JP5746038B2 - Ｃｎｓの炎症性疾患の治療のための化合物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、それに限定されないが多発性硬化症などの中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患の治療および／または緩和に関し、この用途のために利用可能な化合物および方法を提供する。

細胞遊走は、免疫応答などのヒトの体内の多くのプロセスの中心であるが、慢性炎症の構成要素でもあり得る。ＣＮＳへの単核細胞の遊走は、ＣＮＳの炎症性疾患の病理の根底にある１つの因子であると考えられる。

１つの例は多発性硬化症（ＭＳ）であり、これは、ＣＮＳ、すなわち脳および脊髄に影響する自己免疫疾患である。ＭＳは、脱力感、振戦および視力障害を特徴とする。他の症状は、不明瞭発語および運動障害であり、例えば患者は、足を引きずり、つまずき、頻繁に物を落とす。これらの症状は、軽度のままであるか、現れたり消えたりするか、または肢体不自由になることもある。しかし、これらは、年齢とともに進行的に悪化する傾向がある（Ｈａｆｌｅｒ、２００４）。ＭＳは、通常、男性よりも女性がかかりやすい。この疾患は、２０歳〜４０歳の年齢で最も一般的に開始するが、いずれの年齢にも発生する可能性がある。正確な原因は分かっていないが、ＭＳは、神経細胞を取り囲む保護物質であるミエリン鞘の損傷に起因すると考えられる。これは進行性の疾患であり、損傷が時間とともに悪化することを意味する。炎症はミエリンを破壊し、多数の領域の瘢痕組織を残す（硬化症）。炎症は、体自体の免疫細胞が神経系を攻撃する場合に生じる。

ＭＳの病理における１つの重要なステップは、ＣＮＳへの細胞の遊走であり、ここでは、自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞が単球と一緒にＣＮＳの炎症を媒介し、このことにより軸索の脱髄が引き起こされる。ケモカインおよびそれらの受容体は、ＣＮＳへのこれらの白血球の動員において主要な役割を演じると提案されている。つまり、ケモカイン受容体の減少は、ＣＮＳへの破壊性細胞の遊走を妨げるための効果的なストラテジーであり得る。ＭＳの病理において記載されている重要なケモカイン受容体は、ＣＣＲ５（ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１アルファなどの走化性タンパク質の受容体）、ＣＸＣＲ３（ＩＰ−１０およびＭＩＧなどの走化性タンパク質の受容体）、およびＣＣＲ２（ＭＣＰ１〜３などの走化性タンパク質の受容体）である（Ｔｒｅｂｓｔ Ｃら、２００９）。

リンパ球をＣＮＳの実質に侵入させることができる別のステップは、ＣＤ４９ｄ（最晩期抗原、Ｔ細胞およびＢ細胞において発現されるＶＬＡ−４）の、内皮細胞上のそれらの受容体への接着であり、それにより血液脳関門を通って移動する。ＣＤ４９ｄの低減は、ＣＮＳにおける免疫細胞の移動および蓄積を低減させることができる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ Ｌ、２００９）。

健常な個体において、免疫細胞は、ＣＮＳ毛細血管および細静脈を通過してＣＮＳ組織に入ることができない。なぜなら、ＣＮＳの毛細血管壁は、それらが免疫細胞を通過させない非常に緊密に詰まった細胞を有するという点で、体の他の部分の血管壁とは異なるからである。ＣＮＳ血管系のこの特別な特徴は、血液脳関門（ＢＢＢ）と呼ばれる。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、ＢＢＢの破壊を誘導し、これにより次いで、ＣＮＳの自己免疫疾患（例えばＭＳ）の炎症性応答を憎悪させ得ると記載されている（Ｐｒｏｅｓｃｈｏｌｄｔ ＭＡら、２００２）。ＶＥＧＦの低減は、ＢＢＢの増加した血液透過性を妨げ、そのことによりＣＮＳ内への破壊性細胞の流入を低減するために効果的なストラテジーである。

炎症は、神経インパルスを減速または遮断させ、ＭＳの症状をもたらす。炎症の繰り返されるエピソードまたはフレアアップは、脳および脊髄のいずれの領域でも生じる可能性がある。

それぞれの発作の位置および程度は様々であるので、症状は様々である。通常、数日、数週間またはさらには数カ月間持続するエピソードは、症状が低減している、または症状がない期間（寛解）と交互に起こる。繰り返し（再発）が一般的であるが、寛解期間がなく停止しないで進行することもある。

ＭＳを有すると診断された患者には、疾患の４つの臨床経過のうちの１つが予測でき、それらのそれぞれは、軽度、中程度または重度であり得る。

１．再発寛解型
特徴：この型のＭＳの人は、はっきりしたフレアアップ（再発、発作、または憎悪とも呼ばれる）を経験する。これらは、神経機能の急性の悪化のエピソードである。これらの後に、疾患が進行しない部分的または完全な回復の期間（寛解）が続く。

頻度：初期の診断時のＭＳの最も一般的な形態。患者のおよそ８５％。

２．一次性進行型
特徴：この型のＭＳの人は、明確な再発または寛解なく、発症からゆっくりであるがほぼ連続的な疾患の悪化を経験する。しかし、経時的な進行速度の変動、不定期的なプラトーおよび一時的なわずかな改善がある。

頻度：比較的まれである。患者のおよそ１０％。

３．二次性進行型
特徴：この型のＭＳの人は、再発寛解型ＭＳの初期期間と、その後の不定期的なフレアアップ、わずかな回復（寛解）またはプラトーを有する、または有さない着実に悪化する疾患経過を経験する。

頻度：再発寛解型ＭＳの人の５０％が、「疾患修飾」薬の導入前に、初期の診断から１０年以内にこの形態の疾患を発症した。これが治療により著しく遅延されるかどうかを証明するための長期データはまだ入手できていない。

４．再発進行型
特徴：この型のＭＳの人は、発症から着実に悪化する疾患を経験するが、回復することがあるまたはない明確な急性再発（発作または憎悪）も有する。再発寛解型ＭＳとは対照的に、再発と再発の間の期間は、継続的な疾患進行を特徴とする。

頻度：比較的まれである。患者のおよそ５％。

何が発作を引き起こすかについて、科学界での総意はない。ＭＳの患者は、通常、健常な人よりも多数の免疫細胞を有し、このことが、免疫応答が役割を有し得ることを示唆する。最も一般的な理論は、ウイルスもしくは遺伝子欠陥、またはこれらの両方の組合せを示す。疾患への遺伝的なつながりもあるようである。ＭＳは、他の地域よりも、北欧、米国北部、オーストラリア南部およびニュージーランドでより発症しやすい。地理学的研究は、環境因子が関与し得ることを示す。ＭＳの家族歴を有する人およびＭＳの高い発生率の地域に居住する人は、この疾患の高い危険性を有する。

インターフェロン−ベータ、グラチラマー酢酸塩およびミトキサントロンなどの薬物投与は、再発寛解型ＭＳの人における発作の頻度および重篤度を低減することができ、将来の能力障害を低減または遅延し得る。インターフェロン−ベータおよびミトキサントロンは、二次性進行型ＭＳの進行も減速させ得る。

インターフェロン−ベータまたはグラチラマー酢酸塩での治療は、再発寛解型ＭＳと診断されるとすぐに開始すべきである。ほとんどの専門家が、今では、神経系への永久的な損傷は、早い時期に、さらには症状がまだ非常に軽い間に生じ得ることに同意している。早期の治療は、この損傷のいくらかを防ぐまたは遅延させる助けとなり得る。

しかし、インターフェロンベータ治療は、いくつかの有害事象を伴う。最も頻繁な有害事象は、インフルエンザ様症状である：体温上昇、体調不良、疲労、頭痛、筋肉痛、痙攣、めまい、毛髪菲薄化およびうつ。注射部位での紅斑、疼痛および硬結も頻繁に観察される。インターフェロン療法は、免疫抑制を引き起こし、通常と異なる方式で現れるいくつかの感染をもたらし得る。

炎症を低減し、発作を短くするために、再発中にコルチコステロイド類を投与することもできる。コルチコステロイド類の有力な効果は、コルチゾールの過剰生成をもたらす副腎の機能不全であるクッシング病によく似る重篤な副作用をもたらし得る。可能性のある副作用のリストは長く、食欲増進および体重増加；胸部、顔、上背および胃での脂肪の沈着；腫脹および浮腫をもたらす水および塩の貯留；高血圧；糖尿病；黒および青色の斑点；創傷治癒の減速；骨粗鬆症；白内障；ざ瘡；筋力低下；皮膚菲薄化；易感染性の増加；胃潰瘍；発汗増加；気分変動；うつなどの心理的問題；ならびに副腎抑制を含む。

２００４年に、ＦＤＡは、ＭＳの再発形態の患者の治療のためにモノクローナル抗体（ナタリズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡおよびＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）の使用を承認した（ＦＤＡ Ｎｅｗｓ Ｐ０４−１０７、２００４年１１月２３日）。

