゲンによる、スギ花粉症に対するワクチン療法の有効性が予測できる。
後述の実施例に示すように、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法に対する応答が低く、良好な治療効果が確認されなかった患者においては、末梢血単核球におけるIGHA1の発現が治療後において顕著に亢進しているが、該ワクチン療法に対する応答が良好であり、良好な治療効果が確認された患者においては、末梢血単核球におけるIGHA1の発現は抑制傾向にあり、ほとんど亢進は認められなかった。即ち、花粉アレルゲンによるワクチン療法の適用による、単核球(好ましくは、末梢血単核球)におけるIGHA1発現の上昇と、当該ワクチン療法の有効性との間の負の相関に基づき、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性が予測できる。
後述の実施例に示すように、花粉アレルゲンによる、花粉症のワクチン療法に対する応答が低く、良好な治療効果が確認されなかった患者においては、末梢血単核球におけるNCF1の発現が治療後において顕著に亢進しているが、該ワクチン療法に対する応答が良好であり、良好な治療効果が確認された患者においては、末梢血単核球におけるNCF1の発現の亢進は緩やかであった。即ち、花粉アレルゲンによるワクチン療法の適用による、単核球(好ましくは、末梢血単核球)におけるNCF1発現の亢進と、当該ワクチン療法の有効性との間の負の相関に基づき、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性が予測できる。
本発明は、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための診断薬であって、
(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、からなる群から選択される少なくとも1つを含む、診断薬を提供するものである。本発明の診断薬を用いれば、上記本発明の方法により、容易に花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測することが可能となる。
例えば、本発明の診断薬が、各遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体を含むものであれば、免疫学的手法により各遺伝子の発現変動を測定することにより、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測することができる。この場合、本発明の試薬は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
本発明は、以下の(A)及び(B)を含むキット(即ち、組み合わせ物)を提供するものである:
(A)花粉アレルゲンを含む、花粉症に対するワクチン、並びに
(B)(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、
からなる群から選択される少なくとも1つ。
舌下免疫療法に使用するワクチンとしては、標準化アレルゲン治療エキス「トリイ」2000JAU/ml及び200JAU/mlを用いた。2mLバイアルには標準化スギ花粉エキス原液10,000JAU/mLがそれぞれ0.4mL及び0.04ml含有される。これはスギ花粉エキスを50%グリセリン食塩液で稀釈した注射剤で、無色澄明の液であり、PHは4.0〜5.5、浸透圧比は約3である。
これらの製剤を、日本薬局方濃グリセリン、10%塩化ナトリウム注射液を使用し、注射用水で希釈することにより作製したグリセリン50%(W/W)、塩化ナトリウム5%(W/W)の溶液(以下、50%グリセリン食塩液)で適宜稀釈し、20JAU/ml, 200JAU/ml, 2000JAU/mlの舌下投与用製剤を作製した。プラセボには50%グリセリン食塩液を用いた。これを1週目-3週目の投与用として、1プッシュ0.2ml排出される容器に、4週以降の投与用として、1プッシュ1.0ml排出される容器に詰めた。尚、本剤の浸透圧は添加物により測定できないため、蒸留水にて10倍に希釈した液を用いて測定した結果を参考値として示したものである。
対象疾患名はスギ花粉症であり、選択基準は年齢20-65歳の血清スギ特異的IgE抗体価が陽性(class 2以上)であること、および2年以上のスギ花粉症の既往があることとした。また、下記の条件は除外基準とし、1-9項目のいずれかの項目に該当する対象者は除外した。尚、後述の遺伝子発現解析は舌下エキス投与群20名を対象に行った。
1) 効果判定の支障となる程度の鼻疾患(鼻茸、鼻中隔弯曲症等)、感染性疾患(上気道炎、副鼻腔炎等)を合併している患者
2) 通年性アレルギー性鼻炎、薬物性鼻炎、非アレルギー性鼻炎の患者
3) 効果判定を妨げる可能性のある以下の薬剤を同意取得前2週間以内に使用した患者(抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、ステロイド薬、血管収縮薬等)
4) 免疫療法中の患者
5) 同意取得前6ヶ月以内に鼻症状治療のためにレーザー治療、手術を受けた患者
6) コントロールされていない気管支喘息患者
7) 有効な抗菌剤の存在しない感染症、全身の真菌症の患者
8) 妊婦、妊娠している可能性のある患者、および授乳中の患者
9) その他、担当医が有効性、安全性の上から不適当と判断した患者
日本で標準化されたスギ花粉標準化エキス「トリイ」を用いて舌下免疫療法を行った。安全域である20JAU/ml 0.2mlより投与を開始し、最終的には2000JAU/mlの濃度のエキスを1.0ml舌下に滴下した。投与は、舌下吐き出し法を用いた。プラセボは50%グリセリン食塩液のみとした。1週目は1プッシュ0.2ml排出される容器に、20JAU/ml の濃度のスギ花粉エキス溶液が収容された製剤、2週目は1プッシュ0.2ml排出される容器に、200JAU/ml の濃度のスギ花粉エキス溶液が収容された製剤、3週目は1プッシュ0.2ml排出される容器に、2000JAU/ml の濃度のスギ花粉エキス溶液が収容された製剤、4週以降には1プッシュ1.0ml排出される容器に、2000JAU/mlの濃度のスギ花粉エキス溶液が収容された製剤をそれぞれ用いた。被験者は毎週自宅に送られてくる容器から決められた容量を自ら舌下に投与した。投与は12月に開始し、4月末までの5ヶ月間行った。投与スケジュールを以下の表にまとめた。
(1)主要評価項目(Primary endpoint):2009年の花粉飛散期に被験者自身が記載した症状日記における自覚症状に基づきsymptom-medication score(症状薬物スコアー)を算出した。
(2)副次的評価項目(Secondary endpoint):プロボケーション前後のパラメーターとして、血清中IgE抗体価、スギ花粉特異的減感作療法前後のスギ花粉特異的T細胞のクローンサイズを解析した。
データの集計および統計解析方法
症状データの収集は2009年2月1日から2009年4月30日まで(花粉飛散期)の自覚症状日記により行われた。それぞれの症状スコアは中央値によって群間比較された。統計解析としてITT解析を採用した。2009年の花粉飛散期中において花粉飛散量が最大であった日の被験者のsymptom-medication scoreを抽出した。結果を図1に示す。symptom-medication scoreの数値が低い(治療効果が高いと予測される)群をSLIT good responder群(6人)、数値の高い(治療効果が低いと予測される)群をSLIT poor responder群(6人)とした。
治験者末梢血50mlを採血し、LYMPHO SEPARATION MEDIUM (MP Biomedical. LLC)が10ml入っている50mlのグライナーチューブに移した。その後、比重分離法にて遠心分離(800xg 20min)を行い、単核球層を採取して50mlのファルコンチューブに移して遠心分離を行った(RT 15,000rpm 10min)。遠心分離後にアスピレーターで上澄みを除去した。上清除去後のペレット状の細胞に50mlのPBSを再度加えて洗浄し、遠心分離を行った(RT 15,000rpm 10min)。上清除去後のペレット状の細胞にPBSを1ml加えて、細胞数を計算した。その後、細胞凍結保存用セルバンカー液(日本全薬工業株式会社)に5x106/mlの濃度で懸濁した。懸濁した液を凍結保存用チューブに移し、即座に-80℃冷凍庫で保存した。
-80℃で保存して置いた末梢血単核球を37℃のwater bathで3分間解インキューベートして解凍後、10mlのPBSが入った15ml Falcon Tubeに移し、遠心分離を行った(RT 15,000rpm 10min)。遠心分離後にアスピレーターで上澄みを除去した。上清除去後のペレット状の細胞に10mlのPBSを再度加えて洗浄し、遠心分離を行った(RT 15,000rpm 10min)。末梢血単核球に、MEMアミノ酸溶液(Wako)、ピルピン酸(Wako)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Wako) と最終濃度が10%になるように加えたFCS(invitrogen)入りのファイナルRPMI1640培地(Sigma)で細胞を5mlに懸濁した。その後、6穴プレートに移し、6時間培養して細胞を完全に解凍した。培養後、細胞を回収して遠心分離した(RT 15,000rpm 10min)。上清除去後のペレット状の細胞に1mlのファイナルRPMI1640培地を加え、細胞数を計算した。
-80℃で保存して置いた末梢血単核球を37℃のwater bathで3分間解インキューベートして解凍後、10mlのPBSが入った15ml Falcon Tubeに移し、遠心分離を行った(RT 15,000rpm 10min)。遠心分離後にアスピレーターで上澄みを除去した。上清除去後のペレット状の細胞に10mlのPBSを再度加えて洗浄し、遠心分離を行った(RT 15,000rpm 10min)。上清除去後のペレット状の細胞にTrizol 1mlを加えピペッティングを行い、細胞を溶解させた。クロロホルム 200mlを加え遠心分離(4℃ 15000rpm 15min)し、水層を抽出した。抽出した水層にエタノールを終濃度55%になるように加えた。