全般的に耐容性がよいが、ナタリズマブは、場合によっては重篤な有害事象と関連する。抗体療法は一般的に費用がかかり、なかでも効力に関して改善が必要とされている。

現在、他の状態において既に使用されているいくつかのものを含めて、多くの他のモノクローナル抗体がＭＳについて調査されている。これらは、オクレリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ダクリズマブ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，Ｉｎｃ．）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，ＢＴＧ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）およびリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．）を含む。

ＷＯ２００６／０６５７５１は、少なくとも１つのそのヌクレオチドにおいて熱不安定性置換を含むＣｐＧオリゴヌクレオチドプロドラッグに関する。このような熱不安定性ＣｐＧオリゴヌクレオチドプロドラッグを用いる治療方法が記載されている。サイトカイン、特にインターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータまたはインターフェロン−ガンマの誘導が開示されている。

ＷＯ２００６／０２７７７６は、ｍｉＲＮＡ構成要素を有するＡＣｈＥ関連生物学的経路を調節するための方法であって、ＡＣｈＥ関連生物学的経路を、ｍｉＲＮＡの機能を調節できる作用物質に晒すことにより、ＡＣｈＥ関連生物学的経路を調節することを含む方法に関する。上記の作用物質は、改変ポリヌクレオチド配列を含む。

ＷＯ２００７／０９５３１６は、全般的に、免疫賦活性核酸、その組成物および該免疫賦活性核酸を用いる方法に関する。特に、この発明は、パリンドローム含有免疫賦活性核酸および疾患の治療におけるこれらの核酸の使用に関する。

ＷＯ２００４／０１６８０５は、免疫応答を刺激するために有用な軟性または半軟性ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドのクラスを開示する。

ＷＯ２００６／０６５７５１ ＷＯ２００６／０２７７７６ ＷＯ２００７／０９５３１６ ＷＯ２００４／０１６８０５

まとめると、ＭＳのための現存する療法を改善することが、効力の改善ならびに費用および有害事象の低減のために必要とされている。ＭＳとの戦いのための新しい治療ストラテジーを開発することも必要とされている。

本発明者らは、ＭＳを治療または緩和するための現存するアプローチが、治療の結果、治療の費用および有害事象の発生の点で不十分であることを理解した。本発明者らは、ＭＳの治療および／または緩和のために有用な新規化合物を同定し、患者への効力が改善され有害事象が低減された治療方法を開発することに着手した。本発明の根底をなす他の課題、および本発明に付随する利点は、本明細書に参照により組み込まれる発明の説明、実施の形態および特許請求の範囲を熟読することにより、当業者に明らかになる。

本発明者らは、驚くべきことに、特定のオリゴヌクレオチド配列が、特定の細胞表面マーカーの発現を下方制御することにより中枢神経系への自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するために有効であることを見出した。本発明および実施形態は、本明細書に参照により組み込まれる同封の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

以下の詳細な説明において、以下の添付の図面を参照する。

本発明の化合物で刺激し、２４時間培養したラット脾細胞におけるＩＦＮ−アルファの標準化した相対的ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。値は、培地のみで刺激した試料の平均ＲＱ値に対して標準化した。データは、６個の脾臓に由来する脾細胞の平均±ＳＤとして示す。 本発明の化合物で刺激し、２４時間培養したラット脾細胞におけるＩＦＮ−ベータの標準化した相対的ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。値は、培地のみで刺激した試料の平均ＲＱ値に対して標準化した。データは、６個の脾臓に由来する脾細胞の平均±ＳＤとして示す。 本発明の化合物で刺激し、２４時間培養したラット脾細胞におけるＩＬ−１０の標準化した相対的ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。値は、培地のみで刺激した試料の平均ＲＱ値に対して標準化した。データは、６個の脾臓に由来する脾細胞の平均±ＳＤとして示す。 ＤＡラット（ｎ＝３）の脾細胞におけるＣＤ４９ｄの発現（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。脾細胞（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１０μＭ）。本発明の化合物は、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ３発現細胞において発現されるＣＤ４９ｄを下方制御することができた。 ＤＡラットのＰＢＭＣにおけるＣＤ４９ｄの発現（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１０μＭ）。本発明の化合物は、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ３発現細胞において発現されるＣＤ４９ｄを下方制御することができた。 オリゴヌクレオチドおよび媒体（ＰＢＳ）の治療効果を示す、ＤＡラット（雌）におけるＭＯＧ誘導ＥＡＥの平均臨床スコアを示すグラフである。各群の１２匹のラットを全て、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のラットＭＯＧで第０日に免疫した。ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ０９８０および媒体を、１回目の発作のピークの前（第９日および第１５日）、および１回目の発作のピーク中（第２０日）に投与した。１５０μｇの薬物を、１００μｌの総容量でｓ．ｃ．投与した。 ＤＡラットにおけるＭＯＧ誘導ＥＡＥの発生率を示すグラフである。疾患の重篤度は、ＩＤＸ０９８０およびＩＤＸ９０５４で処置したラットにおいて、ＰＢＳおよびＩＤＸ９０５２処置群と比較して減少した。 オリゴヌクレオチドおよび媒体（ＰＢＳ）の治療効果を示す、ＤＡラットにおけるＭＯＧ−ＥＡＥの平均臨床スコアを示すグラフである。各群の１６匹のラットを全て、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のラットＭＯＧで第０日に免疫した。ＩＤＸ９０５４および媒体を、１回目の発作のピークの前（第９日および第１５日）、および１回目の発作のピーク中（第２０日）に投与した。１５０μｇの薬物を、１００μｌの総容量でｓ．ｃ．にて、および４０μｌの総容量でｉ．ｎ．にて投与した。ＰＢＳ処置群は、ｉ．ｎ．のみで処置した。 ＤＡラットにおけるＭＯＧ−ＥＡＥの死亡率を示すグラフである。ＩＤＸ０９８０およびＩＤＸ９０５４処置群の両方において、ＰＢＳおよびＩＤＸ９０５２処置群と比較して減少した死亡率。ラットは、疾患により死亡したか、または倫理規定に従って屠殺した。データは、第２５日および第３５日の両方で示す。 ＲＲＭＳ患者（ｎ＝９）から単離したＣＤ３陽性細胞上のＣＤ４９ｄの発現を示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。オリゴヌクレオチドは、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるＣＤ４９ｄ発現を下方制御することができた。エラーバーはＳＥＭを示し、ノンパラメトリックＴ検定であるウィルコクソンの符号付き順位和検定により分析した^*P＜０．０５、^**P＜０．０１、^***P＜０．００１。 ＲＲＭＳ患者から単離したＣＤ３陽性細胞上のＣＸＣＲ３（ＣＤ１８３）の発現を示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。本発明の化合物は、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞上でのＣＸＣＲ３発現を下方制御することができた。 ＲＲＭＳ患者から単離したＣＤ１９陽性細胞上のＣＸＣＲ３（ＣＤ１８３）の発現を示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。オリゴヌクレオチドは、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ１９陽性細胞上でのＣＸＣＲ３発現を下方制御することができた。 ＲＲＭＳ患者から単離したＣＤ１４陽性細胞上のＣＸＣＲ３（ＣＤ１８３）の発現を示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。オリゴヌクレオチドは、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ１４陽性細胞上でのＣＸＣＲ３発現を下方制御することができた。 ＲＲＭＳ患者から単離したＣＤ１４陽性細胞上のＣＣＲ５（ＣＤ１９５）の発現を示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。オリゴヌクレオチドは、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ１４陽性細胞上でのＣＣＲ５発現を下方制御することができた。 ＲＲＭＳ患者から単離したＣＤ１４陽性細胞上のＣＣＲ２（ＣＤ１９２）の発現を、それぞれＭＦＩ（Ａ）または％（Ｂ）で示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。オリゴヌクレオチドは、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ１４陽性細胞上でのＣＣＲ２発現を下方制御することができた。 ＲＲＭＳ患者から単離したＣＤ１４陽性細胞上のＣＣＲ２（ＣＤ１９２）の発現を、それぞれＭＦＩ（Ａ）または％（Ｂ）で示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。オリゴヌクレオチドは、ＦＡＣＳにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、ＣＤ１４陽性細胞上でのＣＣＲ２発現を下方制御することができた。 ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳへの細胞の遊走を示すグラフである。２名のＲＲＭＳ患者の０．５×１０⁶⁽Ａ）または０．２５０×１０⁶⁽Ｂ）のＰＢＭＣを、本発明の化合物ＩＤＸ９０４５、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ０９８０（１、１０および２５μＭ）と４８時間インキュベート、または未処置のままにした。細胞を、次いで、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳへの遊走を分析するために、ＱＣＭ遊走アッセイにおいて用いた。両方の実験は、未処置の細胞と比較して、本発明の化合物で処置した細胞の遊走の低減を示した。 ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳへの細胞の遊走を示すグラフである。２名のＲＲＭＳ患者の０．５×１０⁶⁽Ａ）または０．２５０×１０⁶⁽Ｂ）のＰＢＭＣを、本発明の化合物ＩＤＸ９０４５、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ０９８０（１、１０および２５μＭ）と４８時間インキュベート、または未処置のままにした。細胞を、次いで、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳへの遊走を分析するために、ＱＣＭ遊走アッセイにおいて用いた。両方の実験は、未処置の細胞と比較して、本発明の化合物で処置した細胞の遊走の低減を示した。 ＲＲＭＳ患者（ｎ＝６〜１１）の上清中のＶＥＧＦの発現を示すグラフである。ＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、未処置のままにするか、または薬物で刺激した（１、１０および２５μＭ）。オリゴヌクレオチドは、ＣＢＡにより分析されるように、４８時間のインキュベーションの後に、刺激細胞の上清中のＶＥＧＦを下方制御することができた。エラーバーはＳＥＭを示し、ノンパラメトリックＴ検定であるウィルコクソンの符号付き順位和検定により分析した^*P＜０．０５、^**P＜０．０１、^***P＜０．００１。 ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−ベータの誘導を示すグラフである。異なるＲＲＭＳ患者（ｎ＝６）のＰＢＭＣ（２×１０^6/ｍｌ）を、３つの異なる濃度（１、１０および２５μＭ）のオリゴヌクレオチドで刺激した。ＩＦＮ−ベータ生成を４８時間のインキュベーションの後に、ＩＦＮ−ベータＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。

以下の記載は、本発明を行うために現在考えられる最良の形態のものである。この記載は、限定する意味で捉えられるためではなく、本発明の全般的な原理を記載する目的のためにのみなされる。本発明の範囲は、特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。

本発明を詳細に記載する前に、本発明は、記載される特定の化合物または記載される方法の進行ステップに限定されないことが理解される。なぜなら、そのような化合物および方法は変動し得るからである。本明細書で用いられる術語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することを意図しないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば「配列（ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」との言及は、複数のそのような配列を含み、その他同様である。

さらに、用語「約」は、適切な場合、与えられた値の＋／−２％、好ましくは数値の＋／−５％および最も好ましくは＋／−１０％の偏差を示すために用いられる。

「中枢神経系への自己攻撃性細胞の流入」という表現において用いられる場合の用語「流入」は、中枢神経系における自己攻撃性細胞の蓄積を意味することを意図し、単核細胞、特にＴ細胞、Ｂ細胞および単球の遊走、接着および移動のステップを含む。

本発明により、特定の新規ヌクレオチド、すなわち配列番号１〜８のいずれか１つに記載の単離オリゴヌクレオチド配列が利用可能になる。配列番号、内部参照番号および配列を相関させる表１を参照されたい。

上記の配列番号１〜８の配列は、本発明者らにより設計され、本発明者らが知る限りでは、以前に知られていない。配列番号１０は、医薬的な使用が知られているが（以下を参照されたい）、本発明者らが知る限りでは、ＭＳの治療における使用について以前に知られていない。

配列番号９（ＩＤＸ０１５０）は米国特許第６，４９８，１４７号から知られており、炎症性腸疾患の治療について第ＩＩ相臨床試験において試験が成功した（Ｋａｐｐａｐｒｏｃｔ（登録商標）、Ｉｎｄｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＡＢ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。配列番号１０（ＩＤＸ０９８０）は、ヒトにおける強い免疫調節オリゴヌクレオチドとして知られているので、これを当初は用いた（Ｋｅｒｋｍａｎｎら、２００５；Ｗｉｋｓｔｒｏｍら、２００７）。

本発明者らにより、配列番号１〜８より選択される単離されかつ実質的に精製されたオリゴヌクレオチドが利用可能になる。

一実施形態によると、このようなオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸主鎖修飾を有する。好ましくは、上記のリン酸主鎖修飾は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾である。

本発明者らにより、配列番号１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物も利用可能になる。上記の医薬組成物は、好ましくは、生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、シクロデキストリンまたはそれらの組合せから選択される薬理学的に適合可能でありかつ生理的に許容され得る賦形剤または担体をさらに含む。

本発明の別の実施形態は、多発性硬化症の治療および／または緩和のための医薬組成物の製造のための、配列番号１〜８のいずれか１つに記載の単離されかつ実質的に精製されたオリゴヌクレオチドの使用である。

別の実施形態は、多発性硬化症、特に再発寛解型多発性硬化症の治療および／または緩和のための医薬組成物の製造のための、配列番号９［ＩＤＸ０１５０］または配列番号１０［ＩＤＸ０９８０］に記載の単離されかつ実質的に精製されたオリゴヌクレオチドの使用である。

いずれの特定の理論に結び付けられることも望まないが、本発明者らは、本発明の化合物の効果が少なくとも部分的に、少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現を下方制御することにより中枢神経系への自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するそれらの能力により説明できると考えている。よって、本発明の一実施形態は、配列番号１〜８または９〜１０に記載のオリゴヌクレオチドの、少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現を下方制御することにより中枢神経系への自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するのに有効な量での投与を含む。

オリゴヌクレオチドおよびそれらの使用の方法は、上記のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現を下方制御することにより中枢神経系への単核細胞の流入を阻害または低減するのに有効な量で投与される中枢神経系の炎症性疾患の治療または緩和にも全般的に適用することができると考えられる。

好ましくは、上記の少なくとも１つの細胞表面マーカーは、ＣＤ４９ｄ、ＣＸＣＲ３（ＣＤ１８３）、ＣＣＲ２（ＣＤ１９２）およびＣＣＲ５（ＣＤ１９５）から選択される。一実施形態によると、上記のオリゴヌクレオチドは、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］、配列番号２［ＩＤＸ９０５４］；配列番号７［ＩＤＸ９０５８］；配列番号３［ＩＤＸ９０３８］から選択される。好ましくは、上記のオリゴヌクレオチドは、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］である。別の実施形態によると、上記の少なくとも１つの細胞表面マーカーはＣＤ４９ｄであり、オリゴヌクレオチドは配列番号３［ＩＤＸ９０３８］または配列番号７［ＩＤＸ９０５８］から選択される。

本発明者らは、しかし、これもまた特定の理論に結び付けられることを望まないが、この効果が少なくとも部分的に、ＶＥＧＦの生成を低減することによる中枢神経系への自己攻撃性細胞の流入の阻害または低減により説明できるとも考えている。

よって、本発明の別の実施形態によると、オリゴヌクレオチドは、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］および配列番号１０［ＩＤＸ０９８０］から選択される。

本発明により、多発性硬化症の治療および／または緩和の方法であって、オリゴヌクレオチドが、特定の細胞表面マーカーの発現を下方制御することにより中枢神経系への自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するのに有効な量で投与される方法も利用可能になる。

好ましくは、配列番号１〜８、９および１０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が患者に投与される。

好ましくは、投与経路は、粘膜、皮下、筋肉内、静脈内および腹腔内投与から選択される。好ましくは、粘膜投与は、経鼻、口腔、胃、眼、直腸、泌尿生殖器および膣内投与から選択される。

上記の方法において、細胞表面マーカーは、ＣＤ４９ｄ、ＣＸＣＲ３（ＣＤ１８３）、ＣＣＲ２（ＣＤ１９２）およびＣＣＲ５（ＣＤ１９５）の少なくとも１つであり、オリゴヌクレオチドは、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］、配列番号２［ＩＤＸ９０５４］；配列番号７［ＩＤＸ９０５８］；配列番号３［ＩＤＸ９０３８］から選択される。

好ましい実施形態によると、細胞表面マーカーはＣＤ４９ｄであり、オリゴヌクレオチドは配列番号３［ＩＤＸ９０３８］または配列番号７［ＩＤＸ９０５８］から選択される。

多発性硬化症の治療および／または緩和の方法の別の実施形態によると、上記のオリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦの生成を低減することにより中枢神経系への自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するのに有効な量で投与される。この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］および配列番号１０［ＩＤＸ０９８０］から選択される。

一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇあたり約１〜約２０００μｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり約１〜約１０００μｇの量で投与される。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇあたり約１〜５００μｇの量で投与される。

本発明による方法において、投与経路は、粘膜、皮下、筋肉内、静脈内および腹腔内投与から選択される。この方法の実施形態によると、粘膜投与は、経鼻、口腔、胃、眼、直腸、泌尿生殖器および膣内投与から選択される。

経鼻投与は、本発明による方法の一実施形態を構成する。経鼻投与のために利用可能ないくつかの方法およびデバイスがある；局所または全身のいずれかの作用を有する液体および粉末の両方の製剤の単回または複数回投与。適切なデバイスまたは投与技術を用いて、ＣＮＳへの到達のために嗅球領域を標的にすることが可能である。本発明は、オリゴヌクレオチドを鼻粘膜へ投与するための特定の方法またはデバイスに限定されない。初期の動物研究は、ピペットによる単純な注入が満足に作用することを示したが、ヒトの使用のためには、信頼できる単回または複数回用量の投与のためのデバイスが好ましい。

本発明の別の実施形態によると、オリゴヌクレオチドは、直腸注入により結腸粘膜に、例えば適切な緩衝液に懸濁されたオリゴヌクレオチドを含む水性浣腸剤の形態で投与される。