抽出したtotal RNAの1μlを用いて、NanoDrop(NanoDrop Technologies Inc.)により吸光度測定を行い、濃度の算出及びクオリティーチェックを行った(OD260nm/OD280nmが1.8から2.0の間の値、OD260nm/OD230nmが1.5倍以上)。続いてtotal RNAの1μlを用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)により、RNAのクオリティーチェックを行った(28S rRNA/ 18S rRNAが1.5以上、RIN(RNA Integrity Number)値が7.0以上)。クオリティーが低いものは、細胞からの再抽出またはエタノール沈殿による再精製を行った。
抽出したtotal RNAに全量が50μlになるようにNuclease free Waterを加え、3M 酢酸ナトリウム(Applied Biosystems) 5μlと100%エタノール(Wako) 125μlを加えピペッティング後、-80℃ 30min放置した。続いて遠心分離(4℃ 15000rpm 30min)を行い、上清を取り除き、70%エタノール180μlを加え、さらに遠心分離(4℃ 15000rpm 30min)を行い、上清を取り除き、室温で放置して乾燥させた。最後にNuclease free water 30μlを加えて、再度濃度測定及びクオリティーチェックを行い、精製できたことを確認した。
ラベル化cRNAの合成
末梢血由来total RNAをQuick Amp Labeling Kit(Agilent Technologies)を用いて、各々のラベル化cRNAを調製した。詳細は以下の1)〜4)のとおりである。
1-1)Spike-Mixの調製
キット付属のSpike-Mixをヒートブロックでインキュベーション(37℃ 5min)し、ボルテックス(10sce)、遠心分離(1000rpm 10sec)を行った。Spike-Mix 2μlにDilution Buffer 38μlを加え、ボルテックス(10sec)、遠心分離(1000rpm 10sec)を行い、Spike-Mix希釈溶液1を調製した。2μl のSpike-Mix希釈溶液1にDilution Buffer 8μlを加え、ボルテックス(10sec)、遠心分離(1000rpm 10sec)を行い、Spike-Mix希釈溶液2を調製した。4μl のSpike-Mix希釈溶液2にDilution Buffer 16μlを加え、ボルテックス(10sec)、遠心分離(1000rpm 10sec)を行い、Spike-Mix希釈溶液3を調製した。10μl のSpike-Mix希釈溶液3にDilution Buffer 30μlを加え、ボルテックス(10sec)、遠心分離(1000rpm 10sec)を行い、Spike-Mix希釈溶液4を調製した。
1サンプル当たりtotal RNA250ng、Spike-Mix希釈溶液1μl、T7Promoter Primer 0.6μl、Nuclease free waterを全量が5.75μlになるように加え反応溶液を調製した。ヒートブロックでインキュベーション(65℃ 10min)後、氷上で5min放置した。続いて1サンプル当たり5×First Strand Buffer 2μl、0.1M DTT 1μl、10mM dNTP mix 0.5、MMLV-RT 0.5μl、RNase Inhibitor 0.25μlを加え、cDNAマスターミックスを調製した。ピペッティング後、各反応溶液にcDNAマスターミックスを4.25μlずつ加え(total volume 10μl)、ウォーターバスでインキュベーション(40℃ 2hr)。反応終了後、反応溶液をヒートブロックでインキュベーション(65℃ 15min)し、氷上で5min放置した。
1サンプル当たりNuclease free water 7.65μl、4×Transcription Buffer 10μl、0.1M DTT 3μl、NTP mix 4μl、50%PEG 3.2μl、RNase Inhibitor 0.25μl、Inorganic Pyrophosphatase 0.3μl、T7 RNA Polymerase 0.4μl、Cyanine3-CTP 1.2μlを加え、Cy3 Transcription mixを調製した。ピペッティングでよく混合させた後、Cy3 Transcription mixを各反応溶液に30μlずつ加えて、ウォーターバスでインキュベーションした(遮光 40℃ 2hr)。反応終了後、氷上で放置した。
ラベル化cRNAの精製は、RNAeasy Kit (Qiagen)を用いて行った。詳細は以下のとおりである。
各反応溶液にNuclease free water 60μl、RLTバッファー 350μl、100%エタノール250μlを加えた。ピペッティングでよく混合した後、RNeasyカラムに反応溶液を500μl程度移し、遠心分離(4℃13000rpm 30sec)を行い、ろ液は捨てた。この作業を繰り返し、サンプルごとに溶液全量をRNeasyカラムに移した。各RNeasyカラムを新しいコレクションチューブに移し、RPEバッファー 500μlをカラムに加え、遠心分離(4℃ 13000rpm 1min)を行い、ろ液は捨てた。再度RPEバッファー 500μlをカラムに加え、遠心分離(4℃ 13000rpm 1min)を行い、ろ液は捨てた。各RNeasyカラムを新しいコレクションチューブに移し、遠心分離(4℃ 13000rpm 1min)を行った。各RNeasyカラムを1.5mlエッペンチューブに移し、Nuclease free water 30μl加えて室温で1分間遮光放置した後、遠心分離(4℃ 13000rpm 1min)を行い、カラムを捨て、ろ液を-80℃で遮光して保存した。
3)で得られたラベル化cRNA 1μlを用いて、NanoDrop(NanoDrop Technologies Inc.)により吸光度測定を行い、濃度とラベル化cRNA(Cy3)の取り込み率の算出を行った(Cy3取り込み効率は9pmol/μl以上が望ましい)。続いて、total RNAの1μlを用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)によりラベル化cRNAのクオリティーチェックを行った。
各ラベル化cRNAを氷上で溶解した後、遠心分離(1000rpm 10sec)を行った。1.5ml low-bind Nuclease free tubeにラベル化cRNA1.65μg、10×Blocking Agent 11μl、25×Fragmentation Buffer 2.2μl、Nuclease free waterを最終液量55μlになるように加え、ボルテックス(10sec)、遠心分離(1000rpm 10sec) 後、ヒートブロックでインキュベーション(遮光 60℃ 30min)し、氷上で1min放置。遠心分離(1000rpm 10sec)後、2×GE Hybridization Buffer HI-RPM 55μlを加えピペッティング、遠心分離(4℃ 13000rpm 1min)後、氷上で放置し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
マイクロアレイスライドをスライドホルダーに入れ、Agilent DNA microarray Scanner(Agilent Technologies)にセットし測定を行う。測定した画像データはFeature extraction software(Agilent Technologies)を用いて、クオリティーチェックと数値化を行った。
上記で得られたマイクロアレイ数値データを基に解析を行った。SLIT good responder投与前サンプル群(n=6)と飛散前サンプル群(n=6)の2群間の比較、及びSLIT poor responder投与前サンプル群(n=6)と飛散前サンプル群(n=6) の2群間の比較を、それぞれ行った。データノーマライズ方法は、各サンプルで75%tileを行った。プローブ抽出条件は、比較サンプルにおいて全てのサンプルでraw dataの値が100以下の低シグナル値のプローブを除去し、Fold change(median)解析を用い、2群間で発現に2倍以上差があるプローブを抽出した。SLIT good responderにおける変動プローブとして67プローブが抽出された。SLIT poor responderにおける変動プローブとして135プローブが抽出された。
cDNA templateの調製
cDNA templateの調製の詳細は以下の5)〜7)のとおりである。
5)cDNAの合成
末梢血単核球由来total RNAサンプル(マイクロアレイの実験に用いたものと同様のサンプル)を濃度100ng/μlになるように小分け希釈分注をし、0.5ml PCRチューブに100ng/μl total RNA抽出スギ花粉サンプル10μl、Nuclease free water 6μl、High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix(Applied biosystems) 4μlを加え、ピペッティング後、i-Cycler (Bio-Rad Laboratories)でPCRを行った。遠心分離(1000rpm 10sec)後、各サンプルにNuclease free water 80μlを加え、全量を100μlにしてcDNAサンプルを合成した。PCRプログラムは以下の通り。
25℃、5min → 42℃、30min → 85℃、5min → 4℃、∞
上記で合成したNo.13 cDNAサンプル(原液)及び10倍希釈した溶液を調製し、5点の希釈系列300μlを以下のように調製した。No.13 cDNAサンプル(原液) 60μl、Nuclease free water 240μlを加え希釈系列溶液1を調製。No.13 cDNAサンプル(原液) 15μl、Nuclease free water 285μlを加え希釈系列溶液2を調製した。No.13 cDNAサンプル(原液) 3.75μl、Nuclease free water 296.25μlを加え希釈系列溶液3を調製した。No.13 cDNAサンプル(10倍希釈) 9.38μl、 Nuclease free water 290.62μlを加え希釈系列溶液4を調製した。No.13 cDNAサンプル(10倍希釈 ) 2.34μl、Nuclease free water 297.66μlを加え希釈系列溶液5を調製した。