本発明の別の実施形態によると、オリゴヌクレオチドは、肺または気道の粘膜に、適切な緩衝液に懸濁されたオリゴヌクレオチドを含むエアロゾルの吸入により、またはこれもまた適切な緩衝液に懸濁されたオリゴヌクレオチドを含む洗浄を行うことにより投与される。

本発明のさらに別の実施形態によると、オリゴヌクレオチドは、尿道、膣のような泌尿生殖器道の粘膜に、適切な媒体に懸濁されたオリゴヌクレオチドを含む溶液、緩衝液、ゲル、軟膏、パスタなどを適用することにより投与される。

特定の実施形態は、Ｔ細胞上の細胞表面マーカーであるＣＤ４９ｄに対する抗体であるＴｙｓａｂｒｉの投与とともに用いるための本発明によるオリゴヌクレオチドの使用を含む。本発明によるオリゴヌクレオチドがＣＤ４９ｄを下方制御できることが示され、このことは、血液脳関門を通るＴ細胞の移動を低減し得る。よって、本発明者らにより、オリゴヌクレオチド化合物を抗ＣＤ４９ｄ抗体と一緒に用いることを含む組合せ療法が利用可能になる。このことは、抗体消費を低減することができ、これにより、上記の抗体療法に付随する費用、副作用および危険性を低減すると考えられる。よって、この実施形態において、上記の化合物は、抗体が対象とする特定の細胞表面分子の下方制御を可能にするために、抗体の投与の十分に前に投与される。

当業者は、ＭＳの治療へのいくつかのアプローチがあることをよく理解している。当然ながら、新しいアプローチは常に開発されており、本発明によるオリゴヌクレオチド、それらの使用および治療方法は、将来の治療と組み合わせても有用であると考えられる。本発明者らは、現在、本発明のオリゴヌクレオチド、それらの使用および治療方法が、ＭＳのための独立型の療法として有用であると考えている。しかし、本発明のオリゴヌクレオチドが、現存するまたは将来の抗ＭＳ治療と組み合わせて有用であることは排除できない。

オリゴヌクレオチドは、治療有効用量で投与される。「治療有効用量」の定義は、疾患および治療の状況に依存し、「治療有効用量」は、単独または他の治療との組合せで患者の状態の測定可能な改善をもたらす用量である。当業者は、経験的に、または過度の負担なく行われる実験室での実験に基づいて、治療有効用量を決定できる。治療する医師も、その人の経験に基づいて、そして疾患の性質および重篤度ならびに患者の状態を考慮して適切な用量を決定できる。

別の実施形態は、約１２、約２４時間単位で分けられた２回または３回以上の別々の用量でのオリゴヌクレオチドの投与である。

本発明は、実験部に示され、添付の図面に図示されるｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータにより支持されるように、ＭＳの治療に有用である。

本発明の実施形態は、多くの利点を有する。今までのところ、本発明者らにより定義される用量でのオリゴヌクレオチドの投与は、顕著な副作用を惹起していない。さらに、粘膜投与は、容易で迅速かつ痛みを伴わず、そして驚くべきことに全身効果をもたらす。この効果は、単独で、または現存するおよび将来の抗ＭＳ治療との組合せで、この疾患および関連する疾患と戦うための有望なアプローチを提案すると考えられる。

ラット脾細胞に対するオリゴヌクレオチドの影響
本発明者らは、ＭＳの治療および／または緩和のために有益であると考えられる候補化合物を見出して確認することに着手した。これらの研究において用いた化合物は、オリゴデオキシヌクレオチドに基づく。特定のオリゴヌクレオチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究においてそれらの有益な効果について試験する前に、本発明者らが、オリゴヌクレオチドがラットにおいて免疫調節効果を有するかを試験することを可能にするアッセイを開発した。この目的のために、本発明者らは、ラット脾細胞に基づくアッセイを用い、ここでは、脾細胞を選択された本発明の化合物とともに特定の時間インキュベートした。インキュベーションの後に、いくつかの免疫学的に関連するマーカーについてｍＲＮＡ発現を分析し（ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−１０およびＴＧＦ−ベータ１）、これを、ラットにおいて免疫調節効果を示す化合物を同定するための基準とし、さらなるラット研究において用いられる化合物の選択を可能にした。

材料および方法
オリゴデオキシヌクレオチド：本研究において、６個の異なるオリゴヌクレオチドを、ラット由来脾細胞を用いる刺激実験のために用いた。全てのオリゴヌクレオチドを、Ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ（Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。全てのオリゴヌクレオチドは、到着の際に、一連の異なる希釈度に滅菌水で希釈した。光学密度（ＯＤ）Ａ２６０／２８０を、それぞれの希釈度の少なくとも５つ以上の試料で、分光光度計（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（商標）３０００、Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて決定した。全ての希釈度について、全ての読み取り値の平均濃度を、ストックの濃度を決定するために算出した。これらのストック溶液を全て、−２０℃にて貯蔵した。異なる作業溶液を実験で用いた：１μＭおよび１０μＭは、オリゴヌクレオチドストック溶液を滅菌水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）でさらに希釈することにより調製した。融解／凍結サイクルの反復は最小限にして、化合物の分解を制限した。

ＰＣＲプライマー：遺伝子特異的プライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（表２；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いることにより設計した。混入ゲノムＤＮＡの増幅／検出は、プライマーの１つをエキソン／イントロン境界を覆って構築することにより回避した。プライマーオリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。

ラット脾細胞調製：雌のＤＡラットに由来する６個の脾臓を本研究で用いた。脾臓はプールせずに、個別に扱って、変動性の程度を評価した。細胞懸濁物を、滅菌条件下で、７０μｍのナイロン細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いることにより調製した。次いで、細胞を完全ＲＰＭＩ１６４０（５％熱不活化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で１２００ｒｐｍにて７〜１０分間、４℃にて２回洗浄した。上清をデカントし、細胞を１ｍｌの赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し、さらに２分間、室温にてインキュベートした。別の５ｍｌの完全培地を加えた後に、上記のようにして遠心分離を行った。上清をデカントした後に、ペレットを完全培地中に再懸濁し、細胞数を、０．４％トリパンブルー色素排除（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００−Ｓ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて決定した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激：細胞を、９６ウェルＶ底プレートに、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中に、ウェルあたり５×１０⁵細胞に相当する１０×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で播種した。細胞を播種した直後に、ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したオリゴヌクレオチドを、加えたオリゴヌクレオチドの最終濃度がそれぞれ１μＭおよび１０μＭに到達するように加えた。インキュベーションを２連で行った。細胞を、空気中５％ＣＯ₂を用いる湿潤細胞培養インキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション期間の後に、細胞懸濁物をプールし、１ｍｌの氷冷ＰＢＳに加え、その後、１２００ｒｐｍにて１０分間、４℃にて洗浄した。最後に、上清を除去し、その後、細胞ペレットを１％のβ−メルカプトエタノールを加えた３５０μｌのＲＬＴ緩衝液中に溶かして溶解した。溶解細胞懸濁物を、さらに処理するまで−２０℃にて凍結した。

ＲＴ−ＰＣＲ：全ＲＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ全ＲＮＡ抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。混入ゲノムＤＮＡの増幅／検出を回避するために、試料を２７ｋＵのＤＮアーゼとともに３７℃にて３０分間インキュベートした。ＲＮＡを４０μｌのＲＮアーゼフリー水に溶出させた後に、５μｌのＲＮＡ溶出物を用いて、分光光度計によりＲＮＡ濃度を決定した。逆転写を、０．１５〜１μｇの全ＲＮＡ、ランダムヘキサマー（０．１μｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（２００Ｕ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者のガイドラインに従って行った。得られたｃＤＮＡを滅菌脱イオン水で希釈して、ｃＤＮＡストック溶液を作製した。増幅を、２ステップＰＣＲプロトコル（９５℃で１０分、その後、９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル）でＳＹＢＲ−ＧｒｅｅｎＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った。予備的実験において、プライマー対は、通常のＰＣＲプロトコルを用いて試験した。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲルに泳動させ、全ての場合において、予測されたサイズの単一バンドに限定された。用いた全てのプライマーを表２に列挙する。

ｍＲＮＡレベルの半定量的な評価を、別々のチューブにおいてｍＲＮＡおよびハウスキーピング遺伝子であるアクチン−ガンマの増幅を用いるΔΔＣｔ法を用いて行った。全ての試料を２連で行った。リアルタイムＰＣＲデータ（個別のΔＣｔ値およびＲＱ値）を算出し、７５００リアルタイムＰＣＲシステムＳＤＳソフトウェアを用いて分析した。個別の値を、次いで、Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。それぞれの特定の遺伝子について、２連の試料の平均ＲＱ値を、培地のみで刺激した試料の平均ＲＱ値に対して標準化した。６個の個別の脾細胞集団の平均値および標準偏差を、適宜に算出した。

結果
最初に、本研究の焦点は、ＭＳにおいてそれらの保護効果が示唆されていたことから、サイトカインＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータおよびＩＬ−１０であったので、これらの因子のみについてのグラフを含める。