各cDNAサンプル(原液)15μlとNuclease free water 135μl加え、各スギ花粉cDNAサンプル10倍希釈溶液150μlを調製した。96PCRプレートに5点の希釈系列溶液、NTC (Nuclease free water)をアプライした。上記で調製したcDNAサンプル10倍希釈溶液を150μlずつ残りのウェルにアプライして、cDNA templateを作成した。cDNA templateの保存は-80℃で行った。
96穴 PCRプレートに1ウェル当たり、ターゲット遺伝子のプライマー(濃度100pmol/μl Forward Primer及びReverse Primer) それぞれ0.04μl、Universal probe Library (Roche) 0.2μl、TaqMan(R) Fast Universal PCR Master Mix(Applied biosystems) 10μl、Nuclease free water 0.72μlを加え、遠心(1000rpm 20sec)後、氷上で放置した。
作成したPrimer mixに、cDNA template 9μlを12連ピペットで撹拌、分注し、プレートシールを貼り、遠心分離(1000rpm 20sec)した後、7900HT Fast Real Time PCR System(Applied biosystems)にセットして測定を行った。
上記で得られた測定結果を用いて解析を行った。比較サンプルはSLIT good responder投与前サンプル群と飛散前サンプル群の2群比較、及びSLIT poor responder投与前サンプル群と飛散前サンプル群の2群間の比較。ノーマライズ方法は、実験ごとに測定しているNo.13スギ花粉cDNAサンプルのStandard curveを基にサイクル数を算出し、18Sでノーマライズをしたものを解析データとした。尚、サイクル数の算出にはSDS Software 2.3(Applied biosystems)を用いた。解析方法は、比較サンプルにおいて全てFold change(median)解析を用い、2群間で発現に1.5倍以上差がある遺伝子を抽出した。SLIT good responderにおける変動遺伝子として、16遺伝子が抽出された。SLIT poor responderにおける変動遺伝子として、20遺伝子が抽出された。抽出された遺伝子を以下の表に示す(遺伝子リストの表記はGene Symbol)。
SLIT good responder投与前サンプル群と飛散前サンプル群、及びSLIT poor responder投与前サンプル群と飛散前サンプル群で、マイクロアレイのデータとReal Time PCRデータが相関する遺伝子群を抽出した。抽出方法は、遺伝子ごとに上記2群間の無相関検定を行い、p-value<0.05以下の遺伝子を抽出。これらの遺伝子は実験系の異なる手法でも同様の結果が得られたことから、投与前後で変動が確実な遺伝子であると考えられた。抽出された遺伝子を以下の表に示す(遺伝子リストの表記はGene Symbol)。
上記の抽出遺伝子において、SLIT good responder群とSLIT poor responder群で1.5倍以上の変動があるものとして、CCL2、IGHA1及びNCF1が抽出された(表7)。これらの遺伝子は、スギ花粉エキス投与による効果の有無を判別できる有効なマーカーであると考えられた。
スギ花粉特異的IL5およびIL13産生細胞は、SLIT good responder 群でのみ投与前サンプルに比べて飛散前サンプルがdown regulate しているものが有意に多いことから、マイクロアレイデータとReal Time PCRデータを用いて、それぞれスギ花粉特異的IL5およびIL13産生細胞と似た挙動を示す遺伝子を抽出した。抽出方法は、SLIT good responder 群で投与前のサンプルに比べて飛散前でdown regulateしているサンプルが5検体中3検体以上、かつSLIT poor responder 群で投与前のサンプルに比べて飛散前でdown regulateしているサンプルが5検体中2検体以下を満たす遺伝子を抽出した。マイクロアレイの結果とスギ花粉特異的IL5およびIL13産生細胞と似た挙動を示す遺伝子として、4遺伝子が抽出された。また、Real Time PCR結果とスギ花粉特異的IL5およびIL13産生細胞と似た挙動を示す遺伝子として、8遺伝子が抽出された(表8)。
特に、CCL2とIGHA1についてはマイクロアレイ、Real Time PCRの双方で抽出されており、さらに上記の解析においても抽出されている遺伝子であることから、スギ花粉エキス投与による効果の有無を判別できる特に有効なマーカーであると考えられた。抽出された遺伝子は以下に載せた(遺伝子リストの表記はGene Symbol)。