ＩＦＮ−アルファ（図１）およびＩＦＮ−ベータｍＲＮＡ（図２）はともに、いくつかのオリゴヌクレオチドにより誘導され、特にＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０６０およびＩＤＸ０９８０は、これらの遺伝子のｍＲＮＡの高いレベルを誘導した。ＩＦＮ−アルファ／ベータを誘導できなかったオリゴヌクレオチドは、ＩＤＸ９０２２およびＩＤＸ９０４５を含む。

１型インターフェロンとは対照的に、強力なＴｈ−２関連サイトカインであるＩＬ−１０は、はるかに低いレベルで誘導された。図３に示すように最高レベルのＩＬ−１０を誘導したオリゴヌクレオチドには、ＩＤＸ９０６０およびＩＤＸ０９８０が含まれる。値は、培地のみで刺激した試料の平均ＲＱ値に対して標準化した。データは、６個の脾臓に由来する脾細胞の平均±ＳＤとして示す。

ＩＦＮ−ガンマ、ＣＸＣＬ−１０およびＶＥＧＦ−Ａのパターンは、Ｉ型インターフェロンのパターンと比較してほぼ同様であり、いくつかのオリゴヌクレオチドにより中程度〜強く誘導された（データは示さず）。ほとんどのヌクレオチドが、限定された量だけのＩＬ−６ ｍＲＮＡを誘導し、試験した化合物間の差は比較的小さかった（データは示さず）。

ＴＮＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータのｍＲＮＡは、試験したオリゴヌクレオチドのいずれによってもほとんど影響されなかった。なぜなら、これらの分子はいずれも、その発現を著しく変化させることができなかったからである。しかし、興味深いことに、ＩＤＸ９０２２およびＩＤＸ９０４５が、ＴＧＦ−ベータを著しく下方制御したことが観察された（データは示さず）。

残りのケモカインについてのデータをまとめようとすると、２つの群があることが明らかになる：オリゴヌクレオチドによる処置に対して応答する遺伝子からなる１群と、オリゴヌクレオチドとの培養後に応答しないか、または下方制御さえ示さない遺伝子からなる１群。最初の群にはＭＩＰ−１アルファ、ＭＣＰ１およびＣＣＬ−５が属し、ＣＣＬ−４、ＭＩＰ−２およびＣＩＮＣは後者の群に属する。いずれの群にも、遺伝子間の明確なオーバーラップは観察できなかった。

結論として、本発明者らの候補薬物は、ラット細胞を刺激することができ、それにより、いくつかの免疫学的に関連するマーカー遺伝子の発現レベルを変更でさせることが明確になった。これらの結果により、ラットＥＡＥモデルを含むさらなる研究において特定のオリゴヌクレオチドに焦点を当てるための基礎が形成された。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット細胞におけるＣＤ４９ｄ発現の低減
本発明者らは、本発明の化合物がＣＤ４９ｄ（内皮細胞上の受容体と相互作用するリンパ球表面上の重要な分子）を低減し、それによりＣＮＳへの細胞の移動、すなわちＭＳ病理における重要なステップを低減できるかどうかを調べることに着手した。本発明者らは、ラットの脾細胞または血液を、本発明の化合物による刺激の際のＣＤ４９ｄの発現を研究するために用いた。

材料および方法
ＤＡラットの脾細胞（ｎ＝３）またはＰＢＭＣ（ｎ＝１）を３７℃にて、５００μｌの容量の完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有）中で、４８ウェルプレートにて２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度でインキュベートし、１０μＭのＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０５８、ＩＤＸ９０３８、ＩＤＸ０１５０、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ９０４５で処理した。

４８時間後に、２００μｌの細胞懸濁物を９６ウェルプレート中でスピンダウンし、１００μｌの２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）に再懸濁し、蛍光色素複合抗ＣＤ３および抗ＣＤ４９ｄ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と３０分間、４℃にてインキュベートした。次いで、細胞を純粋ＰＢＳ中で２回洗浄し、その後、表面抗原発現分析のためのＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザー（ＢＤ）を用いるＦＡＣＳにより分析した。

結果
３匹のプールしたＤＡラットの脾細胞は、本発明の化合物による処理の際にＣＤ４９ｄの下方制御を示した（図４）。この下方制御は、インキュベーションの４８時間後に、ＩＤＸ０１５０、ＩＤＸ９０４５およびＩＤＸ９０５４で最も著しかった。１匹のＤＡラットのＰＢＭＣは、本発明の化合物による処理の際にＣＤ４９ｄの下方制御を示した（図５）。この下方制御は、インキュベーションの４８時間後に、ＩＤＸ０１５０およびＩＤＸ９０３８で最も著しかった。

ＣＤ４９ｄ発現の減少は、本発明の化合物で処理した脾細胞およびＰＢＭＣにおいて観察された。本発明の化合物のこれらの特性は、移動のプロセス、およびそれによりＣＮＳへの細胞の流入を、独立型または抗体療法との組合せ治療のいずれかとして低減することができた。

動物研究
本発明者らは、本発明者らの仮説を確認し、異なる候補化合物を試験するために、動物研究を依頼した。２つの研究を、ＤＡラットにおけるＭＯＧ誘導実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を用いて行った。

ＤＡラットにおけるＭＯＧ誘導ＥＡＥは、ヒトにおけるその相対物である多発性硬化症と多くの特徴を共有する高い再現性を有するよく特徴づけられた実験モデルであり、それ自体で、治療の試験のための適切なモデルである（Ｇｏｌｄら、２００６、Ｆｒｉｅｓｅら、２００６）。ＩＦＡ中のＭＯＧでの免疫化の後に、炎症性免疫細胞が脊髄および脳に浸潤することにより引き起こされるミエリンの進行性の変性により、動物は、尾部から、後肢を通って前肢まで次第に麻痺し始める。病理は、動物が部分的に回復し、次いで増大した疾患が再発する慢性再発型であり、単球およびＴ細胞（１型サイトカイン）ならびにＢ細胞（抗体）活性の両方の結果である。

広く認められた再発／寛解型実験モデルであるため、ラットをげっ歯類の種として選択した。選択された系統は、ＣＮＳ炎症に対する感受性が記録されている。一般的に、免疫されたラットの５０〜８０％が、用量設定された免疫化の後に再発疾患を発症する。残りのものは、遅発型慢性疾患を発症するか、または１回目の発作中に死亡する。

試験動物：Ｂ＆Ｋ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、ＳｗｅｄｅｎのＤＡラット（雌、１８０〜２５０ｇ、１０〜１４週齢）を用いた。動物は、試験開始前の少なくとも７日間、馴化させた。この期間中に、動物を毎日観察して、それらが研究のために適格であることを確認した。不健康の徴候、何らかの異常または極端な体重範囲を示す動物は、研究の前に交換した。

群は、柵内および柵の間で、研究全体の環境の影響が等しくなるように分布させた。試験動物は、耳のタグにより識別した。ケージのカードは実験の番号および群コードのみを示した。

飼育：動物は、死亡または単離により減少しない限りは１ケージあたり４匹で飼育した。ケージは、ステンレス鋼の蓋を有する通常のｍａｋｒｏｌｏｎプラスチックケージであった。ポプラチップを床材として用いた。ろ過した再循環していない空気を供給した。温度は２０〜２３℃の範囲に、相対湿度は４０〜６０％の範囲に保持した。温度および相対湿度はともに、毎日監視した。照明条件は、１２時間の明期および１２時間の暗期であった（０７．００〜１９．００）。

食餌：試験動物には、通常のげっ歯類の食餌を自由に与えた（Ｌａｃｔａｍｉｎ、ＳｗｅｄｅｎからのＲ３６（照射））。配達の前に、それぞれのバッチの食餌を、種々の栄養要素ならびに化学物質および微生物の混入物について供給業者が分析した。いずれのバッチの食餌も使用のために与える前に、供給業者の分析証明書を精査して確認した。

この食餌は、抗生物質または他の化学療法剤もしくは予防薬が添加されていなかった。試験動物には、給水管を備えたポリエチレンまたはポリカーボネートパイプを通して水を自由に与えた（都市飲用水）。

免疫化手順：ラットを、尾部のつけ根にフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）中の３０μｇのラットＭＯＧ ｐＨ３（５．２ｍｇ／ｍｌストック）で構成されるエマルジョン０．１ｍｌをｉ．ｄ．注射することにより免疫した（第０日）。この手順は、およそ第１０日から開始して、尾部から生じて前肢まで次第に達する進行性の麻痺の出現をもたらすことが知られている。

処置期間：試験化合物および対照は、１回目の発作のピークの前に２回（すなわち第１１日および第１５日）と、第２０日に３回目の処置（１回目の発作のピーク中）にて投与した。

試験物質：第１の研究において、２つの本発明のオリゴヌクレオチドであるＩＤＸ９０５２（配列番号５）およびＩＤＸ９０５４（配列番号２）を、公的に利用可能であるオリゴヌクレオチドＩＤＸ０９８０（配列番号１０）と一緒に用いた。第２の研究において、１つの本発明のオリゴヌクレオチド；ＩＤＸ９０５４（配列番号２）を用いた。試験物質の配列は、表１に示す。

第１の研究の試験化合物（ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ０９８０）を、１００μｌの総容量で首にｓ．ｃ．投与した。この用量を３回投与した。第２の研究の試験化合物（ＩＤＸ９０５４）を、１００μｌの総容量で首にｓ．ｃ．投与するか、または４０μｌの総容量で鼻にｉ．ｎ投与した。薬物は、ｓ．ｃまたはｉ．ｎ．のいずれかで３回投与した。両方の研究において、ＰＢＳを媒体および対照（ブランク）の両方として用いた。投与した用量は、全ての研究において１回の免疫化あたり１５０μｇであった。

研究の設計：第１の研究は、それぞれ１２匹の動物の４群を含んだ。全ての群を、免疫化プロトコルに従って、ＩＦＡ中のラットＭＯＧで免疫した。全ての化合物は３回免疫した。
群１：対照群：ｓ．ｃ．経路による媒体単独ＰＢＳ
群２：ｓ．ｃ．経路による１５０μｇのＩＤＸ９０５２の投与
群３：ｓ．ｃ．経路による１５０μｇのＩＤＸ９０５４の投与
群４：ｓ．ｃ．経路による１５０μｇのＩＤＸ０９８０の投与。

１群あたりの動物の数は、観察される薬理学的影響の正確な評価を可能にする最小限の数であった。

第２の研究は、それぞれ１６匹の動物の３群を含んだ。全ての群を、免疫化プロトコルに従って、ＩＦＡ中のラットＭＯＧで免疫した。全ての化合物は３回免疫した。
群１：ｓ．ｃ．経路による１５０μｇのＩＤＸ９０５４の投与
群２：対照群：ｉ．ｎ．経路による媒体単独ＰＢＳ
群３：ｉ．ｎ．経路による１５０μｇのＩＤＸ９０５４の投与

臨床観察：動物を、処置に対する反応または健康障害の証拠について１日あたり少なくとも２回視覚的に検査した。第５日から開始して、動物を、以下のような臨床スコアにより麻痺の存在について個別に調べた：
０＝疾患の徴候なし
１＝尾部脱力または尾部麻痺
２＝後肢不全対麻痺または不全片麻痺
３＝後肢麻痺または片麻痺
４＝完全麻痺（四肢対麻痺（ｔｅｔｒａｐａｒａｐｌｅｇｙ））
５＝瀕死状態または死亡

運動失調を日常的に評価した。疾患の寛解は、少なくとも２日連続での疾患スコアの改善と定義した。再発は、少なくとも２日間持続する、少なくとも２ポイントの臨床欠陥の増加と定義した。

臨床スコアの結果を、各群内での平均（±ＳＥＭ）スコアとして表した。試験物質の効果を、媒体処置対照群のものと比較した。群同士間の臨床スコア値の差を、クラスカル−ウォリス検定と、有意な場合は、その後のペアワイズウィルコクソン検定とにより、各測定時間にて分析した。

動物の観察は、静かな部屋で行った。臨床徴候は、処置の各群において毎日、処置を知らされていない技術者による盲検法で監視した。動物の体重も毎日監視した。

疼痛、苦痛または瀕死の状態にあると考えられる動物を、職員の獣医師または権限が付与された者により調べ、必要であれば、過度の疼痛または苦痛を最小限にするために人道的に屠殺した。

結果
動物の状態：第１の研究において、全ての動物は、毎日評価したところ有害な行動的または身体的影響がなく、媒体またはＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ０９８０でのｓ．ｃ．処置に耐容性であった。第２の研究において、全ての動物は、毎日評価したところ有害な行動的または身体的影響がなく、媒体またはＩＤＸ９０５４のｉ．ｎおよびｓ．ｃ．処置に耐容性であったが、ＰＢＳ ｉ．ｎ対照群の１匹の動物だけは処置の直後に死亡し、この事象は正常であるとは考えなかった。同じ群の１匹の動物は関節炎を発症し、倫理指針に従って乱切した。

疾患の最初に、通常の付随する体重の減少があり、これは全ての研究においてその後継続した。群同士間での様々な疾患発生率および死亡率のために、群同士間での差の統計解析は有益でない。しかし、ＩＤＸ９０５４処置群およびＩＤＸ０９８０処置群はともに、第１の研究においてＰＢＳ対照群よりも体重の減少がより少なく、第２の研究において、ＩＤＸ９０５４ ｉ．ｎおよびｓ．ｃ処置群は、ＰＢＳ ｉ．ｎ対照群よりも体重の減少がより少なかった。

臨床疾患経過：第１の研究において、全てのラットの群を、疾患の臨床徴候について毎日評価した。ラットは、第１０日からＥＡＥを発症し始めた（図６）。ＩＤＸ０９８０処置群の４匹の動物およびＩＤＸ９０５４処置群の３匹の動物は疾患を発症しなかったが、それ以外では全ての他の群は第１６日までに１００％の臨床疾患発生率に到達した（図７）。ＩＤＸ０９８０処置群と対照群との発生率の間に有意差があった（ｐ＝０．０２８５）。全ての動物が、ここに示す分析に含まれる。第２の研究において、ラットは、第１１日目からＥＡＥを発症し始めた（図８）。ｓ．ｃおよびｉ．ｎの両方のＩＤＸ９０５４処置群の５匹の動物は疾患を発症しなかったが、ＰＢＳ ｉ．ｎ群は第２６日までに１００％の臨床疾患発生率に到達した。ｉ．ｎ対照群と比較して、ＩＤＸ９０５４ ｓ．ｃ処置群とｉ．ｎ処置群との発生率の間に有意差があった（ｐ＝０．０２）。

疾患の経過は、時間とともに次第に悪化する再発寛解型の経過で進展した。群のうちの全ての動物が全く同時に疾患を発症したのではなく、よってそれらの疾患の経過は、互いに完全に一致しなかったので、示された平均値の標準偏差は様々である（示さず）。

第１の研究において、ＩＤＸ９０５４処置群においてＥＡＥの発症における有意差があり（ｐ＝０．０３１８）、対照群と比較してわずかに遅延していた。群同士間で平均疾患重篤度、累積スコアまたは平均最大スコアのいずれにも統計学的有意差はなかったが、ＩＤＸ０９８０処置群およびＩＤＸ９０５４処置群の両方が、他の２つの群よりも低減された体重減少、低減された疾患重篤度および低い死亡率を有する明確な傾向があった（図９）。第２の研究において、群同士間でＥＡＥの発症、平均疾患重篤度、累積スコアまたは平均最大スコアのいずれにも統計学的有意差はなかったが、ｉ．ｎ−およびｓ．ｃ−ＩＤＸ９０５４処置群の両方が、対照ＰＢＳ ｉ．ｎ群よりも低減された体重減少、低減された疾患重篤度および低い死亡率を有する明確な傾向があった。ｉ．ｎ−ＩＤＸ９０５４処置群についての累積スコアおよび平均最大スコアは、ｓ．ｃ−ＩＤＸ９０５４処置群よりもわずかにより低かった。

このＭＯＧ−ＥＡＥモデルは重度疾患モデルであり、全ての示した分析においてその後それぞれ５または４の最大スコアに割り当てられたラットは、死亡したかまたは各群における倫理規定により屠殺された。死亡率は全般的に高かったが、モデルにおいて通常生じる自然な変動を反映する。

全ての臨床データのまとめを表３〜４に示し、統計解析のまとめをそれぞれの表の下に示す。

第１の前臨床研究についてのＰ値
ＩＤＸ０９８０対ＰＢＳ
累積スコアｐ＝０．２１２８
最大スコアｐ＝０．２４４４
疾患持続期間ｐ＝０．３００８
発症の日ｐ＝０．２８７３
発生率 ｐ＝０．０２８５^*

ＩＤＸ９０５４対ＰＢＳ
累積スコアｐ＝０．３５４８
最大スコアｐ＝０．４４９０
疾患持続期間ｐ＝０．１０１８
発症日ｐ＝０．０３１８^*
発生率ｐ＝０．０６４１

ＩＤＸ９０５２対ＰＢＳ
累積スコアｐ＝０．６８５８
最大スコアｐ＝０．６８０６
疾患持続期間ｐ＝０．３９０７
発症日ｐ＝０．６１２３
発生率ｐ＝−（ともに１００％）

第２の前臨床研究についてのＰ値
ＩＤＸ９０５４ ｉ．ｎ対ＰＢＳ ｉ．ｎ
累積スコアｐ＝０．２０
最大スコアｐ＝０．０５５
疾患持続期間ｐ＝０．２９
発症日ｐ＝０．１７
発生率ｐ＝０．０２^*

ＩＤＸ９０５４ ｓ．ｃ対ＰＢＳ ｉ．ｎ
累積スコアｐ＝０．２１
最大スコアｐ＝０．１２
疾患持続期間ｐ＝０．２４
発症日ｐ＝０．１６
発生率ｐ＝０．０２^*

ＤＡラットにおけるＭＯＧ誘導ＥＡＥは、高い再現性を有するよく特徴づけられた実験モデルである。これは、ヒトにおけるその相対物である多発性硬化症と多くの特徴を共有し、それ自体で、治療の試験のための適切なモデルである（Ｇｏｌｄら、２００６、Ｆｒｉｅｓｅら、２００６）。