Claims (11)
- 花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための方法であって、
(1)花粉飛散開始の遅くとも8週間前までに開始する、花粉アレルゲンを含むワクチンの投与を開始する前における、対象者から単離された単核球における、CCL2、IGHA1及びNCF1からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を、当該ワクチンの投与開始後であって、花粉飛散開始直前における、当該遺伝子の発現と比較することにより、対象者への花粉アレルゲンによるワクチン療法の適用による、当該対象者から単離された単核球における、CCL2、IGHA1及びNCF1からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現の変化を測定すること;及び
(2)(1)において測定した発現の変化と、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性とを相関付けること
を含む、方法。 - スギ花粉アレルゲンによる、スギ花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための方法であって、
(1)スギ花粉飛散開始の遅くとも8週間前までに開始する、スギ花粉アレルゲンを含むワクチンの投与を開始する前における、対象者から単離された単核球における、CCL2、IGHA1及びNCF1からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を、当該ワクチンの投与開始後であって、スギ花粉飛散開始直前における、当該遺伝子の発現と比較することにより、対象者へのスギ花粉アレルゲンによるワクチン療法の適用による、当該対象者から単離された単核球における、CCL2、IGHA1及びNCF1からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現の変化を測定すること;及び
(2)(1)において測定した発現の変化と、スギ花粉アレルゲンによる、スギ花粉症に対するワクチン療法の有効性とを相関付けること
を含む、方法。 - スギ花粉アレルゲンがCryJ1又はCryJ2を含む、請求項2記載の方法。
- ワクチン療法が、花粉アレルゲン又はスギ花粉アレルゲンを口腔粘膜投与することにより行われる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1記載の方法により、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための診断薬であって、
(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、からなる群から選択される少なくとも1つを含む、診断薬。 - 請求項2記載の方法により、スギ花粉アレルゲンによる、スギ花粉症に対するワクチン療法の有効性を予測するための診断薬であって、
(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、からなる群から選択される少なくとも1つを含む、診断薬。 - 以下の(A)及び(B)を含む、請求項1記載の方法により、花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性をモニターしながら、花粉アレルゲンによる花粉症に対するワクチン療法を実施するためのキット:
(A)花粉アレルゲンを含む、花粉症に対するワクチン、及び
(B)(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、
からなる群から選択される少なくとも1つ。 - 以下の(A)及び(B)を含む、請求項2記載の方法により、スギ花粉アレルゲンによる、花粉症に対するワクチン療法の有効性をモニターしながら、スギ花粉アレルゲンによるスギ花粉症に対するワクチン療法を実施するためのキット:
(A)スギ花粉アレルゲンを含む、スギ花粉症に対するワクチン、及び
(B)(a)CCL2をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はCCL2を特異的に認識し得る抗体、
(b)IGHA1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はIGHA1を特異的に認識し得る抗体、及び
(c)NCF1をコードするmRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、又はNCF1を特異的に認識し得る抗体、
からなる群から選択される少なくとも1つ。 - スギ花粉アレルゲンがCryJ1又はCryJ2を含む、請求項8記載のキット。
- ワクチンが、口腔粘膜投与用製剤である、請求項7〜9のいずれか1項に記載のキット。
- 構成要件(B)がアレイとして提供される、請求項7〜9のいずれか1項に記載のキット。
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