ＩＦＡ中のＭＯＧでの免疫化の後に、炎症性免疫細胞が脊髄および脳に浸潤することにより引き起こされるミエリンの進行性の変性により、動物は、尾部から、後肢を通して前肢まで次第に麻痺し始める。病理は、動物が部分的に回復し、次いで増大した疾患が再発する慢性再発型であり、単球およびＴ細胞（１型サイトカイン）ならびにＢ細胞（抗体）活性の両方の結果である。

試験物質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫賦活活性が証明されたオリゴヌクレオチドである。これらの特定の免疫賦活プロファイルはオリゴヌクレオチドの配列により異なり、このことにより、治療対象の進行中の炎症性応答に対するｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの影響の比較分析が行われる。２回のＥＡＥ動物研究の目的は、ＩＤＸ９０５２、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ０９８０の影響を、ＤＡラットにおける再発／寛解型ＭＯＧ誘導ＥＡＥのモデルにおいて調べることであった。

全ての試験オリゴヌクレオチド、または媒体単独での処置は、受容ラットにおいて有害な身体的または行動的影響を引き起こさなかった。処置は、まず疾患を正常に発症させるが、その後、進行中の炎症誘発性カスケードを抑えるために、疾患の最初の発作の直前に開始した。追加の投与は、疾患の増大および臨床疾患期の開始と同時になるように合わせた。ＥＡＥのこの最初の期間からの回復は、ＩＤＸ０９８０処置群およびＩＤＸ９０５４処置群においてともにより著しく、その後の臨床発作の発症は、ＩＤＸ０９８０処置群ではあまり著しくなかった。全ての測定したパラメータは、媒体処置群と比較して、ＩＤＸ０９８０処置群およびＩＤＸ９０５４処置群の両方で低減した。

配列番号５（ＩＤＸ９０５２）は、ラット脾細胞におけるＩＦＮアルファ／ベータの強力な誘導因子であるが、ＥＡＥラットモデルにおいて疾患の重篤度の低減を示さなかった。よって、ＩＤＸ９０５４およびＩＤＸ０９８０での処置の際のＥＡＥラットモデルにおいて観察された疾患の重篤度の低減は、ＩＦＮベータ生成のみとは相関し得ない。さらに、配列番号２（ＩＤＸ９０５４）を用いて得られた結果は、この化合物が、ＤＡラットにおけるＭＯＧ−ＥＡＥにおいてｓ．ｃ．およびｉ．ｎ．の両方で治療効果を有することを示す。

患者試料におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ４９ｄの低減
本発明の化合物がＣＤ４９ｄ発現を低減できるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＲＲＭＳ患者から単離されたＰＢＭＣを、候補化合物での刺激の際のＣＤ４９ｄの発現を研究するために用いた。

材料および方法
ＲＲＭＳ患者（ｎ＝９）のＰＢＭＣを、ＢＤ ＣＰＴ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から得た。細胞を直ちに３７℃にて５００μｌの容量の完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有）中で、４８ウェルプレートにて、２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度でインキュベートし、１、１０および２５μＭのそれぞれのオリゴヌクレオチド化合物で処理した（表１）。オリゴヌクレオチドとインキュベートした細胞を４８時間後に採集し、ＰＢＳで洗浄し、２％ＦＣＳを補ったＰＢＳに再懸濁した。細胞を、異なる２組の蛍光色素複合抗体混合物；（１）抗ＣＤ３ ＡＰＣ、抗ＣＤ４９ｄ ＰＥおよび（２）抗ＣＤ１９ ＰＥ Ｃｙ７、抗ＣＤ４９ｄ ＡＰＣで４℃にて３０分間染色した。抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。染色の後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。

結果
ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣは、オリゴヌクレオチドでの刺激の際に用量依存的にＴ細胞におけるＣＤ４９ｄの下方制御を示した（図１０）。

細胞におけるＣＤ４９ｄ発現の減少が、本発明の化合物で処理した、ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣにおいて観察された。本発明の化合物のこれらの特性は、ＣＮＳへの細胞の移動およびそれによる流入を減少することができた。

患者試料におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのケモカイン受容体の低減
ＣＮＳにおける血液単核細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、単球）の流入は、ＭＳの病理において重要な役割を果たす。よって、流入を遮断または低減することは、ＭＳの治療に有益である。ＣＣＲ５（ＣＤ１９５）、ＣＣＲ２（ＣＤ１９２）およびＣＸＣＲ３（ＣＤ１８３）のようなケモカイン受容体は、単核細胞において発現され、炎症部位への細胞の動員に関与する。本発明の化合物が上記のケモカイン受容体の発現を低減できるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣを、本発明の化合物を用いて刺激した。

材料および方法
ＲＲＭＳ患者（ｎ＝３）のＰＢＭＣを、ＢＤ ＣＰＴ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを用いて単離した。細胞を直ちに３７℃にて５００μｌの容量の完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有）中で、４８ウェルプレートにて、２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度でインキュベートし、１、１０および２５μＭのそれぞれの本発明の化合物で処理した。オリゴヌクレオチドとインキュベートした細胞を４８時間後に採集し、ＰＢＳで洗浄し、２％ＦＣＳを補ったＰＢＳに再懸濁した。細胞を、異なる３組の蛍光色素複合抗体混合物；（１）抗ＣＤ３ ＰＥ−Ｃｙ−７、抗ＣＣＲ５ ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗ＣＣＲ２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、抗ＣＸＣＲ３−ＰＥ、（２）抗ＣＤ１９ ＰＥ−Ｃｙ−７、抗ＣＣＲ５ ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗ＣＣＲ２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、抗ＣＸＣＲ３ ＰＥおよび（３）抗ＣＤ１４ ＰＥ−Ｃｙ−７、抗ＣＣＲ５ ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗ＣＣＲ２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、抗ＣＸＣＲ３ ＰＥで４℃にて３０分間染色した。抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。ＰＢＳで洗浄した後に、細胞を、ＦＡＣＳａｒｒａｙフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。

結果
ＲＲＭＳ患者（ｎ＝３）から単離したＰＢＭＣは、本発明の化合物での刺激の後に、特にＩＤＸ９０４５によりＴ細胞（ＣＤ３陽性）におけるＣＸＣＲ３の下方制御を示した（図１１）。ＣＣＲ５も、オリゴヌクレオチド処理の後に、特にＩＤＸ９０２２によりＴ細胞において下方制御された（データは示さず）。

ＲＲＭＳ患者（ｎ＝３）から単離したＰＢＭＣは、ＣＤ１９陽性細胞におけるＣＸＣＲ３の下方制御を示した。この受容体の最も強力な下方制御効果を示したオリゴヌクレオチドは、ＩＤＸ９０３８、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０５８、ＩＤＸ９０４５、ＩＤＸ９００４およびＩＤＸ０９８０であった（図１２）。

ＲＲＭＳ患者（ｎ＝３）から単離したＰＢＭＣは、ＣＤ１４陽性細胞におけるＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５およびＣＣＲ２の下方制御を示した。ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５およびＣＣＲ２の最も強力な下方制御効果を示すオリゴヌクレオチドは、それぞれ図１３、１４ならびに１５ＡおよびＢに示す。

Ｔ、Ｂおよび単球におけるケモカイン受容体（ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２）の発現の減少が、本発明の化合物で治療した、ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣにおいて観察された。本発明の化合物のこれらの特性は、ＣＮＳに対するこれらの細胞の遊走の低減において重要な役割を果たすことができた。

ＲＲＭＳ患者から単離した白血球の走化性の低減
ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳは、炎症部位への血液単核細胞、特に単球、Ｔ細胞およびＢ細胞の動員のための強力なケモカインである。ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳに対する血液単核細胞の走化性は、それぞれＣＣＲ２およびＣＣＲ５受容体により主に媒介される。この研究の目的は、実施例５に示すような本発明の化合物によるＣＣＲ２およびＣＣＲ５の発現の減少が、単核細胞の遊走を実際に低減できることを示すことであった。

材料および方法
血液単核細胞の走化性を、ＱＣＭ（商標）比色走化性アッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を製造業者の使用説明に従って用いて調べた。手短に述べると、ＰＢＭＣを、ＢＤ ＣＰＴ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを用いてＲＲＭＳ患者から単離し、実施例５に記載されるようにして１、１０および２５μＭの本発明の化合物で処理した。４８時間後に細胞を洗浄し、３μｍのポアサイズを有する２４ウェル細胞遊走プレートアセンブリの上部のインサートに移した（２５０μｌの培地中に３×１０⁵細胞）。次いで、化学誘引物質ＭＣＰ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＲＡＮＴＥＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する３００μｌの培地を、下部のチャンバに加えた。次いで、空気中５％ＣＯ₂を用いる湿潤細胞培養インキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃にて１６時間、化学誘引物質に向かってフィルタを通って細胞が遊走できるようにした。その後、下部のチャンバの細胞、すなわち遊走した細胞を、細胞生存染料ＷＳＴ−１との１時間のインキュベーションと、その後のマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いる４５０ｎｍでの吸光度の測定による定量により検出した。

結果
本発明の化合物（ＩＤＸ９０４５、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ０９８０）で処置した、２名の異なるＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣは、機能的遊走アッセイにおいて化学誘引物質に対して未処置の細胞よりも少ない遊走を示した（図１６Ａ〜Ｂ）。

このことは、細胞遊走の低減が、受容体のより低い発現によることを示す。これらの結果はｉｎ ｖｉｖｏのシナリオも反映し、結果として中枢神経系への細胞の走化性の低下を導くという予測をする理由がある。

患者試料におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶＥＧＦの低減
ＭＳにおける活発な病変は、血液脳関門（ＢＢＢ）破壊を特徴とし、このことは、疾患の病理に血液透過性の変化が関与することを示唆する。ＭＳの患者において、ＶＥＧＦが血管透過性を誘導し、それによりＣＮＳへの自己攻撃性細胞の流入を増加させることが報告されている（Ｐｒｏｅｓｃｈｏｌｄｔ ＭＡら、２００２）。本発明の化合物がＶＥＧＦ生成を低減できるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＲＲＭＳ患者から単離されたＰＢＭＣを、本発明の化合物での刺激の際のＶＥＧＦ生成を研究するために用いた。

材料および方法
ＰＢＭＣを、ＲＲＭＳ患者（ｎ＝６〜１１）からＢＤ ＣＰＴ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを用いて単離した。細胞を直ちに３７℃にて５００μｌの容量の完全ＲＰＭＩ培地中で、４８ウェルプレートにて、２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度でインキュベートし、１、１０および２５μＭのそれぞれの本発明の化合物で処理した。４８時間後に、上清を、ＶＥＧＦの存在について、細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。

結果
ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣは、ＩＤＸ９０３８、ＩＤＸ９０４５、ＩＤＸ９００４およびＩＤＸ０９８０での刺激の後に、細胞上清中で著しいＶＥＧＦ低減を示した（図１７）が、ＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０５８、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０６０、ＩＤＸ０１５０およびＩＤＸ９０５２は、細胞上清中のＶＥＧＦを低減しなかった（データは示さず）。

ＶＥＧＦの低減が、本発明の化合物で処理した細胞の細胞上清において観察された。本発明の化合物のこの特性は、ＢＢＢの血管透過性を低減し、それによりＣＮＳへの免疫細胞の浸潤を妨げると考えられる。

患者試料におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−ベータの誘導
本発明者らは、ＲＲＭＳ患者の血液を用いて、ＩＦＮ−ベータの誘導についてｉｎ ｖｉｔｒｏで異なる候補化合物を試験した。

材料および方法
ＰＢＭＣを、ＲＲＭＳ患者（ｎ＝６）からＢＤ ＣＰＴ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを用いて単離した。細胞を直ちに３７℃にて５００μｌの容量の完全ＲＰＭＩ培地中で、４８ウェルプレートにて、２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度でインキュベートし、１、１０および２５μＭのそれぞれのオリゴヌクレオチド化合物で処理した。４８時間後に、上清を、ＩＦＮ−ベータ生成について、ＩＦＮ−ベータＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分析した。

結果
ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣは、ＩＤＸ９０５８、ＩＤＸ９０４５、ＩＤＸ９００４、ＩＤＸ９０５４、ＩＤＸ９０６０およびＩＤＸ０９８０で４８時間後に刺激した後に、細胞上清中で著しいＩＦＮ−ベータ生成を示した（図１８）。ＩＤＸ９０２２、ＩＤＸ９０３８およびＩＤＸ９０５２は、上清中で著しいＩＦＮ−ベータ生成を誘導しなかった（データは示さず）。ＩＤＸ０１５０は、ＩＦＮ−ベータ生成を全く示さなかった（データは示さず）。

ＩＦＮ−ベータ生成の増加が、本発明の化合物で処理した、ＲＲＭＳ患者から単離したＰＢＭＣの細胞上清において観察された。ＩＦＮ−ベータ生成を惹起する本発明の化合物のこの特性は、ＲＲＭＳ療法において現在用いられているように、このサイトカインの既知の有益な効果により、より低い炎症に寄与し得る。

全体として、本発明者らにより行われた実験の結果は、オリゴヌクレオチドが、中枢神経系への単核細胞の阻害または低減がＣＮＳの炎症性疾患の治療のために有益であり得るｉｎ ｖｉｖｏ状況において効果的であり得ることを示す。本発明の化合物のこの有益な効果は、少なくとも１つの細胞表面マーカーまたはＶＥＧＦの発現の下方制御により媒介することができる。

本発明を、本発明者らが現在認識する最良の形態を構成するその好ましい実施形態に関して記載したが、当業者に明らかな種々の変更および改変を、本明細書に添付する特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を逸脱することなく行い得ることが理解される。

（参照文献）
《１》
FDA News P04-107, November 23, 2004.
《２》
Friese, M A et al., The value of animal models for drug development in multiple sclerosis, Brain, 2006;129 (Pt 8):1940-52.
《３》
Gold et al., Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research, Brain, 2006;129 (Pt 8):1953-71.
《４》
Hafler, D A, Multiple sclerosis. J Clin Invest, 2004.
《５》
Kerkmann, M. et al., Spontaneous formation of nucleic acid-based nanoparticles is responsible for high interferon-alpha induction by CpG-A in plasmacytoid dendritic cells, J Biol Chem, 2005; 280(9):8086-93.
《６》
Wikstroem, F H et al., Structure-dependent modulation of alpha interferon production by porcine circovirus 2 oligodeoxyribonucleotide and CpG DNAs in porcine peripheral blood mononuclear cells., J Virol. 2007; 81(10):4919-27.
《７》
Proescholdt M A. et al, Vascular endothelial growth factor is expressed in multiple sclerosis plaques and can induce inflammatory lesions in experimental allergic encephalomyelitis rats., J Neuropathol Exp Neurol. 2002; 61(10):914-25
《８》
Trebst C, Ransohoff RM. Investigating chemokines and chemokine receptors in patients with multiple sclerosis: opportunities and challenges, Arch Neurol. 2001;58(12):1975-80.
《９》
Steinman L. A molecular trio in relapse and remission in multiple sclerosis, Nat Rev Immunol., 2009;9(6):440-7.

Claims (17)

1. 配列番号１［ＩＤＸ９０４５］、配列番号２［ＩＤＸ９０５４］、配列番号４［ＩＤＸ９００４］、配列番号８［ＩＤＸ９０６０］および配列番号５［ＩＤＸ９０５２］から選択される配列からなり、単離されかつ精製されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
2. 少なくとも１つのヌクレオチドが、リン酸主鎖修飾を有することを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. リン酸主鎖修飾が、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾であることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする医薬組成物。
5. 生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、シクロデキストリンまたはそれらの組合せから選択される薬理学的に適合可能でありかつ生理的に許容され得る賦形剤または担体をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
6. 多発性硬化症の治療および／または緩和のための医薬組成物の製造のために使用され、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］、配列番号２［ＩＤＸ９０５４］、配列番号４［ＩＤＸ９００４］、配列番号８［ＩＤＸ９０６０］および配列番号５［ＩＤＸ９０５２］から選択される配列からなり、単離されかつ精製されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
7. 少なくとも１つのヌクレオチドが、リン酸主鎖修飾を有することを特徴とする請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
8. リン酸主鎖修飾が、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾であることを特徴とする請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現を下方制御することにより中枢神経系への単核細胞および／または自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するのに有効な量で投与されることを特徴とする請求項６乃至８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 中枢神経系の炎症性疾患の治療および／または緩和のための医薬組成物の製造に使用され、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］、配列番号２［ＩＤＸ９０５４］、配列番号４［ＩＤＸ９００４］、配列番号８［ＩＤＸ９０６０］および配列番号５［ＩＤＸ９０５２］から選択される配列からなり、単離されかつ精製されたオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現を下方制御することにより中枢神経系への単核細胞および／または自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するのに有効な量で投与されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
11. 少なくとも１つのヌクレオチドが、リン酸主鎖修飾を有することを特徴とする請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
12. リン酸主鎖修飾が、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾であることを特徴とする請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
13. 前記少なくとも１つの細胞表面マーカーは、ＣＤ４９ｄ、ＣＸＣＲ３（ＣＤ１８３）、ＣＣＲ２（ＣＤ１９２）およびＣＣＲ５（ＣＤ１９５）から選択されることを特徴とする請求項１１または１２に記載のオリゴヌクレオチド。
14. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］および配列番号２［ＩＤＸ９０５４］から選択される配列からなることを特徴とする請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
15. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１［ＩＤＸ９０４５］の配列からなるものであることを特徴とする請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
16. 前記少なくとも１つの細胞表面マーカーはＣＤ４９ｄであることを特徴とする請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
17. 前記オリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦの生成を低減することにより中枢神経系への単核細胞および／または自己攻撃性細胞の流入を阻害または低減するのに有効な量で投与されることを特徴とする請求項６または１０に記載のオリゴヌクレオチド。

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